nghiên cứu con đường xâm nhiễm của vi khuẩn streptococcus iniae vào cá chẽm (lates calcarifer) và đánh giá khả năng phòng bệnh do streptococcus iniae gây ra bằng cách ngâm cá trong vaccine

an toàn với con người, các nỗ lực nghiên cứu để hiểu hơn về tác nhân gây bệnh, từ đó sản xuất và đưa vaccine phòng bệnh Streptococcosis trên cá chẽm vào ứng dụng đã và đang được thực hiệ

LỜI CẢM ƠN

Thực tập tốt nghiệp thật sự là cơ hội quan trọng để sinh viên nói chung, sinh viên chuyên ngành Bệnh học thủy sản nói riêng có thể tiếp cận với thực tế nghề nghiệp, rèn luyện phương pháp nghiên cứu khoa học và hoàn thiện những kỹ năng thực hành cần thiết trước khi rời khỏi giảng đường đại học Những kiến thức đúc kết được sẽ là bước đệm vững chắc, hỗ trợ cho công việc thực tế sau này

Trong thời gian hoàn thành đồ án tốt nghiệp, ngoài những cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của nhiều cơ quan và cá nhân Với tất cả sự chân thành và lòng biết ơn sâu sắc tôi xin được gởi lời cảm ơn tới:

Thạc sĩ Trần Vĩ Hích-giáo viên hướng dẫn, người đã định hướng, động viên

và tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi được thực hiện đề tài này

Tiến sĩ Nguyễn Hữu Dũng-giám đốc trung tâm Giống và Dịch bệnh thủy sản, trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện cho tôi được học hỏi và thực hiện đề tài tại đây

Ban chủ nhiệm Khoa Nuôi trồng Thủy sản, các thầy cô bộ môn Bệnh học thủy sản đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và những người thương yêu tôi đã luôn bên cạnh, giúp tôi có thêm sức mạnh thực hiện tốt đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, tháng 06 năm 2012

Sinh viên thực hiện

Võ Thị Mỹ Dung

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Một số đặc điểm sinh học của cá chẽm 3

1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh Streptococcosis trên cá .4

1.2.1 Bệnh Streptococcosis 4

1.2.2 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus iniae gây ra trên cá 5

1.2.2 Bệnh do Streptococcus iniea gây ra trên cá chẽm 8

1.3 Vaccine 8

1.3.1 Tình hình nghiên cứu phát triển vacxin ở cá trên thế giới 9

1.3.2 Tình hình nghiên cứu vaccine phòng bệnh Streptococcosis trên cá 10

1.3.3 Tình hình nghiên cứu và triển vọng sử dụng vacxin ở Việt Nam 13

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 14

2.2 Vật liệu nghiên cứu 14

2.2.1 Môi trường 14

2.2.2 Hóa chất 14

2.2.2.1 Hóa chất sản xuất vaccine, xác định đặc điểm sinh hóa 14

2.2.2.2 Hóa chất nhuộm mô hóa miễn dịch 14

2.2.3 Dụng cụ, thiết bị 15

2.2.3.1 Nuôi cấy vi khuẩn, sản xuất vaccin và cắt mô 15

2.2.3.2 Xác định hiệu quả vaccin 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 15

2.3.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu (Hình 2.1) 15

2.3.2 Kiểm tra một số đặc điểm sinh hóa của hai chủng Streptococcus iniae 15

2.3.3 Nuôi cấy vi khuẩn và chuẩn bị vacxin Streptococcus iniae bất hoạt 16

2.2.4.1 Bố trí thí nghiệm và thu mẫu 18

2.2.4.2 Xử lý mẫu 18

2.2.4.3.Quy trình nhuộm mô hóa miễn dịch 18

2.2.5 Phương pháp đánh giá hiệu quả vaccine 19

2.2.5.1 Chuẩn bị cá thí nghiệm 19

2.2.5.2 Xác định liều gây chết 50% (LD50) bằng phương pháp ngâm 21

2.2.6 Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm ngược, xác định tỷ lệ sinh tồn tương đối RPS (%) 21

2.2.7 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu 21

2.2.7.1 Phương pháp xác định các thông số 21

2.2.7.2 Phương pháp xử lý số liệu 22

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Các đặc điểm sinh hóa của hai chủng vi khuẩn Streptococcus inae 23

3.2 Kết quả LD50 (%) và độc lực của chủng vi khuẩn Strep1 25

3.3 Sự xâm nhiễm của vi khuẩn S iniae trên cá chẽm 27

3.4 Đánh giá mức độ an toàn của vaccine 31

3.5 Kết quả cảm nhiễm cá sau khi dẫn truyền vaccine và tỷ lệ sinh tồn tương đối RPS (%) 33

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 38

4.1 Kết luận 38

4.2 Đề xuất ý kiến 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

SGR (specific growth rate) Tốc độ sinh trưởng đặc trưng

SL (standard length) Chiều dài thân (không kể đuôi)

w/v (weight / volume ) Khối lượng / thể tích

v/v (volume / volume) Thể tích / thể tích

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 So sánh đặc điểm sinh hóa 2 chủng Strep1, Strep 2 với S iniae từ các

nghiên cứu khác 24 Bảng 3.2 Tốc độ sinh trưởng đặc trưng theo chiều dài của cá chẽm ở các nghiệm thức 32 Bảng 3.3 Tỷ lệ chết trung bình và tỷ lệ sinh tồn tương đối ở các nghiệm thức 34

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cá chẽm Lates calcarifer 3

Hình 2.1: Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 16

Hình 2.2: Sơ đồ quy trình nghiên cứu mô hóa miễn dịch 17

Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá khả năng bảo vệ của vaccine 20

Hình 3.1: Khuẩn lạc của chủng vi khuẩn Streptococcus iniae trên môi trường BA bổ sung 5% máu cừu và 2% NaCl (A); mẫu soi tươi của vi khuẩn trên khi được nuôi trong môi trường TSB (B) 23

Hình 3.2: Đồ thị về tương quan giữa tỷ lệ cá chết với nồng độ vi khuẩn chủng Strep1 trong thí nghiệm xác định LD50 (%) bằng phương pháp ngâm 26

Hình 3.3: Tỷ lệ chết tích lũy ở cá chẽm ở những nồng độ vi khuẩn khác nhau khi cảm nhiễm bằng phương pháp ngâm 26

Hình 3.4: Một số dấu hiệu bệnh lý của cá chẽm bị nhiễm bệnh do S iniae khi cảm nhiễm bằng phương pháp ngâm (A) xuất huyết bụng, (B) màu sắc cơ thể đen tối, xuất huyết ở gốc vây ngực 27

Hình 3.5: Sự hiện diện cuả vi khuẩn () trong các cơ quan khác nhau: (A, B) mang, (C, D) mô thận, (E, F) lách Lách (E) thể hiện sự thoái hóa () 28

Hình 3.6: Mô gan và ruột của cá chẽm sau khi được cảm nhiễm với S iniae: (A, B) mô gan thể hiện sự xuất hiện của vi khuẩn (), hình thành các không bào () và thoái hóa (); (C, D) mô ruột có nhiều vi khuẩn bên trong () 29

Hình 3.7: Sự hiện diện cuả vi khuẩn () trong mắt (A, B) và não (C, D) cá chẽm sau khi cảm nhiễm S iniae bằng phương pháp ngâm 30

Hình 3.8 Tỷ lệ chết tích lũy (%) của cá chẽm ở các nghiệm thức khác nhau 33

ta Tuy nhiên, sự phát triển nghề nuôi cá chẽm gia tăng nhanh chóng cả về quy mô

và diện tích, đồng thời thiếu sự quản lý, quy hoạch trong quá trình phát triển trong thời gian qua đã dẫn đến một số vấn đề về môi trường và dịch bệnh, kết quả là các báo cáo dịch bệnh trên đối tượng nuôi này xuất hiện với tần số ngày càng tăng

Một trong những bệnh nguy hiểm và thường gặp đã được thông báo trên cá

chẽm có thể kể đến là bệnh Streptococcosis do vi khuẩn Streptococcus iniae gây ra

Bệnh đã được bắt gặp trên nhiều hệ thống nuôi cá chẽm ở Việt Nam và một số quốc gia trên thế giới với tỷ lệ gây chết lớn lên đến 70% trong một thời gian ngắn, gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho người nuôi Kháng sinh, chất kích thích miễn dịch và vaccine là những công cụ được ứng dụng để kiểm soát bệnh Tuy nhiên, so với vaccine, hai công cụ kháng sinh và chất kích thích miễn dịch còn thể hiện nhiều hạn chế Sử dụng kháng sinh có thể để lại dư lượng trong cá, trong môi trường tạo

ra những tác động tiềm ẩn gây nguy hại cho môi trường và con người, từ đó dẫn đến những sản phẩm dùng kháng sinh gặp phải e ngại của người tiêu dùng, gây khó khăn trong tiêu thụ Sử dụng chất kích thích miễn dịch tuy an toàn với con người, với môi trường và vật nuôi nhưng lại chỉ tạo ra sự bảo vệ trong một thời gian ngắn

Do đó, sử dụng vaccine là phương pháp kiểm soát tối ưu được các nhà khoa học hướng đến để kiếm soát bệnh này

Trên thế giới, vaccine phòng bệnh Streptococcosis đã được nghiên cứu từ những năm 1980, trên thị trường cũng đã xuất hiện sản phẩm vaccine thương mại để

phòng bệnh S iniae trên các loài cá khác nhau, nhưng ở Việt Nam lĩnh vực vaccine

còn rất mới Với mục tiêu phát triển nghề nuôi trồng thủy sản Việt Nam nói chung, nghề nuôi cá chẽm nói riêng hướng tới sự bền vững, thận thiện với môi trường và

an toàn với con người, các nỗ lực nghiên cứu để hiểu hơn về tác nhân gây bệnh, từ

đó sản xuất và đưa vaccine phòng bệnh Streptococcosis trên cá chẽm vào ứng dụng

đã và đang được thực hiện

Được sự cho phép của khoa Nuôi trồng thủy sản, trường Đại học Nha Trang

và sự định hướng, giúp đỡ của thầy Trần Vĩ Hích, tôi đã thực hiện đề tài tốt nghiệp

với tiêu đề: “Nghiên cứu con đường xâm nhiễm của vi khuẩn Streptococcus iniae vào cá chẽm (Lates calcarifer) và đánh giá khả năng phòng bệnh do Streptococcus iniae gây ra bằng cách ngâm cá trong vaccine”

Nội dung thực hiện:

1 Nghiên cứu con đường xâm nhiễm của vi khuẩn Streptococcus iniae vào cá

chẽm

2 Đánh giá khả năng phòng bệnh do Streptococcus iniae gây ra bằng cách

ngâm cá trong vaccine

Mục tiêu của đề tài: Xác định con đường xâm nhập, phát triển của S iniae vào

cá chẽm Lates calcarifer và hiệu quả của vaccine dẫn truyền bằng phương pháp ngâm trong phòng trị bệnh do S iniae gây ra trên đối tượng này, từ đó làm cơ sở

khoa học cho những nghiên cứu tiến tới hoàn thiện quy trình sản xuất và sử dụng vaccine phòng bệnh Streptococcosis trên cá chẽm ở Việt Nam

Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn, kiến thức còn hạn chế và bước đầu làm quen với phương pháp nghiên cứu khoa học nên đồ án khó tránh khỏi những sai xót Kính mong các thầy cô cùng bạn đọc đóng góp ý kiến để đồ án được hoàn thiện hơn

PHẦN 1: TỔNG QUAN

1.1 Một số đặc điểm sinh học của cá chẽm

Cá Chẽm có hệ thống phân loại như sau:

Ngành: Chordata

Lớp: Actinopterygii

Bộ: Perciformes

Họ: Centropomidae

Giống: Lates Hình 1.1 Cá chẽm Lates calcarifer

Loài: Lates calcarifer (Bloch, 1790)

Tên tiếng Việt: Cá chẽm, cá vược

Tên tiếng Anh: Sea bass, Barramundi, Giant seaperch [9]

Cá chẽm có thân hình thon dài và dẹp bên, cuống đuôi khuyết sâu Chiều dài thân bằng 2,7 – 3,6 lần chiều cao Đầu nhọn, nhìn bên cho thấy phía trên hơi lõm xuống ở giữa và hơi lồi ở lưng Miệng rộng và hơi so le, hàm trên kéo dài đến phía dưới sau hốc mắt Răng dạng nhung, không có răng nanh, trên nắp mang

có gai cứng, vây lưng gồm có 2 vi: vi trước có 7-9 gai cứng và vi sau có 10-11 tia mềm Vi hậu môn có 3 gai cứng, vi đuôi tròn và có hình quạt Vẩy dạng lược và có kích cỡ vừa phải, có 61 vẩy đường bên

Khi cá còn khoẻ, trên mặt lưng có màu nâu, mặt bên và bụng có màu bạc khi sống trong môi trường nước biển, màu nâu vàng khi sống trong môi trường nước ngọt Khi cá ở giai đoạn trưởng thành sẽ có màu xanh lục hay vàng nhạt trên lưng

và màu vàng bạc ở mặt bụng

Cá chẽm phân bố rộng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc tây Thái Bình Dương và Ấn Độ Dương, từ Đông Phi đến Papua New Guinea, từ nam Trung Quốc, Đài Loan đến Bắc Úc Tại Việt Nam, cá chẽm có thể được tìm thấy ở vịnh Bắc bộ,

vùng biển Trung và Nam Bộ

Về khả năng thích ứng với các yếu tố sinh thái, cá chẽm là loài có khả năng thích ứng rộng với sự thay đổi độ mặn, cá giai đoạn giống và trưởng thành sống được ở độ mặn từ 0 – 35 ppt và có thể chịu đựng tốt với sự thay đổi độ mặn đột ngột Thực tế cho thấy cá giống cỡ 2 – 3 cm có thể thuần hóa từ độ mặn 30 – 32 ppt

xuống 5 – 10 ppt trong 2 – 3 giờ (Kungvankij et al 1984; Tucker, 2000) [1] Vì vậy, đây là loài rất thích hợp cho phát triển nuôi cả trong nước ngọt, nước lợ cũng

như nuôi biển (Kungvankij et al 1984; Schipp, 1996) [1] Cá chẽm có thể thích ứng

với nhiệt độ từ 21 – 39oC, thích hợp nhất 27 – 30oC Nhiệt độ thay đổi đột ngột

2 – 3oC có thể gây sốc cho cá giống (Tucker, 2000) [ 1] Độ pH thích hợp cho cá từ 7,0 – 8,5; DO 4 -9 ppm; NH3-N < 0,025 ppm, H2S < 0,3 ppm (Kungvankij et al

1984) [9]

Cá chẽm là loài cá dữ, ăn mồi sống và có khả năng ăn thịt đồng loại, đặc biệt tỉ

lệ chết do ăn nhau cao nhất ở giai đoạn từ 1 – 10 cm Ngoài tự nhiên, thức ăn của cá chẽm gồm cá nhỏ, tôm, cua, mực…

Cá chẽm là loài có kích thước lớn, khối lượng tối đa có thể đạt 60 kg Cá tăng trưởng chậm ở giai đoạn đầu, khi đạt 20 – 30 g tốc độ tăng trưởng nhanh hơn và chậm lại khi đạt khoảng 4 kg Cá bột mới nở có chiều dài 1,49 mm, sau 40 ngày đạt

cỡ 17,4 mm, 50 ngày đạt 28,9 mm, 90 ngày đạt chiều dài 93 mm, khối lượng là 9 g

(Kungvankij et al 1984)[1] Trong điều kiện nuôi, cá giống cỡ 2 – 2,5 cm sau thời gian ương từ 30 – 45 ngày đạt cỡ 5 – 11 cm, sau từ 6 đến 24 tháng nuôi thương phẩm cá đạt 0,35 – 3 kg (Schipp, 1996)[1] Cá chẽm nuôi tại Úc dễ dàng đạt > 0,6

kg sau 12 tháng nuôi Tại các vùng có nhiệt độ cao, cá có thể đạt 0,8 kg sau 12

tháng, 3 kg sau 18 – 24 tháng (Tucker et al 2002)[1]

1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh Streptococcosis trên cá

1.2.1 Bệnh Streptococcosis

Streptococcosis là một bệnh thường gặp ở người, động vật trên cạn và cả ở động vật thủy sản Ở cá, Streptococcosis được xem là một phức hợp các bệnh giống

nhau được gây ra bởi các loài vi khuẩn khác nhau Bệnh được phát hiện xảy ra đầu tiên ở châu Á vào năm 1957 trên cá hồi Oncorhynchus mykiss tại Nhật Bản

(Hoshina et al 1958) [28] Từ đó, bệnh đã không ngừng lan rộng cả về quốc gia

phân bố, loài cá cảm nhiễm và trở thành một bệnh nhiễm khuẩn gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho các quốc gia nuôi trồng thủy sản trên thế giới

Phân lập vi khuẩn từ các loài cá bệnh khác nhau và phân loại dựa vào lai

đoạn DNA của chuỗi 16S cho thấy có ít nhất 6 loài Streptococcus khác nhau Streptococcus parauberis, S iniae (S shiloi), S difficilis (S agalactiae), Lactococcus garvieae (Enterococcus seriolicida), L piscium và Vagococcus salmoninarum (Mata et al 2004) [25] Trong những thông báo đầu tiên, các chủng

vi khuẩn gây bệnh này được phân chia làm 3 nhóm dựa vào đặc điểm dung huyết:

dung huyết α, dung huyết β (Boom-ker et al 1979; Kitao et al 1981) và dung huyết

γ (Plumb et al 1974; Rasheed et al 1985; Baya et al 1990) [16], [27] Ngày nay, người ta chia những vi khuẩn này thành hai nhóm dựa vào độc lực của vi khuẩn theo nhiệt độ Trong đó, L Garvieae, S iniae, S agalactiae và S parauberis

được xem là các tác nhân gây bệnh Streptococcosis cho các loài cá nước ấm với việc gây chết ở nhiệt độ trên 15oC, còn L piscium và V salmoninarum là những

tác nhân gây bệnh Streptococcosis nước lạnh [27] Các vi khuẩn gây bệnh ở vùng nước ấm được xem là những tác nhân tiềm năng có khả năng gây bệnh cho người

1.2.2 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus iniae gây ra trên cá

S iniae là những vi khuẩn hình cầu, có đường kính lên đến 1,5 µm, các tế

bào thường ghép với nhau tạo thành chuỗi liên cầu Những liên cầu khuẩn này thuộc vi khuẩn Gram (+), không sinh bào tử, không di động, có phản ứng oxidase

và catalase âm tính Vi khuẩn sinh trưởng trong các môi trường tổng hợp như TSA, BHIA hình thành các khuẩn lạc tròn nhỏ có đường kính 1 - 2 mm sau 24 - 48h nuôi cấy ở 15 - 37oC, trong môi trường TSB vi khuẩn kéo dài thành chuỗi (Bromage at

al 1999; Romalde et al 2009) Nuôi cấy trên môi trường thạch có bổ sung 5% máu

cừu cho phản ứng dung huyết α hay β (Pier and Madin, 1976; Eldar et al 1995;

Bromage et al 1999; Suanyuk et al 2010)

S iniae là một trong những tác nhân chính gây bệnh ở động vật thủy sản, vi

khuẩn này được phân lập đầu tiên vào năm 1976 trên cá heo nước ngọt vùng

Amazon Inia geoffrensis, đến năm 1979 thì phát hiện đầu tiên trên cá nuôi, loài cá nhiễm bệnh là cá yellowtail Seriola spp ở Nhật Bản (Pier and Madin, 1976; Minami et al 1979) [16] Chỉ một thời gian ngắn sau đó, tác nhân này đã lây lan khắp Nhật Bản và nhiều quốc gia khác, cảm nhiễm nhiều ký chủ khác nhau Streptococcus iniae được xem là tác nhân gây bệnh chủ yếu ở cá rô phi Oreochromis niloticus x O aureus (Al-Harbi, 1994; Perera et al 1994), striped bass hybrids Morone saxatilis (Evans et al 2000), cá hồi Oncorhynchus mykis (Hoshina

et al 1958; Bragg và Broere, 1986; Ceschia et al 1992) [16], [25] Ngoài ra, một số loài cá biển như yellowtail Seriola spp (Kitao, 1982), cá bơn ở Nhật Bản

labrax) và cá đù đỏ (Sciaenops ocellatus) (Eldar et al 1999) ở Israel, gần đây là cá chẽm (Latex calcarifer) ở Australia (Bromage et al 1999), cá giò (Rachycentron canadum ) cũng đã được thông báo là phân lập được vi khuẩn này Theo thống kê

đến năm 2007, đã có trên 27 loài cá nước ngọt và nước mặn nhiễm bệnh do vi khuẩn này gây ra [28] Các quốc gia được thông báo chịu ảnh hưởng nặng nề của bệnh như Nhật Bản, Irasel, Mỹ, Australia

Những loài cá khác nhau khi bị nhiễm vi khuẩn Streptococcus iniae biểu

hiện những dấu hiệu khác nhau, tuy nhiên đều xuất hiện một số dấu hiệu chung, bao gồm: Màu sắc đen tối, mắt cá lồi và đục, xuất huyết ở các gốc vây và xương nắp

mang, cá mất thăng bằng, bơi lội không bình thường (Perera et al 1994; Bromage

et al 1999; Eldar et al 1999; Colorni et al 2002) [25] Các vết xuất huyết lan rộng

thành lở loét, nhưng các vết loét thường nông hơn các bệnh có lở loét khác Dấu hiệu điển hình của bệnh là cá vận động khó khăn, bơi xoắn, không định hướng, xoang bụng tích dịch, xuất huyết các cơ quan nội quan, thận và lá lách tăng lên về

thể tích do phù nề (Bromage et al 1999; Suanyuk et al 2011) Kiểm tra mô học cho

thấy các biến đổi rõ rệt trong gan, thận, lách, tim, mắt và não Gan, thận và tim thể hiện phản ứng viêm nghiêm trọng Trong mô gan, các mao mạch gia tăng về kích thước, xuất hiện nhiều các tế bào lympho, các tế bào gan xuất hiện nhiều không

bào, thoái hóa và hoại tử (Suanyuk et al 2011) Màng tim phình to với sự xuất hiện

nhiều các tế bào lympho và các trung tâm Melanomacrophage Lách, não thể hiện

sự thâm nhập lượng lớn các tế bào lympho và sự tắc nghẽn nội mạch thường xuyên chứng tỏ sự suy giảm các sợi fibrin trong các mao mạch (Bromage và Owen, 2002)

Bệnh có thể xảy ra ở dạng cấp tính hay bán cấp tính, ở dạng bán cấp tính cá thể hiện các dấu hiệu bệnh lý bên ngoài đặc trưng của bệnh, nhưng nội quan không

bị tổn thương, dạng này tỷ lệ chết chỉ chiếm 1% Ở dạng cấp tính, cá chết với tỷ lệ chết cao chủ yếu xảy ra trong đêm nhưng biểu hiện rất ít dấu hiệu bệnh lý bên ngoài (Bromage và Owen, 2002) Bệnh Streptococcosis tác động trên cá ở bất kỳ tuổi và kích thước khác nhau, có thể xảy ra trong bất kỳ giai đoạn nào trong quá trình nuôi

Bệnh lan truyền theo chiều ngang có thể xảy ra thông qua nguồn nước hay thông qua thức ăn chứa mầm bệnh…Trong cảm nhiễm thực nghiệm, cá có thể bị nhiễm bệnh thông qua phương pháp tiêm, ngâm, cho ăn hay sống với những sinh vật mang mầm bệnh Mang, da, hệ thống tiêu hóa, hệ thống khứu giác được xem là

những vị trí xâm nhập của S iniae Tuy nhiên, con đường xâm nhiễm, phát triển và

lây lan bệnh khác nhau tùy theo phương pháp cảm nhiễm và loài cá Trên cá rô phi,

Pereral et al (1997) cho rằng S iniae có thể gây bệnh thông qua phương pháp ngâm hay cho ăn Nghiên cứu sâu hơn của Evans et al (2000) trên đối tượng này đã cho

thấy mang và cơ quan khứu giác là hai vị trí xâm nhập vi khuẩn, vi khuẩn phát triển rất nhanh sau khi xâm nhập, xuất hiện trong máu, não và thận sau 12h Trên cá bơn Nhật Bản, mang là vị trí xâm nhiễm khi cảm nhiễm bằng phương pháp ngâm, vi khuẩn cũng xâm nhập qua ruột khi cho ăn thức ăn gây bệnh nhưng chỉ ở liều gây nhiễm cao (Nguyen, 2000) Trên cá chẽm, Bromage và Owen (2002) tiến hành cảm nhiễm bệnh bằng những phương pháp khác nhau, kết quả cho thấy cảm nhiễm bằng phương pháp ngâm và cho ăn đều cho tỷ lệ chết cao, tuy nhiên ở phương pháp ngâm bệnh xảy ra ở dạng cấp tính, phương pháp cho ăn gây bệnh ở dạng mãn tính Cũng trong thí nghiệm này, hai ông đã chứng minh được những vết thương trên da không

phải là vị trí xâm nhiễm của S iniae trên cá chẽm, nhưng vị trí xâm nhiễm chủ yếu

chưa được xác định

1.2.2 Bệnh do Streptococcus iniea gây ra trên cá chẽm

Bệnh do S iniae gây ra trên cá chẽm Lates calcarifer đã được thông báo xảy

ra từ rất sớm vào giữa những năm 1980: Singapore là quốc gia đầu tiên báo cáo sự xuất hiện bệnh trên cá chẽm, bệnh được thông báo đồng thời với dịch bệnh nghiêm

trọng do vi khuẩn này gây ra trên cá dìa (Singanus canaliculatus), mặc dù dịch bệnh gây chết lên đến 100% trên cá dìa nhưng trên cá chẽm tỷ lệ chết lại rất thấp (Foo et al.1985) [10] Trung Quốc là quốc gia thứ hai thông báo bệnh Streptococcosis trên

cá chẽm với tỷ lệ chết từ 16.7- 32.6%, tuy nhiên chưa xác định được loài Streptococcus gây bệnh (Huang et al, 1990) [10] Ở Australia, từ năm 1992,

Streptococcus iniae đã gây bệnh vào mỗi hè với thiệt hại khoảng 8-15% sản lượng

cá chẽm nuôi lồng trên biển hàng năm, thậm chí thiệt hại có thể lên 70% khi bệnh

bùng phát dữ dội (Bromage et al 1999) Kết quả thử nghiệm cảm nhiễm chủng S iniae ở cá chẽm cho thấy tỉ lệ tử vong cao với tỷ lệ chết tích lũy lớn hơn 75% (Bromage et al 1999) Vào năm 2003 và 2004, S iniae cũng đã được thông báo gây

tác động nghiêm trọng đến nghề nuôi cá chẽm ở khu vực phía Nam Thái Lan

(Suanyuk et al 2010) Ngoài ra còn có các báo cáo về bệnh xảy ra trên cá chẽm ở

Port Hurt, đảo Bathhurst (2005) với những dấu hiệu đặc trưng như đã nêu trên [3]

Ở Việt Nam, bệnh cũng đã xuất hiện với thông báo của Hich và Duzng (2011) về phân lập được vi khuẩn này trên cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa

1.3 Vaccine

Ngành nuôi trồng thủy sản thế giới ngày càng phát triển, với sự tác động của con người cùng hàng loạt mô hình nuôi thâm canh và siêu thâm canh ra đời đã làm tăng hiệu suất trong nuôi trồng thủy sản, tuy nhiên một hệ quả kéo theo là sự mất cân bằng sinh thái, dịch bệnh xảy ra ngày càng nhiều hơn đã gây tổn thất không nhỏ cho người nuôi Việc sử dụng kháng sinh để kiểm soát bệnh nhiễm khuẩn - một trong những nguyên nhân gây thiệt hại nặng nề cho nghề nuôi trồng thủy sản, là một phương pháp truyền thống, tuy nhiên bên cạnh hiệu quả chữa trị thì việc dùng kháng sinh còn kéo theo những mối nguy hại trực tiếp cho môi trường và cho sức khỏe con người khi hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn càng gia tăng Trong bối

cảnh đó, sử dụng vaccine được xem là một giải pháp tối ưu cho sự phát triển nghề nuôi trồng thủy sản bởi vì đây là một phương pháp hiệu quả để kiểm soát nhiều bệnh nguy hiểm Mặt khác, mục tiêu chính của dùng vaccine là để ngăn ngừa bệnh, trong khi dùng kháng sinh là để trị bệnh.Vì thế khi dùng vacxin có thể giảm thiểu việc sử dụng thuốc kháng sinh trong qua trình nuôi, tăng năng suất nuôi và đảm bảo

vệ sinh an toàn thực phẩm, từ đó góp phần vào việc tạo ra các sản phẩm đạt tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm

Nguyên lý sản xuất và sử dụng vaccine là đưa vào cơ thể cá kháng nguyên có nguồn gốc từ vi sinh vật gây bệnh hoặc vi sinh vật có cấu trúc kháng nguyên gần giống với vi sinh vật gây bệnh, đã được bào chế đảm bảo độ an toàn cần thiết để kích thích sự đáp ứng của hệ miễn dịch đặc hiệu của cá chống lại tác nhân gây bệnh

và bảo vệ cơ thể [4] Theo nguyên lý trên, có các loại vaccine gồm: Vaccine bất hoạt, vaccine nhược độc (vaccine sống), vaccine tiểu phần và DNA vaccine được dẫn truyền thông qua 3 đường: tiêm, dẫn truyền qua da, dẫn truyền qua miệng Mỗi loại vaccine và mỗi cách dẫn truyền đều có những lợi, bất lợi nhất định về hiệu quả bảo vệ, các tác dụng phụ lên cá, chi phí thực hiện Hiện tại, hầu hết vaccine dùng trong nuôi trồng thủy sản là vaccine bất hoạt của một hay nhiều tác nhân, có thể bảo

vệ một hay nhiều bệnh, các vaccine này được dùng kết hợp với chất bổ trợ như nhũ tương dầu, β(1,3/1,6)–glucan Phương pháp tiêm là phương pháp hiệu quả cao, được dùng rộng rãi, tuy nhiên phương pháp ngâm là phương pháp có thể được ưa thích hơn trong tương lai

1.3.1 Tình hình nghiên cứu phát triển vacxin ở cá trên thế giới

Vaccine phòng bệnh trong nuôi trồng thủy sản được bắt đầu nghiên cứu và phát triển từ những năm 40 với thông báo đầu tiên về vacxin của Duf (1942) khi thử

nghiệm cho ăn vaccine bất hoạt Aeromonas salmonicida ở cá hồi Oncorhynchus clarki Sau đó, vào những năm 1970 là những nghiên cứu của Mỹ về vaccine nhược

độc dạng ngâm để bảo vệ đàn cá nuôi chống lại bệnh Vibriosis Đến thập kỷ 80, vaccine được nghiên cứu ở Na Uy khi ngành công nghiệp nuôi cá hồi nước này gặp

nhiều tổn thất lớn mà tác nhân gây bệnh chính là vi khuẩn Vibrio spp., sử dụng

vaccine đã cho kết quả tốt, lượng kháng sinh sử dụng đã giảm đi rất đáng kể Sau

đó, một lọai vi khuẩn mới (Aeromonas salmonicida) lại xuất hiện, vaccine sử dụng

theo phương pháp ngâm không mang lại hiệu quả bảo vệ nên đến những năm 1990 vaccine sử dụng theo phương pháp tiêm kết hợp cùng chất bổ trợ ra đời Vài năm tiếp sau đó, nhiều loại chất bổ trợ cùng những kháng nguyên tái tổ hợp được tiến hành thử nghiệm Ngày nay, vaccine đã được sử dụng rộng rãi trên thế giới, đặc biệt

ở các vùng nuôi cá hồi công nghiệp của các nước Bắc Âu, Chile, Canada, Mỹ, Nhật; các trang trại nuôi cá da trơn ở Mỹ, mô hình nuôi cá chẽm, cá rô phi ở Châu Âu hay các mô hình nuôi nhỏ ở Trung Quốc, Nga, Tây Ban Nha và Đức Từ vaccine thương

mại được cấp phép đầu tiên ở cá là vaccine Yersinia ruckeri bất hoạt chống lại bệnh

viêm đỏ miệng được dẫn truyền bằng phương pháp ngâm trên cá hồi thì cho đến

tháng 7 năm 2005, đã có 35 loại vaccine phòng bệnh vi khuẩn và 2 loại vaccine phòng bệnh virut được đăng ký bản quền và sử dụng cho 6 đối tượng nuôi phổ biến trên 41 quốc gia trên thế giới bao gồm cá hồi, cá chẽm châu Âu, cá chẽm châu Á, cá

rô phi, cá turbot, và cá bơn đuôi vàng (Klesius và Shoemaker, 2009) [4] Bên cạnh

đó 5 loại vaccine phòng bệnh virus trên động vật thủy sản khác đang được nghiên

cứu và phát triển

1.3.2 Tình hình nghiên cứu vaccine phòng bệnh Streptococcosis trên cá

Những nghiên cứu kiểm soát bệnh Streptococcosis đã được thực hiện trong suốt bốn thập kỷ kể từ khi bệnh được phát hiện đầu tiên trên cá, trong đó có vaccine Vaccine phòng bệnh Streptococcosis được nghiên cứu đầu tiên vào năm

1982, vaccine được dùng là vaccine bất hoạt formaline dẫn truyền bằng phương

pháp tiêm phòng bệnh do L garvieae gây ra ở cá yellowtail Vaccine này đã cho hiệu quả bảo vệ cao với tỷ lệ sinh tồn tương đối RPS đạt 70% (Idia et al 1982) [27] Sau sự thành công này, các nghiên cứu vaccine phòng bệnh do L garvieae trên một

số đối tượng Oncorhynchus mykiss , yellowtail Seriola spp và vaccine phòng bệnh

do những loài Streptococcus khác tiếp tục được phát triển

Vaccine đầu tiên phòng bệnh do S iniae gây ra là vaccine bất hoạt formaline

trên trên cá hồi Oncorhynchus mykiss ở Israel, được dẫn truyền bằng phương pháp

tiêm xoang bụng (Bercovier et al 1997; Eldar et al.1997) Vaccine này đã đem lại

kết quả thành công từ 1995 đến năm 1997 khi cá 50 g được chủng ngừa cho hiệu quả bảo vệ hơn bốn tháng trong điều kiện thí nghiệm và ngoài thực nghiệm, với tỷ

lệ chết hàng năm gây ra bởi S iniae đã giảm từ 50% đến ít hơn 5% (Bercovier et

al 1997) Tuy nhiên, một thời gian ngắn sau đó vaccine dường như không hiệu quả

khi bệnh Streptococcosis lại bùng nổ, nguyên nhân được xác định là do một dạng khác của vi khuẩn này, với kết cấu vỏ khác và với vị trí xác định kháng nguyên

khác nhau (Bachrach et al 2001)

Tiếp theo đó, vaccine phòng bệnh do S iniae gây ra trên cá rô phi được phát triển và đã cho hiệu quả bảo vệ cao Đầu tiên là nghiên cứu của Bercovier et al

(1997), ông thực hiện vaccin bất hoạt dẫn truyền bằng phương pháp tiêm xoang bụng, hiệu quả bảo vệ cao với RPS đạt 80-90% Sau nghiên cứu này, vaccine trên

cá rô phi được phát triển theo hướng mở rộng các phương pháp dẫn truyền và tăng hiệu quả bảo vệ với vaccine được bổ sung thêm các chất kích thích miễn dịch

Shoemaker et al (2006) thông báo hiệu quả bảo vệ RPS đạt đến 100% khi sử dụng

vaccine bổ sung chất kích thích miễn dịch được dẫn truyền bằng phương pháp tiêm xoang bụng, tuy nhiên khi dẫn truyền bằng phương pháp cho ăn hiệu quả chỉ đạt

63% Đến năm 2011, sau đợt bùng phát bệnh do S iniae gây ra ở cá rô phi Thái

Lan, Suanyuk và Itsaro cũng đã tiến hành nghiên cứu vaccine phòng bệnh trên đối tượng này, kết quả cho thấy một tuần sau khi dẫn truyền vaccine, nghiệm thức dùng vaccine bất hoạt formallin có bổ sung β(1,3/1,6)–glucan dẫn truyền bằng phương pháp tiêm cho hiệu quả bao vệ cao nhất RPS đạt 95.12%; nghiệm thức chỉ dùng vaccine bất hoạt dẫn truyền bằng phương pháp tiêm xoang bụng cho hiệu quả bảo

vệ đạt 80,49%; nghiệm thức dùng vaccine ngâm cho hiệu quả bảo vệ 41.46% và nghiệm thức dẫn truyền vaccine bằng phương pháp cho ăn cho hiệu quả thấp chỉ 9,75%

Trên cá chẽm, vaccine phòng bệnh S.iniae được nghiên cứu đầu tiên ở

Australia vào năm 2006 với các nghiên cứu của Creeper và Buller,

Delamare-Deboutteville et al. Kết quả khả quan về đáp ứng miễn dịch dịch thể trên đối tượng

này đã được thông báo khi dẫn truyền vaccine bất hoạt bằng phương pháp tiêm xoang bụng với một lượng lớn kháng thể đặc hiệu được tìm thấy trong cả dịch nhầy

và huyết thanh sau 21 ngày, ở phương pháp ngâm đáp ứng miễn dịch dịch thể mạnh

mẽ được tìm thấy trong dịch nhầy (Delamare- Deboutteville et al 2006) Tuy nhiên,

khi áp dụng vaccine ngoài thực nghiệm thì gặp một số hạn chế khi cá lại bị cảm nhiễm bệnh sau vài tuần dẫn truyền vaccine (Agnew and Barnes, 2007)

Với hơn 25 năm phát triển vacxin chống Streptococcosis, đã có nhiều nghiên cứu vaccine trên nhiều loài Streptococcus khác nhau và trên những loài cá khác nhau như cá hồi Oncorhynchus mykiss (Bercovier et al 1997; Eldar et al 1997b), cá chẽm (Delamare-Deboutteville et al 2006), cá rô phi (Bercovier et al 1997; Shoemaker et al 2006; Suanyuk và Itsaro, 20110), yellowtail (Idia et al 1982; Ooyama et al 1999) và cá bơn Nhật Bản (Shin et al 2007b; Shutou et al

2007) [27] Một số vaccine thương mại đã được đưa ra thị trường như vaccine

phòng bệnh S iniae dùng cho cá chẽm châu Á của Intervet, vacxin dùng cho cá rô

phi của Schering-Plough [27]

Tùy theo từng loài cá, loài vi khuẩn, loại vaccine, phương pháp dẫn truyền, tuổi cá cũng như việc dùng các chất kích thích miễn dịch kèm theo mà có sự khác nhau trong hiệu quả bảo vệ khi dùng vaccine phòng bệnh Streptococcosis Khoảng thời gian bảo vệ sau khi dẫn truyền có sự khác nhau trên một số loài cá : báo cáo

cho thấy trong khi vaccine phòng bệnh do L garvieae và S iniae gây ra cho hiệu

quả bảo vệ cao trong khoảng 3-6 tháng ở cá hồi O mykiss khi chủng ngừa trong

điều kiện thí nghiệm (Bercovier et al 1997; Eldar et al 1997), thì cả vaccine ngăn ngừa bệnh do L garvieae và S parauberis đều cho hiệu quả bảo vệ cao trong một thời gian dài với cá yellowtail và cá bơn (Romalde et al 2009) Bên cạnh đó, hầu

hết các vaccine phòng bệnh Streptococcosis đều cho hiệu quả cao trong bảo vệ khi dẫn truyền bằng phương pháp tiêm xoang bụng, các phương pháp khác hiệu quả bảo

vệ không cao Vì thế thời gian bảo vệ ngắn hay sự hạn chế trong phương pháp dẫn truyền là một trong những lý do hạn chế sự phát triển và ứng dụng vaccine này

Mặc dù, công nghệ vaccine ở cá mới ở giai đoạn đầu của sự phát triển, nhưng những thành tựu mà nó đã đạt được là đáng chú ý kể cả trên lĩnh vực nghiên cứu khoa học hay ứng dụng vào sản xuất sản phẩm thương mại Khoa học phát triển vaccine ở cá sẽ tiếp tục phát triển hoàn thiện hơn những sản phẩm vaccine Vì vậy, bên cạnh việc kết hợp giữa chủng ngừa vaccine và chọn lựa cá kháng bệnh để nâng cao việc kiểm soát bệnh, thì các nghiên cứu sâu về vaccine như phát triển những dạng vaccine hiệu quả (vaccine bổ sung các chất bổ trợ, vaccine tạo từ những kháng nguyên tinh khiết) hay thiết kế những phương pháp dẫn truyền hiệu quả hơn là xu hướng phát triển vaccine ở cá nói chung và vaccine phòng bệnh Streptococcosis trên thế giới trong thời gian tới

1.3.3 Tình hình nghiên cứu và triển vọng sử dụng vacxin ở Việt Nam

Trong bối cảnh nghề nuôi trồng thủy sản Việt Nam ngày càng phát triển, dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản cũng ngày càng thường xuyên hơn và những tổn thất kinh tế lớn do dịch bệnh gây ra, việc sản xuất và sử dụng vaccine để quản lý dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản ở nước ta là điều cần thiết Trong thời gian qua, tại Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu, phát triển và ứng dụng vaccine vào nuôi trồng thủy sản như đề tài sản xuất vaccine cuả Bộ Thủy Sản, đề tài sản xuất vaccine bất hoạt phòng bệnh xuất huyết trên cá trắm cỏ, đề tài nghiên cứu tạo vaccine phòng bệnh đốm trắng trên cá tra của Viện nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản

II Ngoài ra, một số công ty nước ngoài cũng đang nghiên cứu sản xuất và thử nghiệm vaccine phòng bệnh cho cá tra, cá điêu hồng và cá giò…[4] Vào năm 2011,

vaccine thương mại đầu tiên cho cá ở ViệtNam đã được phép thử nghiệm, đó là

vaccine ALPHA JECT Panga 1 trên cá tra của công ty Pharmaq Trên cá chẽm, cùng với các công trình nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất giống và nuôi thương phẩm, các nghiên cứu về bệnh thì những nghiên cứu sâu về đặc điểm miễn

phòng bệnh do S iniae gây ra trên đối tượng này

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu

 Đối tượng nghiên cứu: Cá chẽm Lates calcarifer (Bloch, 1790)

 Thời gian nghiên cứu: Từ ngày 20/2/2012 đến 02/06/2012

 Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm nghiên cứu Giống và Dịch bệnh thủy sản, trường Đại học Nha Trang

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Môi trường

- Môi trường tổng hợp bổ sung 2% NaCl: TSA (Tryptic Soy Agar), TSB (TrypticSoy Broth), BA (Blood Agar) có bổ sung 5% máu cừu

- Môi trường Nutrient Broth ở các nồng độ muối khác nhau: 0 ppt, 10 ppt,

30 ppt, 40 ppt, 50 ppt để kiểm tra khả năng chịu mặn của vi khuẩn

- Môi trường Manitol để kiểm tra khả năng di động và lên men đường manitol của vi khuẩn

- Test API Strep để thử đặc điểm sinh hóa của các chủng liên cầu khuẩn

2.2.2 Hóa chất

2.2.2.1 Hóa chất sản xuất vaccine, xác định đặc điểm sinh hóa

- Thuốc thử kèm theo API Strep test kit; H2O2 để thử phản ứng Catalase

- Giấy tẩm hóa chất Tetramethyl Phenylenediamine Edihydroclorid để thử phản ứng Oxidase

- Nước muối sinh lý, dầu soi kính, cồn tuyệt đối

- Formalin 40% (w/v)

2.2.2.2 Hóa chất nhuộm mô hóa miễn dịch

- Paraffin, dung dịch Buffered Formallin 10% (v/v)

- H2O2 (30%); Metanol; Etanol; Xylen; Bom Canada

- Dung dịch Phosphate buffered saline (PBS); dung dịch Tris Buffered Saline (TBS); 3,3’-Diaminobenzidinetetrahydrochloride (DAB) ; Hematoxylin

- Mabs; huyết thanh dê; kháng thể Ig G gắn với HRP

2.2.3 Dụng cụ, thiết bị

2.2.3.1 Nuôi cấy vi khuẩn, sản xuất vaccin và cắt mô

- Tủ ấm, tủ lạnh, tủ sấy, nồi áp suất, kính hiển vi, bếp điện, máy ly tâm thể tích lớn, máy cắt mô Microtone

- Hộp lồng, que cấy đầu tròn, đầu nhọn, que cấy chan

- Micropipette, đầu cồn

- Đèn cồn, lam, lamen

- Bông không thấm nước, etiket

2.2.3.2 Xác định hiệu quả vaccin

- 500 con cá chẽm giống cỡ 2-4 cm, nguồn gốc từ trung tâm Giống và Dịch bệnh, trường Đại học Nha Trang

- Bể 2m3, hệ thống cung cấp khí, vợt cá và một số dụng cụ khác

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu (Hình 2.1)

2.3.2 Kiểm tra một số đặc điểm sinh hóa của hai chủng Streptococcus iniae

Vi khuẩn được dùng trong nghiên cứu này là hai chủng vi khuẩn

Streptococcus iniae ký hiệu Strep1, Strep2 được cung cấp từ dự án SRV2701

Những chủng vi khuẩn này trước đó được phân lập từ cá chẽm bệnh ở Khánh Hòa

và lưu giữ trong TSB bổ sung 20% Glycerol ở -80oC

Kiểm tra đặc điểm sinh hóa bằng API Strep kit và kết hợp kiểm tra bổ sung một số đặc điểm sinh hóa bằng phương pháp truyền thống: Manitol di động,

catalase, oxidase, khả năng chịu đựng nồng độ muối

Hình 2.1: Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu

2.3.3 Nuôi cấy vi khuẩn và chuẩn bị vacxin Streptococcus iniae bất hoạt

Để sản xuất vaccine, mỗi chủng vi khuẩn được nuôi cấy thuần trong môi trường TSA bổ sung 2% NaCl ở 27oC trong 24h, tiến hành nuôi tăng sinh trong

Nghiên cứu con đường xâm nhiễm của vi khuẩn Streptococcus iniae vào cá

chẽm (Lates cacarifer) và đánh giá khả năng phòng bệnh của vacxin dẫn

truyền bằng phương pháp ngâm

Nghiên cứu con đường xâm nhiễm

qua phương pháp mô hóa miễn dịch

Đánh giá vacxin dẫn truyền bằng phương pháp ngâm

Đánh giá tính an toàn

Đánh giá hiệu quả bảo vệ

Kết luận

Tỷ lệ chết do dẫn truyền

Đánh giá tốc

độ sinh trưởng đặc trưng

Tỷ lệ sinh tồn tương đối RPS (%)

2000 mL TSB bổ sung 2% NaCl ở 27oC trong 24h Sau đó, dung dịch formalline 40% (w/v) được cho dung dịch vi khuẩn để đạt nồng độ 0.5% (v/v) và ủ trong 24h ở

27oC Tiến hành ly tâm (400 x g ) trong 30 phút, rửa trong nước muối sinh lý 0.85%

và tạo dịch huyền phù Mật độ vi khuẩn trong dung dịch huyền phù được đo bằng phương pháp sắc ký ở bước sóng 550 nm với độ hấp thụ quang OD550= 2.9, tương ứng với nồng độ 2.75 x 108 tế bào/mL

Chủng Strep1 được dùng làm chủng vi khuẩn để xác định LD50 (%), cảm nhiễm ngược và bố trí thí nghiệm xác định con đường xâm nhiễm Vi khuẩn được nuôi cấy tăng sinh trong TSB + 2% NaCl ở 27oC trong 24h và tiến hành ly tâm ở

(400 x g) trong 30 phút để thu được vi khuẩn sống Vi khuẩn sau khi ly tâm sẽ được

rửa và tạo dịch huyền phù trong nước muối sinh lý Tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng 550 nm để xác định mật độ vi khuẩn

2.3.4 Phương pháp xác định con đường xâm nhiễm bằng phương pháp thực

Làm mất nước và mềm mẫu

Thấm parafin

và đúc mẫu

Cắt mẫu bằng máy Microtone

Nhuộm mô hóa miễn dịch

Gắn tiêu bản bằng bom-Canada

Đọc tiêu bản

dưới kính

hiển vi quang

học

2.3.4.1 Bố trí thí nghiệm và thu mẫu

30 cá chẽm kích cỡ 3 cm được ngâm trong dịch huyền phù có chứa vi khuẩn

Streptococcus iniae nồng độ107 CFU/mL trong 60 phút Sau đó, đưa cá trở lại nuôi trong nước biển 31-33 ppt, nhiệt độ ở 26-29oC và cho ăn thức ăn công nghiệp Tiến hành thu mẫu cá sau 6h, 12h, 24h, 48h, 72h và 96h; mỗi lần thu 3 con và cố định trong dung dịch Buffered Formallin 10% trong 24h để cắt mô

2.3.4.2 Xử lý mẫu

Mẫu cá sau khi thu được cố định trong dung dịch Buffered Formallin 10% (v/v) trong 24h, sau đó tiến hành xử lý, đổ paraffin, cắt lát và nhuộm mẫu

Xử lý và đổ parafin: Áp dụng quy trình xử lý mẫu và đổ paraffin theo

phương pháp mô bệnh học được được mô tả trong tài liệu “Một số phương pháp nghiên cứu và chẩn đoán bệnh ở động vật thủy sản” của Đỗ Thị Hòa 2005 (Tài liệu

lưu hành nội bộ) Sau khi xử lý, khối parafin được giữ lạnh trước khi được cắt bằng máy Microtone, lát cắt có độ dày 3-7 µm và nhuộm theo quy trình mô hóa miễn dịch

2.3.4.3.Quy trình nhuộm mô hóa miễn dịch

 Ngâm trong Xilen 2 lần, mỗi lần 5 phút

 Ngâm trong cồn ethanol 100% trong 5 phút, trong cồn ethanol 70% trong 3 phút

 Rửa bằng nước cất

 Đặt lam trong buồng ẩm và giữ lát cắt luôn được ẩm ướt

 Dùng bút dầu khoanh tròn khu vực lát cắt

 Ủ lam với H2O2 trong methanol trong 10 phút ở nhiệt độ > 22oC

 Rửa lam 3 lần với TBS

 Ủ với huyết thanh dê pha loãng với TBS 1/10 trong 10 phút ở > 22oC

 Đổ huyết thanh dê ra ngoài và lau huyết thanh thừa bằng cách dùng khăn giấy thấm ở góc lam

 Đặt 50-100 µl Mabs đã được pha lên lát cắt và ủ 60 phút ở >22oC trong buồn ẩm

 Rửa lam 3 lần với TBS

 Thêm kháng thể IgG liên kết HRP được pha loãng với TBS 1/50 trong 30 phút

 Rửa lam 3 lần với TBS

 Ủ lam 10 phút với dung dịch DAB

 Ngâm lam trong nước máy

 Nhuộm Haematoxylin trong 3-4 phút

 Rửa trong nước máy trong 10 phút

 Ngâm lam trong cồn 70 trong 3 phút, cồn 100 trong 5 phút

 Ngâm trong Xylen 5 phút, lặp lại 2 lần

 Nghiệm thức 1: Cá được ngâm trong vaccine chủng Strep1 bất hoạt bằng formaline 0.5% (v/v) trong 60 phút

 Nghiệm thức 2: Cá được ngâm trong vaccine chủng Strep2 bất hoạt bằng formaline 0.5% (v/v) trong 60 phút

 Nghiệm thức 3: Cá được ngâm trong vaccine Strep Si theo chỉ dẫn sử dụng của công ty Intervet

 Nghiệm thức 4: Nghiệm thức đối chứng, cá không ngâm vaccine

Cá sau khi được ngâm vaccine được đưa trở lại nuôi trong bể composite 1 m3

có chứa 1 m3 nước, sục khí liên tục 24/24h, cho ăn thức ăn công nghiệp 2 lần/ngày, duy trì nhiệt độ nước từ 26-28oC, độ mặn 31 -33 ppt, định kỳ 5 ngày thay 5-10% nước

Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá khả năng bảo vệ của vaccine

Sau 25 ngày, cảm nhiễm ngược với chủng

vi khuẩn Strep1 bằng phương pháp ngâm,

lặp lại 4 lần

NT1 Vaccin Strep 1

NT2 Vaccin Strep 2

NT3 Vaccin Strep Si

NT4

ĐC

Xác định tỷ lệ sinh tồn tương đối (RPS)

Đánh giá khả năng bảo vệ của vaccine dẫn truyền bằng

phương pháp ngâm

Xác định LD50

NT3 Vaccin Strep Si

NT4 Đối chứng Chuẩn bị cá thí nghiệm Dẫn truyền

vaccine bằng pháp ngâm