khảo sát khả năng phát triển trứng và sự tạo thành phôi chó trong điều kiện phòng thí nghiệm

Với mục đích nghiên cứu về nuôi thành thục trứng và tạo phôi chó in vitro, tôi tiến hành đề tài: “Khảo sát khả năng phát triển của trứng và sự tạo thành phôi chó trong điều kiện phòng t

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGÔ THỊ MAI HƯƠNG

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN TRỨNG VÀ

SỰ TẠO THÀNH PHÔI CHÓ TRONG ĐIỀU KIỆN

PHÒNG THÍ NGHIỆM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2011

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGÔ THỊ MAI HƯƠNG

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN TRỨNG VÀ

SỰ TẠO THÀNH PHÔI CHÓ TRONG ĐIỀU KIỆN

PHÒNG THÍ NGHIỆM

Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

(Sinh lý động vật)

Mã số: 60 42 30 3

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 TS NGUYỄN THANH BÌNH

2 PGS TS TRẦN THỊ DÂN

Thành phố Hồ Chí Minh - 2011

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC BIỂU ĐỒ vi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Chu kỳ động dục ở chó 3

2.1.1 Kỳ không động dục 3

2.1.2 Kỳ tiền động dục 3

2.1.3 Kỳ động dục 4

2.1.4 Kỳ đình dục 4

2.2 Sự thành thục của trứng chó in vivo 7

2.2.1 Các giai đoạn phát triển của trứng chó 7

2.2.2 Đặc điểm môi trường phát triển của trứng chó in vivo 8

2.3 Sự thành thục của trứng chó in vitro 10

2.3.1 Thử nghiệm mô phỏng điều kiện in vivo 11

2.3.2 Môi trường nuôi cấy 13

2.3.3 Các điều kiện nuôi cấy in vitro 17

2.3.4 Ảnh hưởng của điều kiện sinh lý chó 19

2.4 Kết quả tạo phôi chó in vitro 20

PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm và thời gian 22

3.2 Nội dung nghiên cứu 22

3.3 Dụng cụ, thiết bị, và hóa chất 22

3.4 Phương pháp nghiên cứu 22

3.5 Chỉ tiêu đánh giá 27

3.6 Xử lý số liệu 27

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1 Tỉ lệ trứng sống/ trứng thoái hóa 28

4.2 Nuôi thành thục trứng chó in vitro 30

4.3 Kết quả thúc đẩy sự thành thục của trứng chó khi đồng nuôi cấy với tinh trùng 33

4.4 Kết quả thụ tinh và tạo phôi 37

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 40

5.2 Đề nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

PHỤ LỤC 46

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Trang

Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ sống của trứng theo thời gian nuôi thành thục 28

Biểu đồ 4.2: Tỉ lệ trứng chó ở các giai đoạn thành thục in vitro 31

Biểu đồ 4.3: Tỉ lệ thành thục nhân trứng IVM/IVF sau 48 giờ nuôi 34

Biểu đồ 4.4: Tỉ lệ thành thục nhân trứng IVM/IVF sau 60 giờ nuôi 35

Biểu đồ 4.5: Tỉ lệ thành thục nhân trứng IVM/IVF sau 72 giờ nuôi 35

Biểu đồ 4.6: Tỉ lệ thành thục nhân của trứng được thụ tinh 36

Biểu đồ 4.7: Tỉ lệ thụ tinh 37

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 2.1: Diễn tiến hormone trong chu kỳ động dục chó 5

Hình 2.2: Hình ảnh tế bào học ống sinh sản chó trong chu kỳ động dục 6

Hình 2.3: Các giai đoạn phát triển nang buồng trứng 9

Hình 2.4: Trứng chó trước khi nuôi cấy và sau khi nuôi cấy 11

Hình 2.5: Phôi chó thu nhận in vitro ở các giai đoạn 21

Hình 3.1: Chó giống nội 22

Hình 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 22

Hình 3.3: Các hình thái buồng trứng 24

Hình 3.4: Trứng được thu nhận cho thí nghiệm 25

Hình 3.5: Tinh hoàn và phó tinh hoàn 26

Hình 3.6: Trứng chó được nhuộm với Hoechst 33342 sau nuôi thành thục 27

Hình 4.1: Trứng chó sau nuôi cấy 29

Hình 4.2: Trứng chó sau nuôi thành thục và nhuộm với PI 32

Hình 4.3: Phôi chó thu nhận in vitro 38

Hình 4.4: Hợp tử với 2 tiền nhân 39

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT – THUẬT NGỮ

IVF in vitro fertilization Thụ tinh trong ống nghiệm IVM in vitro maturation Nuôi thành thục trứng trong ống

nghiệm

giải phóng từ tuyến Yên

In vitro Trong ống nghiệm

In vivo Trong cơ thể

MỞ ĐẦU

Nghiên cứu về sinh lý sinh sản và công nghệ hỗ trợ sinh sản đã phát triển từ lâu trên đối tượng động vật có vú Cơ chế sinh sản ở các loài này tương đối giống nhau (heo, bò, người, chuột ) tuy nhiên ở loài chó, có một số khác biệt với các loài động vật có vú khác Thứ nhất là chu kỳ sinh dục của chó kéo dài khoảng 3 – 10 tháng tùy giống trong khi bò, người, heo là 20 – 28 ngày Thứ hai là sự kiện chảy máu âm

đạo ở giai đoạn tiền động dục Sự chảy máu này không giống ở người là do bong

tróc lớp niêm mạc dạ con khi không thụ tinh, ở chó sự chảy máu này là để bong lớp

tế bào ngoài giúp tử cung sẵn sàng cho phôi làm tổ Thứ ba là quá trình chín của trứng chó Ở các loài động vật có vú khác, trứng tiến hành giảm phân trong nang trứng ở giai đoạn nang tiền rụng Khi rụng, trứng ở giai đoạn Metaphase II và sẵn sàng cho thụ tinh Tuy nhiên, ở chó không xảy ra như vậy, khi rụng trứng, trứng ở giai đoạn túi mầm (germinal versicle –GV) và quá trình giảm phân hoàn thành sau khoảng 48 giờ trong ống dẫn trứng [36] Trên thực tế, chỉ có sự kiện thứ nhất và thứ

ba là có ảnh hưởng nhiều tới những nghiên cứu về sinh sản in vitro của chó

Hiện nay, trên thế giới, kết quả của những nghiên cứu nuôi trưởng thành trứng in vitro còn rất hạn chế Tỷ lệ nuôi chín trứng chó chỉ đạt khoảng 20% ngoại trừ nghiên cứu gần đây của tác giả Songsasen và Wildt đã báo cáo nuôi chín trứng thu nhận từ những nang trứng có kích thước > 2 mm đạt tỷ lệ 79,5% [14], [46] Do đó,

tỷ lệ phôi hình thành từ nguồn trứng nuôi trưởng thành in vitro này cũng rất hạn chế

[14] Ở Việt Nam, hiện nay chưa có quy trình nào hiệu quả cho việc nuôi thành thục

trứng chó và tạo phôi chó in vitro Năm 2005, nhóm tác giả Quách Tuyết Anh và

Trần Thị Dân [35] đã báo cáo nuôi thành thục được trứng chó với tỉ lệ 0,75% ngoài

ra không còn công bố nào có kết quả cao hơn

Với mục đích nghiên cứu về nuôi thành thục trứng và tạo phôi chó in vitro, tôi

tiến hành đề tài: “Khảo sát khả năng phát triển của trứng và sự tạo thành phôi chó trong điều kiện phòng thí nghiệm”

Mục tiêu của đề tài là khảo sát thời gian tối ưu cho nuôi thành thục trứng và tạo

phôi chó in vitro, đồng thời kiểm tra khả năng thúc đẩy trứng chó thành thục bằng

việc đồng nuôi cấy với tinh trùng sau mỗi khoảng thời gian nuôi Kết quả được đánh

giá thông qua các chỉ tiêu về tỉ lệ trứng sống/ thoái hóa; tần suất và mức độ thành thục nhân của trứng; tỉ lệ thụ tinh và khả năng tạo phôi.

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Chu kỳ động dục ở chó

Ở chó, mỗi chu kỳ động dục kéo dài vài tháng; ngoài ra, biểu hiện về thời gian động dục ở mỗi con và mỗi giống rất khác nhau, đôi lúc những biểu hiện cũng khác nhau Chu kỳ sinh dục bình thường của chó cái có thể phân chia thành 4 giai đoạn, mỗi giai đoạn có hành vi, sinh lý và kiểu nội tiết riêng biệt

2.1.1 Kỳ không động dục

Kỳ không động dục (anaestrus) ở chó kéo dài 2-10 tháng [47] Tuyến sinh dục của chó ở kỳ này không có hoạt động rõ rệt Chúng không đòi hỏi giao phối hoặc không chấp nhận cho chó đực giao phối Âm hộ nhỏ và không phồng lên Phân tích

tế bào học ống sinh dục của chó cái cho thấy các tế bào nhỏ chiếm đa số và một phần nhỏ các tế bào bạch cầu và các vi khuẩn Nội soi âm đạo thấy các nếp gấp phẳng, mỏng và đỏ Sinh lý của chó trong giai đoạn này vẫn chưa được hiểu rõ nhưng chắc chắn là có sự giảm chức năng thể vàng và giảm tiết prolactin

Ở kỳ này, kết quả đo nồng độ estrogen được công bố rất khác nhau nhưng đều cho rằng hàm lượng đạt mức độ cao hơn mức trung bình một tháng trước kỳ tiền động dục rồi tăng lên nhanh chóng [30] Trong khi đó, nồng độ của Luteinizing hormone (LH) trong huyết thanh đạt ở mức thấp, dưới 1 ng/ml, chỉ bằng 2-20% so với nồng độ đỉnh Ở giai đoạn đầu của kỳ không động dục, follicle stimulating hormone (FSH) luôn ở nồng độ căn bản (khoảng 20 ng/ml) và tăng lên vào giữa và cuối của kỳ (>30ng/ml) [8], [29]

Trong giai đoạn không động dục, chó cái không thấy có sự hoạt động chức năng của buồng trứng

2.1.2 Kỳ tiền động dục

Trong suốt kỳ tiền động dục (proestrus), chó cái bắt đầu hấp dẫn con đực nhưng vẫn không chấp nhận giao phối Có sự bong lớp màng niêm mạc giả ở tử cung khiến chảy máu âm đạo, và âm đạo mở rộng ở mức trung bình Phân tích tế bào âm đạo cho thấy, có sự thay đổi phát triển từ những tế bào nhỏ cận gốc thành các tế bào trung gian nhỏ và lớn, tế bào trung gian và cuối cùng là tế bào biểu mô bề mặt phản

ánh tác dụng của sự thay đổi nồng độ estrogen Nếp gấp âm đạo của chó biểu hiện

sự sung phù, có màu hồng và tròn

Khi chuyển dần từ kỳ tiền động dục sang kỳ động dục, nồng độ estrogen tăng từ mức độ trung bình (26 pg/ml) cho tới đỉnh (50-100 pg/ml) rồi giảm xuống nhanh chóng sau đó [6], [9] Trong kỳ tiền động dục, LH đạt đỉnh (4-40ng/ml) khoảng 1-3 ngày sau đỉnh của estrogen [6] Ngược lại, progesterone lại tăng chậm Progesterone tăng từ mức căn bản (0,2-0,4 ng/ml) tới trước đỉnh LH thì đạt 0,6-0,8 ng/ml và sau đỉnh thì đạt 3,2-5,4 ng/ml [7]

Vào giai đoạn sớm của kỳ tiền động dục, nang trứng trội có kích thước khoảng 2-3 mm Các nang này phát triển tới kích thước khoảng 9-12 mm trước khi vào cuối

kỳ tiền động dục [7]

2.1.3 Kỳ động dục

Trong suốt kỳ động dục (estrus), chó có biểu hiện chấp nhận hoặc thụ động trong giao phối và có thể bị chảy máu Sự chảy máu âm đạo này là do sự bong màng niêm mạc giả ở tử cung chó Giai đoạn này, âm hộ chó phồng hết cỡ Các tế bào bề mặt âm đạo chiếm đa phần Các nếp gấp âm đạo trở nên cuộn nhiều hơn Nồng độ estrogen giảm rõ rệt sau đỉnh LH, trong khi progesterone tăng dần (khoảng từ 4-10 ng/ml ở thời điểm rụng trứng) đánh dấu pha thể vàng của buồng trứng Kỳ động dục kéo dài 3 ngày tới 3 tuần và thường là 9 ngày Hành vi động dục của chó có thể có trước hoặc sau đỉnh LH Nó kéo dài (khác nhau ở mỗi cá thể) và có thể không cùng lúc với thời kỳ có khả năng thụ tinh Trứng tiền trưởng thành rụng ở thời điểm 2 ngày sau đỉnh LH và thành thục khoảng 2-3 ngày sau Thời gian tồn tại của trứng sau thành thục là 2-3 ngày [6], [8], [29]

2.1.4 Kỳ đình dục

Trong kỳ đình dục (diestrus), những con chó bình thường trở nên khó tính cùng với giảm các biểu hiện lôi cuốn con đực Sự chảy máu âm đạo giảm và âm hộ cũng giảm phồng từ từ Nồng độ estrogen ở mức thấp, còn nồng độ progesterone tăng dần tới đỉnh là 15-80 ng/ml và duy trì ở mức cao trước khi giảm dần vào cuối kỳ đình dục (khoảng 30-50 ngày) ở cả chó mang thai và không mang thai [6] Nội mạc tử cung và cơ tử cung phát triển dưới ảnh hưởng của sự tăng nồng độ progesterone Kỳ đình dục thường kéo dài 2-3 tháng ở những con chó mang thai Cá thể sẽ đẻ khoảng

64-66 ngày sau đỉnh LH Nồng độ prolactin tăng ngược lại với sự giảm progesterone ở giai đoạn cuối của kỳ đình dục hoặc mang thai Progesterone đạt mức độ cao nhất trong giai đoạn mang thai

Chu kỳ động dục với ngày bắt đầu kỳ động dục là ngày thứ nhất

Hình 2.1: Diễn tiến hormone trong chu kỳ động dục chó

(Nguồn: http://www yourownvet.com)

Hình 2.2: Hình ảnh tế bào niêm mạc trong ống sinh sản chó trong chu kỳ động dục

Giai đoạn đầu kỳ tiền động dục có

sự tập trung của bạch cầu trung tính,

tế bào cận gốc, tế bào biểu mô bề

mặt, hồng cầu, và chất nhầy

Giai đoạn cuối kỳ tiền động dục,

hồng cầu, tế bào biểu mô, và sự vắng mặt của các bạch cầu trung tính

Giai đoạn động dục đặc trưng bởi

các tế bào biểu mô được keratin hóa,

phần lớn không có nhân và tế bào có

góc cạnh

Giai đoạn đình dục đặc trưng bởi sự

giảm sút các tế bào biểu mô, sự tăng các tế bào trung gian, và sự hiện diện của bạch cầu trung tính

Nguồn: http://www.vet.uga.edu/vpp/clerk/beimborn

Tế bào gốc (basal cell): là những tế bào trẻ nhất của tế bào biểu mô âm đạo

Tế bào cận gốc (parabasal cell): là những tế bào nhỏ nhất trong các tế bào biểu mô âm đạo

Tế bào trung gian (intermediate cell) có kích thước rất khác nhau nhưng thường lớn hơn 2 lần tế bào cận gốc

Tế bào biểu mô (superficial cell): là những tế bào già nhất trong các tế bào biểu mô âm đạo

2.2 Sự thành thục của trứng chó in vivo

2.2.1 Các giai đoạn phát triển của trứng chó

Ở giai đoạn nang sơ cấp, các trứng chứa một nhân, bao quanh bởi ty thể, mạng lưới nội chất trơn và thể Golgi Vào giai đoạn phát triển sớm, liên kết giữa trứng và nang chưa hoàn thiện đầy đủ [53] [54] Màng trong suốt của trứng trong nang sơ cấp bắt đầu hình thành và trở nên rõ ràng cùng với sự tăng trưởng tế bào Một nghiên cứu về vi cấu trúc gần đây đã chứng minh rằng màng trong suốt ở trứng chó được hình thành bởi mạng lưới các sợi fibrin và các lỗ với nhiều kích thước [51]

Độ dày của màng trong suốt của trứng phát triển đầy đủ khoảng 10 µm

Ty thể hiện diện ngày càng nhiều trong suốt thời kỳ phát triển của trứng, thể hiện sự gia tăng các hoạt động trao đổi chất trong trứng [53], [54] Tế bào chất của trứng giai đoạn nang sơ cấp bao gồm các hạt và sợi hoặc các phiến lưới nội chất Thể Golgi cũng tăng về số lượng Các hạt lipid đầu tiên xuất hiện trong noãn

sơ cấp của nang đang phát triển và gia tăng trong suốt quá trình sinh trứng [53], [54]

Trong giai đoạn sớm của nang trội, nhân chiếm gần hết thể tích của noãn bào, bao xung quanh là các ty thể, và số lượng các hạt lipid tiếp tục tăng Các vùng tế bào chất của trứng tiếp giáp với các tế bào hạt có sự hiện diện với số lượng lớn các thể Golgi và vài ty thể Trong suốt quá trình phát triển, trứng vẫn tiếp tục gia tăng kích thước cùng với đó là sự gia tăng của các hạt lipid khiến cho trứng có màu đen [12], [54] Cho tới nay, người ta vẫn chưa biết hạt lipid hiện diện trong trứng chó với số lượng lớn như thế có ảnh hưởng như thế nào đến sự trưởng thành và phát

triển trứng ở loài này

Trong sinh lý bình thường, trứng chó được giải phóng khỏi nang trứng ở giai đoạn prophase I của quá trình phân chia giảm phân [14] lúc này trứng vẫn còn sự hiện diện của túi mầm (germinal vesicle) ở trong tế bào chất Túi mầm được tạo thành từ màng nhân và một nhân chứa vật chất di truyền Trứng có sự thay đổi quan trọng về hình thái nhân trong suốt quá trình thành thục bao gồm sự phiên mã của mRNA và tổng hợp protein ở mức cao Ở tế bào chất, sự hình thành của các bào quan, điển hình là ti thể và ribosome và sự hình thành nên màng trong suốt (zona

pellucida) và hạt vỏ cho phép quá trình giảm phân tới giai đoạn metaphase II, thể hiện ở sự giải xoắn của các nhiễm sắc thể và xuất hiện của thể cực thứ nhất

Sự rụng trứng xảy ra 2 ngày trước kỳ động dục và ở hầu hết các con chó cái là khoảng ngày thứ 3 sau khi có biểu hiện chấp nhận giao phối [22], [55] Trứng được giải phóng khỏi nang tiền rụng (có đường kính khoảng 4-13 mm) ở giai đoạn túi mầm có đường kính khoảng 118-135 µm Quá trình vỡ túi mầm ở trứng chó diễn ra khoảng 48 giờ trong ống dẫn trứng [22], [55] Trứng đạt giai đoạn thành thục về nhân khoảng 48-72 giờ sau rụng trứng Theo kết quả báo cáo của Reynaud và cs (2005), khi quan sát trứng từ 17 đến 138 giờ sau rụng trứng cho thấy trứng đầu tiên

đạt giai đoạn metaphase II vào 54 giờ sau rụng [36] Các trứng thành thục in vivo

cũng cho thấy có sự giãn nở của lớp tế bào hạt tuy nhiên lớp trong cùng bao quanh sát trứng còn tồn tại quanh trứng tới tận giai đoạn phôi nang [22] Trứng chó được thụ tinh di chuyển trong ống dẫn trứng khoảng 9-10 ngày sau đó mới tiến vào tử cung [22], [55]

2.2.2 Đặc điểm môi trường phát triển của trứng chó in vivo

Môi trường nang trứng

Trong buồng trứng của tất cả các loài động vật có vú, nang trứng là một đơn vị cấu trúc và chức năng Nang trứng chứa giữ trứng phát triển và thành thục Trong nang trứng đang tăng trưởng, trứng chó phát triển và gia tăng về kích thước [12] Trứng nhỏ với một lớp tế bào hạt tiền thân hình thành trong nang nguyên sơ (primordial) (đường kính 25 µm); trong nang tiền xoang (pre-antral follicle), trứng hiện diện cùng với sự bao quanh của lớp đơn tế bào hạt và ở cuối nang tiền xoang (advanced preantral follicles) (đường kính khoảng 211,4 ± 1,5 µm) trứng lớn lên (đường kính khoảng 115 ± 14 µm), có sự tập trung các hạt lipid với số lượng lớn Đây cũng là đặc trưng của trứng chó tiền rụng với nhiều lớp tế bào hạt bao quanh Ở giai đoạn sớm của nang trưởng thành (đường kính khoảng 360,5 ± 18 µm) có sự hình thành những xoang [12] và kích thước nang trưởng thành giai đoạn tiền rụng đạt khoảng từ 2-3 tới 8-10 mm [8] Do vây, trong suốt giai đoạn phát triển này, đường kính của trứng tăng từ khoảng gần 20 µm đến 120 µm và trở nên tương đối hoàn thiện

Đa số các nang chỉ gồm 1 trứng mặc dù nang đa rụng trứng đã được quan sát ở chó cũng như nhiều loài động vật có vú khác Tuy nhiên, phần trăm nang đa rụng ở chó gặp nhiều hơn: 14% ở những con chó 1-2 tuổi và 5% ở những con 7-11 tuổi [52] Sự hiện diện của nang đa rụng không được coi như một hiện tượng bệnh lý mà

nó là một hiện tượng tự nhiên bắt nguồn từ sự hiện diện với mật độ cao các mảng nang sơ cấp trong tủy của buồng trứng chó non Số phận của các nang rụng nhiều lần vẫn chưa được biết rõ Chúng có thể hoặc rụng hoặc trải qua sự thoái lui (atresia) như ở đa số các nang rụng một lần [1]

Có 2 kiểu thoái hóa được quan sát ở buồng trứng chó: thoái hóa kiểu A, kiểu này chiếm đa số ở nang tiền xoang, đặc trưng bởi sự hoại tử của trứng và màng trong suốt Trái lại, sự thoái hóa kiểu B, là sự hoại tử của tế bào hạt Quá trình thoái hóa kiểu B dẫn tới kết quả là nang tăng trưởng giả bởi sự phát triển giả hình thành cấu trúc giống nang tăng trưởng [49]

và cs 2004)

dài bao gồm sự thành thục hoàn toàn, sự thụ tinh và sự phát triển tới giai đoạn phôi nang Do vậy, tổng thời gian trứng chó trong ống dẫn trứng khoảng 8,5 tới 9 ngày, nhiều hơn 3-4 ngày so với các loài khác [22] Bởi thế, hình thái của ống dẫn trứng phải thích hợp cho sự tồn tại dài ngày của giao tử trong cơ quan này Trong thực tế, lòng trong của ống dẫn trứng động vật có vú được hình thành bởi tổ hợp hệ thống những nếp gấp niêm mạc nhầy đan dọc vào nhau Những nếp gấp dọc được sắp thành hàng bởi một lớp biểu mô hình trụ đơn giản Hình thái và đặc tính sinh học của mô này được điều khiển bởi hormone buồng trứng [56] Trong suốt chu kỳ động dục của chó, các tế bào biểu mô xếp hàng bao gồm các tế bào có lông nhung đã biệt hóa hoàn toàn và các tế bào tiết, chúng chiếm tới 40-50% các tế bào biểu mô Do vậy, ở chó, trứng được đặt trong môi trường các chất tiết và chất nhầy của ống dẫn trứng trong một thời gian dài, và có thể những chất này có vai trò chủ chốt trong sự kiện toàn của trứng

Sự tương tác với tinh trùng trong ống dẫn trứng

Trong cơ thể, trứng chó rụng duy trì khả năng thụ tinh ít nhất 4 ngày [55] Sự giao phối có thể xảy ra trước 2-3 ngày đến 1 tuần sau khi rụng trứng Tinh trùng có thể thực sự hiện diện quanh tổ hợp trứng-tế bào ổ trước cả khi trứng thành thục Chúng vẫn có thể còn sống sau khi giao phối 11 ngày trong ống dẫn trứng của con cái [11] Thời gian tinh trùng tập trung quanh trứng chó không chắc chắn vì chênh lệch giữa thời điểm rụng trứng, thụ tinh và thành thục của trứng Trong một nghiên

cứu in vivo đã báo cáo có sự hiện diện của tinh trùng trong trứng ở giai đoạn túi

mầm, mặc dù không có sự thay đổi trong những đầu tinh trùng được quan sát cho tới sau khi trứng bài xuất thể cực thứ 2 Trong khi sự tập trung của tinh trùng ở trứng tiền thành thục có thể xảy ra, hiện nay vẫn không có bằng chứng về phôi phát triển sau đó của những trứng được báo cáo này Mặt khác, ở loài cáo xanh sự phát triển của tiền nhân đực đã được quan sát ở trứng giai đoạn túi mầm thu nhận từ những con đã giao phối [13]

2.3 Sự thành thục trứng chó in vitro

Theo các báo cáo hiện nay, tỷ lệ IVM trên trứng chó chỉ đạt khoảng 20% và do

đó tỉ lệ phát triển thành phôi cũng thấp trong các thử nghiệm IVF [21] Trong thập

kỷ gần đây, các nhà khoa học đang cố gắng tìm hiểu sự thành thục và thụ tinh in

vitro ở trứng chó Đó là một thách thức vô cùng hấp dẫn đối với các nhà khoa học

Đa số ý kiến cho rằng sự phân chia giảm phân của trứng chó in vitro là kết quả ảnh

hưởng một cách gián tiếp bởi gonadotropin, hormone nhóm steroid, nhân tố tăng trưởng và protein bổ sung trong môi trường nuôi cấy Ngược lại, một số tác giả

khác lại cho rằng sự trưởng thành nhân của trứng có thể xảy ra in vitro không phụ

thuộc vào nguồn protein bổ sung trong môi trường Do đó, nhiều thử nghiệm đã được tiến hành nhằm mô phỏng các đặc tính sinh hóa cũng như sinh lý môi trường nang trứng hay ống dẫn trứng

2.3.1 Thử nghiệm mô phỏng điều kiện in vivo

Nuôi cấy nang trứng

Sự duy trì cấu trúc ba chiều của nang trứng cho phép bảo tồn chức năng và hình thái của đơn vị chứa và nuôi dưỡng trứng phát triển và thành thục một cách toàn vẹn Bolamba và cs (1998) ước lượng sự trưởng thành nhân của trứng chó thông

qua nuôi cấy nang trứng trên đĩa nuôi cấy mô bằng nhựa trong điều kiện in vitro có

phủ 0,6% agar vô trùng để ngăn cản sự mất các tế bào hạt Kết quả thu được sau nuôi 48 giờ cho thấy số nang tiền xoang đạt 11,5% hoặc giai đoạn sớm của nang có xoang đạt 8,7% mặc dù tỉ lệ này thấp Sự tách nang trứng ra khỏi buồng trứng làm gián đoạn sự vận chuyển sinh lý của các nhân tố trong buồng trứng, có thể thúc đẩy trứng hoàn tất giảm phân [3]

Nuôi cấy trên lớp tế bào đơn

Ảnh hưởng có lợi của đồng nuôi cấy tới sự phát triển của phôi đã được chứng

Hình 2.4: Trứng chó trước khi nuôi cấy (A) và sau khi nuôi cấy (B)

(Nguồn: Shaikhun và cs, 2008)

minh trong sản xuất phôi bò in vitro [15] Otoi và cs (2000) đã nuôi trưởng thành

trứng chó trên lớp đơn tế bào ổ của bò với môi trường nuôi phôi bò [32] Mặc dù tăng số trứng đạt giai đoạn metaphase II song không có ảnh hưởng tới sự phát triển tiếp theo sau thụ tinh

Việc đồng nuôi cấy với lớp đơn tế bào ống dẫn trứng chó đã được tiến hành lần đầu tiên bởi Hewitt và England (1999) Kết quả cho thấy các tế bào ống dẫn trứng không có bất cứ ảnh hưởng có lợi nào lên sự trưởng thành nhân của trứng sau 48 giờ đồng nuôi cấy Chỉ sau 96 giờ thì có cải thiện về sự hoàn tất giảm phân [20] Gần đây, Bogliolo (2002) đã chứng minh rằng việc đồng nuôi cấy với các tế bào ống dẫn trứng thu nhận từ phần loa của ống dẫn trứng chó ở giai đoạn động dục có ảnh hưởng tốt tới tỉ lệ trưởng thành của trứng, đạt 16,7% sau 48 giờ và 23,2% sau

72 giờ nuôi [2]

Việc đồng nuôi cấy trứng chó trên lớp đơn tế bào ống dẫn trứng là một thử nghiệm nhằm gia tăng điều kiện sinh lý mà ở đó trứng hoàn tất quá trình giảm phân Tuy nhiên, mô hình này vẫn khác rất nhiều so với môi trường ống dẫn trứng trong

cơ thể, do đó, ở chó có một số đặc trưng đặc biệt ảnh hưởng có lợi tới sự trưởng thành và khả năng tồn tại lâu của trứng ở đây

Nuôi cấy trong ống dẫn trứng

Một đoạn ống dẫn trứng được cô lập có thể cung cấp môi trường in vitro với các

đặc điểm khác với lớp đơn tế bào ống dẫn trứng Trong thực tế, việc nuôi cấy tế bào rất khác so với nuôi cấy ống dẫn trứng Trong nuôi cấy tế bào thì số lượng kiểu tế bào nuôi cấy được giới hạn trong khi ở ống dẫn trứng còn nguyên có sự hiện diện của tất cả các loại tế bào và được giữ ở cùng giai đoạn như ở động vật sống Một lợi ích khác của kiểu nuôi cấy này là sự điều chỉnh về không gian và những liên kết sinh lý giữa màng nhầy và trứng Điều này tạo vi môi trường khác với điều kiện nuôi cấy trong vi giọt hoặc trên lớp đơn tế bào ống dẫn trứng

Việc nuôi cấy trứng chó trong đoạn loa của ống dẫn trứng đã được chứng minh

là có ảnh hưởng tốt tới sự tồn tại, phát triển nhân trong 30 giờ nuôi cấy [25] và kết quả cho thấy nhân ở giai đoạn giữa metaphase I tới metaphase II đạt từ 12,5% đến 31,9% Tuy nhiên, nghiên cứu này được cho là không phù hợp thực tế và nó không hẳn là một kiểu nuôi cấy; nhưng với kết quả đó, người ta dự đoán rằng ống dẫn

trứng nguyên vẹn cùng với sự hiện diện của các tế bào ống dẫn trứng có thể tiết các nhân tố khác (như các chất có dinh dưỡng cao hoặc là các nhân tố) trong sự trưởng thành và khả năng sống của trứng chó

Tiến hành tương tác với tinh trùng

Như được quan sát trong in vivo, trong in vitro cũng thấy có sự tập trung tinh

trùng chó ở màng trong suốt và ở khoảng không quanh trứng ngay cả khi trứng ở giai đoạn chưa thành thục Tuy nhiên, thông tin liên quan tới mối quan hệ giữa giai đoạn thành thục của trứng và đầu tinh trùng trong tế bào chất của trứng còn giới hạn

và trái ngược nhau Mahi và Yanagimachi (1976) đã thấy sự trương phồng của nhân tinh trùng không khác so với sự giãn nhân của nó trong tế bào chất trứng ở tất cả các giai đoạn trưởng thành [28] Yamada và cs (1992 và 1993) đã quan sát tinh trùng mở rộng trong những trứng ngừng ở giai đoạn túi mầm nhưng nhân nguyên đực lại chỉ được quan sát ở trứng đã thực sự có nhân nguyên cái Những ảnh hưởng của sự tập trung tinh trùng lên sự khởi động và hoàn tất giảm phân lần thứ I ở trứng chó vẫn còn đang được tìm hiểu [58], [59] Trong nghiên cứu khác lại khẳng định

sự tập trung tinh trùng là một phần trong những tác động có lợi tới sự hoàn tất giảm phân ở trứng chó [42] Những kết quả đó cho thấy rằng ngoài sự tập trung tinh trùng còn có các nhân tố khác tham gia vào sự hoàn tất giảm phân của trứng chó trong nuôi thành thục trong ống nghiệm

2.3.2 Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi thành thục trứng có thể được chia ra 2 loại, môi trường đơn giản hoặc môi trường phức hợp Môi trường đơn giản được cân bằng bởi các dung dịch với các nguồn năng lượng như pyruvate, lactate và glucose còn môi trường phức hợp có thêm các chất như amino acid, vitamin và một số phân tử khác [15]

Môi trường đơn giản được sử dụng rộng rãi cho nuôi thành thục trứng chó in

vitro là môi trường Modified Krebs Ringer Bicarbonate (mKRB), Synthetic

Oviductal Fluid (SOF) và môi trường phức hợp như Tissue Culture Medium 199 (TCM 199) Vẫn chưa có báo cáo nào so sánh hiệu quả giữa môi trường đơn giản và môi trường phức hợp cho nuôi trưởng thành trứng chó nhưng môi trường TCM199

đã được báo cáo là môi trường tốt hơn cho sự trưởng thành nhân của trứng chó đạt tới giai đoạn metaphase II so với môi trường Connaught Medical Research Labs

Medium 1066 (CMRL 1066) [27] Nhằm năng cao tỉ lệ nuôi trưởng thành trứng

chó, các môi trường được bổ sung một số chất:

Protein

Nguồn protein được bổ sung vào môi trường nuôi cấy dưới dạng huyết thanh Huyết thanh lại là một thành tố quan trọng bảo vệ trứng khỏi các tác động có hại của độc tố trong môi trường nuôi cấy Huyết thanh cô lập phản ứng oxy hóa của O2

vàcung cấp đệm pH đồng thời nó có lợi cho trứng chó thụ tinh in vitro và sự phát

triển của phôi chó sau này Mặc dù vậy, sự hiện diện của huyết thanh lại khiến màng trong suốt bị xơ cứng [40]

Huyết thanh bất hoạt nhiệt hoặc là albumin huyết thanh được bổ sung vào môi trường nuôi cấy làm cải thiện tỉ lệ sống và trứng thành thục ở gia súc [15] Sự

trưởng thành in vitro của trứng chó đã được chỉ ra trong môi trường có bổ sung

huyết thanh bò hoặc chó với nồng độ 5-20%, và 0,3-4% albumin huyết thanh bò (BSA) Huyết thanh bò chửa chỉ tăng cường sức sống của trứng chó trong điều kiện

in vitro khi thêm với nồng độ ≥ 10% và không cho thấy có lợi đối với sự thành thục

[19] Khi so sánh giữa huyết thanh chó động dục và bò động dục, huyết thanh chó

có ảnh hưởng tốt hơn ở thời điểm khởi đầu sự trưởng thành tới giai đoạn MI-AI (10,4% so với 4.2%) mặc dù trong nhóm đối chứng không có trứng nào đạt tới giai đoạn MII [37] Tỉ lệ nhân thành thục khi thêm 10% huyết thanh chó động dục (16,3%) cao hơn so với nhóm thêm 10% huyết thanh chó không động dục (11,1%) [31] Như được biết, thành phần huyết thanh trong máu ngoài các protein còn có các hormone như gonadotropin, steroid và các nhân tố tăng trưởng và do đó rất khó để biết chính xác thành phần nào có ảnh hưởng tốt tới sự trưởng thành nhân trứng Theo báo cáo của Hewitt và England (1999) ảnh hưởng của việc bổ sung BSA lên sự thành thục trứng cũng có liên quan tới số lượng lớn các nhân tố tăng trưởng liên kết với protein [20] So sánh trực tiếp giữa BSA và sự bổ sung huyết thanh vào môi trường TCM199 cho thấy BSA có tác hỗ trợ hơn đối với sự phát triển của trứng chó tới giai đoạn metaphase I-anaphase I [19], [38] Khi bổ sung BSA với nồng độ 4% vào môi trường SOF cho thấy có dấu hiệu cải thiện tỉ lệ vỡ túi mầm sau 96 giờ nuôi cấy [21] Gần đây, Bolamba và cs (2002) đã chỉ ra rằng khi trứng chó được nuôi cấy trong nang trứng được cô lập, việc bổ sung 0,3% BSA hoặc 20% huyết

thanh vào môi trường cơ bản SOF là không cần thiết đối với sự hoàn thiện trưởng thành nhân, và sự hiện diện của chúng đã làm tăng khả năng hoàn tất giảm phân chỉ

ở giai đoạn vỡ túi mầm giai đoạn hướng cực (germinal vesicle diakinesis – GVBD-DK) [3]

breakdown-Hormone

Trong in vivo, hormone kích hoạt tại thời điểm tiền rụng trứng là cần thiết cho

trứng chó để bắt đầu tiếp nhận những nhân tố ở ống dẫn trứng kích thích hoàn tất

quá trình giảm phân và thành thục Tuy nhiên, trứng chó nuôi thành thục in vitro

thường được thu nhận từ những nang trứng chưa trưởng thành hơn là những nang tiền rụng và chúng cũng không được trải qua ảnh hưởng khởi động của hormone

Do vây, việc thêm hormone vào môi trường nuôi cấy là nhằm mô phỏng các điều

kiện in vivo Như đã được chứng minh ở các loài khác, FSH kích thích hoàn tất giảm phân in vitro thông qua điều hòa nồng độ cAMP trong tổ hợp trứng-tế bào ổ

[24] Ngoài ra, FSH được cho là có vai trò trong sự giãn nở của tế bào ổ Sự giãn nở này có liên quan tích cực tới sự hoàn tất giảm phân Trong khi đó, khả năng trưởng thành nhân của trứng chó lại không có liên quan sự giãn nở của tế bào ổ Sự hiện diện của các FSH và/hoặc LH với nồng độ 1µg/ml trong giai đoạn nuôi cấy đã không cải thiện sự trưởng thành nhân [45], [59] Sự thiếu vắng FSH giúp trứng vượt qua giai đoạn dừng giảm phân thông qua việc cải thiện tỉ lệ vỡ túi mầm nhưng nó không thúc đẩy tiến trình giảm phân tiến xa hơn [38]

Gần đây người ta đã chứng minh trứng được ủ với eCG trong thời gian ngắn (60-240 phút) đã khởi động quá trình hoàn tất giảm phân và tiến trình trứng chó tiến tới giai đoạn metaphase I [48] Ảnh hưởng tốt này được cho rằng do hoạt tính FSH của eCG và sự trái ngược với kết quả trước, có thể do sự khác nhau giữa thời gian tác động dài hay ngắn của các chất gonadotropin lên tế bào ổ của chó và sự sinh tổng hợp steroid của chúng Ảnh hưởng của sự bổ sung gonadotropin có thể thực sự

bị tác động bởi sự đồng hiện diện của các steroid trong môi trường Tuy nhiên Rodrigues (2003) đã không chỉ ra được hiệu quả của estradiol (nồng độ từ 1-20 µg/ml) kết hợp với gonadotropin lên sự trưởng thành nhân của trứng chó [38] Nồng độ progesterone cao hiện diện trong môi trường nang trứng và sự thay thế

estrogen bằng progestagen có thể giúp cho sự phát triển in vitro Nồng độ của

progesterone (từ 0 – 800 ng/ml) đã được thêm vào môi trường nuôi thành thục trứng chó nhưng không có hiệu quả lên sự hoàn tất giảm phân hay sự thành thục toàn diện của nhân [57]; hơn thế nữa, không có khác biệt trong tỉ lệ thành thục của trứng chó

ở nhóm thêm progesterone (1 µg/ml) và/hoặc estrogen (1 µg/ml) so với nhóm không

được thêm Điều này cho thấy cần phải có thêm nhiều nghiên cứu in vivo về nồng

độ của các hormone trong môi trường nang trứng và ống dẫn trứng để có sự bổ sung

chính xác các chất này vào môi trường nuôi cấy in vitro

Theo Kim và cs (2007) việc bổ sung 1 IU/ml hCG và 1 IU/ml FSH đã thúc đẩy

sự trưởng thành nhân ở trứng chó thu nhận giai đoạn nang trứng [23]

Dựa trên những kết quả thu được từ những loài khác, các hormone khác nhau như somatotropin người và bò (hST, bST) đã được thử trong môi trường nuôi chín trứng chó Hormone tăng trưởng ở người dường như thúc đẩy sự trưởng thành tế bào chất trên trứng mèo và bò, còn bST (1 µg/ml) có vẻ kích thích hoàn tất giảm phân và làm tăng số lượng trứng cáo xanh đạt tới giai đoạn metaphase II [50] Ở trứng chó, bST (1-10 µg/ml) không có tác dụng lên sự trưởng thành nhân nhưng hST (1 µg/ml) lại có dấu hiệu làm tăng tỉ lệ trứng chó đạt tới giai đoạn metaphase II [38] Điều này cho thấy rằng trứng của chó và các loài động vật khác và cả giữa những giống chó khác nhau có đáp ứng khác nhau với hormone

Các chất cung cấp năng lượng và chống oxy hóa

Sự tồn tại của các tế bào trong nuôi cấy in vitro đòi hỏi bổ sung đầy đủ các chất

mang năng lượng Tuy nhiên, tổ hợp các chất mang năng lượng phù hợp nhất, hỗ trợ nhất cho quá trình trưởng thành nhân ở trứng chó còn ít được biết

Nồng độ pyruvate trong môi trường thường là 0,25 mM nhưng khi được kiểm tra với nồng độ cao hơn (2,5 mM) trong môi trường không có protein cho thấy có 7-33% trứng chó hoàn tất sự trưởng thành nhân sau 48 giờ nuôi cấy [45]

Bổ sung glucose vào môi trường nuôi cấy cũng đã được nghiên cứu Songsasen

và cs (2002) báo cáo rằng thêm 11 mM glucose vào môi trường nuôi cấy không thúc đẩy sự thành thục trứng chó Tác giả cho rằng có thể do trong thực nghiệm, glucose độc lập là nguồn năng lượng không đầy đủ cho trứng chó như đối với trứng chuột hay nồng độ cao của glucose có ảnh hưởng bất lợi lên sự thành thục của trứng chó nuôi trong điều kiện nồng độ oxy cao (20%) [45]

Để giảm những tổn hại do hoạt tính oxy hóa gây ra bởi nồng độ oxy cao trong

điều kiện nuôi cấy in vitro mà tế bào phải tiếp xúc, các nhà nghiên cứu đã thêm các

hợp chất có tính chống oxy hóa vào môi trường nuôi Beta-mercaptoethanol (bME),

có gốc glutathione là một hợp chất chống oxy hóa được sinh tổng hợp bởi các tế bào sống đã được thêm vào môi trường nuôi cấy Sự hiện diện của chất này thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp glutathione và kích thích sự trưởng thành tế bào chất của trứng heo và bò [27] Tuy nhiên trong báo cáo duy nhất về việc thêm chất chống oxy hóa này vào môi trường nuôi chín trứng chó với nồng độ 0,25 mM đã không cải thiện sự hoàn tất giảm phân của trứng chó [45]

2.3.3 Các điều kiện nuôi cấy in vitro

Nuôi cấy trong vi giọt, mật độ nuôi trong vi giọt

Nuôi cấy trong vi giọt là lựa chọn phổ biến để nuôi thành thục trứng ở các loài động vật khác nhau bao gồm cả đối tượng chó Với cách nuôi cấy này, yếu tố sinh

lý chính được tính bởi tỉ lệ thể tích của vi giọt so với số trứng nuôi trên vi giọt Số lượng lớn các tổ hợp trứng-tế bào ổ được nuôi trong vi giọt nhỏ có thể dẫn tới khả năng ức chế sự hoàn tất giảm phân vì những nhân tố này có thể được tiết bởi các tế bào hạt vào môi trường nuôi Những nhân tố này có thể ức chế sự tách ra của các nếp gấp; do đó, ngăn cản trứng trải qua giai đoạn vỡ túi mầm Trên thực tế, sự gián đoạn thông tin giữa trứng và các tế bào hạt được cho là đáp ứng để hoàn tất quá trình giảm phân ở trứng [24] Trứng chó được nuôi trong thể tích môi trường rất khác nhau và mật độ (số lượng trứng / thể tích môi trường) trứng cũng khác nhau Otoi và cs (2001) đã nghiên cứu về hiệu quả của mật độ trứng lên sự hoàn tất giảm phân Kết quả cho thấy ảnh hưởng của mật độ trứng tùy theo các giai đoạn của chu

kỳ sinh dục của chó Trứng chó thu từ buồng trứng ở giai đoạn không động dục được nuôi với mật độ 10 tổ hợp trứng-tế bào ổ/100 µl vi giọt cho thấy tỉ lệ đạt giai đoạn metaphase II cao hơn (16,2%) so với nhóm 5 tổ hợp trứng-tế bào ổ (4,6%) nhưng không có sự khác biệt ở nhóm trứng thu từ buồng trứng của chó ở giai đoạn đình dục Mật độ phù hợp của trứng liên quan tới chu kỳ sinh sản của chó được khuyến cáo là 1:10 ở thời kỳ không động dục và 1:7 ở thời kỳ đình dục [33]

Thời gian nuôi cấy

Thời gian nuôi cấy trứng chó in vitro được báo cáo rất khác nhau (lên tới 120

giờ) nhưng tỉ lệ thành thục hoàn toàn còn thấp và còn nhiều ý kiến trái ngược Do

đó, ở trứng chó, người ta thừa nhận sự đánh giá hoàn tất giảm phân trong giai đoạn trung gian của sự cô đặc nhiễm sắc thể (vỡ túi mầm tới metaphase I) sau thời gian nuôi cấy [5] Việc kéo dài thời gian nuôi cấy có khả năng làm tăng tỉ lệ trứng đạt giai đoạn vỡ túi mầm-metaphase II hơn giai đoạn túi mầm Tuy nhiên, thời gian nuôi kéo dài lại cho thấy tỉ lệ trứng chó thoái hóa cao [26] Để vừa có được ích lợi của việc nuôi cấy trong ống dẫn trứng và giới hạn tỉ lệ thoái hóa cao của cả trứng và ống dẫn trứng sau thời gian nuôi cấy dài, hệ thống nuôi cấy hai bước (nuôi trong ống dẫn trứng cô lập trong 24 giờ và nuôi trong vi giọt trong 48 và 72 giờ) đã được báo cáo bởi Luvoni và cs (2003) Kết quả cho thấy sau 72 giờ nuôi cấy, tỉ lệ trứng chó hoàn tất giảm phân ở nhóm được nuôi cấy bước đầu trong ống dẫn trứng cao hơn so với nhóm nuôi trong vi giọt (74% so với 12,2%) Trứng thoái hóa có vẻ tăng khi tăng tổng thời gian nuôi cấy nhưng trứng được nuôi bước đầu trong ống dẫn trứng cho tỉ lệ thoái hóa sau 72 giờ và 96 giờ (24,4 và 54,8%) thấp hơn tương ứng khi nuôi trong vi giọt (74,3 và 94,8%) [26]

Nhiệt độ nuôi cấy

Về nhiệt độ, trứng chó được nuôi cấy ở nhiệt độ từ 37 đến 39oC tùy theo các tác giả nhưng chưa có thông tin chính thức về việc so sánh ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới kết quả thành thục nhân ở trứng chó

Nồng độ O 2

Đã có những nghiên cứu khẳng định nồng độ O2 của điều kiện nuôi cấy in vitro có

ảnh hưởng tới kết quả nuôi thành thục trứng chuột và trứng bò Kết quả cho thấy mức oxy ở 5% phù hợp hơn mức 20% trong không khí [15] Hiện nay, mới chỉ có một báo cáo duy nhất về ảnh hưởng của nồng độ oxy khi nuôi cấy trứng chó cho rằng 5% hay 20% oxy trong suốt quá trình nuôi trưởng thành với môi trường TCM199 và môi trường CMRL 1066 không có dấu hiệu ảnh hưởng tới sự trưởng thành nhân [45]

2.3.4 Ảnh hưởng của điều kiện sinh lý chó

Tuổi chó

Theo nghiên cứu của Haenisch và cs (2003) cho thấy trứng thu nhận từ buồng trứng của những con chó chưa thành thục về tính (4-6 tháng) thì không có khả năng

nuôi trưởng thành trong điều kiện in vitro Trứng từ những chó đã động dục (đã trải

qua thành thục về tính) mới có khả năng phát triển hoàn tất tới giai đoạn metaphase

II [trích dẫn 19], [45] Tuy nhiên, khả năng phát triển này của trứng giảm đáng kể ở chó cái lớn hơn 7 tuổi [19]

Giai đoạn động dục của chó

Các thông tin báo cáo về mối liên quan giữa các giai đoạn của chu kỳ động dục chó và khả năng phát triển hoàn thiện của trứng chó tới metaphase II vẫn còn nhiều quan điểm trái ngược Một số nghiên cứu cho rằng không có sự liên quan [18], [34], [39], [46], trong khi một số khác đã chứng minh rằng giai đoạn chu kỳ sinh sản ảnh hưởng lớn đến năng lực phát triển của các trứng [23], [33], [41], [57], [59] Tuy nhiên, tất cả các báo cáo đều có chung quan điểm là các trứng thu nhận từ các nang thuộc pha nang noãn hoặc nang tiền rụng (giai đoạn tiền động dục hoặc động dục)

có năng lực phát triển tới metaphase II cao nhất Đặc biệt, trong nghiên cứu của Willingham-Rocky và cs (2003) cho thấy trứng thu nhận từ buồng trứng của chó giai đoạn đình dục có khả năng phát triển tới MII giống như chó giai đoạn động dục [57]

có đường kính 120 µm cao hơn so với các trứng nhỏ hơn [33]

2.4 Kết quả tạo phôi chó in vitro

Do những kết quả hạn chế trong nuôi thành thục trứng chó in vitro nên kết quả

thụ tinh, và nuôi phôi chó cũng rất hạn chế Mahi và Yanagimachi (1976) là nhóm đầu tiên báo cáo về thử nghiệm thụ tinh ống nghiệm ở loài này và thu được khoảng 20-30% trứng thụ tinh được đánh giá thông qua sự hiện diện của tiền nhân đực trong các noãn bào [28] Songsasen và cs (2002) đã thụ tinh trong ống nghiệm đối

với trứng nuôi cấy in vitro và thấy rằng 34% trứng có sự xâm nhập của tinh trùng

(sự thụ tinh được đánh giá bởi sự hiện diện của hai nhân nguyên và một đuôi tinh trùng duy nhất trong tế bào chất trứng) Thông thường, sự thụ tinh được ghi nhận chỉ khoảng 4% tổng số trứng Trong nghiên cứu khác cũng của Songsasen và cs, tác giả thu được 7 phôi giai đoạn 2-12 tế bào sau khi thụ tinh 85 trứng (8,23%) [45] Một nghiên cứu gần đây của Rodrigues và cs (2004) đạt được tỉ lệ thụ tinh 30%, một nửa trong số đó là thụ tinh đa tinh trùng Các tác giả này cũng cho biết tỷ lệ thụ tinh của trứng thu nhận từ chó giai đoạn động dục là 42,5%, giai đoạn không động dục là 34,3% và giai đoạn hoàng thể hóa là 18,6% Tổng số các phôi phát triển sau giai đoạn 8 tế bào trong các nghiên cứu khoảng 10% [41] Trong nghiên cứu khác của Saikhun và cs (2008), tỉ lệ phôi 2 tế bào thu được khi nuôi phôi trong môi trường SOF là 33,6% [43] Cho tới nay, chỉ có Otoi và cs (2001) đã nuôi thành công 1 phôi chó tới giai đoạn phôi nang từ 217 trứng nuôi thành thục trong ống nghiệm (0,46%)

Các công bố về chuyển phôi cũng rất hạn chế [33] England và cs (2001) đã thu nhận trứng từ những chó được kích thích động dục sau đó nuôi cấy trong 24-72 giờ

và thụ tinh Các tác giả đã chuyển 88 phôi giai đoạn 1 và 2 tế bào vào con nhận Kết

quả là có một phôi được ghi nhận nhờ siêu âm vào ngày thứ 20 sau khi chuyển Tuy nhiên, phôi này đã bị hỏng 2 ngày sau đó [trích dẫn 36]

Hiện nay, các nghiên cứu in vitro về sinh sản của chó ở Việt Nam còn hạn chế

cả về số lượng nghiên cứu và kết quả đạt được Hiện chỉ có nhóm của tác giả Quách Tuyết Anh, Trần Thị Dân trường Đại học Nông lâm Tp HCM đã báo cáo kết quả

nuôi thành thục trứng chó in vitro đạt 0,75% [35] Nghiên cứu này sẽ giúp tìm hiểu thêm về các đặc điểm nuôi thành thục trứng chó và thụ tinh cho trứng chó in vitro

Hình 2.5: Phôi chó

thu nhận in vitro ở

các giai đoạn 2 tế bào (A); 4 tế bào (B); 8 tế bào (C);

16 tế bào (D)

(Nguồn: Shaikhun

và cs (2008)

PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm và thời gian

Đề tài được tiến hành tại phòng thí nghiệm Nghiên

cứu và Ứng dụng Tế bào gốc, Trường Đại học Khoa

học Tự nhiên, Tp HCM từ tháng 01/2010 đến tháng

12/2010

Buồng trứng và tinh hoàn chó được thu nhận từ lò

mổ của gia đình anh Hải, số nhà 15/8 Bùi Thị Xuân,

P3, Q Tân Bình, Tp.HCM

3.2 Nội dụng nghiên cứu

Khảo sát khả năng phát triển của trứng và tạo phôi chó theo 3 khoảng thời gian nuôi trứng khác nhau 48, 60 và 72 giờ Kết quả thành thục nhân, tạo phôi được đánh giá tại thời điểm chấm dứt nuôi thành thục trứng ở mỗi lô và sau khi thụ tinh

3.3 Dụng cụ, thiết bị, và hóa chất (Xem phụ lục 1)

3.4 Phương pháp nghiên cứu

Hình 3.1: Chó giống nội

Hình 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Nhuộm, đánh giá trạng thái nhân Thụ tinh

Nhuộm, đánh giá trạng thái nhân Phôi được nuôi tiếp 36h

Nhuộm, đánh giá trạng thái nhân Phôi được nuôi tiếp 36h

Nhuộm, đánh giá trạng thái nhân Thụ tinh

Nhuộm, đánh giá trạng thái nhân Phôi được nuôi tiếp 36h

Thu nhận trứng Nuôi ủ Đ/giá trứng Nuôi ủ Đ/giá trứng thụ tinh

vú và dựa trên những nhận xét của nhân viên lò mổ

Bảng 3.1: Thời gian mọc răng của chó

Răng cửa một, 1 số răng tiền hàm, hàm 4-5 tháng

Dơ và vàng ở các răng phía sau do cao răng 2 năm

(Nguồn: The Merck Veterinary manual, 2006) Buồng trứng được thu nhận tại lò mổ và vận chuyển về phòng thí nghiệm trong nước muối sinh lý ấm bổ sung kháng sinh Buồng trứng được thao tác ngay khi tới phòng thí nghiệm (khoảng 30 phút – 1 giờ sau khi thu nhận từ lò mổ) Những buồng trứng được lựa chọn cho thí nghiệm là những buồng trứng có nang nổi từ 0,5-2 mm Những buồng trứng không có nang nổi hoặc nang nổi to (>4 mm) hoặc có thể vàng đều không được lựa chọn cho thí nghiệm

Tại lò mổ, buồng trứng được thu nhận ngay sau khi chó được giết và được tẩy sạch lông Một đường mổ dài khoảng 3 cm bắt đầu từ rốn kéo xuống bụng được thực hiện với dao mổ số 11 và cán dao số 3 Buồng trứng được lấy ra khỏi ổ bụng

và rửa bằng nước muối sinh lý ấm có bổ sung kháng sinh ,rồi giữ trong dung dịch này và chuyển ngay về phòng thí nghiệm