ĐỀ TÀI " PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG SINH CELLULASE CAO " docx

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN ______***______ KIỀU NGỌC BÍCH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG SINH CEL

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN ***

KIỀU NGỌC BÍCH

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG SINH

CELLULASE CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT

Người hướng dẫn khoa học

TS PHƯƠNG PHÚ CÔNG

HÀ NỘI, 2012

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phương Phú Công

đã định hướng ý tưởng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn nghiên cứu, sửa luận văn

để em hoàn thành luận văn

Em xin chân thành cảm ơn Ths Nguyễn Khắc Thanh - trưởng phòng

Vi Sinh Vật trường ĐH Sư Phạm Hà Nội 2, PGS TS Đinh Thị Kim Nhung và

tập thể cán bộ phòng Vi Sinh Vật trường ĐH Sư Phạm Hà Nội 2 đã tận tình hướng dẫn thí nghiệm, thường xuyên chỉ bảo kiến thức chuyên môn, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp em học tập và rèn luyện trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp đại học

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong khoa Sinh trường

ĐH Sư Phạm Hà Nội 2 đã giảng dạy và tạo điều kiện chu đáo cho em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận

Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người

thân đã động viên giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập để em có được kết

quả như ngày hôm nay

Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quí báu đó !

Hà Nội, tháng 05 năm 2012

Sinh Viên Kiều Ngọc Bích

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng mình Các số liệu, các kết quả thu được trong khóa luận là trung thực, chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình khoa học nào Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Hà Nội, tháng 05 năm 2012

Sinh Viên

Kiều Ngọc Bích

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ BẢNG TRONG LUẬN VĂN DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Các dạng Hyphomycetes

Hình 1.2 Giá sinh bào tử Coelomycetes

Hình 1.3 Cấu tạo một Coelomycetes

Hình 1.4 Các kiểu phát sinh bào tử trần

Hình 1.5 Các kiểu phát triển của bào tử trần

Hình 1.6 Các dạng phát triển của tế bào sinh bào tử trần

Hình 1.7 Cuống sinh bào tử trần

Hình 1.8 Các dạng cuống sinh bào tử trần đặc biệt

Hình 1.9 Một số hình dạng bào tử trần

Hình 1.10 Các hình dạng khác nhau của bào tử

Hình 1.11 Chi Penicillium Link ex Fries Các thành phần của chổi

(bộ máy mang bào tử trần)

Hình 1.12 Cấu tạo cơ quan sinh bào tử trần ở Aspergillus

Hình 1.13 Cấu tạo khuẩn ti và cơ quan sinh bào tử trần của Penicillium

Hình 1 14 Cấu trúc không gian của cellulose

Hình 1.15 Cấu trúc không gian của CMC

Hình3.1 Hoạt tính cellulase của 3 chủng mạnh nhất

Hình 3.2 Một số đặc điểm hình thái của chủng M 4V

Hình 3.3 Một số đặc điểm hình thái của chủng M 151

Hình 3.4 Một số đặc điểm hình thái của chủng M 251

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả và đặc điểm các chủng nấm mốc phân lập được

Bảng 3.2 Kết quả thử hoạt tính 25 chúng nấm mốc phân lập được

A.glaucus : Aspergillus glaucus

A.restricus : Aspergillus restricus A.cervinus : Aspergillus cervinus A.ornatus : Aspergillus ornatus

A.nidulans : Aspergillus nidulans A.versicolor : Aspergillus versicolor Austus : Aspergillus ustus

A.flavipes : Aspergillus flavipes

A.wentii : Aspergillus wentii

A.flavus : Aspergillus flavus

A.niger : Aspergillus niger

A.ocharaceus : Aspergillus ocharaceus

A sparsus : Aspergillus sparsus

A cremeus : Aspergillus cremeus

A candidus : Aspergillus candidus

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích của đề tài 2

3 Nội dung của đề tài 3

4 Ý nghĩa khoa học của đề tài 3

5 Điểm mới của đề tài 3

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương về nấm mốc 4

1.1.1 Nấm bất toàn (Deuteromycetes) 4

1.1.1.1 Hyphomycetes 5

1.1.1.2 Coelomycetes 5

1.1.1.3 Agonomycetes 7

1.1.2 Các kiểu phát triển bào tử trần trong sự phát sinh bào tử dạng nảy chồi 8

1.1.3 Sự phát triển của các tế bào sinh bào tử trần 8

1.1.4 Cuống sinh bào tử trần 9

1.1.5 Bào tử trần 10

1.2 Chi Aspergillus Micheli ex Fries 11

1.2.1 Tình hình nghiên cứu phân loại Aspergillus trên thế giới 11

1.2.2 Đặc điểm sinh học của Aspergillus 15

1.3 Sơ lược về Penicillium 17

1.4 Cellulose va cellulase 19

1.4.1 Celulose 19

1.4.2 Cellulase 21

1.4.3 Ứng dụng của cellulase 1.4.3.1 Ứng dụng enzyme cellulase trong chế biến thực phẩm 22

1.4.3.2 Trong công nghệ sử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh 23

1.5 Các nhóm vi sinh vật phân giải cellulose 24

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 26

2.1.1 Mẫu phân lập 26

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng cho nghiên cứu 26

2.2 Môi trường 27

2.3 Phương pháp nghiên cứu 27

2.3.1 Phương pháp phân lập 27

2.3.1.1 Thu thập mẫu 27

2.3.1.2 Chuẩn bị môi trường phân lập và bảo quản 27

2.3.1.3 Tiến hành phân lập 28

2.3.2 Phương pháp thử hoạt tính 30

2.3.2.1 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp cấy chấm điểm 30

2.3.2.2 Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch ( William, 1983) 30

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu định loại (Maren A Klich, 2002) 31

2.3.3.1 Phương pháp cấy chấm điểm các chủng nấm mốc lên môi trường Crapek- Dox cơ sở để nghiên cứu các đặc điểm vĩ mô 31

2.3.3.2 Phương pháp cấy trên khối thạch để quan sát các đặc điểm vi mô (Robert A Samson and Ellen S Hoekstra, Jens C Frisvad and Filtenborg,

1996) 31

2.3.4 Phương pháp quan sát các đặc điểm phân loại 32

2.3.4.1 Quan sát các đặc điểm vĩ mô sau đây bằng mắt thường hoặc dưới kính hiển vi soi nổi 32

2.3.4.2 Quan sát các đặc điểm vi mô dưới kính hiển vi quang học và chụp ảnh qua kính hiển vi ( Axioskop) 33

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1.1 Kết quả phân lập 34

1.2 Kết quả thử hoạt tính 35

1.3 Kết quả định loại sơ bộ 37

1.3.1 Bản mô tả chủng M4V 37

1.3.2 Bản mô tả chủng M151 40

1.3.3 Bản mô tả chủng M251 43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Từ trước đến nay, chăn nuôi luôn có vai trò quan trọng đối với nền nông nghiệp nước ta, giá trị chăn nuôi chiếm tỷ trọng khá, trên 27% cơ cấu của toàn ngành và tăng trưởng mỗi năm (giai đoạn 2001 - 2009) đạt 7-8% Trong chăn nuôi việc tìm giải pháp nào để tăng năng suất vật nuôi, nâng cao hiệu suất

sử dụng các chất dinh dưỡng trong thức ăn ở mức cao nhất và đặc biệt là không

có hại đến sức khỏe con người là vấn đề đang cần được quan tâm Một trong những giải pháp được đưa ra là có thể sử dụng các chế phẩm enzyme ( gồm nhiều loại enzyme, trong đó có cellulase) [2]

Nguồn thức ăn cung cấp năng lượng cho gia súc và gia cầm chủ yếu là ngũ cốc và phụ phẩm của ngũ cốc Ngoài protein, lipit, chất dinh dưỡng cung cấp năng lượng chủ yếu của ngũ cốc và phụ phẩm là carbohydrate Trong đó, các polysaccharide gồm cellulose, β-glucan là các chất chứa cầu nối β-1,4 glucoside Các chất này làm tăng độ nhớt trong ruột, cản trở tế bào vách ruột hấp thụ các chất dinh dưỡng Các chất này có trong vách tế bào thực vật, ngăn trở các enzyme nội sinh tiếp cận với các chất dinh dưỡng như protein, tinh bột và lipit

có trong bào chất, từ đó cản trở sự tiêu hóa, hấp thụ các chất dinh dưỡng này

Bổ sung cellulase, β-glucanase trực tiếp vào thức ăn sẽ cho phép tăng khả năng hấp thu và chuyển hóa thức ăn của động vật.[3], [7]

Việc ứng dụng phức hệ cellulase trong phân giải các nguồn thức ăn giàu cellulose như rơm, rạ, bã mía, bã khoai, bã sắn đã và đang được triển khai ở nhiều nước, trong mọi lĩnh vực như sản xuất protein đơn bào làm thức ăn cho gia súc Trong lĩnh vực này, nấm sợi thường được sử dụng lên men các nguồn

phế thải giàu cellulose tạo ra sinh khối protein chứa hàm lượng các amino axit cân đối, các vitamin và tạo hương thơm có lợi cho tiêu hóa của vật nuôi [7]

Hàng năm, hoạt động trong ngành chăn nuôi đã thải ra môi trường hàng trăm ngàn tấn phế phẩm có thành phần chủ yếu là cellulose, hiện đã và đang là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường Nếu không có biện pháp

xử lý thì đây sẽ là nguồn gây ô nhiễm môi trường

Một số vi sinh vật có khả năng sinh cellulase như vi khuẩn, nấm mốc Cellulase từ vi khuẩn trong nhiều trường hợp được nghiên cứu có hoạt tính cao hơn cellulase từ nấm mốc Tuy nhiên, nhìn chung vi khuẩn sản xuất enzym ngoại bào số lượng thấp hơn nấm mốc Nấm mốc là vi sinh vật hiếu khí, nhân chuẩn

dị dưỡng, chúng thường có mặt trong đất, xác động thực vật và không khí Một

số loài nấm mốc có khả năng tổng hợp ra các enzyme, axit hữu cơ, vitamin, các

kích thích tố tăng trưởng động thực vật như: Aspergillus niger, Aspergillus hennebergii [4], [6], với khả năng chống chịu pH và khả năng sử dụng nguồn

cacbon, nguồn nitơ tốt

Do đó tôi chọn đề tài “ Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các đặc điểm hình thái của một số chủng nấm mốc có khả năng sinh cellulase cao” để nghiên cứu

3 Nội dung của đề tài

Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh cellulase trên các phế phụ phẩm nông nghiệp ở miền Bắc Việt Nam ( Mỹ Đức- Hà Nội,

Tam Dương – Vĩnh Phúc )

Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái của chủng nấm mốc có khả năng

sinh cellulase

Định loại chủng mốc có khả năng sinh cellulase cao, nhằm chọn những chủng

nấm mốc thuộc danh mục an toàn (thường dùng trong công nghệ sinh học)

4 Ý nghĩa của đề tài

4.1 Tìm hiểu sự đa dạng của các chủng nấm mốc có khả năng sinh

cellulase trên các phế phụ phẩm nông nghiệp ở miền Bắc Việt Nam

4.2 Nâng cao khả năng nghiên cứu các đặc điểm phân loại của một số chủngnấm mốc có khả năng sinh cellulase ở Việt Nam

4.3 Tìm ra những chủng nấm mốc thuộc danh mục an toàn sinh học có

khả năng sinh cellulase cao nhằm ứng dụng có các nghiên cứu tiếp theo

5 Điểm mới của đề tài

Trong các chủng nấm mốc phân lập được, dựa theo phương pháp phân

loại truyền thống, tôi xác định được chủng M 251 thuộc loài Aspergilus niger,

đây là loài thuộc danh mục an toàn sinh học, có tiềm năng ứng dụng cao trongsản xuất enzyme bổ sung vào thức ăn vật nuôi

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương về nấm mốc

Phần lớn nấm mốc thuộc nhóm phân loại Deuteromycetes, một số là dạng sinh sản vô tính của các nhóm nấm túi (Ascomycetes) hoặc nhóm nấm đảm (Basidiomycetes) Deuteromycetes bao gồm khoảng 2400 chi trong đó có 1700 chi thuộc nhóm nấm Hyphomycetes và 700 chi thuộc nhóm Ceolomycetes Theo E.Kiffer, M Morelet, 2000, trong số các chi nấm thuộc tổ chi Phialoconidiae ( lớp phụ Euhyphomycetidae, lớp Hyphomycetes, ngành phụ Deuteromycetes) thì chi Penicillium có số loài nhiều nhất là khoảng 223 loài, tiếp theo là chi Aspergillus có khoảng 185 loài [16]

1.1.1 Nấm bất toàn (Deuteromycetes)

Nấm bất toàn là giai đoạn vô tính của nấm túi hoặc nấm đảm Theo hệ thống phân loại căn cứ vào đặc điểm phát sinh của bào tử trần của Hughes (1953) Lớp nấm bất toàn được chia thành 3 nhóm:

Nhóm Hyphomycetes: Gồm các nấm bất toàn không có túi giá và đĩa giá

(giá sinh bào tử trần ở trên các sợi nấm hoặc các sợi nấm kết lại thành bó sợi, bó giá)

Nhóm Coelomycetes: Gồm các nấm bất toàn có túi giá hoặc đĩa giá, giá

bào tử trần ở trong các thể quả (Fruit - body) gọi là các conidiomata

Nhóm Agonomycetes: Gồm các nấm bất toàn không có bào tử trần Ở đây

chúng tôi giới thiệu 2 khoá phân loại đến chi của lớp nấm bất toàn

Phân lớp của nấm bất toàn

1.1.1.1 Hyphomycetes (moniliaales- nấm bông, 1700 chi, 11000 loài)

Các dạng hệ sợi nấm mang các bào tử trên sợi riêng rẽ hoặc trên cụm sợi nấm (như các đệm nấm, các bó giá), nhưng không ở trong các conidiomata (fruit body) riêng biệt

Hình 1.1 Các dạng Hyphomycetes

1.1.1.2 Coelomycetes (nấm xoang, 700 chi, 9000 spp) riêng rẽ

Bào tử trần sinh ra trong các túi giá, đĩa giá, túi giá dạng cốc hoặc đệm giá

Hình 1.2 Giá sinh bào tử Coelomycetes

Hình 1.3 Cấu tạo một Coelomycetes

1 Bào tử trần, 2 Tế bào sinh bào tử trần, 3 Cuống sinh bào tử trần, 4 Sợi nấm

Những bộ phận sinh sản vô tính

Hypha (sợi nấm): Một trong các sợi trong hệ nấm là các tản của một sợi nấm Các tản khác biệt với các phần sợi sinh dưỡng hấp phụ chất dinh dưỡng

Bào tử trần: Một tế bào bất kỳ mà từ đó một bào tử được sinh ra trực tiếp

Các kiểu phát sinh bào tử trần: Tản (a ), nảy mầm ( b)

Hình 1.4 Các kiểu phát sinh bào tử trần

1.1.1.3 Agonomycetes( mycelia sterilia - nấm bất thụ)

Agonomycetes không có khả năng sinh sản bằng bào tử Một số tạo thành

cấu trúc gọi là sclerotina, các bào tử áo (chlamydospore ) hoặc các tế bào dày ( tế bào Hulle) Nói chung đây là nhóm không có các đặc điểm đặc trưng để phân loại ( Erick H.C.Mckenzie, 2004; Michael J.Carlie, Sarah C Watkinson, Graham, 1994) [18], [19]

Năm 1995, Hughes đã đưa ra khóa phân loại có tính liên kết và tổng quát

hơn về nhóm Hyphomycetes Ông chia nhóm này thành 8 tổ chi dựa vào đặc

điểm của giá bào tử trần ( conidiophores) và bào tử trần ( conidia) Năm 1968, Baron lại đưa ra một khóa phân loại khác hoàn chỉnh hơn mà ngày này nhiều nhà nấm học vẫn sử dụng (H.L.Barneet & Barry B Hunter, 1973), trong đó các đặc điểm của conidia, các kiểu tạo thành conidia từ các tế bào sinh ra nó, sự tiến hóa của các tế bào conidia và các tế bào sinh ra nó là những đặc điểm quan trọng

để phân loại ( Erick H.C Mckenzie, 2004; E Kifer & N Morelet, Robert K Noyd, 2000) [18], [16], [21]

Gần đây, trong các khóa phân loại của mình E Kifer & N Morelet, Robert

K Noyd ( 2000) [16], [21] đã kết hợp khóa phân loại của Saccardo ( 1880 –

1884) và Grove ( 1919) để phân chia Deuteromycota thành 2 lớp lớn là Hyphomycetes và Coelomycetes dựa vào cách sắp xếp của các giá bào tử trần

Lớp Hyphomycetes: đặc trưng bởi các giá bào tử trần ( condiophores) tạo

ra trên sợi nấm, không tạo thể quả vô tính

Lớp Coelomycetes: các giá bào tử trần ( conidiophores) được sinh ra trong

các thể quả vô tính (axesual ascomata)

1.1.2 Các kiểu phát triển bào tử trần trong sự phát sinh bào tử dạng nảy chồi

(blastic) (Theo Katsuhiko Ando, 2002) [15]

Sự phát sinh bào tử phân cắt hoàn toàn: Kiểu bào tử đính (Aleurio - type), một điểm trên tế bào sinh bào tử trần, bào tử đơn độc (H.1.5a ) Kiểu nảy chồi (Blasto - type): Cấu trúc màng đỉnh ở vị trí trên tế bào sinh bào tử trần và chuỗi bào tử với một vị trí để tạo thành mộ chuỗi liên tiếp không phân nhánh (chuỗi gốc già) ( H.1.5b )

Hình 1.5 Các kiểu phát triển của bào tử trần

Phát sinh bào tử nội sinh: Dạng bình (Phialo - type), Các chuỗi bào tử ra khỏi tế bào sinh bào tử trần ở cùng một vị trí, đôi khi trong các chuỗi rời tế bào

có thay đổi ( H.1.5c) Dạng phân đốt (Annello - type), Các chuỗi bào tử ra khỏi

tế bào sinh bào tử trần ở các vị trí cao hơn, thỉnh thoảng trong các chuỗi rời, tế bào có thay đổi (H.1.5d )

1.1.3 Sự phát triển của các tế bào sinh bào tử trần

Tế bào sinh bào tử trần phát triển theo nhiều kiểu: Kiểu ổn định, kích thước của tế bào sinh bào tử trần là ổn định (H1.6a) Kiểu kéo dài, tế bào sinh bào tử trần phát triển cùng với sự sản sinh các bào tử trần (H1.6b) Kiểu giảm

dần, độ dài các tế bào sinh bào tử trần giảm đi khi mỗi bào tử trần được sinh ra (H1.6c)

Hình 1.6 Các dạng phát triển của tế bào sinh bào tử trần

1.1.4 Cuống sinh bào tử trần

Một sợi nấm phân nhánh hoặc đơn giản (một sợi nấm sinh sản) mang hoặc gồm có các tế bào sinh bào tử trần mà từ đó các bào tử trần được sinh ra Đôi khi được dùng khi mô tả những cấu trúc biến đổi đối với các tế bào sinh bào tử trần

Hình 1.7 Cuống sinh bào tử trần

Có nhiều dạng: dạng có hoặc không có vách ngăn đơn giản không phân nhánh ( H1.8c), dạng cuống sinh bào tử trần kéo dài cùng với việc sinh bào tử trần (H1.8d ), dạng cuống có vách ngăn, phát triển đơn độc hoặc phân nhánh

(H1.9d ) Bào tử dạng chữ thập, bào tử có nhiều trục, có mấu, có lông mềm chiếm 1/4 chiều dài của bào tử (H1.9e)

Hình 1.9 Một số hình dạng bào tử trần

1.2 Chi Aspergillus Micheli ex Fries

1.2.1 Tình hình nghiên cứu phân loại Aspergillus trên thế giới

Chi Aspergillus do Micheli mô tả lần đầu tiên năm 1729, sau đó năm

1809, Link đã mô tả loài Aspergillus glaucus và loài nấm túi Eurotiumherbariorum được phát hiện trên cùng một tiêu bản mẫu cây khô Fries

( 1832) đã công nhận chi nấm này của Micheli De Bary ( 1850) phát hiện ra

rằng, giai đoạn bào tử trần của Eurotium herbariorum chính là Aspergillus glaucus Như vậy, theo Luật pháp Quốc tế và danh pháp thực vật, chi Aspergillus chính thức mang tên Aspergillus Micheli ex Fries

Chuyên luận về chi Aspergillus xuất bản gần đây nhất và vẫn đang được

sử dụng rộng rãi để định loại các loài của chi nấm này là chuyên luận của

Raper và Fennell (1965) Hệ thống phân loại chi Aspergillus của Raper và

Fennell (1965) [24] gồm 132 loài (đã được chấp nhận) và được xếp vào 18 nhóm loài (Robert A Samsom, 1999) [25] , đến nay vẫn ổn định và được sử dụng rộng

rãi, về cơ bản không sửa đổi, mặc dù cho đến nay một số loài mới thuộc chi nấm

này đã được công bố với số loài hiện biết là 185 loài Aspergillus (E Kifer & N

Morelet; Robert K Noyd, 2002) [16], [21]

Để có thể xử lý phân loại một số lượng lớn các loài thuộc chi này, các nhà

nghiên cứu trước đây đã chia nó ra thành các nhóm loài (group) hoặc các thứ

(series) dựa trên màu sắc bào tử, hình dạng và kích thước của bọng đỉnh giá, sự

có mặt của trạng thái hữu tính (Raper và Fennell ,1965) [24] Năm 1985, Gams

và cộng sự đề nghị đổi các nhóm loài (group) thành các chi phụ (subgenera) và

các tổ chi (sections) để cho nó phù hợp với danh pháp thực vật hơn Dưới đây là

phần tóm tắt hệ thống phân loại chi Aspergillus hiện đang được sử dụng rộng rãi

(Maren A Klich, 2002) [17] Ở đây chúng tôi bổ sung tên các nhóm loài ( group) tương đương trong chuyên luận của Raper và Fennell, 1965 [24]

Chi Aspergillus Micheli ex Fries

Chi phụ Aspergillus: thể bình dạng đơn tầng ( uniseriate), ưa khô, bào tử

màu lục xám

Tổ chi ( Section) Aspergillus ( tương đương với A.glaucus Group): dạng

hữu tính eurotium, thể quả (cleistothecia) màu vàng với thành là một lớp tế bào

nhu mô giả hình đa giác, bào tử túi (ascospore) trong suốt

Tổ chi ( Section) Restricti ( tương đương vói A.restricus Group): chỉ có

dạng vô tính, sinh trưởng chậm trên tất cả các môi trường

Chi phụ Fumigati: dạng thể bình đơn tầng Bọng đỉnh giá thương có hình

quả lê, bào tử màu lục xám, lục xanh đến màu cam

Tổ chi (Section) Fumigati ( tương đương với A.fumigatus Group): bào tử

màu lạc xám đến lục xanh

Tổ chi (Section ) Cervini ( tương đương với A.cervinus Group) : bào tử

cam nhạt đến cam xám

Chi phụ Ornati : thể bình dạng đơn tầng, bào tử màu lục xám, lục vàng

hoặc nâu olive

Tổ chi (Section) Ornati ( tương đương với A.ornatus Group): giống với

chi phụ

Chi phụ Clavati: Thể bình dạng đơn tầng, bọng đỉnh giá chủ yếu hình

chùy, bào tử có màu lục xám

Tổ chi ( Section) Clavati (tương đương với A.nidulans Group): giá bào tử

trần ngắn, thường nâu, bào tử lục, thường có tế bào Hulle, đa số các loài có trạng

thái hữu tính Emericella Thể quả có thành mềm, bao quanh bởi tế bào Hulle,

bào tử màu đỏ đến tía

Tổ chi (Section ) Versicolores (tương đương với A.versicolor Group): giá

bào từ trong suốt đến nâu, bào tử lục, lục xám hoạc lục xanh

Tổ chi (Section ) Usti (tương đương với A.ustus Group): giá bào tử trần

màu nâu, bào tử màu đỏ đục, nâu hoặc olive

Tổ chi (Section ) Terrei (tương đương với A.terreus Group): giá bào tử

trần trong suốt, bào tử màu da bò, đến cam nâu

Tổ chi (Section) Flavipedes ( tương đương với A flavipes Group): giá

bào tử trần trong suốt đến nâu nhạt, bào tử màu trắng đến da bò

Chi phụ Circumdati: thể bình dạng lưỡng tầng hoặc đơn tầng, bọng giá

hình cầu cho đến hình quả lê

Tổ chi (Section) Wentii (tương đương với A.wentii Group): bào tử màu da

bò, nâu vàng cho đến nâu olve

Tổ chi (Section) Flavi (tương đương với A flavus Group): bào tử màu lục

vàng đến nâu olive

Tổ chi (Section) Nigri (tương đương với A.niger Group): giá bào tử trần

có thành nhẵn, bào tử đen hoặc gần đen

Tổ chi ( Section) Circumdati (tương đương với A.ocharaceus Group): thể

bình thường là dạng lưỡng tầng, bào tử vàng

Tổ chi ( Section) Candidi (tương đương với A.candidus Group): bào tử

trắng hoặc gần trắng

Tổ chi ( Section) Cremel (tương đương với A.cremeus Group): bào tử

nâu, vàng hoặc xanh lục

Tổ chi ( Section) Sparsi (tương đương với A.sparsus Group): bào tử xám

nhợt đến màu olive

Chi phụ Stilbothamnium: đặc điểm nổi bật là các giá bào tử trần tập hợp

thành bó, dạng cụm lớn, thẳng Chi phụ này được thiết lập bởi Samson và Seifert năm 1985 (J.E.Smith, 1994) Tuy nhiên, sự sắp đặt của một số loài và sự tồn tại

của một số nhóm loài này vẫn đang có nhiều tranh cãi ( Ozakiewiez, 1989; Samson & Frisvad, 1991; Peterson, 2000 [25]

1.2.2 Đặc điểm sinh học của Aspergillus

Các đặc điểm đặc trưng của chi Aspergillus Micheli ex Friex

Hệ sợi nấm gồm các sợi có vách ngăn phân cách,, không màu, màu nhạt, hoặc một số trường hợp trở nên nâu hay màu sẫm khác ở vùng nhất định của khuẩn lạc

Sinh sản vô tính bằng bào tử trần (conidia) Cũng như các loại nấm bất toàn khác, hình thái cơ quan sinh bào tử trần là một đặc điểm chủ yếu, đặc trưng dùng trong phân loại chi nấm này

Các đặc điểm cơ quan sinh bào tử trần

Cơ quan sinh bào tử trần phát triển tử một tế bào đặc biệt gọi là tế bào chân (foot- cell) có đường kính lớn hơn, màng dày hơn các tế bào lân cận của sợi nấm Tử tế bào chân phát triển thành giá bào tử trần ( condiophore hay stipe) Giá bào tử trần có thể có vách ngăn, bề mặt nhẵn hoặc không nhẵn, trong suốt hoặc có màu, dài hay ngắn tùy thuộc vào loài Phần ngọn của giá bào tử phình rộng tạo thành bọng định giá ( versicle) Bọng định giá có thể có nhiều hình thái

khác nhau, đây là một đặc điểm đặc trưng đế phân loại Aspergillus với các loại nấm Hyphomycetes khác, đặc biệt với các chi Penicillium

Bọng đỉnh giá có thể có hình cầu, hình bán cầu, hình chùy, hình quả bầu, hình bàn chang

Từ bọng đỉnh giá sinh ra các tế bào sinh bào tử trần gọi là thể bình ( phialide) Nếu các thể bình sinh ra trực tiếp từ bọng đỉnh giá thì gọi là dạng đơn

tầng (uniseriate) Nếu các thể bình được sinh ra qua một lớp tế bào gốc xuất phát

từ bọng đỉnh giá ( lớp cuống thể bình, metulae) thì gọi là dạng lưỡng tầng ( biseriate) Philade hoặc metulae mọc trên bọng đỉnh giá cũng là đặc điểm đặc

trưng để phân biệt Aspegillus với các chi có quan hệ gần gũi với nó Từ thể bình

sinh ra các bào tử trần (conidia) Bào tử trần không có vách ngăn, khác nhau về

hình dạng, kích thước, màu sắc ở các loài khác nhau

Hình 1.10 Các kiểu cuống bào tử đính của Aspergillus: a 1 lớp - b 2 lớp - c

phiến - d tia, e tể (theo Samson và ctv., 1995)

Ở một số loài Aspergillus người ta đã tìm thấy hình thức sinh sản hữu tính

(telrmorph) của chúng, các loài này được xếp vào các chi của nấm túi như

Emercella, Eurtium, Neosartorya và một số chi khác (Raper & Fennell, 1965;

Samson, 1979) [17]

Đặc điểm đặc trưng của nhóm loài Aspergillus niger

Theo khóa phân loại chi Aspergillus (Raper & Fennell, 1965; Al-

Musallam, 1980; Domsch et al; 1980; Klich & Pitt; Kozakiewiez, 1989; Tzean et al., 1990; Parenicova, 2000 và Maren A Krick, 2002) [17], [24] thì nhóm loài

Aspergillus niger có những đặc điểm nổi bật sau:

Bông nấm (conidial head): dạng màu đen tối, đen hơi lục, đen hơi nâu, đen tía hoặc đen cacbon; có hình cầu hoặc phóng xạ hoặc chia ra thành các cột không đều, đặc Giá bào tử trần ( conidiophore, stipe): thường nhẵn hoặc hơi ráp ở một

số loài, thành thường dày Bọng đỉnh giá (vesicle): hình cầu hoặc gần cầu.Các lớp thể bình (seriation): đơn tầng hoặc lưỡng tầng tùy ở từng loài Bào tử trần (conidia): hình cầu, gần cầu, elip, nhẵn hoặc gần nhẵn, hơi ráp hoặc ráp.Hạch nấm: hình cầu đến cầu, màu kem khi non, khi già màu lông bò hoặc hồng hoặc nâu

1.3 Sơ lƣợc về Penicillium

Theo E Kiffer, M Morelet, 2000, trong số các chi nấm thuộc tổ chi

Phialoconidiae ( lớp phụ Euhyphomycetidae, lớp Hyphomycetes, ngành phụ Deuteromycotina) thì chi Penicillium có số loài nhiều nhất là khoảng 223 loài,

chúng phân bố khắp nơi trên trái đất, cư trú ở trên rất nhiều các ổ sinh thái.[16]

Theo Bùi Xuân Đồng và Nguyễn Huy Văn (2001: 186-187) [1] chi

Penicillium đặc trưng bởi các đặc điểm:

Sợi nấm ngăn vách, phân nhánh, không màu hoặc màu nhạt, đôi khi màu sẫm Khuẩn lạc màu lục, vàng lục, xanh lục, lục xám, xám, đôi khi có màu vàng,

đỏ, tím hoặc trắng Mặt trái khuẩn lạc không màu hoặc có màu sắc khác nhau, môi trường thạch nuôi cấy không màu hoặc có màu sắc do có mặt các sắc tố hòa tan tương ứng Bộ máy mang bào tử trần (còn gọi là "chổi", penicillius) hoặc chỉ gồm giá bào tử trần với một vòng thể bình ở đỉnh giá, hoặc gồm giá bào tử trần với hai đến nhiều cuống thể bình (metulae) ở phần ngọn giá, trên đỉnh của mỗi cuống thể bình đó có các thể bình (cấu tạo hai vòng, biverticillate) Giá bào tử trần có thể phát triển từ các sợi nấm nằm sát cơ chất, sát mặt môi trường thạch nuôi cấy (các sợi nền), khi đó thường có chiều dài đều nhau và khẩn lạc có dạng mặt nhung (velutinate) Bào tử trần cũng như giá bào tử trần, các nhánh, các cuống thể bình, các thể bình tùy từng loại có mặt ngoài nhẵn, ráp, có gai hoặc sần sùi, gồ ghề

Hình 1.11 Chi Penicillium Link ex Fries Các thành phần của chổi

(bộ máy mang bào tử trần)

1.4 Cellulose va cellulase

1.4.1 Cellulose

Cellulose là polysaccarit chủ yếu của thành tế bào thực vật Trong bông nó chiếm trên 90%, còn trong gỗ hơn 50% Ngoài ra, người ta còn thấy chúng có nhiều ở tế bào một số loài VSV Ở tế bào thực vật và ở tế bào một số loài VSV, chúng tồn tại ở dạng sợi Khi đun sôi với axit sulfuric đặc, cellulose sẽ chuyển thành glucose còn khi thủy phân trong điều kiện nhẹ nhàng sẽ tạo thành disacarit cellobiose [12]

Cellulose không có trong tế bào động vật Chúng là một homopolimer mạch thẳng, được cấu tạo bởi các β-D-glucose-pyranose Các thành phần này liên kết với nhau bởi liên kết β-1,4 glucoside Tinh bột cũng được cấu tạo bởi các glucose này và bằng liên kết β-1,4 glucoside Điểm khác biệt là tinh bột chứa các gốc glucose phân nhánh còn cellulose chứa các glucose không phân nhánh Các gốc glucose trong cellulose thường lệch một góc 1800 và có dạng như một chiếc ghế bành Cellulose thường chứa 10.000-14.000 gốc đường và được cấu tạo như sau: [12]

Hình 1 12 Cấu trúc không gian của Cellulose

Trọng lượng phân tử của cellulose khoảng từ 50000-2500000 Dalton Các phân tử cellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút Vandervan và liên kết