ẢNH HƯỞNG CỦA TUỔI BÒ ĐẾN SỐ LƯỢNG VÀ CHẤT LƯỢNG TẾ BÀO TRỨNG CHỌC HÚT BẰNG SIÊU ÂM Phan Lê Sơn 1 , Nguyễn Thị Thoa 2 , Lưu Công Khánh 1 , Chu Thị Yến 1 , Nguyễn Thị Hương 1 , Phạm Kh
Trang 1ẢNH HƯỞNG CỦA TUỔI BÒ ĐẾN SỐ LƯỢNG VÀ CHẤT LƯỢNG
TẾ BÀO TRỨNG CHỌC HÚT BẰNG SIÊU ÂM
Phan Lê Sơn 1 , Nguyễn Thị Thoa 2 , Lưu Công Khánh 1 , Chu Thị Yến 1 , Nguyễn Thị Hương 1 ,
Phạm Khánh Vân 2 và Lưu Thị Ngọc Anh 2
1
Bộ môn Sinh lý Sinh hóa và Tập tính vật nuôi 2
Phòng thí nghiệm trong điểm Tế bào động vật
*Tác giả liên hệ: Phan Lê Sơn - Bộ môn Sinh lý Sinh hóa và Tập tính vật nuôi
Viện Chăn nuôi - Thụy Phương - Từ Liêm - Hà Nội Tel: (04) 38.385.940 /0914551149 ; Email: sonphanle@yahoo.com
ABSTRACT
Effect of cow ages on oocyte quantity and quality
Phan Le Son*, Nguyen Thi Thoa, Luu Cong Khanh, Chu Thi Yen, Nguyen Thi Huong, Pham Khanh Van and Lưu Thi Ngoc Anh
The aim of this study was examin the possible effect of age of doner cows on oocytes quantity and quality Two
groups of Holstein Friese cows of 3 and six years were used For this study ovum pick up was conducted twice a
weeks It was found that number of follicles with diameter of 2 to ≥ 9mm obtained from 3 year old cows was
higher than that from 6 year old cows (10.35 vs 9.63) p<0.05 Similarly, number of oocyte/ovary otained from 3
year old cows was higher than that from 6 year old cows (7.2 vs 6.78) (p< 0.05) The number of oocytes
qualified as A,B Grade, Which can be use for maturation , fertiliration and culturewas higher in cows of 3 year
old (5.39 vs 5.12) than that in cows of 6 year old It was conluded that the younger the cows were, the greater the
quantity and quality of oocytes were.
Key word: occyte, ovum pick up, follicle
ĐĂT VẤN ĐỀ
Số lượng, chất lượng, nguồn gốc tế bào trứng đóng một vai trò hết sức quan trọng trong việc
phát triển các công nghệ sinh sản như sản xuất phôi in-vitro, vi tiêm, cloning, chuyển gen,
thành lập ngân hàng tế bào trứng,…Trước đây tế bào trứng để phục vụ nghiên cứu và sản suất
phôi bò ở nước ta được lấy từ lò mổ nên chất lượng di truyền của phôi rất thấp, khả năng triển
khai vào sản xuất rất hạn chế do ở Việt Nam bò được giết thịt ở các lò mỏ chủ yếu là bò vàng,
bò lai sind có khả năng di truyền và chất lượng tế bào trứng rất kém Hiện nay kỹ thuật siêu
âm hút tế bào trứng từ bò sống đã thành công, cho phép chúng ta có được số lượng và chất
lượng tế bào trứng tốt của bò cho Tế bào trứng có giá trị di truyền cao, chủ động được thời
gian, do vậy chất lượng phôi tốt, dễ triển khai sản suất, thu được sản phẩm có chất lượng cao,
khai thác tối đa tiềm năng sinh sản Theo Hansel (2003) siêu âm hút tế bào trứng và thu được
10,4 tế bào trứng/bò cho tế bào trứng, với 40% phôi dâu và phôi nang thu được sau khi nuôi
chín và thụ tinh ống nghiệm thu được 4 phôi/tuần hay có ít nhất 200 phôi/bò/năm Kết quả
này cao hơn nhiều khi thu phôi in vivo bằng phương pháp gây rụng trứng nhiều 5,9 phôi/lần
hay 35 phôi/bò/năm (Thibier, 2001) Siêu âm hút tế bào trứng chịu ảnh hưởng của rất nhiều
yếu tố trong đó tuổi bò cho tế bào trứng đóng vai trò hết sức quan trọng, liên quan mật thiết
đến sinh lý sinh sản cũng như khả năng cho tế bào trứng Nhằm xác định được mức độ ảnh
hưởng của tuổi bò đến số lượng và chất lượng tế bào trứng thu được
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu
4 bò sữa HF thuần, có độ tuổi từ 3 (n=2) tuổi và từ 6 tuổi (n=2), có năng suất sữa ≥ 5000 lít
sữa/chu kỳ Được nuôi dưỡng và chăm sóc trong cùng một điều kiện chăn nuôi, cho ăn 50 kg
cỏ tươi và 4 kg thức ăn tinh mỗi ngày
Trang 2Nội dung nghiên cứu
Xác định ảnh hưởng của tuổi bò lên số lượng nang trứng
Xác định ảnh hưởng của tuổi bò lên số lượng tế bào trứng thu được
Xác định ảnh hưởng của tuổi bò lên chất lượng tế bào trứng thu được
Phương pháp nghiên cứu
Chuẩn bị bò: Sau khi lắp đặt xong hệ thống máy siêu âm và nhiệt độ của môi trường hút tế
bào trứng (trong bình ổn nhiệt) được làm ấm lên 37oC Bò cho tế bào trứng được cố định, gây
tê cục bộ bằng cách tiêm 4 - 6 ml lidocain 2% vào khấu đuôi, lấy hết phân, rửa sạch và sát khuẩn khu âm đạo và khu vực xung quanh bằng cồn 70o
Xác định số lượng và kích thước nang trứng
Cho đầu giò siêu âm vào trực tràng, cố định buồng trứng, đưa buồng trứng về phía mặt quét của đầu giò siêu âm Nhẹ nhàng xoay, đếm và đo kích thước nang trứng có mặt trên buồng trứng qua màn hình của máy siêu âm Quá trình đo, đếm cần thực hiện tỉ mỉ, chính xác và ghi chép cẩn thận
Hút tế bào trứng
Siêu âm hút tế bào trứng được thực hiện sử dụng kim 18 G dài 55 cm, áp suất 120 mmHg và tần suất 2 lần/tuần Môi trường hút tế bào trứng (mDPBS của Sigma) có bổ sung 2% heparin
và 5% huyết thanh bê và kháng sinh (100.000iu penicilin/ml + 100l streptomycin/ml) duy trì
ở nhiệt độ 37oC bằng máy ổn nhiệt
Nhẹ nhàng cho đầu dò siêu âm có gắn hệ thống dẫn kim vào âm đạo, cho tay qua trực tràng cố định buồng trứng, đưa các nang trứng về vị trí mũi kim, quan sát các nang trứng trên màn hình máy siêu âm và chọc hút dịch nang trứng
Trong quá trình hút hệ thống kim và ống dẫn luôn luôn chứa đầy môi trường hút tế bào trứng Sau khi chọc hút 2 - 4 nang trứng, rút kim ra, hút dung dịch thu tế bào trứng để tế bào trứng chảy vào ống falcon (giữ ấm trong bình ổn nhiêt 37oC), tiến hành hút lặp lại đến khi không còn nhìn thấy nang trứng nào trên buồng trứng thì chuyển qua buồng trứng đối diện
Lọc, soi tìm tế bào trứng
Sau khi hút xong một buồng trứng, đưa ngay về phòng thí nghiệm, lọc bằng cốc lọc Emcon có đường kính lỗ lọc 20m, khoảng 10ml dung dịch còn lại được chuyển vào đĩa petri vô trùng
có đường kính 90mm để soi tìm, đánh giá, phân loại tế bào trứng dưới kính hiển vi soi nổi
Đánh giá chất lượng tế bào trứng
Tế bào trứng thu được được đánh giá phân loại theo phương pháp của Goodhand và cs (1999) Dựa vào hình dạng, sự đồng nhất của tế bào chất và đặc biệt là màng cumulus
Loại A có ≥ 4 lớp màng cumulus, phân bố rõ ràng, liên kết chặt chẽ và tế bào chất đồng nhất Loại B có ≥ 1 lớp màng tế bào cumulus, liên kết chặt chẽ và tế bào chất đồng nhất
Loại C một số phần vỏ ngoài tế bào trứng bị lột trần, tế bào chất co lại không đều
Loại D tế bào trứng hoàn toàn bị lột trần và tế bào chất co lại không đều
Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học có sử dụng phần mềm Excel
Trang 3KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng của tuổi bò lên số lượng nang trứng
Nang trứng có mặt trên buồng trứng
114 lượt buồng trứng được siêu âm ở 2 nhóm bò thí nghiệm với 1137 nang trứng có mặt trên
buồng trứng Trong đó nang trứng có kích thước 2 – 8 mm và ≥ 9mm của bò 3 tuổi tương ứng
482 và 77 nang trứng, bình quân nang trứng/buồng trứng tương ứng 8,93 và 1,43 nang Ở
nhóm bò 6 tuổi nang trứng có kích thước 2 – 8 mm và ≥ 9m tương ứng 466 và 112 nang, nang
trứng/buồng trứng tương ứng 7,77 và 1,87 nang
Bảng 1 Số lượng nang trứng/buồng trứng và số lượng nang trứng
có kích thước 2 – 8 mm, ≥ 9 mm/buồng trứng của 2 nhóm bò
Tuổi bò cho tế
bào trứng
Nang trứng/buồng
Nangtrứng
Nang trứng /buồng trứng
Các chữ cái a, b trong cùng cột có giá trị sai khác (p<0,05)
Bảng 1 cho thấy, bò 3 tuổi có số lượng nang trứng/buồng trứng ở kích thước 2 – 8 mm cao
hơn nhóm bò 6 tuổi Song ở nang trứng có kích thước ≥ 9mm nhóm bò 6 tuổi có phần cao
hơn Số nang trứng bình quân thu được của chúng tôi không sai khác nhiều so với số nang
trứng trung bình/buồng trứng của Rizos và cs (2005) ở bò hậu bị và bò cái sinh sản tương ứng
10,4 và 7,8 nang trứng/buồng trứng Song lại cao hơn Ramos và cs (2009) khi tiến hành siêu
âm hút tế bào trứng 2 lần/tuần và 1 lần/tuần sử dụng hormon để kích thích thu được tương ứng
7,05, 7,95 và 8,75 nang trứng/buồng trứng
Nang trứng được hút
Bảng 2 Tổng số nang trứng được chọc hút, nang trứng được chọc hút/buồng trứng
ở 2 nhóm bò
Tuổi bò cho tế
bào trứng
Tổng số nang (2 - > 9 mm)
Nang trứng được hút
Nang trứng được hút/buồng trứng
Tỉ lệ hút
(Mean ± SE)
Các chữ cái a, b trong cùng cột có giá trị sai khác (p <0,05)
Bảng 2 cho thấy, tổng số nang trứng được chọc hút là 926 nang/ tổng số 1137 nang quan sát
được chiếm tỉ lệ 81,43 % Số lượng nang trứng được chọc hút/buồng trứng ở cả 2 nhóm bò là
8,20 nang Không có sự khác nhau của 2 nhóm bò về tỉ lệ nang trứng được chọc hút/nang
trứng quan sát được ở nhóm bò 3 tuổi và 6 tuổi, tương ứng 81,2 và 81,66 % Số lượng nang
trứng được chọc hút/buồng trứng của chúng tôi cao hơn so với kết quả của Manik và cs
(2003) đã nghiên cứu siêu âm hút tế bào trứng ở bò Ấn có số lượng nang trứng được chọc
hút/buồng trứng 4,25 nang trứng Goodhand và cs, (2000) chọc hút được 6,65 nang
trứng/buồng trứng
Trang 4Ảnh hưởng của tuổi bò lên số lượng tế bào trứng thu được
Sau 114 lượt buồng trứng được siêu âm hút tế bào trứng có 796 tế bào trứng được thu, bình quân tế bào trứng/buồng trứng 6,98 tế bào trứng Tỉ lệ thu được chiếm 85,95 %/ tổng số nang trứng được chọc hút Có sự khác nhau về tế bào trứng/ buồng trứng thu được giữa 2 nhóm bò,
ở nhóm bò 3 tuổi thu được 7,20 tế bào cao hơn nhóm bò 6 tuổi 6,78 tế bào Không có sự khác nhau về tỉ lệ tế bào trứng thu được/nang trứng được chọc hút giữa hai nhóm bò
Bảng 3 Tổng số tế bào trứng thu được, tế bào trứng/buồng trứng Tuổi bò cho tế
bào trứng
Buồng trứng được hút
Tế bào trứng thu được
Tế bào trứng/buồng trứng
Tế bào trứng thu được/nang trứng được hút (%) (Mean ± SE)
Các chữ cái a, b trong cùng cột có giá trị sai khác (p <0,05)
Nghiên cứu để nâng cao số lượng tế bào trứng được rất nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu để thu được tối đa tế bào trứng có chất lượng Manik và cs, (2003) thu được 4,5 tế bào/buồng trứng De Roover và cs, (2005) thu đuợc bình quân 5,6 tế bào trứng/buồng trứng khi tiến hành siêu âm hút tế bào trứng từ bò sống Kết quả của chúng tôi cũng phù hợp với Viana và cs, (2004) đã thu được bình quân số tế bào trứng 7,0 tế bào trứng, Ramos và cs, (2009) thu được 7,05 tế bào trứng/buồng trứng
Ảnh hưởng của tuổi bò lên chất lượng tế bào trứng thu được
Chất lượng tế bào ảnh hưởng rất lớn đến khả năng phát triển sau khi nuôi chín, thụ tinh, phân chia và phát triển đến giai đoạn phôi dâu và phôi nang Sau khi chọc hút xong, dịch hút nang trứng tế bào trứng được đưa ngay về phòng thí nghiệm để lọc, soi tìm và đánh giá chất lượng theo 4 mức độ khác nhau (A, B, C và D) Chỉ có tế bào trứng loại A và B mới đủ tiêu chuẩn nuôi cấy, thụ tinh và tạo phôi
Bảng 4 Tế bào trứng loại A, B, C và D của 2 nhóm bò
Tuổi bò cho tế bào trứng
Bảng 4 cho thấy, tổng số tế bào trứng loại A, B là 598 tế bào Tế bào trứng bình quân thu được/buồng trứng của nhóm bò 3 tuổi 5,39 tế bào, cao hơn nhóm bò 6 tuổi 5,12 tế bào Tế bào trứng loại C, D không có sự khác nhau nhiều, tương ứng 1,81 và 1,67 tế bào
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Tuổi bò có ảnh hưởng đến số lượng và chất lượng tế bào trứng thu được
Nhóm bò cho tế bào trứng có độ tuổi 3 tuổi cho số lượng và chất lượng tế bào trứng tốt hơn nhóm bò 6 tuổi
Trang 5TÀI LIỆU THAM KHẢO
De Roover, R., Genicot, G., Leonard, S., Bols, P and Dessy, F (2005) Ovum pick up and in vitro embryo
production in cows superstimulated with an individually adapted superstimulation protocol Animal Reproduction Science 2005; 86: p.13-25
Dimitrios Rizos, Lisa Burke, Patrick Duffy, Mary Wade, John F Mee, Kevin J.O’Farrell, Mairtin MacSiurtain,
Maurice P Boland and Patrick Lonergan, (2005) Comparisons between nulliparous heifers and cows as oocyte doners for embryo production in vitro Theriogenology 2005; 63: p.939-949
Hasler J.F., Hasler W.B Henderson, P.J Hurtgen, Z.Q Jin, A.D McCauley, S.A Mower, B Neely, L.S Shuey,
J.E Stockes and S.A Trimmer, (1995) Production, freezing and transfer of bovine IVF embryos and Halsel, B.M Magunath, J.P Ravinada, P.S.P Gupta, M Devaraj and S.Nandi(2003) Effect of breeding season
on in vivo oocyte recovery and embryo production in non – descriptive indian river buffaloes Animal Reproduction Science 2: 376-383
K.L Goodhand, M.E Staines, J.S.M Hutchinson and P.J Broadbent, (2000) In vivo oocyte recovery and in
vitro embryo production from bovine oocyte doner treated with progestagen, oestradiol Animal reproduction 2000; 63; p.145-185
K.L Goodhand, M.E Staines, J.S.M Hutchinson and P.J Broadbent (1999) In vivo oocyte recovery and in
vitro embryo production from doner aspirated at different frequencies or following FSH treatment Theriogenology 1999; 51, p 951-961
Manik, F.li, X.chen, W pi, C Lin and Z Shi (2003) Collection oocytes through transvaginal Ovum pick-up for
invitro embryo production in Nanyang yellow cattle Reproduction in Domestic Animal 42: 666-670 Ramos, R Rupt, J.U Camara, M R Mollo, I Pivato, A P Marques and Satori Effect of follicular wave
sunchronzation on invitro embryo production in heifers Animal Reproduction Science 3: 201-207 Rizos, D., Burke, L., Duffy, P., Wade, M., Mee, J.F., O'Farrell, K.J., MarSiurtain, M., Boland, M.P and
Lonergan, P, (2005) Comparisons between nulliparous heifers and cows as oocyte donors for embryo production in vitrro Theriogenology 2005; 63: p.939-949
Thibier.M, (2001) A constrated year for the world activity of the animal embryo transfer industry Newslett 20,
p.13-19
Viana, JHM Camargo, LSA and Ferreira, A.M, (2004) Short intervals between ultrasonographically guided
follicle aspiration improve oocyte quality but do not prevent establishment of dominant follicle in the Gir breed of cattle Animal Reproduction Science 84: p.1-12
*Người phản biện: TS Phan Văn Kiểm; TS Đào Đức Thà
