Hệ Thống Nuôi Cấy Lớp Mỏng Tế Bào Trong Nghiên Cứu Tái Sinh Và Nhân Giống Vô Tính Cây Hoa Thu Hải Đường (Begonia Tuberous).Pdf

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Đề tài: HỆ THỐNG NUÔI CẤY LỚP MỎNG TẾ BÀO TRONG NGHIÊN CỨU TÁI SINH VÀ NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY HOA THU HẢI ĐƯỜNG Begonia tuberous LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN K

Sơ lược lịch sử phát triển và thành tựu đạt được trong vi nhân giống thực vật

Ý tưởng phát triển mô thực vật trong môi trường nhân tạo với điều kiện được kiểm soát được khởi xướng từ đầu thế kỷ XX bởi nhà sinh lý học người Đức Haberlandt (1902) Ông tin rằng tất cả tế bào của cây có tính toàn thể (Totipotency), tức là mỗi tế bào có khả năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh nếu điều kiện thuận lợi Tuy nhiên, thử nghiệm của Haberlandt lúc đó chưa thành công.

White (1934)[2] đã nuôi cấy thành công đầu rễ cây cà chua (Lycopercum esculentum) trên môi trường lỏng có chứa đường, muối khoáng và dịch chiết nấm men

Gautheret và Nobecourt (1941)[3] đã tạo ra và duy trì được đỉnh sinh trưởng của cây cà rốt (Daucus carota)

Vào những năm 50, nghiên cứu về các chất kích thích sinh trưởng như kinetin, cytokinin và gibberellin đã đạt được nhiều thành công Các môi trường dinh dưỡng cơ bản được phát triển dựa trên nhu cầu chất vô cơ của cây, trong đó nổi bật là môi trường Murashige và Skoog (MS) năm 1962, Linsmaier và Skoog (LS) năm 1965, và Gamborg năm 1968 Những môi trường này có thể được điều chỉnh linh hoạt tùy theo mục tiêu và loại đối tượng nuôi cấy.

Lúc này thuật ngữ “Micropropagation” (vi nhân giống), nghĩa là nhân giống thực vật trong môi trường vô trùng cũng được hình thành

Hầu như đến nay, các nghiên cứu đã kiểm soát đgroupName> và phát triển mô thực vật trong môi trường nuôi cấy vô trùng Các kiến thức về sự phát triển của thực vật đã đạt mức độ đủ để ứng dụng nuôi cấy mô trong sản xuất thương mại Kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng được sử dụng để tạo ra các giống sạch bệnh, như cây Khoai Tây (Solanum tuberosum) và hoa Lan (Orchid) Các loài Thược Dược, Cẩm Chướng, Cúc và Địa Lan cũng đã được áp dụng kỹ thuật này để tạo ra cây sạch virus.

Trong nhiều năm qua, vi nhân giống thực vật đã trở nên phổ biến trên toàn cầu Việc nuôi cấy mô phân sinh và các kỹ thuật tiên tiến khác đã thúc đẩy sinh sản của thực vật, làm tăng nhiều lần so với tốc độ trong tự nhiên Điều này giúp tạo ra một loạt các mẫu mới với các đặc điểm di truyền giống hệt với mẹ của chúng, và rút ngắn thời gian đưa các loài mới vào sản xuất quy mô lớn Việc dùng kỹ thuật nghiên cứu để bảo vệ và duy trì các loài thực vật quý hiếm cũng trở nên khả thi, đồng thời cũng có thể tiến hành loại bỏ vi sinh vật gây dịch bệnh, góp phần vào việc phục tráng giống cây trồng.

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một lĩnh vực khoa học mới mẻ trong sinh lý thực vật, bắt đầu được ứng dụng vào đầu thế kỷ XX Kỹ thuật này đã được sử dụng để chọn giống và nhân giống cây trồng, nhưng sự phát triển rõ rệt của nó chỉ diễn ra vào khoảng sau đó.

20 năm gần đây do các phát hiện quan trọng sau:

Tính toàn năng của mô và tế bào thực vật cho phép tái sinh cây hoàn chỉnh từ mô hoặc thậm chí từ một tế bào nuôi cấy riêng lẻ.

Khả năng tạo hạt đơn bội thông qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn giúp phát triển các dòng đồng hợp tử tuyệt đối, từ đó rút ngắn chu trình lai tạo.

− Khả năng hấp thu ADN ngoại lai vào tế bào thực vật và khả năng gây biến tính ở thực vật do ADN ngoại lai nhờ công nghệ gen

Khả năng nuôi cấy tế bào thực vật tương tự như nuôi cấy vi sinh vật đã mở ra cơ hội ứng dụng di truyền phân tử vào thực vật bậc cao, từ đó hỗ trợ hiệu quả cho công tác giống.

− Khả năng loại trừ virus thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tạo dòng vô tính sạch bệnh ở cây nhân giống vô tính

− Khả năng dùng chồi nách, các thể protocorm vào nhân giống vô tính với tốc độ cực nhanh một số cây trồng nông nghiệp

− Khả năng sử dụng phương pháp nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng baỏt thuù khi lai xa

Khả năng bảo quản nguồn gen thông qua nuôi cấy trong ống nghiệm cho phép trao đổi quốc tế các nguồn gen sạch bệnh dưới dạng cây nuôi trong ống nghiệm.

− Khả năng tồn trữ các tế bào thực vật sống trong thời gian dài và ở nhiệt độ thấp mà không mất tính toàn thế của tế bào.

Các kỹ thuật vi nhân giống thực vật

Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời

Năm 1946, Lon và Ball đã tiên phong nghiên cứu mô và cơ quan tách rời bằng cách nuôi cấy đỉnh chồi cây Măng Tây (Asparagus officinalis) Sau đó, họ tiến hành nuôi cấy các bộ phận non của cây như lá, hoa, thân, phôi hợp tử trưởng thành, lá mầm, và chồi bên của lá Theo Thorpe và cộng sự (1991), những bộ phận này chứa nhiều tế bào mô phân sinh.

Mô hoặc cơ quan tách rời nuôi cấy đều có đặc điểm chung về yêu cầu dinh dưỡng: nguồn carbon (đường), các nguyên tố đa lượng (N, P, K, Ca), các nguyên tố vi lượng (Mg, Fe, Mn, Zn, Co…), các vitamin (A, B…) Tuy ngyen, nghien cuu nuoc cay co ganRequireingredient ca cao nen phai bo sung them cac chat hieu oci co nitro (acid amin) va dac biêt la-chat dieu hoa sinh truong vi moatchou gui ko co Khoa hoc nop tien hanh.

Nuôi cấy mô và cơ quan nhằm mục đích:

+ Nghiên cứu điều kiện sinh trưởng một bộ phận hoặc mô của cây

+ Tạo mô sẹo phục vụ cho các nghiên cứu cơ bản như: Chọn dòng tế bào, đột biến soma…

Nuoâi caáy moâ phaân sinh

Thí nghiệm nuôi cấy mô phân sinh được khởi xướng bởi Morel và Martin (1971) Để thực hiện, có thể sử dụng các môi trường như White, Murashige và Skoog (1962), Gamborg (1968) và bổ sung đường, vitamin, cùng các chất điều hòa sinh trưởng Mô phân sinh có đặc điểm chứa tế bào non trẻ phân chia mạnh và không bị virus xâm nhập, do đó được xem là mô duy nhất của cây sạch virus Nhờ kỹ thuật này, đã thu nhận được những cây khoai tây sạch virus từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.

Nuôi cấy mô phân sinh là phương pháp hiệu quả để tạo ra giống cây sạch virus từ những giống bị bệnh, phục tráng giống cây Phương pháp này cũng được áp dụng trong nhân giống in vitro, tạo cây đa bội thông qua xử lý colchicine, và nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan.

Nuoõi caỏy moõ seùo (callus)

Khi sự cân bằng các chất điều hoà sinh trưởng trong thực vật thay đổi, mô đỉnh sinh trưởng hoặc nhu mô được tách ra và nuôi cấy trên môi trường giàu auxin sẽ hình thành mô sẹo Mô sẹo này là một khối tế bào phát sinh vô tổ chức với hình dạng không nhất định và có màu vàng, trắng hoặc xanh.

Nguyên liệu để tạo mô sẹo bao gồm các phần non của cây, được nuôi cấy trên môi trường MS và Gamborg, kèm theo các chất điều hoà sinh trưởng Loại và nồng độ của các chất điều hoà sinh trưởng phụ thuộc vào loại mô nuôi cấy Trong quá trình nuôi cấy mô sẹo, mẫu thường cần được để trong tối Mô sẹo hình thành sẽ bao gồm hai loại khác nhau.

+ Loại xốp: chứa nhiều tế bào xốp với nhân nhỏ, tế bào chất loãng và không bào to

+ Loại cứng: thì ngược lại các tế bào chắc, nhân to, tế bào chất đậm đặc và không bào nhỏ (Trần Văn Minh, 1994)

Từ các khối mô sẹo có thể đưa vào môi trường nhân sinh khối để thu được lượng lớn mô sẹo Tuy nhiên, khả năng tái sinh là đặc tính quan trọng nhất của mô sẹo Khả năng này sớm mất đi ở mô sẹo xốp trong khi nó lại duy trì lâu hơn ở mô sẹo cứng Nguyên nhân có thể do các tế bào của mô sẹo sẽ mất khả năng tổng hợp một số chất cần thiết cho sự tái sinh của nó khi số lần cấy chuyền tăng lên.

Nuoâi caáy phoâi

Những tế bào phôi dinh dưỡng đầu tiên được thu nhận từ mô dinh dưỡng của cây cà rốt (Daucus carota) và nuôi cấy in vitro đã mở ra hướng mới trong nuôi cấy phôi vô tính Phôi vô tính có khả năng nảy mầm tạo ra cây hoàn chỉnh giống như phôi hữu tính, điều này thể hiện một đặc điểm quan trọng và thu hút sự chú ý của các nhà nghiên cứu.

Các môi trường nuôi cấy phôi đều xuất phát từ môi trường cơ bản: môi trường MS[5], môi trường White (1963)[2], môi trường Gamborg (1968)[7]… bổ sung thêm với đường, vitamin, chất điều hòa sinh trưởng và một số chất khác Mỗi loại cây trồng và ở từng giai đoạn phát triển phôi khác nhau thì nhu cầu về đường sucrose và áp suất thẩm thấu cũng khác nhau Các auxin cần thiết cho quá trình phát sinh phôi như: khi nuôi cấy kéo dài trên môi trường có auxin thường thúc đẩy nhanh quá trình phân chia tế bào phôi tạo ra các tế bào xốp (Friable cells), làm giảm khả năng tái sinh cây (Evan và cộng sự, 1981)[11]

Như vậy, việc nuôi cấy phôi vô tính được sử dụng để kiểm tra khả năng sống của hạt phôi, giữ gìng phôi yếu, cứu phôi xa và sản xuất các hạt nhân tạo, cơ bản là tế bào phôi được bọc một vỏ alginate Đây là một quá trình có vai trò quan trọng trong thực hiện các nghiên cứu và ứng dụng trong sinh học và y học.

Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn

Bourgin và Nitsh (1967)[12] tạo thành công cây đơn bội ở nhiều thực vật, góp phần tăng thêm các kho tàng kiến thức trong chọn giống cây trồng

Nguyên liệu cho nuôi cấy bao phấn hoặc hạt phấn tách rời mang lại những ưu điểm và nhược điểm riêng Nuôi cấy bao phấn có thao tác kỹ thuật đơn giản và dễ dàng trong việc chuẩn bị môi trường, nhưng có thể dẫn đến sự hình thành cây lưỡng bội từ mô soma, gây khó khăn trong việc phân biệt với cây tự lưỡng bội từ cây đơn bội Để nuôi cấy bao phấn và hạt phấn, các nhà nghiên cứu thường sử dụng các môi trường khác nhau, trong đó có môi trường Gamborg (1968).

LS (Linsmainer và Skoog, 1965)[6], MS[5],… có bổ sung các loại dịch chiết, chất điều hòa sinh trưởng…

Vi sinh bao phấn và hạt phấn sẽ tạo ra các cây đơn bội (haploid), tỷ lệ này phụ thuộc vào các yếu tố như tuổi của hạt phấn ở giai đoạn phân ban đầu (mitose) và nhiệt độ Khi xử lý bao phấn ở nhiệm độ lạnh, như áp dụng cho thuốc lá ở 4 o C trong hai đến bốn ngày trong điều kiện ẩm, sẽ giúp tăng số lượng cây đơn bối tái sinh (Niizeki và Oono, 1968)[13].

Nuôi cấy tế bào đơn và tế bào trần

Thí nghiệm nổi bật của Street (1969) cho thấy khả năng duy trì sự sinh trưởng liên tục của dịch huyền phù tế bào Các tế bào đơn được tách ra từ mô thực vật thông qua phương pháp nghiền hoặc xử lý enzyme, sau đó được nuôi cấy trong môi trường lỏng có khuấy hoặc lắc để tối ưu hóa sự trao đổi khí và tiếp xúc với chất dinh dưỡng Một số nghiên cứu, như của Trần Văn Minh (1994), đã sử dụng mô sẹo cho việc nuôi cấy tế bào đơn Tuy nhiên, khi tách rời khỏi quần thể tế bào, các tế bào đơn thường mất đi nhiều chất dinh dưỡng cần thiết, dẫn đến yêu cầu dinh dưỡng phức tạp cho quá trình nuôi cấy Do đó, việc lựa chọn môi trường và điều kiện nuôi cấy phù hợp là yếu tố quan trọng hàng đầu trong nuôi cấy tế bào đơn.

Nuôi cấy huyền phù tế bào

Huyền phù tế bào là môi trường lỏng được lắc liên tục, chứa tế bào soma đơn hoặc cụm tế bào có khả năng tái sinh phôi và phát triển thành cây nguyên vẹn Trong môi trường này, tế bào từ mô sẹo có thể tách ra thành những tế bào đơn hoặc cụm tế bào, giúp tăng diện tích hấp thu chất dinh dưỡng Việc lắc tròn không chỉ hỗ trợ sự tăng trưởng bình thường của mô sẹo mà còn cải thiện khả năng trao đổi khí của tế bào Mô sẹo của cây Cà Rốt (Daucus carota) dễ dàng phóng thích tế bào đơn và cụm tế bào nhỏ trong môi trường lỏng lắc liên tục, trong khi đó, cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) có vận tốc lắc thích hợp là 60 vòng/phút.

Nhu cầu về ánh sáng trong quá trình lắc tạo dịch huyền phù thường tương tự như quá trình tạo mô sẹo trước đó Sự hình thành và tăng trưởng của dịch huyền phù có thể xảy ra trong điều kiện tối hoàn toàn như trường hợp của Khoai tây (Solanum tuberrosum) (De Vries và Toonen M A J., 1996)[19], nhưng cũng có thể xảy ra trong điều kiện chiếu sáng như trường hợp của Pyrus communis (Mehra và Jaidka, 1985)[20], Brassica nigra (Klimaszewska và Keller, 1986)[21], hay trường hợp của

Một số loài thực vật như Solanum melongena yêu cầu sự kết hợp giữa auxin và cytokinin để tạo dịch huyền phù tế bào Quá trình này cũng được áp dụng cho việc tạo dịch huyền phù tế bào từ mô sẹo lá của Khoai tây (Solanum tuberosum L), theo nghiên cứu của De Vries và Toonen (1996)[19], cũng như Pyrus communis theo nghiên cứu của Mehra và Jaidka (1985)[20].

Nuôi cấy bầu nhụy và noãn

Trong những năm gần đây, đã có những thành công trong việc nuôi cấy bầu nhụy và noãn chưa thụ tinh trên một số loài cây công nghiệp quan trọng Tuy nhiên, số lượng các côn đơn bội cú thu được từ các loại côn như củ cải đường, lúa mỡt, thuốc lỏ, lúa gạo vẫn còn rất ít Ổn điểm của phương pháp này là khả năng áp dụng thành công cả trên đối tượng cây Ngũ Cốc do số lượng cây đột biến thấp và trên đối tượng cây củ cải đường nuôi cấy bao phấn, nơi không thực hiện được việc này.

Hạt giống nhân tạo

Redenbaugh và cộng sự (1987) đã phát hiện ra kỹ thuật sinh học mới trong việc tạo ra hạt giống nhân tạo, có cấu trúc tương tự như hạt giống tự nhiên Hạt giống nhân tạo bao gồm phôi được bao bọc bởi lớp vỏ ngoài, nhưng không có phôi nhũ như hạt tự nhiên Mặc dù vậy, hạt giống nhân tạo vẫn có khả năng nảy mầm tương tự Hiện nay, nghiên cứu về hạt giống nhân tạo được thực hiện theo hai hướng: nghiên cứu cơ bản và phát triển hạt giống nhân tạo cho các mục đích ứng dụng.

Hiện nay, khi tạo hạt nhân tạo thường phải chú ý đến hai vấn đề:

+ Tạo vỏ hạt: việc sử dụng một chất ở dạng gel có chứa các khoáng dinh dưỡng để bao quanh phôi soma vẫn đang được tiếp tục nghiên cứu

+ Gieo hạt có hơi nước: mục đích là để cho hạt nhân tạo nảy mầm đồng loạt

Kitto và Janick (1985)[23] bọc vỏ cho phôi hay từng cụm tế bào và thấy rằng chúng cũng có thể làm hạt nhân tạo

Redenbaugh và cộng sự (1986)[24] đã thành công khi dùng các giá thể hoà tan như: alginate calcium hay alginate sodium làm vỏ bọc phôi để tạo hạt nhân tạo

Drew (1992)[25] tạo hạt nhân tạo có chứa phôi theo kiểu nhỏ giọt và hạt có thể tái sinh thành cây trong môi trường không có carbohydrate

Phương pháp nuôi cấy lắc và Bioreactor

Phương pháp nuôi cấy trên môi trường lỏng lắc đã được khảo sát bởi Takayama và Misawa (1981)[26] cho thấy hiệu quả trong việc nhân sinh khối giống cây Gần đây, Takayama (1986)[27] đã áp dụng kỹ thuật nhân số lượng lớn bằng Bioreactor, giúp sản xuất từ 4.000 đến 20.000 cây con chỉ trong 1-2 tháng với Bioreactor cỡ nhỏ 4-10 lít Điều này mở ra triển vọng to lớn cho việc sử dụng Bioreactor trong vi nhân giống thương mại và sản xuất các chất có hoạt tính sinh học từ thực vật.

1.1.3 Sự phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật ở Việt Nam

Sau khi đất nước được giải phóng, chính phủ đã đầu tư mạnh mẽ vào phát triển ngành sinh học, đặc biệt là nuôi cấy mô tế bào thực vật Các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào được thiết lập tại nhiều cơ sở nghiên cứu, bao gồm Viện Công Nghệ Sinh Học, Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM, Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lạt, Trường Đại Học Đà Lạt, Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Đại Học Nông Nghiệp I và Viện Lâm Nghiệp Ngoài ra, một số tỉnh thành cũng đã bắt đầu xây dựng các phòng thí nghiệm tương tự nhằm thúc đẩy nghiên cứu và ứng dụng trong lĩnh vực này.

Phòng thí nghiệm này có nhiệm vụ xây dựng và phát triển các phương pháp nghiên cứu, tổ chức các hướng nghiên cứu ứng dụng phù hợp với điều kiện trang thiết bị ở Việt Nam Các kết quả quan trọng đạt được bao gồm: vi nhân giống Dứa, Khoai tây, hoa Hồng, Cúc, Cẩm chướng tại Viện Công Nghệ Sinh Học, nhân giống Bạch Đàn tại Viện Lâm nghiệp và đặc biệt là các thành quả nuôi cấy bao phấn Lúa và thuốc Lá Ngoài ra, nuôi cấy tế bào trần của thuốc Lá và Khoai Tây cũng được thực hiện tại Viện Công Nghệ Sinh Học và Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thành phố Hồ Chí Minh Bước đầu, một số kết quả khác đã được ghi nhận như: chọn dòng tế bào kháng bệnh, chọn dòng tế bào chịu mặn và bảo tồn nguồn gen.

Phương pháp nhân giống in vitro vượt trội hơn so với các phương pháp truyền thống, đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự phát triển của công nghệ sinh học và nông nghiệp nhờ vào những lợi ích đáng kể như tăng năng suất, cải thiện chất lượng cây trồng và rút ngắn thời gian nhân giống.

+ Không phụ thuộc vào thời tiết, mùa vụ và quá trình tiến hành trên một diện tích không lớn

Phục tráng các giống cây bị nhiễm bệnh thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng giúp khôi phục và tăng nhanh hệ số nhân giống, từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho sản xuất đại trà Đồng thời, việc bảo quản giống trở nên dễ dàng hơn nhờ vào việc tạo ra thể phôi, bảo quản lạnh và thiết lập ngân hàng gen.

+ Giảm chi phí vận chuyển từ nơi này đến nơi khác Dễ dàng trao đổi công nghệ với các nước có nền khoa học tiên tiến trên thế giới

+ Vật liệu dùng để nhân giống dồi dào, mang lại hiệu quả kinh tế cao cho người sản xuất

Góp phần tích cực cho công tác giống cây trồng thông qua các phương pháp như nuôi cấy mô, nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy mô sẹo (Callus), tạo thể đột biến (Mutant), dung hợp tế bào trần (Protoplast) và phát triển các thể lai với những tính trạng mong muốn.

1.1.5 Các nhược điểm của vi nhân giống

Các phương pháp vi nhân giống thực vật đã mang lại nhiều thành tựu trong công nghệ sinh học thực vật trong các thập niên vừa qua Tuy nhiên, các phương pháp này vẫn còn nhiều giới hạn, chưa thể ứng dụng phổ biến cho tất cả các loài thực vật

Một trong những nguyên nhân chính dẫn đến giá thành cao của vi nhân giống là do nhiễm vi sinh vật (Kozai, 1991)[28]

Ngoài ra còn có một số nhược điểm như:

Các phòng thí nghiệm công nghệ cao thường có chi phí cao và chủ yếu được áp dụng cho hoa và cây cảnh Mặc dù cây con in vitro mang lại sự đồng nhất về kiểu hình, điều này lại hạn chế tính đa dạng của sản phẩm Hơn nữa, quy trình vi nhân giống rất phức tạp, đòi hỏi nhiều giai đoạn, hóa chất, dụng cụ và kỹ năng chuyên môn, dẫn đến giá thành sản phẩm vẫn còn khá cao.

Quá trình vi nhân giống có thể dẫn đến đột biến do ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng trong môi trường nuôi cấy Bên cạnh đó, điều kiện nuôi cấy in vitro trong bình kín làm giảm sức sống của cây, gây ra dị dạng và ảnh hưởng đến chức năng của khí khẩu, dẫn đến tỷ lệ cây chết cao khi chuyển cây từ in vitro ra vườn.

Những thuận lợi của phương pháp vi nhân giống trên môi trường thạch so với phương pháp nhân giống truyền thống thì hơn hẳn như:

+ Những cây nhân giống in vitro trong điều kiện vô trùng cây khỏe mạnh, sạch virus, đồng nhất về mặt di truyền

+ Có thể sản xuất quanh năm và chủ động kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh như: nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm…

+ Sản xuất được số lượng lớn cây giống với một diện tích nhỏ trong một thời gian ngắn nhằm đáp ứng nhu cầu cho những người trồng thương mại

Theo Tự điển Bách Khoa Nông nghiệp do Trung tâm quốc gia biên soạn xuất bản năm 1991 đã định nghĩa cây cảnh như sau:

Cây cảnh, hay còn gọi là cây trang trí, là loại cây được trồng để làm đẹp cho không gian sống như nhà ở, sân vườn và nội thất, giúp cải thiện mỹ quan và tạo điểm nhấn cho những khu vực hạn chế Chúng đa dạng về họ, kích thước và loại hình, mang đến nhiều lựa chọn cho người yêu thích cây xanh.

Cây cảnh không chỉ đáp ứng nhu cầu tinh thần và nâng cao giá trị thẩm mỹ cho không gian sống, mà còn góp phần cải thiện môi trường, nâng cao sức khỏe cộng đồng và phát triển văn hóa Hơn nữa, cây cảnh còn tạo ra cơ hội việc làm và thu nhập, đóng góp tích cực vào nền kinh tế quốc dân.

Ngành sản xuất và kinh doanh hoa, cây cảnh là một ngành kinh tế đã và đang phát triển trên thế giới và cũng đang phát triển ở Việt Nam

Hoa và cây cảnh đã được công nhận về giá trị và vẻ đẹp từ rất sớm trên thế giới Các nhà khoa học thực vật đã dành nhiều thời gian nghiên cứu hình thái và phương pháp nhân giống các loài hoa Tuy nhiên, lĩnh vực này vẫn được coi là phát triển muộn hơn so với các ngành khoa học khác vì một số lý do nhất định.

− Thứ nhất: tính mềm yếu, dễ hư hỏng của hoa nên đòi hỏi đóng gói cũng như bảo quản phải tốt mới đáp ứng được yêu cầu

Việc vận chuyển và xếp dỡ hoa cần diễn ra nhanh chóng để đảm bảo chất lượng, tuy nhiên, ngành vận tải hàng không chưa phát triển mạnh và chi phí vẫn ở mức cao.

Trong nhiều thập kỷ qua, với sự thức cấp của ngành điên cứu và phát triển trong lĩnh vực hoa, cây cảnh, các công ty đã tạo ra vô số sản phẩm độc đáo và luôn cập nhật mới nhằm đáp ứng nhu cầu của khách hàng Điều này đã giúp ngành này phát triển mạnh và trở thành một phần không thể thiếuposables of the modern age Dhancement of the international air transport industry, coupled with the growth of the flower production and trade sector, has provided conditions for this industry to thrive and keep pace with the times.

Hoa được xem là mũi nhọn của nông nghiệp Đài Loan Ban cố vấn khoa học kỹ thuật Viện hành chính Đài loan đã thành lập, tổ chức qui hoạch khoa học kỹ thuật sinh học để nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật sinh học vào phát triển cây cảnh và nông nghiệp.Trong khi đó, Trung Quốc có lịch sử trồng hoa, cây cảnh đã lâu, có nguồn cây cảnh rất phong phú nhưng cũng chỉ ở những kiểu cây giống cũ do chưa chú ý đến đầu tư tuyển chọn những giống loài mới nên tuy chơi cây cảnh lâu đời nhưng vẫn theo lối cũ với phong cách dân tộc

Các nhược điểm của vi nhân giống

Các phương pháp vi nhân giống thực vật đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể trong công nghệ sinh học thực vật trong những thập niên gần đây Mặc dù vậy, những phương pháp này vẫn còn tồn tại nhiều hạn chế và chưa thể được áp dụng rộng rãi cho tất cả các loài thực vật.

Một trong những nguyên nhân chính dẫn đến giá thành cao của vi nhân giống là do nhiễm vi sinh vật (Kozai, 1991)[28]

Ngoài ra còn có một số nhược điểm như:

Các phòng thí nghiệm công nghệ cao, mặc dù đắt đỏ, hiện chủ yếu được áp dụng cho hoa và cây cảnh Cây con in vitro có ưu điểm đồng nhất về kiểu hình nhưng lại hạn chế tính đa dạng sản phẩm Tiến trình vi nhân giống phức tạp với nhiều giai đoạn và đòi hỏi cao về hóa chất, dụng cụ cùng kỹ năng, dẫn đến giá thành sản phẩm khá cao.

Trong quá trình vi nhân giống, có khả năng xảy ra đột biến do ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng được thêm vào môi trường Bởi đặc điểm sinh lý của cây trong việc nuôi cấy in vitro trong bình kín có thể làm giảm sức sống của cây, gây dị dạng và sai hỏng chức năng của gốciators Diese thì làm tăng tỷ lệ cây chết khi chuyển cây in vitro ra vườn.

Những thuận lợi của phương pháp vi nhân giống trên môi trường thạch so với phương pháp nhân giống truyền thống thì hơn hẳn như:

+ Những cây nhân giống in vitro trong điều kiện vô trùng cây khỏe mạnh, sạch virus, đồng nhất về mặt di truyền

+ Có thể sản xuất quanh năm và chủ động kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh như: nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm…

+ Sản xuất được số lượng lớn cây giống với một diện tích nhỏ trong một thời gian ngắn nhằm đáp ứng nhu cầu cho những người trồng thương mại.

TÌNH HÌNH THẾ GIỚI

Theo Tự điển Bách Khoa Nông nghiệp do Trung tâm quốc gia biên soạn xuất bản năm 1991 đã định nghĩa cây cảnh như sau:

Cây cảnh, còn được gọi là cây trang trí, chính là những loài thực vật được trồng cho mục đích trang trí trong nhà, ở sân, vườn và khu vực nội thất Chính nhờ những cây cảnh này mà vẻ đẹp thẩm mỹ của môi trường xung quanh có thể được cải thiện, giúp nâng cao｡ misdemeanor quality of the limited space Cây cảnh bao gồm các loài thuộc nhiều họ, được phân thành các kích cỡ và loại khác nhau tùy thuộc vào nhu cầu và phong cách của không gian.

Cây cảnh là điều đáp ứng cho con người nhu cầu về mặt tinh thần, góp phần tăng giá trị thẩm mỹ của mọi vật Không chỉ thế, nó còn cải thiện môi trường sống, nâng cao sức khỏe cũng như văn hóa của nhân dân Với vai trò đó, cây cảnh cũng mang lại nhiều cơ hội làm việc và thu nhập cho nền kinh tế quốc dân.

Ngành sản xuất và kinh doanh hoa, cây cảnh là một ngành kinh tế đã và đang phát triển trên thế giới và cũng đang phát triển ở Việt Nam

Trên toàn cầu, công dụng và vẻ đẹp của hoa và cây cảnh đã được biết đến từ rất sớm Các nhà khoa học thực vật đã nghiên cứu hình thái và phương pháp nhân giống, nhưng lĩnh vực này vẫn phát triển muộn hơn các lĩnh vực khác vì nhiều lý do.

− Thứ nhất: tính mềm yếu, dễ hư hỏng của hoa nên đòi hỏi đóng gói cũng như bảo quản phải tốt mới đáp ứng được yêu cầu

Trong ngày thứ hai, yếu tố quan trọng là đảm bảo chất lượng hoa khi chuyển và xếp dỡ một cách nhanh chóng Tuy nhiên, mặc dù ngành hàng không chưa được phát triển mạnh, giá cả cho đào dịch vẫn còn khá cao.

Trong roughly 40 năm qua, với sự phát triển nhanh chóng của ngành vận tải và hàng không quốc tế, nghàn sản xuất và kinh doanh hoa, cây cảnh đã có điều kiện để vươn lên và phù hợp với tâm hvie xuất hiện thời kỳ mới Tạo ra một thế hệ sản phẩm phong phú, đa dạng, đáp ứng nhu cầu của khách hàng một cách tối đa, ngành hoa, cây cảnh đã góp phần làm giàu cho nền kinh tế và đóng góp cho xã hội Nguồn gốc hình thành và phát triển của ngành này thường gặp ở các nước châu Á, đặc biệt là việt nam với truyền thống tôn gia và sự phát triển của công nghệ liên quan đến hoa, cây cảnh.

Hoa được coi là lĩnh vực chủ chốt của nông nghiệp Đài Loan Ban cố vấn khoa học kỹ thuật tại Viện hành chính Đài Loan đã tổ chức và thành lập kế hoạch quy hoạch vui chơi thăm꽃 và nông nghiệp để nghiên cứu và áp dụng các kỹ thuật sinh học đời thực trong việc phát triển Trong khi đó, Trung Quốc đã có một lịch sử lâu dài trong trồng hoa, cây cảnh, nhưng nguồn cây cảnh phong phú lại vẫn chỉ giới hạn ở những loài cây giống cổ điển, do chưa quan tâm đến đầu tư tuyển chọn các loài cây mới Đây là lý do khiến phong cách chơi cây của Trung Quốc vẫn mù mờ, cơ bản vô cùng dân tộc.

Các loại hoa và cây cảnh cao cấp trên thị trường thường được sản xuất tại Nhật Bản, điều này dẫn đến giá thành của chúng cao hơn nhiều so với sản phẩm từ Trung Quốc.

TÌNH HÌNH TRONG NƯỚC

Tại đất nước ta, các khu vực sản xuất hoa, cây cảnh truyền thống quy mô lớn như Đà Lạt (Lâm Đồng), Gò Vấp (Tp HCM), Sa Đéc (Đồng Tháp), Cái Mơn (Bến Tre), đã được biết đến rộng rãi Thủ đô Hà Nội cũng nổi tiếng với những làng sản xuất và kinh doanh hoa gắn với tên tuổi như Đào, Cúc Nhật Tân, Lay ơn Phú Thượng.

Ngành trồng và sản xuất hoa, cây cảnh đang phát triển mạnh mẽ, với sự hình thành của Hội sinh vật cảnh cấp Trung ương Những người làm nghề trồng hoa đã tích lũy được nhiều kỹ thuật và kinh nghiệm quý báu.

Việt Nam có điều kiện tự nhiên thuận lợi cho nông nghiệp với khí hậu nhiệt đới ẩm ướt và lượng mưa dồi dào Do đó, sản xuất, kinh doanh và xuất khẩu hoa, cây cảnh là một thế mạnh tiềm năng, tuy nhiên, lĩnh vực này vẫn chưa được khai thác hiệu quả.

Quận Gò Vấp, Thành phố Hồ Chí Minh, nổi bật là trung tâm sản xuất hoa và cây cảnh chính của thành phố, với hơn 80 hộ trồng hoa chuyên nghiệp và khoảng 300 hộ trồng hoa thời vụ Diện tích đất trồng hoa tại đây lên đến 80 ha, chiếm 12,5% tổng diện tích canh tác của quận, nhưng chủng loại hoa còn hạn chế Hiện tại, Gò Vấp chủ yếu cung cấp các loại hoa như Bonsai và hoa Hồng theo hình thức bán lẻ Dù có nhiều loại hoa được khách hàng nước ngoài ưa chuộng và đề nghị hợp đồng với số lượng lớn, quận vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu này.

Làng hoa Sa Đéc, thuộc Tân Quy Đông tỉnh Đồng Tháp, là một vùng trồng hoa nổi tiếng với hơn 300 gia đình chuyên nghiệp Nơi đây nổi bật với khả năng ươm và lai tạo hoa, đặc biệt là hoa Hồng Sản phẩm hoa từ Sa Đéc được phân phối đi khắp nơi, trong đó hoa Huỳnh, hoa Mai, hoa Huệ và hoa Cúc cũng rất được ưa chuộng tại các chợ hoa.

Nghề trồng hoa chuyên nghiệp ở Đà Lạt đã được hình thành cách đây khoảng

Trong 60 năm qua, các làng hoa Hà Đông và Vạn Thành đã phát triển mạnh mẽ với nhiều loại hoa nhập khẩu từ Châu Âu và Châu Mỹ, bao gồm hoa Hồng, hoa Lan, hoa Cúc, hoa Huệ, hoa Lay ơn, hoa Cẩm chướng và hoa Bất tử Những sản phẩm hoa này đã chiếm lĩnh thị trường Sài Gòn và các tỉnh lân cận thông qua các kênh vận chuyển hàng không và đường bộ.

Hiện nay, Việt Nam đã chứng kiến sự phát triển của nhiều công ty chuyên về hoa, trong đó nổi bật là công ty liên doanh Dalat Hasfarm, chuyên trồng hoa xuất khẩu với 100% vốn nước ngoài Công ty đã thiết lập hệ thống tổ chức và quy trình công nghệ tiên tiến, góp phần hình thành làng hoa công nghiệp lớn nhất Việt Nam, với 100% giống hoa được nhập khẩu từ Hà Lan và Indonesia.

Công ty Cổ phần Công nghệ sinh học Rừng hoa Đà Lạt cung cấp sản lượng hoa xuất khẩu và nội địa với các giống mới như Lily và cúc Đà Lạt, với khí hậu và thổ nhưỡng thuận lợi, đang đối mặt với khó khăn do giống hoa đã bị thoái hóa nghiêm trọng Hiện tại, Đà Lạt đang phát triển các phòng công nghệ thực vật nhằm nghiên cứu và tạo ra những giống hoa mới.

Hoa Thu hải đường (Begonia spp.) đang trở thành một trong những loài hoa được ưa chuộng nhất hiện nay nhờ vào sự đa dạng về màu sắc, hình dạng và độ bền kéo dài khoảng 3 tháng Tuy nhiên, giống hoa này phải nhập khẩu hạt giống từ nước ngoài với chi phí cao do không phải là cây bản địa Thêm vào đó, quá trình gieo hạt gặp nhiều khó khăn với thời gian kéo dài từ 2 đến 3,5 tháng và tỷ lệ nảy mầm không cao, dẫn đến giá thành cao và chưa được trồng phổ biến Tại chợ hoa thành phố Hồ Chí Minh năm 2005, giá một chậu hoa Thu hải đường trung bình khoảng 70.000 đồng và chậu lớn là 140.000 đồng.

CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT

Trong 20 năm qua, công nghệ sinh học đã thu hút sự chú ý của nhiều quốc gia trên toàn cầu Ngành này đã trở thành lĩnh vực khoa học tiên tiến tại các nước có nền kinh tế phát triển.

Ngành công nghệ sinh học đang phát triển nhanh chóng, không kém gì ngành công nghệ thông tin, và có tiềm năng tạo ra một cuộc cách mạng trong lĩnh vực sinh học Công nghệ sinh học không chỉ ảnh hưởng đến nông nghiệp và công nghệ thực phẩm mà còn đóng góp quan trọng trong y dược, vật liệu mới, năng lượng và bảo vệ môi trường, từ đó mang lại tác động tích cực đến nền kinh tế toàn cầu.

CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT VỚI KẾ HOẠCH

Nghị quyết 18/CP đã đánh dấu mốc quan trọng trong quá trình nâng cao hiệu quả đầu tư, mang lại những kết quả đáng kể về trang thiết bị mới và đào tạo đội ngũ cán bộ khoa học Từ đây, bắt đầu hình thành và đi vào hoạt động mạng lưới vi nhân giống trên toàn quốc, với ưu tư nhân nhanh các loại cây cảnh, cây lâm nghiệp và cây thuốc Vi nhân giống tại sao chúng ta khai thác tiềm năng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp, với nghiên cư ờu nuôi cấy mô thực vật khởi đầu từ năm

1975 ban đầu chỉ chú trọng áp dụng cho cây Thuốc lá Nhưng những năm gần đây kỹ thuật đã áp dụng cho nhiều loại cây trồng quan trọng.

TOÅNG KEÁT

Gần đây, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trở thành phương pháp phổ biến cho việc nhân giống đại trà nhiều loại cây như hoa lan, dương xỉ, cây cảnh, cây ăn quả, cây nông nghiệp, cây xanh và rau Phương pháp này vượt trội hơn so với kỹ thuật truyền thống nhờ khả năng khắc phục vấn đề bệnh tật và nâng cao hiệu quả nhân giống.

Kỹ thuật vi nhân giống mang lại nhiều giá trị quan trọng, bao gồm việc sản xuất cây trồng nhân giống in vitro được khử khuẩn và nuôi trồng trong môi trường vô trùng, đảm bảo sức khỏe và tính đồng nhất về mặt di truyền Hơn nữa, phương pháp này cho phép sản xuất cây trồng mà không bị ảnh hưởng bởi thời tiết hay điều kiện môi trường, đồng thời có khả năng diệt virus thông qua phương pháp nhiệt và nuôi cấy chồi ngọn, từ đó làm cho quá trình sản xuất trở nên ổn định hơn.

Việc nhân giống cây trồng in vitro mang lại hiệu quả cao và dễ dàng trong phân phối cây giống, cho phép bảo tồn một lượng lớn giống cây trồng chỉ trong không gian nhỏ như một phòng nuôi cấy.

Sơ đồ nhân giống in vitro hiệu quả được trình bày bởi Murashige bao gồm 3 quy trỡnh nhử sau:

+ Qui trình 1: chuẩn bị môi trường nuôi cấy vô khuẩn

+ Qui trình 2: nhân giống các mẫu

+ Qui trình 3: chuẩn bị đưa cây xuống đất

Các tác nhân hóa học như hormone thực vật và các yếu tố vật lý có ảnh hưởng lớn đến sự hình thành chồi sinh dưỡng Nồng độ sucrose tối ưu cho việc hình thành chồi thường là 8,76 àM, nhưng nồng độ thấp hơn như 29,2 àM hay 58,4 àM lại cho kết quả tốt hơn Nhiệt độ lý tưởng để tạo chồi sinh dưỡng nằm trong khoảng 20 – 25 oC, trong khi ở 30 oC không có chồi nào hình thành Khi nhiệt độ của cây mẹ dưới 15 oC, sự hình thành rễ và chồi gần như không phụ thuộc vào nhiệt độ trong quá trình tái sinh Ở nhiệt độ cao, chỉ có khoảng 18 oC là hiệu quả cho việc hình thành cô quan Thời gian và nguồn ánh sáng chiếu sáng lên cây thí nghiệm cũng ảnh hưởng đến sự hình thành chồi bất định trong nuôi cấy, với các báo cáo cho thấy ánh sáng từ đèn cao áp thủy ngân, đèn huỳnh quang ánh sáng trắng và đèn cao áp Natri đã cải thiện sự tái sinh của cây trong nhà kính.

Nhiều chồi sinh dưỡng tái sinh từ lá hoặc đoạn cuống lá chỉ xuất hiện lá rễ phụ rất nhỏ, không phù hợp để chuyển vào đất Tuy nhiên, các valign và Misawa đã sáng chế kỹ thuật nuôi cấy khuấy để giải quyết vấn đề này Phương pháp này giúp chồi phát triển hiệu quả và nhanh chóng thành cây con, đó là kỹ thuật nuôi cấy khuấy và nuôi cấy lên men Thành phần môi trường nói chung tương tự môi trường tái sinh chồi bình thường nhưng có một vài điều chỉnh nhỏ Các chất kích thích như auxin (IAA, NAA) được thêm vào để kích thích hình thành rễ.

Việc bổ sung 1-2 g/l than hoạt tính đã thúc đẩy mạnh mẽ sự phát triển rễ của cây con Theo Murashige, việc nuôi cây in vitro dưới ánh sáng cường độ cao giúp cây con trở nên cứng cáp hơn, từ đó nâng cao hiệu quả khi chuyển cây con xuống đất trồng.

GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ CÂY THU HẢI ĐƯỜNG (BEGONIA SPP.)

Vị trí phân loại

Lớp : Magnoliopsida Bộ : Cucurbitales Họ : Begoniaceae Chi : Begonia Loài : Begonia x hiemalis

Nhóm Begonia là một trong những nhóm lớn nhất trong các loại cây cảnh, với nhiều loài được tìm ra cùng vô vàn các loài cây lai khác nhau.odate H Taking shortly current,H ấy nở tiếp tục tăng số lượng giống Thu hải đường có màu sắc hoa và lá rực rỡ tạo ra.

Cây Thu hải đường phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như Trung và Nam Mỹ, Châu Á và Châu Phi Loài cây này thường được trồng trong vườn, chậu hoặc giỏ treo nhờ vào vẻ đẹp của hoa và lá Trong tự nhiên, Thu hải đường ưa thích đất có tính acid nhẹ, ẩm và bóng râm, thường mọc ở sườn đồi với khả năng thoát nước tốt và độ ẩm cao Độ pH lý tưởng của đất cho cây là từ 5,5 đến 6,5.

Hiện nay người ta tạm thời chia Begonia thành các nhóm nhỏ sau:

Đặc điểm sinh học và ý nghĩa kinh tế của cây hoa

1.7.2.1 Đặc điểm sinh học của cây hoa Thu hải đường

Cây hoa Thu hải đường là loại cây thảo mọng nước, thường có màu hồng và vị chua Lá cây có phiến lá lệch rõ ở gốc, mọc cách và có lá kèm sớm rụng, thường mọng nước và sát gốc Cụm hoa sim hai ngả với cuống dài, hoa đơn tính không đều và cùng gốc Hoa đực có từ 2 đến 5 lá đài nhỏ và hai tràng lớn xếp chéo chữ thập, với nhiều nhị rời hoặc hơi hợp thành ống Bộ nhụy gồm ba lá noãn hợp Paracarp thành bầu hạ một ô, vòi rời và đỉnh vòi thường chẻ đôi Quả nang có ba cánh, thường phát triển lệch.

1.7.2.2 Ý nghĩa kinh tế của cây hoa Thu hải đường

Cây Thu hải đường, với nhiều loài có màu sắc rực rỡ như đỏ, trắng, vàng, cam và hồng, được trồng rộng rãi làm cây cảnh trên toàn thế giới Tại Việt Nam, có khoảng 45 loài Thu hải đường mọc tự nhiên, phân bố khắp ba miền.

Cây hoa Thu hải đường không chỉ là một loại cây cảnh mà còn là nguồn thực phẩm và dược phẩm quý giá Với hàm lượng fructose cao, loài cây này mang vị ngọt chua đặc trưng và được sử dụng làm gia vị tại Philippines và Brazil Tại Trung Quốc, Indonesia và Brazil, lá Thu hải đường được tiêu thụ như rau tươi Một số giống hoa Thu hải đường còn có tác dụng dược lý, giúp thanh nhiệt, giải độc, trị ho ra máu, giảm đau, chữa tê bại, di chứng sau viêm màng não, cũng như có khả năng chống ung thư.

1.7.2.3 Các điều kiện sinh lý trồng cây hoa Thu hải đường a Ánh sáng Ánh sáng mạnh là nguyên nhân gây bỏng lá và làm cho cây sinh trưởng chậm Cây có thể an toàn trong giai đoạn ngày ngắn khi cường độ ánh sáng đạt

Để đạt được hiệu quả tối ưu trong quá trình phát triển, cây cần 3000 foot-candles (fc) ở nhiệt độ dưới 18°C, 2000 fc ở nhiệt độ 21°C và 1500 fc ở nhiệt độ 27°C Giai đoạn trước và sau khi hoa hình thành yêu cầu điều kiện ngày dài, tức là trên 12 giờ chiếu sáng, trong khi điều kiện ngày ngắn, dưới 12 giờ, cũng có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng của cây.

Cây cần 12 giờ chiếu sáng để giai đoạn hình thành hoa, giúp cây phát triển nhanh hơn và nở hoa sớm hơn so với điều kiện bình thường Ngoài ra, đã có báo cáo về việc ứng dụng nuôi cấy mô trong việc nuôi cấy đột biến của cây.

Begonia rex được nuôi cấy từ việc thiết lập hệ thống nuôi cấy các đoạn mẫu lá non Sau một tháng ủ ấm, chồi bất định dài 0,5 mm được chiếu sáng bằng tia gamma 10 Krad với liều lượng 0,2 Krad/giờ Một số cây bị đột biến được nhân giống in vitro, tạo ra những cây mới với hiện tượng giống như vùng đột biến, từ đó đã tạo ra nhiều biến thể mới của Begonia masoniana.

Sự phát triển của cây Thu hải đường có yêu cầu về nhiệt độ khác nhau:

− Từ khi trồng đến khi bắt đầu xử lý ngày ngắn là 19 0 C

Trong giai đoạn xử lý, khuyến khích hoa nở nhanh và đều bằng cách duy trì nhiệt độ 21 °C Tuy nhiên, nhiệt độ 34 °C giúp hoa phát triển nhanh hơn, nhưng lá sẽ to và hoa nhỏ có màu kém, kéo dài thời gian hoa Để đạt được cây chất lượng, nhiệt độ cần sau khi xử lý ngày ngắn là 18 °C Aside from that, hydrate with water maintaining a moist environnement of 60-70% for the growth of the Thu hải đường flower, whereas seedlings require 90-95% moisture If the humidity and soluble salt levels are too high, the plants' roots may become damaged, hence, properly regulating the air circulation around the plant The results should be made available in a paragraph in Vietnamese, with no further elaboration Please phrase your reply as a structured paragraph.

CO2 là yếu tố quan trọng cho sự sinh trưởng và phát triển của cây Việc xử lý ngày ngắn sẽ diễn ra sớm hơn khi nồng độ CO2 cao trong giai đoạn đầu phát triển của cây.

CO2 từ 300 - 2000 ppm sẽ tạo ra nhiều lá, chồi, hoa, rút ngắn thời gian trồng và nâng cao chất lượng

Thu hải đường là loài cây nhạy cảm với ô nhiễm không khí, đặc biệt là khi nồng độ Ozone thấp (25 − 30 ppm trong 4 giờ/tuần) Sự ảnh hưởng này có thể dẫn đến các tổn thương như đốm đỏ nâu và vàng đồng xuất hiện ở mặt dưới lá, cùng với đốm nâu trên cánh hoa.

Cây Thu hải đường có thể được trồng trên các loại đất như đất giàu chất hữu cơ, dớn và xơ dừa Tuy nhiên, giá thể cần phải thoáng, xốp và không giữ nước quá nhiều để đảm bảo thông thoáng Độ pH lý tưởng cho giá thể là từ 5,5 đến 6,0.

Bệnh mốc xám do nấm Botrytis cinerea

Beọnh do vi khuaồn Corynebacterium fascian

Cây Thu hải đường có thể bị nhiều khối u và đã được quan sát ở những cây

Begonia × hiemalis Vi khuẩn Corynebacterium fascians được phân lập từ các khối u có khả năng lây nhiễm cao ở cây Thu hải đường khoẻ mạnh.

Beọnh do vi khuaồn Xanthomonas begoniae

Nuôi cấy mô được báo cáo là phương pháp tiềm năng để loại bỏ vi khuẩn gây bệnh Xanthomonas khỏi loài Thu hải đường, cho thấy vi khuẩn này dễ bị loại bỏ trong môi trường nuôi cấy Mặc dù vi khuẩn có thể tồn tại khi nuôi cấy bằng thể sần, nhưng không có dấu hiệu nào xuất hiện cho đến 7 tháng sau, khi chúng xuất hiện trên mặt dưới của lá với những đốm nhũ tròn nhỏ, gây tổn thương nhanh chóng cho bộ lá Các thử nghiệm về phản ứng của Begonia × hiemalis đối với vi khuẩn gây héo cho thấy sự khác biệt về sức đề kháng giữa các loài, với những loài nhạy cảm nhất bao gồm Ballerina, Nexe, Elfe và Stella.

Bệnh thối thân và rễ do nấm Rhizoctonia solani, Pythium spp,

Bệnh thường bắt đầu ở đoạn thân gần bề mặt già thể gây thối thân, hủy hoại rễ.

Nhân giống cây Thu hải đường

Hiện nay có 2 phương pháp nhân giống cây hoa Thu hải đường là:

Gồm có nhân giống vô tính và nhân giống hữu tính a Nhaân gioáng voâ tính

Gồm những phương pháp sau

Phương pháp cắt đoạn (còn gọi là cắt đốt) được áp dụng khi cần nhân một số lượng ít Phương pháp này thường áp dụng cho những giống trong tự nhiên và các dòng lai giày nike air max midnight navy.keras LSTM model example Trong y học, phương pháp này được sử dụng để phân tích và nối các mạch thần kinh Trong nhiên liệu đã chọn, phương pháp cắt đoạn được sử dụng để giảm nhiệm vào khử trùng, trong việc xử lý bề mặt, và khi cần nhân một số lượng nhỏ cho những ứng dụng đặc biệt Phương pháp này cũng được sử dụng trong các ứng dụng y khoa để tạo ra các khía impepdance tế chỉ Trong các việc triển khai ứng dụng của cắt đoạn, khắcChú finely focus để giảm tải Một trong những ứng dụng đa dạng của cụm từ là trong sản suất đường, đường nho và cherry some of the many applications here are in the production of sugar, wine and grape juice Trong các ứng dụng thực tế, các cột sống được sử dụng để tạo ra các đơn vị personalize cũng như để xảy ra mức độ khá từ nhiệm vào khử trùng Because of those, it is important to know the constraints and the potential risks before applying the method in a particular context.

+ Phương pháp cắt lá: việc nhân giống bằng phương pháp cắt lá thì tốn nhiều thời gian nhưng lại cho được lượng lớn cây con

Phương pháp cắt chồi đỉnh là một kỹ thuật hiệu quả và nhanh chóng, đặc biệt khi cần thu hoạch một số lượng nhỏ từ các loài hoang dã trong tự nhiên cũng như những loài đã được thuần hóa.

+ Phương pháp tạo căn hành: người ta có thể nhân giống loại cây này bằng phương pháp cắt đốt từ rễ củ hay căn hành (Rhizome)

Như những phong phú thông tin cho thấy, cách切り葉しまたーのかりの手法 phổ biến hơn so với phương pháp khác Riêng đối với những cây thuộc giống Hiemalis, chúng ta có thể nhân giống từ lá hoặc phương pháp cắt đốt Cung cấp một lượng thông tin hữu tính cũng là một niềm tin lớn để mở rộng quy trình nhân giống.

Phương pháp gieo hạt cho phép thu được cây con giống hệt bố mẹ từ các giống hoang dã mà không cần thụ phấn chéo Tuy nhiên, đối với giống thuần hóa và lai, phương pháp này thường không được áp dụng, trừ khi nhằm mục đích tạo ra giống mới.

Các cơ quan của cây như lá, cuống lá, thân và cụm hoa được sử dụng làm mẫu trong nhân giống in vitro, trong đó phiến lá được coi là nguồn mẫu tối ưu nhất do khả năng tái sinh nhiều chồi, giúp tăng cường số lượng giống Môi trường MS là lựa chọn phổ biến và hiệu quả nhất cho việc nuôi cấy in vitro Begonia spp., bên cạnh đó, các môi trường khác như LS (Reuter, 1980), Welander (Welander, 1974) và White (Fonnesbech, 1974) cũng được áp dụng.

Welander (1977) đã thực hiện nhân giống từ mẫu cấy là chồi đỉnh trên môi trường đa và vi lượng, trong khi Welander (1974) đã bổ sung 0.54 àM NAA và 0.22 àM BA Hakkaart và Versluijs (1984) đã giới thiệu phương pháp nuôi cấy chồi đỉnh của giống.

Elatior Begonia giúp hạn chế sự nhiễm khuẩn Nghiên cứu của Bech và Paludan (1990)[34] phát hiện trong Xanthomonas campestris pv begonia (Xcb) thuộc Elatior begonias, giai đoạn ngủ ngắn diễn ra vào mùa xuân và mùa hè hơn so với giai đoạn mùa đông Hơn nữa, chúng có khả năng phát triển các cọng lá trong prostředí âm ỉ và sạch bờ bằng agar trong thời gian từ 6 đến 12 tháng Quá trình nuôi cấy lá này giúp bảo vệ và giữ gìm thực vật dễ bị nhiễm khuẩn.

Reuter (1980) đã thành công trong việc tạo ra cây con từ mẫu lá kích thước 5 x 5 mm trên môi trường MS có bổ sung cytokinin và IBA Bigot (1981) cũng đạt được kết quả tích cực khi nuôi cấy mẫu lá kích thước 7 mm trên môi trường khoáng MS với 0,54 - 2,2 ppm NAA, 4,9 – 14,7 ppm 2iP, 88 mM sucrose và 8 g/l agar Takayama và Misawa (1981) cũng đã thu được cây con khi nuôi cấy mẫu lá trên môi trường tương tự.

Nghiên cứu của Iida và cộng sự (1986) cho thấy rằng trong môi trường MS bổ sung 1 mg/l BA và 1 mg/l NAA, các chồi được tạo ra từ mẫu cấy lỏ sau 70 ngày phát triển tốt Khi chuyển sang môi trường ra rễ MS có bổ sung 1 mg/l NAA, các chồi này đều ra rễ mạnh mẽ.

Nakano và đồng sự (1999) đã isolation được các chồi bất định dài khoảng 10 mm (tỷ lệ 8-9 chồi trên một lần cấy) từ mẫu cấy lá của Begonia tuberous nuôi trồng trên môi trường MS bổ sung nitoamat (NAA) và bamyl (BA) Các chồi này có thể biến đổi thành rễ trên môi trường MS với nồng độ 0,54 µM NAA và 8 g/lotion agar để tạo thành các cây con Nói cách khác, phương pháp nuôi cấy cuống lá cũng được áp dụng trong nghiên cứu này.

Mẫu cấy có nguồn gốc từ cuống lá được coi là nguồn vật liệu tốt tương đương với mẫu từ lá đã nuôi cấy Nghiên cứu cho thấy cuống lá (10 mm) và đoạn thân (10 mm) trên môi trường MS với 0,54 – 2,2 ppm NAA và 4,9 – 14,7 ppm 2iP, cùng với 88 mM sucrose và 8g/lít agar, mang lại kết quả tái sinh cây con tốt nhất.

Imelda (1983) đã đạt được sự tái sinh chồi tối ưu trên môi trường MS bổ sung NAA 0,1 mg/l và 2iP 0,2 và 0,4 mg/l Trong đó, nhiệm vụ sinh chồi không đều nhất được thực hiện ở những mẫu cuống lá trồng trên môi trường có sự tham gia 0,1 mg/l NAA và 0,5 mg/l BA, nhưng lại kiểm soát lượng sinh trưởng của chồi Nếu sử dụng nồng độ BA thấp hơn (0,1 mg/l), số lượng chồi tạo ra sẽ ít hơn, nhưng lại kích thích sự phát triển của chồi Đừng quên thực hiện nuôi cấy cánh hoa để đạt được kết quả tối ưu.

Mẫu cấy từ cánh hoa giống Schwabenland có khả năng tạo rễ, lá và cấu trúc hoa khi được nuôi trong môi trường Margara N30K với sự bổ sung 10 -6 M BA và 10 -5 M 2,4-D Quá trình phát sinh cơ quan có thể bị ức chế tạm thời khi chuyển sang môi trường không có auxin (Margara và Phelouzat, 1984).

Khoder và các cộng sự (1981) đã thực hiện nuôi cấy đỉnh thân, thân và cuống nhỏ trên môi trường MS được điều chỉnh, với nồng độ NH4NO3 giảm xuống còn 330 mg/l, kết hợp với 0,5 àM NAA, 8,8 àM BA và 87 àM sucrose Kết quả là họ thu được một số lượng lớn cây con trong vòng 7 tháng.

Takayama và Misawa (1982) đã phát triển một mô hình nhân sinh khối thông qua kỹ thuật nuôi cấy lắc và bình nuôi cấy Mẫu cấy được lấy từ lá non có đường kính 3 – 4 cm, cắt thành kích thước 7 x 7 mm và cấy vào môi trường MS với 5,4 mM NAA, 1,3 mM BA, 29 mM đường sucrose và 8 g/lít agar Sau 30 ngày nuôi cấy, mỗi mẫu có khoảng 150 – 200 chồi, tuy nhiên kích thước chồi còn nhỏ Để cải thiện, hệ thống nuôi cấy lắc được đề xuất, sử dụng bình tam giác 300 ml chứa 30 – 50 ml dung dịch môi trường với 5,4 mM NAA và 87,6 mM sucrose, lắc với tốc độ 180 vòng/phút dưới ánh sáng liên tục Phương pháp này cho phép thu được từ 10 – 14 chồi hoặc nhiều hơn từ mỗi mẫu lá non kích thước 7 x 7 mm.

PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY LỚP MỎNG TẾ BÀO (THIN CELL LAYER, TCL)

Mạng lưới ức chế liên quan đến sự tăng trưởng, phát triển và lão hóa, xuất phát từ mối tương quan giữa các cơ quan, mô và tế bào, cũng như giữa các cụm tế bào khác nhau và các bào quan trong tế bào Khái niệm hệ thống lớp mỏng tế bào được giáo sư Trần Thanh Vân phát triển vào đầu những năm 70, nhằm giải thích những tương tác phức tạp này.

Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào, được áp dụng từ thập niên 70, đã chứng minh có ứng dụng to lớn trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu sinh học và công nghệ sinh học thực vật Nó giúp hiểu rõ cơ chế của sự biệt hóa và phát sinh hình thái, hỗ trợ vi nhân giống in vitro, nghiên cứu sinh học phân tử, cũng như sự biến nạp và chuyển gen.

1.8.1 ẹũnh nghúa cuỷa heọ thoỏng TCL

Thực vật có khả năng nổi bật là có thể tái chương trình biệt hóa sự phát triển của cơ thể và có khả năng xây dựng quá trình phân chia chức năng mới (callus, rễ, chồi, phôi soma và hoa), mẫu phát sinh hình thái mới

Trong quá trình hình thành cấu trúc mới như chồi và phôi soma, cá thể mới có thể được tạo ra mà không cần giảm phân hay sinh sản hữu tính Sự phát triển bên trong thực vật được điều chỉnh theo không gian và thời gian thông qua một mạng lưới các đơn vị như cơ quan, mô và tế bào Sự thay đổi trong mạng lưới này có thể dẫn đến sự ức chế ở mức cá thể Phương pháp TCL liên quan đến việc cô lập tế bào từ mạng lưới ức chế và tái chương trình chúng thông qua nuôi cấy in vitro (Dương Tấn Nhựt và cộng sự, 2003).

Hệ thống TCL bao gồm các mẫu mô nhỏ được thu nhận từ nhiều cơ quan khác nhau của thực vật như thân, rễ, lá, cụm hoa, chồi hoa, các cơ quan của hoa, lá, mầm mô phân sinh, đỉnh sinh trưởng và phôi.

Khi thu nhận mẫu theo chiều dọc, thì mẫu được gọi là lTCL (longitudial TCL) hoặc khi thu nhận mẫu theo chiều ngang mẫu gọi là tTCL (transverse TCL)

Các mẫu dạng lTCL (1 mm × 0,5 hay 10 mm) thường chỉ bao gồm một dạng mô như một lớp đơn các tế bào biểu bì, có thể được bóc, tách khỏi cơ quan hoặc một vài lớp (3-6) tế bào biểu bì Trong khi đó, các mẫu tTCL (0,2-0,5 mm hay dày vài mm) chứa một số lượng nhỏ các tế bào thuộc các dạng mô khác nhau như: biểu bì, vùng tượng tầng, bó gỗ, bó mộc và các tế bào nhu mô (Trần Thanh Vân và Gendy, 1996).žíat này cũng nêu bật hệ thống TCL chỉ dày vài micromet (àTCL) cần phải dựng mỏy vi phẫu để cắt, tuy nhiên kích thước này sẽ dễ bị chết hay bị nhiễm khuẩn (Lee - Stedlemamn và cộng sự, 1989).

1.8.2 Đặc trưng của hệ thống Đặc trưng của lTCL và tTCL là chúng rất mỏng, nghĩa là một mẫu cấy có càng ít tế bào càng tốt Đặc điểm mỏng này là một trong những điều quan trọng vì các phân tử đánh dấu (Markers) của quá trình biệt hóa có thể định vị in situ trong các tế bào mục tiêu hay trong các tế bào cảm ứng Quá trình định vị này cho phép giới hạn các tế bào cảm ứng không mong muốn (Trần Thanh Vân, 2003)[46]

Trong quá trình cắt mẫu mô thực vật, enzyme và polysaccharide được sinh ra đóng vai trò quan trọng trong việc kích thích sự sinh trưởng và phát triển của thực vật Việc ứng dụng một số tế bào trong hệ thống TCL có liên quan chặt chẽ đến các tế bào bị thương, nơi diễn ra quá trình tổng hợp cấu trúc vách tế bào và phóng thích oligosaccharide Những yếu tố dinh dưỡng và môi trường cũng góp phần "kiểm soát" sự phát sinh hình thái của thực vật.

Hệ thống đa bào như hệ thống TCL thể hiện sự tổ chức không gian và thời gian của cơ thể ban đầu Khác với tế bào đơn hoặc tế bào trần, khi tách ra, chúng tạo thành vách tế bào và hình thành cụm tế bào với tổ chức không gian và thời gian khác biệt so với tổ chức trước khi tách ra từ mô hoặc cơ quan.

Giảm số lượng tế bào trong phương pháp lát mỏng tế bào đóng vai trò vô cùng quan trọng đối với quá trình phát triển hoặc các chương trình biệt hóa cơ quan, mô Các chương trình biệt hóa có thể biến đổi từ sự thay đổi mối quan hệ giữa cơ quan, mô nuôi cấy với kích cỡ khác nhau khi nuôi cấy trên môi trường có cùng tính chất Dùng phổ biến phương pháp lát cắt dọc (0,5 x 1 x 10 mm), các dạng phát sinh thể mong muốn có thể tạo ra bằng cách kiểm soát mức độ tác động của các nhân tố ngoại sinh.

Quá trình phát sinh hình thái diễn ra trong khoảng thời gian ngắn, trung bình khoảng 14 ngày sau khi cấy, với tần suất phản ứng gần 100% ở các mẫu Tỉ lệ giữa số lượng tế bào đáp ứng và tổng số tế bào hiện diện trên mẫu TCL là cao.

Trên mẫu lTCL của Nicotiana tobacum (1 x 10 mm, bao gồm 3 – 6 lớp tế bào biểu bì thu nhận từ cánh hoa), các cơ quan được biệt hóa trực tiếp trên bề mặt của TCL mà không cần trải qua quá trình mô sẹo trung gian.

+ 50 hoa trong chương trình tạo hoa

+ 500 - 700 chồi trong chương trình tạo chồi

+ 15 - 20 rễ trong chương trình tạo rễ

1.8.3 Ưu điểm của phương pháp.

− Diện tích tiếp xúc của mẫu với môi trường lớn nên mẫu dễ dàng hấp thu các chất dinh dưỡng từ môi trường

− Dễ định vị vùng cho phản ứng do chỉ có một lớp mỏng tế bào

− Lượng hormone nội sinh trong mẫu thấp vì thế các chất điều hòa sinh trưởng thực vật dễ tác động lên mẫu

− Mẫu nuôi cấy đồng nhất và nhanh chóng trả lời các cảm ứng

− Tần số phát sinh cơ quan, việc hình thành phôi thấp

− Tạo ra thực vật hoàn chỉnh, ít bị biến đổi

− Không xảy ra sự tương tác giữa các cơ quan và giữa cơ quan với toàn bộ cơ thể thực vật

− Nhanh chóng đạt kết quả trong thời gian ngắn

Trong phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào, những đặc tính mong muốn khác bao gồm sự đồng nhất về sinh lý, di truyền và khả năng áp dụng phương pháp này cho mọi loài thực vật.

Điều kiện môi trường lý tưởng cho sự tồn tại của mẫu TCL phụ thuộc vào từng loài và cần phải thử nghiệm lại tất cả các yếu tố như hệ thống nuôi cấy in vitro, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (PGRs), chất dinh dưỡng, ánh sáng, độ thẩm thấu và nhiệt độ (Tran Thanh Van, 1980).

1.8.4 Một số thành tựu đạt được trong ứng dụng phương pháp TCL

Phương pháp TCL đã được áp dụng đầu tiên trong nghiên cứu về sự phát sinh hình thái, sự biệt hóa cơ quan và sự phát triển sâu sắc trên ba loài thực vật: Thuốc Lá (Nicotiana tobacum), Lily (Lilium longiflorum) và Cúc (Dendrathema grandiflora) Những loài này được coi là mô hình lý tưởng cho hệ thoáng TCL.

GIỚI THIỆU BIOREACTOR

Trên thế giới, có nhiều loại bồn nuôi cấy khác nhau, được phân loại dựa trên phương pháp khuấy, bao gồm bồn có khuấy và bồn không khuấy, cũng như các kiểu bầu chứa và kiểu sục khí.

Về cấu tạo, các Bioreactor đều có cấu tạo giống các bôn nuôi cấy vi sinh vật

2 Màng lọc khí vô trùng (filter)

8 Hệ thống sủi bọt khí

10 màng lọc khí vô trùng (filter)

1.9.2 Quy trình nhân sinh khối thực vật bằng Bioreactor

Bước 1: thiết lập môi trường nuôi cấy vô trùng

Bước 2: Cảm ứng việc tạo nhiều chồi trên một diện tích mẫu mô cấy (nuôi cấy trên môi trường agar) giúp tăng cường sự phát triển của chồi, đồng thời đó là giai đoạn quan trọng để nuôi cấy lỏng thúc đẩy sự phát triển của chúng.

+ Tăng cường sự phát triển của chồi bằng kỹ thuật sử dụng

Bước 3: giúp tạo rễ và làm cứng cáp cây con trước khi chuyển ra trồng ở vườn ươm

+ Bước 1: là bước cơ bản và quan trọng để hạn chế sự nhiễm khuẩn cho mẫu đối với mọi quá trình nuôi cấy

Bước 2: Để tạo ra nhiều chồi bên và chồi bất định trên mẫu cấy, cần thêm Cytokinin vào môi trường Sau đó, nuôi cấy lỏng và sử dụng Bioreactor sẽ giúp chồi phát triển nhanh chóng và tăng kích thước, từ đó tạo ra cây con (plantlets).

Bước 3 là giai đoạn quan trọng để tạo rễ và làm cho cây con cứng cáp trước khi đưa ra vườn Tuy nhiên, tùy thuộc vào từng loài cây, bước này có thể cần thiết hoặc không.

CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật là những hợp chất hóa học đa dạng, có khả năng điều tiết các quá trình sinh trưởng và phát triển của cây Chúng ảnh hưởng từ giai đoạn thụ phấn, hình thành phôi cho đến khi cây ra hoa, kết quả và phát triển cơ quan sinh sản Các chất này bao gồm cả những hợp chất tự nhiên và những loại được tổng hợp nhân tạo.

1.10.1 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật sử dụng trong đề tài.

Cytokinin gồm các chất như: Zeatin, Kinetin (6-furfurylaminopurine), 2iP (2- isopententyl adenine) và BA (6 – Benzyn adenin) a Nguoàn goác

Mô phân sinh ở ngọn và rễ là nơi tổng hợp cytokinin tự do cho toàn bộ cơ thể thực vật Cytokinin từ rễ di chuyển qua mạch mộc đến chồi, nơi cũng diễn ra quá trình tổng hợp cytokinin.

Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào với điều kiện có auxin, cytokinin tác động trên cả hai bước của sự phân chia tế bào c Coõng duùng

Cytokinin đóng vai trò quan trọng trong việc tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein ở thân và rễ cây Chất này không chỉ ngăn cản sự kéo dài của tế bào mà còn kích thích sự kéo dãn theo chiều ngang, góp phần vào sự phát triển của củ Ngoài ra, cytokinin cũng thúc đẩy sự gia tăng kích thước của tế bào lá trưởng thành.

Cytokinin kích thích sự hình thành tia củ và sự phình to của củ

Nồng độ auxin/cytokinin khi phối hợp với nhau có ảnh hưởng đến thực vật như: nồng độ auxin/cytokinin cao sẽ thích hợp cho việc ra rễ, ngược lại auxin/cytokinin thấp sẽ kích thích mô phát triển về phía chức năng tạo thân Khi nồng độ auxin/cytokinin gần bằng 1 đơn vị thì sẽ tạo mô sẹo

Năm 1976, TDZ (N-phenyl-N’-1,2,3-thidiazol-5-ylurea) được xác nhận nó được xem như là một chất làm rụng lá ở cây Bông Người ta cũng xác định được là TDZ cảm ứng thông qua việc làm tăng lượng ethylen nội sinh trong tế bào

Cấu trúc hóa học của TDZ cho thấy nó là một dẫn xuất của urea, nó không có vòng chung purine giống như các loại cytokinin, adenine như benzyl aminopurine, kinetin hay zeatin

TDZ được báo cáo là có hoạt tính mạnh trong việc kích thích tăng trưởng callus phụ thuộc cytokinin của giống Phaseolus lunatus cv Kingston TDZ không chỉ kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo (callus) mà còn được chứng minh là có hoạt tính cytokinin cao hơn cả zeatin (Mok và cộng sự, 1982)[67] b Thuận lợi và bất lợi khi sử dụng TDZ

TDZ có tính kháng lại sự phân hủy bởi các chất oxy hóa cytokinin (Mok và công sự, 1987)[68], nên nó khá bền trong nuôi cấy mô mà nhất là đối với vi nhân giống TDZ cũng được xem là có hiệu quả trên nhiều loài cây trồng đặc biệt là những cây thân gỗ

Một số loài thì việc dùng TDZ được nhận xét là gây ra những bất lợi, chẳng hạn như: hiện tượng thủy tinh thể đối với những chồi tái sinh, chồi ngắn và nhỏ gây khó khăn trong việc kéo dài và ra rễ đối với các chồi được tái sinh

Trong một số thí nghiệm, người ta đã khắc phục hiện tượng thủy tinh thể bằng cách đóng các đĩa petri loại đáy sâu ở giai đoạn bắt đầu tạo chồi và mở nắp ở giai đoạn kéo dài chồi hoặc bằng cách tăng nồng độ agar lên cao hơn Chất lượng của chồi có thể được cải thiện bằng cách dùng kết hợp TDZ với cytokinin loại purine

Preece và Imel (1991)[69] cũng đã báo cáo rằng phần lớn các chồi tái sinh từ môi trường nuôi cấy có bổ sung TDZ đều ngắn nhưng sau đó nếu chuyển sang nuôi cấy trên môi trường có acid butyric và 2ip thì sẽ được kéo dài hơn Để khắc phục các vấn đề trên thì mẫu cấy phải được cảm ứng ở nồng độ TDZ thấp Thông thường các nhà khoa học không nuôi cấy mẫu trên môi trường có TDZ quá 8 tuần

− Kích thích sự sinh trưởng của tế bào đặc biệt theo chiều ngang

− Kích thích sự phân chia tế bào vùng tượng tầng

− Kích thích sự tái sinh của libe và mộc

− Kích thích sự kéo dài tế bào và tăng trưởng thân

− Kích thích sự phát triển chồi đỉnh, ức chế sự phát triển chồi bên

− Cản trở quá trình lão hóa ở lá

− Có thể ức chế hoặc thúc đẩy (thông qua ethylen) sự rụng lá và quả phụ thuộc vào thời gian và vị trí ban đầu

− Trì hoãn sự chín của quả

− Kích thích sự tăng trưởng các phần của hoa

− Gây ra hiện tượng ưu thế ngọn

− Auxin kích thích sự hình thành rễ trên các đoạn cắt của thân, phát triển các nhánh rễ và sự phản biệt hóa các mô để tạo rễ trong nuôi cấy mô

1.10.1.4 NAA ( α - naphthalenacetic acid) a Công thức cấu tạo b Đặc tính

NAA ổn định hơn so với IAA, không bị oxy hóa bởi ánh sáng Chúng không có hiệu lực ra rễ như IBA, nhưng chúng được sử dụng để cảm ứng sự ra rễ trong nhân giống thương mại

2.1 ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ thực vật thuộc Phân Viện Sinh học tại Đà Lạt.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Vật liệu Đối tượng nghiên cứu: Các thí nghiệm được tiến hành trên loài hoa Thu hải đường (Begonia spp.) 6 tháng tuổi đang được trồng ở vườn ươm của phân Viện sinh học Đà Lạt và đang trong giai đoạn ra hoa với đường kính thân 1,4 cm

2.2.1.1 Mẫu cấy và mục đích

Giai đoạn 1: nuôi cấy lớp mỏng tế bào:

Dùng các đoạn thân thu nhận từ những cây hoa Thu hải đường 6 tháng tuổi lá xanh đang nở hoa (đường kính thân 1,4 cm) được trồng ở Phân viện sinh học tại Đà Lạt đem khử trùng làm mẫu cấy in vitro

• Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của BA, NAA lên khả năng tạo chồi của mẫu tTCL cây hoa Thu hải đường.

Mục đích: đánh giá ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng thực vật lên khả năng tạo chồi của mẫu

Chỉ tiêu đánh giá: số mẫu nảy chồi/tổng số mẫu thí nghiệm (tính bằng %)

Dùng các đoạn thân cây Thu hải đường đã được khử trùng cắt lát mỏng với độ dày khoảng 1 mm để làm mẫu cấy

• Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng độ dày của mẫu cấy tTCL lên khả năng tạo choài

Mục đích: đánh giá ảnh hưởng của độ dày mẫu tTCL lên khả năng tạo chồi

Chỉ tiêu đánh giá: số mẫu nảy chồi/tổng số mẫu thí nghiệm (%)

Dùng các đoạn thân cây Thu hải đường đã được khử trùng cắt lát mỏng với các độ dày 1, 2, 3, 4 mm để làm mẫu cấy

• Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của TDZ lên khả năng tạo chồi của mẫu tTCL cây hoa Thu hải đường

Mục đích: đánh giá ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng thực vật lên khả năng tạo chồi của mẫu

Chỉ tiêu đánh giá: số mẫu nảy chồi/tổng số mẫu thí nghiệm (%)

Dùng các đoạn thân cây Thu hải đường đã được khử trùng cắt lát mỏng với độ dày khoảng 2 và 3 mm để làm mẫu cấy

Giai đoạn 2: nuôi cấy nhân sinh khối chồi:

Dùng các mẫu đã ra chồi bất định thu đuợc từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào ở giai đoạn 1 sau 2 tháng nuôi cấy

• Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng nhân chồi của mẫu trên môi trường có agar Mục đích: đánh giá khả năng nhân chồi của mẫu trên môi trường có agar Chỉ tiêu đánh giá: khối lượng mẫu ban đầu/khối lượng mẫu sau khi nuôi cấy

Dùng mẫu ở giai đoạn 1 sau 2 tháng nuôi cấy cắt nhỏ ra làm nhiều mẫu khối lượng khoảng 0,1 g để làm mẫu cấy

• Thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng nhân chồi của mẫu tTCL trên môi trường lỏng tónh

Mục đích: đánh giá khả năng nhân chồi của mẫu tTCL trên môi trường

Chỉ tiêu đánh giá: khối lượng mẫu ban đầu/khối lượng mẫu sau khi nuôi cấy

Dùng mẫu ở giai đoạn 1 sau 2 tháng nuôi cấy cắt nhỏ ra làm nhiều mẫu khối lượng khoảng 0,1 g để làm mẫu cấy

• Thí nghiệm 6: Khảo sát khả năng nhân chồi của mẫu tTCL trên môi trường lỏng baèng Bioreactor

Mục đích: đánh giá khả năng nhân chồi của mẫu nuôi cấy bằng Bioreactor. Chỉ tiêu đánh giá: khối lượng mẫu ban đầu/khối lượng mẫu sau khi nuôi cấy

Dùng mẫu ở giai đoạn 1 sau 2 tháng nuôi cấy có khối lượng khoảng 3 g để làm mẫu cấy

Giai đoạn 3: tái sinh cây hoàn chỉnh

Dùng các mẫu thu đuợc từ nuôi cấy nhân sinh khối chồi ở giai đoạn 2

• Thí nghiệm 7: Khảo sát sự tái sinh rễ của chồi trên môi trường có agar

Mục đích: đánh giá khả năng ra rễ của chồi

Chỉ tiêu đánh giá: số rễ trên mẫu và độ dài của rễ

Dùng mẫu ở giai đoạn 2 sau 2 tháng nuôi cấy tách lấy từng cụm chồi nhỏ hay chồi đơn lớn để làm mẫu cấy

Môi trường sử dụng trong các thí nghiệm của đề tài là môi trường muối khoáng cơ bản MS (Mugashige và Skoog, 1962)[5] có bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng, đường sucrose, agar tuỳ vào từng thí nghiệm

Các môi trường trên đều được điều chỉnh pH đến 5,7 – 5,8 trước khi đem hấp khử trùng ở 121 0 C, 1 atm trong 35 phút

− Khảo sát ảnh hưởng của BA, NAA, TDZ lên khả năng tạo chồi của mẫu tTCL cây hoa Thu hải đường.

Môi trường thạch: phối hợp 2 chất kích thích sinh trưởng

MS + 30 g đường Sucrose /lít + 8 g Agar/lít + BA/NAA (Bảng 1)

Bảng 1: Nồng độ BA/NAA trong môi trường tái sinh chồi

Môi trường thạch: 1 chất kích thích sinh trưởng

MS + 30 g đường Sucrose /lít + 8 g Agar/lít + TDZ (bảng 2)

Bảng 2: Nồng độ TDZ trong môi trường tái sinh chồi

− Khảo sát ảnh hưởng độ dày mẫu cấy tTCL lên khả năng tạo chồi

MS + 30 g đường Sucrose /lít + 8 g Agar/lít + 0,2 mg/lít BA + 0,2 mg/lít NAA

− Khảo sát khả năng nhân chồi của mẫu trên môi trường thạch

Môi trường thạch: MS + 30 g đường Sucrose /lít + 8g Agar/lít + BA/NAA (bảng 3)

Bảng 3: Nồng độ BA/NAA trong môi trường nhân chồi

Nồng độ chất ẹHST (mg/l) NAA 0,1 0,2 0,1 0,5 0,1

− Khảo sát khả năng nhân chồi của mẫu trên môi trường lỏng tĩnh

MS + 30 g/lít đường Sucrose + 0,5 mg/lít BA + 0,1 mg/lít NAA

− Khảo sát khả năng nhân chồi của mẫu bằng Bioreactor

MS + 30 g/lít đường Sucrose + 0,5 mg/lít BA + 0,1 mg/lít NAA

− Tái sinh rễ của chồi trên môi trường thạch.

MS + 30 g/lít đường Sucrose + 0,5 mg/lít BA + 0,1 mg/lít NAA+ 8g Agar/lít có bổ sung và không bổ sung 1 g/lít than hoạt tính

Thiết lập hệ thống nhân giống in vitro của cây hoa Thu hải đường dùng hệ thống nuôi cấy lớp mỏng tế bào TCL

− Hệ thống (1) khảo sát ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng BA, NAA, TDZ và ảnh hưởng của độ dày mẫu cấy tTCL lên khả năng tạo chồi của mẫu tTCL

Xây dựng hệ thống nuôi cấy trong bình thuỷ tinh 250 ml chứa môi trường với những nồng độ chất kích thích sinh trưởng khác nhau

− Hệ thống (2) khảo sát khả năng nhân chồi của mẫu bằng môi trường thạch và môi trường lỏng tĩnh

Xây dựng hệ thống tương tự hệ thống (1) nhưng thay bằng môi trường nhaân choài

− Hệ thống khảo sát khả năng nhân chồi của mẫu bằng Bioreactor

Xây dựng hệ thống trong Bioreactor thuỷ tinh 5000 ml

Quá trình nuôi cấy bằng Bioreactor có sục khí sử dụng loại máy sục khí của Hàn Quốc Các thông số kỹ thuật của máy:

− Hệ thống tái sinh cây hoàn chỉnh

Xây dựng hệ thống tương tự hệ thống (1) nhưng thay bằng môi trường ra reã

Các hệ thống được hấp khử trùng ở 121 0 C, 1 atm trong 35 phút

Riêng hệ thống Bioreactor được cho vào các túi nylon bịt kín và hấp khử trùng Môi trường được hấp riêng trong các bình thuỷ tinh 500 ml Sau khi hấp khử trùng môi trường mới được cho vào hệ thống Bioreactor

Tất cả các thao tác kể từ sau khi hấp khử trùng đều được tiến hành trong tủ caỏy voõ truứng.

Các thân cây hoa Thu hải đường (đường kính 1,4 cm) sau khi cắt lá tiến hành khử trùng theo các bước sau:

+ Rửa sạch mẫu dưới vòi nước máy

+ Ngâm mẫu trong dung dịch xà phòng trong thời gian 10 phút

+ Rửa lại mẫu bằng nước cất 3 đến 4 lần

+ Sau đó khử trùng mẫu bằng cồn 70 o trong thời gian 30 giây

+ Rửa lại mẫu bằng nước cất vô trùng 3 đến 4 lần

+ Tiếp theo mẫu được khử trùng bằng HgCl2 nồng độ 0,1% bổ sung thêm vài giọt Tween 80 và lắc trong 5 phút

+ Rửa lại mẫu bằng nước cất vô trùng 3 đến 4 lần và thu được mẫu vô truứng

• Từ bước thứ tư trở đi yêu cầu phải thao trong tủ cấy vô trùng.

Cường độ chiếu sáng 2500 lux Độ ẩm trung bình 75 – 80 %

THIEÁT KEÁ THÍ NGHIEÄM

Môi trường đặc Môi trường lỏng tĩnh Bioteactor

Thớ nghieọm 4 Thớ nghieọm 5 Thớ nghũeõm 6

Mẫu được khử trùng với 3 khoảng thời gian khác nhau là 4, 5, 7 phút Sau khi nuôi cấy các mẫu cấy chúng tôi đã thu được kết quả như sau: Đối với mẫu thân cây hoa Thu hải đường thì thời gian khử trùng mẫu tốt nhất là 5 phút Ở thời gian khử trùng là 5 phút mẫu cấy nảy chồi tốt và xanh hơn so với các mẫu cấy khử trùng ở thời gian 4 phút và 7 phút Khi khử trùng mẫu cấy với thời gian 4 phút, mẫu cấy bị nhiễm rất nhiều, còn khử trùng mẫu cấy với khoảng thời gian 7 phút, mẫu cấy bị nâu đen rồi chết Điều này có thể là do khi khử trùng mẫu cấy với thời gian là 4 phút, hóa chất khử trùng chưa diệt hết được các vi sinh vật trên bề mặt mẫu cấy Khi khử trùng mẫu cấy với thời gian 7 phút, do thời gian khử trùng quá lâu hóa chất khử trùng ngấm vào mẫu gây độc cho mẫu cấy và làm chết mẫu hàng loạt Khoảng thời gian khử trùng 5 phút là thích hợp vì với khoảng thời gian này hóa chất khử trùng đã diệt hết các vi sinh vật gây nhiễm trên bề mặt mẫu, nhưng chưa đủ để hóa chất có thể ngấm vào mẫu cấy, nên mẫu cấy không bị nhiễm độc, chúng vẫn còn khả năng tái sinh trên môi trường nuôi cấy thích hợp

3.1.2 Thí nghiệm 1 : Khảo sát ảnh hưởng của BA, NAA lên khả năng tạo chồi cuûa maãu tTCL

Mẫu cấy lớp mỏng tế bào tTCL thân cây hoa Thu hải đường được cắt với độ dày 1 mm sau 45 ngày nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung thêm 30 g/l đường sucrose, 8 g/l agar và các chất điều hòa sinh trưởng với nồng độ được biểu thị như

Bảng 4: Ảnh hưởng của BA/NAA lên khả năng tái sinh chồi của mẫu cấy tTCL

Chất điều hòa sinh trưởng (mg/l)

Kớ hieọu moâi trường BA NAA

Tỉ lệ nảy choài (%) Ghi chuù

Biểu đồ 1 : Ảnh hưởng BA/NAA lên khả năng tái sinh chồi của mẫu cấy tTCL

Qua kết quả của thí nghiệm (Bảng 4) các mẫu cấy non đều phát sinh nhiều chồi, riêng những mẫu già thì cho chồi lớn tuy nhiên, số lượng chồi ít Ở các môi trường từ A9 đến A12 cho tỉ lệ mẫu chết (đen) cao Tuy cũng có những mẫu nảy chồi nhưng rất yếu ớt Điều này chứng tỏ mẫu già không thích hợp cho việc tái sinh chồi

Bên cạnh đó, kết quả thí nghiệm cho thấy khi dùng phối hợp 0,2 mg/l BA 0,2 mg/l NAA và (môi trường A2) mẫu cấy lớp mỏng tế bào của thân cây hoa Thu hải đường cho tỉ lệ phát sinh chồi cao nhất Ở nồng độ này, chồi phát triển đều Trên các môi trường khác như:A1 (0,2 mg/l BA và 0,1 mg/l NAA), A4 (0,2 mg/l BA và 1 mg/l NAA) cũng cho tỉ lệ nảy chồi cao tuy nhiên, mẫu cấy nảy chồi không đều và chồi phát triển kém Riêng môi trường A5 (0,5 mg/l BA và 0,1 mg/l NAA) bên cạnh sự tái sinh chồi mẫu cấy còn hình thành rễ

Từ đó cho thấy, sự phối hợp 2 chất ĐHST thực vật BA và NAA có ảnh hưởng tới sự phát sinh chồi của lớp mỏng tế bào ở cây hoa Thu hải đường Sự phát sinh chồi của mẫu cấy lớp mỏng tế bào Thu hải đường xảy ra tốt trên môi trường bổ sung BA và NAA ở nồng độ thấp, cụ thể là ở môi trường A2 (0,2 mg/l BA và 0,2 mg/l NAA) các mẫu cấy có tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất (tỉ lệ 90%), chồi có kích thước lớn, số lượng chồi tạo ra dày đặc trên bề mặt mẫu cấy Khả năng phát sinh chồi của các mẫu cấy giảm dần khi tăng dần nồng độ BA và NAA Khả năng tạo chồi của các mẫu cấy tTCL thấp nhất khi bổ sung BA và NAA ở nồng độ cao (1 mg/l), tỷ lệ mẫu tái sinh thấp (tỉ lệ 30%), chồi có kích thước nhỏ sinh trưởng chậm vàng úa rồi chết Điều này có thể là do khi bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng ở nồng độ cao dẫn đến mẫu cấy bị ức chế không thể tái sinh được hoặc nếu mẫu cấy vẫn còn khả năng tái sinh thì sự tái sinh xảy ra rất yếu

Từ thí nghiệm này để thực hiện chương trình tái sinh chồi từ mẫu cấy tTCL thân cây Thu hải đường trên môi trường đặc có bổ sung BA va NAA thì nên chọn môi trường A2 (2,0 mg/l BA và 0,2 mg/l NAA)

3.1.3 Thí nghiệm 2 : Khảo sát ảnh hưởng độ dày mẫu cấy tTCL lên khả năng tạo chồi

Mẫu cấy lớp mỏng tế bào tTCL thân cây hoa Thu hải đường được cắt theo các độ dày 1, 2, 3, 4 mm sau 45 ngày nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung thêm 0,2 mg/l BA, 0,2 mg/l NAA, 30 g/l đường sucrose và 8g/l agar

Bảng 5: Ảnh hưởng độ dày mẫu cấy tTCL lên khả năng tạo chồi Độ dày maãu (mm)

Tổ leọ maóu nảy chồi Ghi chú

Biểu đồ 2: Ảnh hưởng độ dày mẫu cấy tTCL lên khả năng tạo chồi

1 mm 2 mm 3 mm 4 mm Độ dày mẫu tTCL

Tỉ le ọ n ảy c ho ài

Kết quả thu được ở Bảng 5 cho thấy ở độ dày 1 mm mẫu cấy cho tỉ lệ tái sinh chồi không cao và chồi phát triển kém, kích thước nhỏ Ở độ dày 1 mm, mẫu cấy cho tỉ lệ tái sinh chồi không cao (tỉ lệ 75%) Chồi có kích thước nhỏ và màu sắc không đẹp, chồi có màu vàng, sinh trưởng chậm Ở độ dày 2 mm, mẫu cấy cho tỉ lệ tái sinh chồi cao (tỉ lệ 91%) Chồi có kích thước nhỏ nhưng đều và màu sắc đẹp, chồi có màu xanh, sinh trưởng tốt Ở độ dày 3 mm, 4 mm mẫu cấy cho tỉ lệ tái sinh chồi rất cao (tỉ lệ 100%), tất cả các mẫu cấy đều tái sinh, chồi phát triển tốt, đều và xanh, lá lớn đẹp Tuy nhiên ở độ dày 4 mm chồi tái sinh lớn nhưng không đều Do vậy, độ dày có ảnh hưởng đến khả năng tạo chồi của lớp mỏng tế bào ở cây hoa Thu hải đường hay kích thước của mẫu cấy có ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy lớp mỏng tế bào cắt ngang (tTCL) Trong thí nghiệm này kết quả thu được cho thấy mẫu cấy có kích thước càng lớn (mẫu cấy càng dày) khả năng tái sinh càng tốt, cho số chồi tái sinh trên mẫu cấy càng lớn Điều này có thể là do mẫu cấy với độ dày 1 mm quá mỏng nên mẫu cấy dễ bị chết hay bị tổn thương nhiều nên mẫu cấy khó hồi phục hay khả năng hồi phục của mẫu cấy là rất chậm nên mẫu cấy tái sinh rất kém Độ dày 4 mm quá dày nên mẫu cấy dễ tái sinh chồi, nhưng có thể do lượng hormone trong mẫu cao nên khả năng hồi phục của mẫu cấy là rất chậm và tạo chồi lớn, không đều Với độ dày lớp mỏng tế bào là 2 mm và 3 mm có lẽ là kích thước phù hợp cho sự tái sinh của mẫu cấy lớp mỏng tế bào cắt ngang (tTCL) thân cây Thu hải đường, cho nên mẫu cấy tái sinh rất tốt, tạo ra số lượng chồi nhiều, chồi phát triển tốt Từ kết quả này cho thấy khi sử dụng mẫu cấy tTCL thân cây Thu hải đường (Begonia spp.) nên sử dụng các mẫu cấy có độ dày 2 mm và 3 mm cho mục đích tái sinh chồi

3.1.4 Thí nghiệm 3 : Khảo sát ảnh hưởng của TDZ lên khả năng tạo chồi của maãu tTCL

Mẫu cấy lớp mỏng tế bào tTCL thân cây hoa Thu hải đường được cắt theo độ dày 2 - 3 mm sau 45 ngày nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung thêm chất điều hòa sinh trưởng TDZ theo (Bảng 5), 30 g/l đường sucrose và 8g/l agar

Tỷ lệ tái sinh chồi

Tỉ lệ tái sinh chồi

Bảng 6: Kết quả ảnh hưởng của TDZ lên khả năng tái sinh chồi

Tỉ lệ tái sinh choài (%) Ghi chuù

Biểu đồ 3: Ảnh hưởng của TDZ lên khả năng tái sinh chồi

Qua kết quả thu được (Bảng 6) cho thấy tỉ lệ tái sinh chồi ở môi trường B1 (0,2 mg/l TDZ) đạt 90% các chồi phát triển yếu, chồi nhỏ Trên môi trường B2 (0,3 mg/l TDZ) các mẫu tái sinh chồi tương đương các môi trường khác Tuy nhiên chồi phát triển không lớn.Trong khi đó trên môi trường B3 (0,4 mg/l TDZ) và B4 (0,5 ng/l TDZ) tất cả các mẫu đều cho kết quả tái sinh chồi cao (tỉ lệ 100%) Tuy nhiên ở môi trường B4 cho các chồi tái sinh lớn, phát triển mạnh, chồi màu xanh thẫm, chứng tỏ môi trường B4 (0,5 mg/l TDZ) là tốt nhất cho tái sinh chồi Bên cạnh đó môi trường B3 (0,4 mg/l TDZ) cũng có thể sử dụng

3.1.5 Thí nghiệm 4 : Khảo sát khả năng nhân chồi của mẫu trên môi trường đặc

Mẫu cấy chuyền thu được sau 60 ngày nuôi cấy từ mẫu ban đầu (khối lượng khoảng 0,3 g/mẫu) trên môi trường MSù bổ sung thêm 30 g/l đường sucrose, 8g/l gar và BA, NAA (Bảng 7)

Bảng 7: Kết quả khả năng nhân chồi của mẫu trên môi trường đặc

Biểu đồ 4: Khả năng nhân chồi của mẫu trên môi trường đặc

Lọai môi trường he ọ s ố ta ờng tr on g lư ợn g

Hệ số tăng trọng lượng

Khối lượng maãu ban đầu (g)

Qua kết quả thu được (Bảng 7) của thí nghiệm này sau 60 ngày nuôi cấy cho thấy các mẫu cấy đều sống sót, tái sinh và tăng trưởng Ở môi trường C1 (0,2 mg/l BA và 0,1 mg/l NAA), sau 60 ngày nuôi cấy, trọng lượng tươi của mẫu cấy tăng đáng kể (2,5 g/mẫu) Sự chênh lệch trọng lượng tươi của mẫu cấy so với trọng lượng tươi ban đầu (0,3 g/mẫu) là 8,3 lần Ở môi trường C2 (0,2 mg/l BA và 0,2 mg/l BA), mẫu cấy có sự tăng trọng lượng tươi (2,3 g/mẫu), so với trọng lượng tươi của mẫu cấy ban đầu tăng gấp 7,6 lần

Tuy nhiên các mẫu cấy tTCL thân cây Thu hải đường trên môi trường C1 và C2 tạo chồi không nhiều, các chồi phát triển bình thường, có màu xanh

Trên môi trường C3 (0,5 mg/l BA và 0,1 mg/l NAA), các mẫu cấy tăng trọng lượng tươi nhiều nhất (3,0 g/mẫu), so với trọng lượng tươi của mẫu cấy ban đầu tăng gấp 10 lần Bên cạnh đó có kèm theo rễ

Trên môi trường C4 (0,5 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA), trọng lượng tươi của mẫu cấy có tăng tuy không nhiều (1,7 g/mẫu), so với trọng lượng tươi của mẫu cấy ban đầu taêng gaáp 5,6 laàn

Trên môi trường C5 (1,0 mg/l BA và 1,0 mg/l NAA), trọng lượng tươi của mẫu cấy cũng tăng, tuy nhiên sự tăng trọng lượng tươi của mẫu cấy rất ít (1,5 g/mẫu), so với trọng lượng tươi của mẫu cấy ban đầu chỉ tăng gấp 3 lần

THẢO LUẬN

3.2.1 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA và NAA

Qua kết quả thu được ở bảng 4 cho chúng ta thấy nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật luôn có ảnh hưởng lớn và được quan tâm hàng đầu Nó giúp chúng ta có thể nghiên cứu sâu hơn đến sự phát triển của cây trong môi trường in vitro, nhất là quá trình phát sinh chồi

Kết quả thí nghiệm cho thấy chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin có vai trò quan trọng trong sự phát sinh chồi Ở thí nghiệm 1 cho kết quả là khi nuôi cấy trên môi trường cơ bản MS không có bổ sung thêm các chất điều hòa sinh trưởng thực vật thì chồi hình thành với số lượng không nhiều sau 45 ngày nuôi cấy Nhưng ngược lại, trên môi trường có bổ sung thêm các chất điều hòa sinh trưởng thực vật thì chồi phát triển tốt, cho số lượng nhiều Kết quả này cho thấy BA, NAA cần thiết cho sự hình thành và phát triển của chồi, nhưng khả năng phát sinh chồi của mẫu cấy phụ thuộc vào nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng bổ sung vào môi trường nuôi cấy

Tuy nhiên, trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của BA, NAA khi có hiện tượng thiếu hụt cytokinin như ở môi trường A1 sẽ làm cho các chồi xuất hiện những hiện tượng như: chồi chết sớm, lùn…

Qua kết quả của thí nghiệm chúng ta còn thấy sự hình thành chồi còn phụ thuộc vào hàm lượng bổ sung và phối hợp các chất điều hòa sinh trưởng với nhau trong môi trường Ở thí nghiệm 1 cho kết quả phát sinh chồi cao nhất ở môi trường bổ sung 0,2 mg/l BA và 0,2 mg/l NAA (môi trường A2) Các nồng độ khác cũng được khảo sát như nồng độ cao hơn: A6 (0,5 mg/l BA và 0,2 mg/l BA) và những nồng độ thấp hơn như: A1 (0,2 mg/l BA và 0,1 mg/l NAA) đều cho tỉ lệ tạo chồi thấp Nếu so sánh với kết quả trước đây cũng không có sự khác biệt lắm khi môi trường tạo chồi bất định nhiều nhất là các mẫu cuống lá trên môi trường có sự tham gia NAA 0,1 mg/l và BA 0,5 mg/l, nhưng hạn chế sự sinh trưởng của chồi Nếu dùng nồng độ BA thấp hơn (0,1 mg/l) thì tạo chồi ít hơn nhưng kích thích sự tăng trưởng của chồi Điều này lại chứng tỏ BA, NAA có ảnh hưởng quan trọng đến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy

3.2.2 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng TDZ

Trong nhóm cytokinin, TDZ được xem là một loại cytokinin mạnh, là dẫn xuất của urea thường được sử dụng trong nhân giống cây thân gỗ (Huetteman và Prece, 1993)[70] Tuy nhiên, khi sử dụng TDZ người ta thường dùng với nồng độ thấp hay cho mẫu tiếp xúc với TDZ trong thời gian ngắn để giảm sự phát triển bất thường của chồi Trong kết quả thí nghiệm 3 (Bảng 6): ảnh hưởng của TDZ đến khả năng hình thành chồi của mẫu tTCL, ở môi trường có nồng độ TDZ (0,5 mg/l) cho tỉ lệ tái sinh chồi tốt nhất Trong những môi trường nuôi cấy bổ sung TDZ ở nồng độ thấp hơn (môi trường MS bổ sung 0,2 mg/l TDZ và môi trường bổ sung 0,3 mg/l TDZ) cho kết quả kém hơn (Bảng 6) Điều này chứng tỏ các mẫu cấy tTCL thân cây hoa Thu hải đường thích hợp khi nuôi cấy trên môi trường bổ sung 0,5 mg/l TDZ

3.2.3 Ảnh hưởng của độ dày mẫu cấy

Qua kết quả thu được trong bảng 5 chúng ta thấy rằng ngoài những yếu tố bổ sung vào môi trường nuôi cấy (điều kiện ngoại cảnh) ảnh hưởng đến khả năng tái sinh chồi của mẫu tTCL còn có yếu tố khác cũng ảnh hưởng đến tỉ lệ sống sót và tái sinh của mẫu cấy đó chính là kích thước hay độ dày của mẫu cấy Biểu hiện qua thí nghiệm 2 (ảnh hưởng của độ dày mẫu cấy tTCL lên khả năng tái sinh chồi của mẫu cấy) Kết quả thu được nhìn chung, tất cả các mẫu cấy đều cho sự tái sinh chồi Tuy nhiên, ở những mẫu cấy có độ dày 3 mm và 4 mm cho khả năng tái sinh chồi tốt hơn hẳn các kích thước khác của mẫu cấy.Ở độ dày 2 mm và 3 mm cũng cho khả năng tái sinh nhưng chồi trên những mẫu này nhỏ Ngược lại, trên những mẫu với độ dày 3 mm và 4 mm thì chồi phát triển to và có màu xanh thẫm Điều này chứng tỏ độ dày của mẫu cấy có ảnh hưởng đến khả năng tái sinh chồi của mẫu tTCL

3.2.4 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

Trong nghiên cứu về khả năng nhân chồi của mẫu cấy, thì các loại môi trường nuôi cấy luôn là điều quan tâm vì nó có những ảnh hưởng rất đáng kể đến khả năng nhaân choài cuûa maãu caáy Để giảm thiểu những ảnh hưởng trên, chúng tôi thực hiện các thí nghiệm như: khả năng nhân chồi của mẫu trên môi trường có agar (môi trường đặc) kết quả thu được là tất cả các mẫu cấy đều có khả năng nhân chồi, mẫu cấy có sự tăng trọng lượng tươi so với trọng lượng mẫu ban đầu Khả năng tăng trọng lượng tươi của mẫu cấy trên môi trường đặc gấp 10,0 lần so với trọng lượng mẫu cấy ban đầu (Bảng 7) Trên môi trường lỏng tĩnh khả năng tăng trọng lượng tươi của mẫu cấy cao hơn so với mẫu cấy trên môi trường đặc (có agar) Nhưng sự tăng trọng lượng tươi cao hơn cả là những mẫu cấy được nuôi cấy trong Bioreactor Sự chênh lệch trong lượng tươi của mẫu cấy sau 30 ngày nuôi cấy đã gấp 14,7 lần so với trọng lượng tươi của mẫu cấy ban đầu (Bảng 8)

Trong lịch sử nuôi cấy mô, việc sử dụng môi trường lỏng trong nuôi cấy là một bước tiến vượt bậc Đây là môi trường thích hợp cho các quá trình phát sinh chồi và phôi, tăng sinh khối hơn là cho quá trình ra rễ (Street, 1969)[71] Tuy nhiên, môi trường lỏng không cung cấp giá thể cho quá trình ra rễ, nên trong môi trường lỏng bộ rễ phát triển rất yếu Khoảng 70 năm trước đây, F W Went [72]đã chứng minh được khả năng tạo Auxin từ chồi của lòai Avena Trong kết quả của thí nghiệm nhân chồi trên môi trường lỏng tĩnh cho thấy khả năng tăng trọng lương của mẫu cấy trong môi trường lỏng là rất cao, nhưng bên cạnh đó cũng gặp một số vấn đề khó khăn bởi vì việc nuôi cấy trên môi trường lỏng thường xuất hiện những bất thường như: hiện tượng thủy tinh thể, cây yếu… trong quá trình nuôi cấy (Hình 3.4)

3.2.5 Ảnh hưởng của hệ thống nuôi cấy Bioreactor

Trong thí nghiệm nhân sinh khối chồi bằng Bioreactor những kết quả thu được cho thấy: dùng Bioreactor để nhân sinh khối chồi cho kết quả (Bảng 8) rất khả quan, mẫu cấy tăng sinh khối rất nhiều, trọng lượng chồi sau 30 ngày nuôi cấy tăng gấp 14,7 lần Tuy nhiên trong khi nuôi cấy mẫu xuất hiện những bất thường như thủy tinh thể, mọng nước ở lá và hệ rễ kém phát triển hơn nữa khi nuôi cấy bằng Bioreactor do có sử dụng hệ thống sục khí, các mẫu cấy có quá trình di chuyển trong môi trường nuôi cấy do đó có sự va chạm với nhau và với thành bình dẫn đến mẫu cấy bị những tổn thương cơ học (Debergh và cộng sự, 1992)[73] Lá là cơ quan chịu ảnh hưởng nhiều nhất trong môi trường lỏng Chúng phát triển một loại nhu mô vô tổ chức, một loại nhu mô không định hình bất thường Cho đến nay, những định nghĩa về hiện tượng thủy tinh thể vẫn chưa rõ ràng Đây là hiện tượng liên quan đến sự rối loạn hình thái cũng như sinh lý thực vật trong nuôi cấy in vitro Đã có nhiều nghiên cứu nhằm hạn chế hiện tượng thủy tinh thể như: tăng nồng độ agar trong môi trường nuôi cấy (Debergh và Harbaoui, 1981)[74], giảm độ ẩm tương đối bằng cách tạo sự trao đổi khí bên trong và bên ngoài môi trường nuôi cấy Bên cạnh những kết quả thu được từ việc nuôi cấy Bioreactor thì chúng cũng cho thấy những mặt hạn chế là các lá cây bị thủy tinh thể thường kém phát triển trong điều kiện in vitro cũng như ex vitro, nên chúng thường yếu và chết sau khi đưa ra đất trồng (Nguyễn Quốc Thiện, 2004)

Sau khi thực hiện các thí nghiệm trên, tôi rút ra được những kết luận sau:

Thí nghiệm: khảo sát ảnh hưởng của BA, NAA, TDZ lên khả năng tái sinh chồi của mẫu tTCL Môi trường A2 sử dụng phối hợp 2 chất điều hòa sinh trưởng thực vật NAA/BA (0,2/0,2) là tốt nhất cho tái sinh chồi của mẫu tTCL

Thí nghiệm: khảo sát ảnh hưởng độ dày mẫu cấy tTCL lên khả năng tạo chồi Độ dày 2 mm là tốt nhất cho tái sinh chồi của mẫu Bên cạnh đó, độ dày 3 mm cũng có thể sử dụng

Thí nghiệm: khảo sát khả năng nhân chồi trên môi trường có agar Môi trường C3 (0,5 mg/l BA, 0,1 mg/l NAA) là môi trường nhân chồi tốt nhất, cho hệ số nhân chồi cao

Thí nghiệm: khảo sát khả năng nhân chồi trên môi trường lỏng tĩnh cho khả năng nhân chồi tốt nhất ở môi trường (0,5 mg/l BA, 0,1 mg/l NAA), các chồi tạo thành nhiều Ở thí nghiệm: khảo sát khả năng nhân chồi bằng bioreactor cho khả năng nhân chồi tốt nhất ở môi trường (0,5 mg/l BA, 0,1 mg/l NAA), các chồi tạo thành to và nhiều

Thí nghiệm: các chồi có tỷ lệ ra rễ tốt nhất ở môi trường không có than họat tính Ở thí nghiệm: các cây in vitro được trồng trong vườn ươm phát triển tốt nhất trên giá thể đất mùn.

ĐỀ NGHỊ

Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên một số thí nghiệm chúng tôi chưa tiến hành khảo sát được Đề nghị một số vấn đề sau:

− Cần khảo sát thêm ảnh hưởng của các chất ĐHST

− Cần nghiên cứu những ảnh hưởng trong nuôi cấy lỏng tĩnh và lỏng có sục khí

− Khảo sát khả năng ứng dụng Bioreactor và nuôi cấy các lọai mẫu khác

− TDZ là chất ĐHST có hoạt tính mạnh Nó vừa là cytokinin và vừa là auxin, nên cần được khảo sát thêm ở các nồng độ khác nhau cũng như kết hợp với các chất ĐHST khác để có thể sử dụng hiệu quả trong nuôi cấy mô thực vật

− Nghiên cứu và đánh giá ảnh hưởng của những hiện tượng trong nuôi cấy lỏng bằng Bioreactor để có biện pháp khắc phục

− Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện ngoại cảnh như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm… để có thể trồng, chăm sóc cây Thu hải đường tốt hơn

5.1 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT

1 Bùi Trang Việt (2002) Sinh lí thực vật đại cương II Phát triển NXB Đại học quoác gia TP Hoà Chí Minh

2 Dương Công Kiên (2002) Nuôi cấy mô thực vật NXB Đại học quốc gia TP

3 Dương Công Kiên (2003) Nuôi cấy mô thực vật II NXB Đại học quốc gia TP Hoà Chí Minh

4 Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thuỷ Tiên (2002) Công nghệ tế bào NXB Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh

5 Mai Xuân Lương, 1999: Giáo trình nuôi cấy mô tế bào thực vật Trường ĐH Đà Lạt

6 Dương Tấn Nhựt, Giang Hoa, Nguyễn Thị Xuân Nguyên, Phan Thị Thùy

Trang, Nguyeãn Vaên Bình, Vuõ Hoàng Lieân, Traàn Nguyeân Vuõ, Phan Xuaân Huyên, Trương Kim Phượng, Trần Linh Thước, Bùi Văn Lệ, Đỗ Năng Vịnh và k Trần Thanh Vân, (2003) Hệ thống nuôi cấy lớp mỏng tế bào trong biệt hoá tế bào và trong nhân giống vô tính thực vật Kỷ yếu Hội nghị Công Nghệ Sinh Học Toàn Quốc lần thứ 3, Hà Nội: PP 992–996

7 Đinh Văn Khiêm, Lê Thị Như Lan, Dương Tấn Nhựt, Mai Xuân Lương

(2004) Nhân nhanh giống hoa thu hải đường (Begonia sp.) qua nuôi cấy lá và thích nghi vườn ươm Tạp Chí Sinh Học, 26(3): PP 56-63

8 Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Quốc Thiện, Nguyễn Ngọc Kim Vi, Nguyễn Văn

Bình, Phan Xuân Huyên, Nguyễn Thị Diệu Hương, Đỗ Năng Vịnh, (2004)

Nuôi cấy lỏng và nuôi cấy thoáng khí trong việc gia tăng sinh khối và năng cao chất lượng cây hoa lily (Lilium longiflorum) Tạp chí công nghệ sinh học; 2 (4): PP 487-499

9 Dương Tấn Nhựt (2002) Hệ thống nuôi cấy bằng bioreactor Giáo trình công nghệ sinh học thực vật

10 Trần Văn Minh (3003) Công nghệ sinh học thực vật Giáo trình công nghệ sinh học thực vật.Trường ĐH Mở – Bán công Tp HCM

5.2 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG NƯỚC NGOÀI

1 Haberlandt G., 1902: Culturversuche mit isolierten planzenzellen Sitzber Kaiser Akad Wiss Berlin Math Naturw KI, 111: 69-92

2 White P R., 1934: Potentially unlimited growth of excised tomato root tip in a liquid medium Plant physiology, 9: 585-600

3 Gautheret RJ., 1941: Action du saccharose sur la croissance de tissue de carrotte CR Paris Socit Biologique pp:135-875

4 Skoog F, Miller CO, Okumura FS, Von Saltza MH and Strong FM., 1955:

Structure and synthesis of kinetin Journal of American Chemistry Society

5 Murashige T., Skoog F., 1962: A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures Plant Physiol 15: 473–497

6 Linsmaier e M & Skoog F., 1965: Organic growth factor requirements of tobacco tissue cultures Physiol Plant 18: 100 – 127

7 Gamborg O., Miller R., Ojima K., 1968: Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells Exp Cell Res 50: 151–168

8 Joy Rw, Kumar Pp & Thorpe Ta., 1991: Long term storage of somatic embryogenic white spruce tissue culture at ambient temperature Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 25: 53-60

9 Morel G., 1971: The principles of clonal propagation of orchids In Corrigan,

MJG (ed.), Proc 6 th World Orchid Conf.: 101–106

10 Steward FC, Mapes MO and Mears K, 1958: Growth and organized development of cultured cells, vol II Am J Bot., 45: 705–708

11 Evans D A., Sharp W R., Flick C E., 1981: Growth and behavior of cell culture: embryogenesis and organogenesis In: Thorpe T.A (Ed) Plant Tissue Culture: Methods and Applications in Agriculture Academic Press New York: 45–113

12 Bourgin J P., Nitsch J P., 1967: Obtention de Nicotiana haploides à partir d’eùtamines cultiveùes in vitro Annual Physiol Vege., 9: 377-382

13 Niizeki H., Oono K., 1968: Induction of haploid rice plants from anther culture Pro Japan Academic, 44: 554-557

14 Stuart R., Street H E., 1969: Studies on the growth in culture of plant cells

IV The initiation and division in suspensions of stationary phase cells of Acer pseudoplatanus J Exp Bot 20: 556–571

15 Henshaw G G., Jha K K., Mehta A R., Shakeshaft D J., Street H E.,

1966 Studies on the growth in culture of plant cells I Growth patterns in batch propagated suspension cultures J Exp Bot 17: 362–377

16 Torres K C., 1989: Overview of cell suspension culture In: TORRES K.C (Ed.) Tissue culture techniques for horticultural crops Chapman & Hall Publisher, the U.S.A pp 151–160

17 Street HE., 1966: Nutrition and metabolism of plant tissue and organ cultures

In: Willner EN (Ed) The biology of cells and tissues in culture Academic Press, New York 3:533-629

18 Pierik R.L.M., Tetteroo F.A.A., 1987: Vegetative propagation of Begonia venosa Skan in vitro from inflorescence explants Plant Cell Tissue Organ Cult 10: 135–142 Pierik R L M., 1987: In vitro culture of higher plants Martinus Nijhoff, Dordrecht, 45-82

19 Toonen M A J and De Vries S C., 1996: Initiation of somatic embryos from single cells In: Embryogenesis: the regeneration of a plant, Wang T L and

20 Mehra P N., Jaidka K., 1985: Experimental induction of embryogenesis in pear Phytomorph 35: 1–10

21 Klimaszewska K., Keller W A., 1985: High frequency plant regeneration from thin all layer explants of Brassica napus, Plant Cell Tiss Org Cult 4:

22 Redenbaugh K., Slade D., Viss P and Fujii J., 1987: Encapsulation of somatic embryos in synthetic seed coats HortSci 22: 803-809

23 Kitto S., Janick J., 1985: Production of synthetic seeds by encapsulating asexual embryos of carrot Journal of the American Society Horticultural Science, 110: 277–282

24 Redenbaugh K., Paasch Bd., Nichol J., Kossler Me., Viss Pr., Walker Ka.,

1986: Somatic seeds: encapsulation of asexual plant embryos Biotechnology,

25 Drew RA., 1992: Improved techniques for the in vitro propagation and germplasm storage of papaya, Hort Science 27: 1122-1224

26 Takayama S., Misawa M., 1981: Mass propagation of Begonia x hiemalis plantlets by shake culture Plant Cell Physiol.; 22: 461-467

27 Takayama S., 1986: Mass propagation of plants by fermentor culture techniques Abst VI Intern Congr Cultural Conditions Physiol Plant; 48:

28 K OZAI T., 1991 : Micropropagation under photoautotrophic conditions In:

DEBERGH P.C., ZIMMERMAN R.H (Eds.) Micropropagation – technology and application Kluwer Academic Publishers, Dordretch, the Netherlands 447–469

29 Reuter G., 1980: Elatiorbegonien I Untersuchungen zur Gewinnung von befallens-freien Elitepflanzen durch Gewebekultur Gartenerbose + Gartrnwelt 80: 876–881

30 Welander T., 1974: Callus and root formation in explants of Beta vulgaris Physiol Plant 32: 305–307

31 Fonnesbech M., 1974: The influence of NAA, BA and temperature on shoot and root development from Begonia x cheimantha petiole segments grown in vitro Physiol Plant; 32: 49-54

32 Welander T., 1977: In vitro organization in explants from different cultivars of Begonia x hiemalis Physiol Plant , 41: 142-145

33 Hakkart F A., Versluijs J M A., 1984: Vakblad voor de Bloemisterij, 39:

35 Bigot C., 1981 Multiplication veùgeùtative in vitro de Begonia x hiemalis (Rieger et Schwabenland) I Methodologie Agro ; 1: 433-440

36 Iida T., Yabe K., Wasida S., Sakurai Y., 1986: Bulletin of Aichi Ken

37 Nakano M., Niimi Y., Kobayashi D., Watanabe A., 1999: Adventitious shoot regeneration and micropropagation of hybrid tuberous begonia (Begonia x tuberhybrida Voss.) Sci Hort.; 79: 245-251

39 Margara J., Phelouzat R., 1984: C R Academic of France, 69: 1145-1153

40 Mikkelsen E P., Sink K C Jr., 1978: In vitro propagation of Rieger Elatior

41 Khoder M., Villemur P., Jonard R., 1981: La multiplication veùgeùtative de l’espèce florale Begonia elatior (cultivar Rieger) à partir de différents organes cultiveùs in vitro Comp End Acad Sci Paris Ser III 293: 403-408

42 Takayama S., Misawa M., 1982: Factors affecting differentiation in vitro, and a mass-propagation scheme for Begonia x hiemalis Sci Hortic.; 16: 65-75

43 Duong Tan Nhut, Jaime A Teixeira da Silva, Bui Van Le, Tran Thanh Van K., 2003: “Thin Cell Layer (TCL) morphogenesis as a powerful tool in woody plant and fruit crop micropropagation and biotechnology, floral genetics and genetic transformation”, Micropropagation of woody trees and fruits, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht/Boston/London

44 Tran Thanh Van K & Gendy C., 1996: Thin cell layer (TCL) method to programme morphogenetic patterns Plant Tiss Cult Man 114: 1 – 25

45 Lee – Stadlemann O Y., Lee S., Hackett W P., Read P E., 1989: The formation of adventitious buds in vitro on micro-sextions of hybrid Populus leaf mid veins Plant Sci 61: 263 – 272

46 Tran Thanh Van K., 2003: Thin cell layer concept In: Nhut D T., Bui V L.,

Tran Thanh Van K & Thorpe T (eds.) Thin Cell Layer Culture System: Regeneration and Transformation application Kluwer Academic Publisher: 1 –

47 Tran Thanh Van K., Mutaftschiev S., 1990: Signals influencing cell elongation, cell enlargement, cell division and morphogenesis In: Nijkam H

J J., Van Der Plas L H W & Aartif J (eds.) Progress in plant cellular and molecular biology Kluwer Academic Publisher: 514 – 519

48 Tran Thanh Van M., 1973: In vitro control of de novo flower, bud, root and callus differentiation from excised epidermal tissues Nature 246: 44 – 45

49 Tran Thanh Van K., 1981: Control of morphogenesis Ann Rev Physiol Plant

50 Tran Thanh Van M., 1974: Methods of acceleration of growth and flowering in a few species of orchids American Orchid Society Bulletin, 43: 699-707

51 Tran Thanh Van K., 1980: Control of morphogenesis by inherent and exogenously applied factors in thin cell layer Intl Rev Cytol 32: 291–311

52 Tran Thanh Van K., Trinh T H., 1986: Fundamental and applied aspect of differentiation in vitro and in vivo In: Evans D A., Sharp W R and Ammirato

P.V (Eds.) Handbook of Plant Cell Culture, Techniques and Application Vol

4 McMilan Publishing Company, New York, U.S.A.: 316–335

53 Tran Thanh Van K., Toubart P., Cousson A., Darvill A.G., Gollin D.J., Chelf P., Albersheim P., 1985: Manipulation of the morphogenetic pathway of tobacco explants by oligosaccharins Nature 314: 615–617

54 Cousson A., Toubart P & Tran Thanh Van K., 1989: Control of morphogenetic pathways in thin cell layers of tobacco by pH Can J Bot 67:

55 Cousson A & Tran Thanh Van K., 1992: Influence of ionic composition of the culture medium on de novo flower formation in tobacco thin cell layer Can

56 Duong Tan Nhut, Bui Van Le, Jaime A Teixeira da Silva, Aswath C R.,

2001: “Thin Cell Layer culture system in Lilium: regeneration and transformation perspectives”, In Vitro Cell Dev Biol-Plant 37, pp 516-523

57 Teixeira da Silva J A., Fukai S., 2003: Chrysanthemum organogenesis through thin cell layer technology and plant growth regulator control Asian J

58 Ohki S., 1994: Scanning electron microscopy of shoot differentiation in vitro form leaf explant of the African Violet Plant Cell, Tissue and Organ Culture,

59 Bui V L., Nghieng Thao D M., Jeannau M., Sadick S., Shanjun T.,Vidal J., Tran Thanh Van K., 1998: Transformation of a C4 monocot, the Digitaria sanguinalis (Larger erabgrass) using somatic embryogenesis induced on thin cell layer 9 th Int Cong Plan Tiss Cult., Jerusalem, Israel Abst.: 1911

60 Chlyah A., Tran Thanh Van K., 1975: Differential reactivity in epidermal cells of Begonia rex excised and growth in vitro Plant Physiology, 35: 16-20

61 Gill R., Gerrath J., Saxena P K., 1992: High frequency direct embryogensis in thin cell layer cultures hybrid seed Geranium pelargonium Canada Journal of Botany, 71: 408-476

62 Stefaniak B., 1994: Somatic embryogenesis and plant regeneration of

Gladiolus (Gladiolus hort) Plant Cell Rep 13: 386 – 389

63 Goh C J., Nathan M J., Kumar P P., 1995: Direct organogenesis and induction of morphogenic callus through thin section culture of Heliconia psittacorum Hort Sci 62: 113-120

64 Gozu Y., Yokoyama M., Nakamura M., Naniba R., Yomogida K., Yanagi M., Nakamura S., 1993: In vitro propagation of Iris pallida Plant Cell Reports, 13: 12-16

65 Mulin M., Tran Thanh Van K 1989: Obtention of in vitro flowers from thin epidermal cell layers of Petunia hybrida Plant Sci 62: 113b–121

66 Hsia C N., Korban S S., 1996: Factors affecting in vitro establishment and shoot proliferation of Rosa hybrida L and Rosa chinensis Minima In vitro Cellular and Developmental Biology, 32: 217-222

67 Mok M C., Mok D W S., Armstrong D J., 1982: Cytokinin activity of

N-phenyl-N’1,2,3-thidiazol-5-yl urea (thidiazuron) Phytochemistry, 21:

68 Mok M C., Mok D W S., Turner J E., Mujer C V., 1987: Biological and biochemical effects of cytokinin-active phenylurea derivatives in tissue culture systems Hort Sci., 22: 1194-196

69 Preece J E., Imel M R., 1991: Plant regeneration from leaf explants of

70 Huetteman CA, Prece JE., 1993: Thidiazuron a potent cytokinin for woody plant tissue culture, Plant Cell Tissue Organ Cult 33: 05-119

71 Stuart R., Street H E., 1969: Studies on the growth in culture of plant cells

IV The initiation and division in suspensions of stationary phase cells of Acer pseudoplatanus J Exp Bot 20: 556–571

72 Went F W., 1934: A test method for rhizocaline, the root–forming substance

Proc On Ned Akad Wet 37: 445 – 455

73 Debergh P C., Aitken Christie J., Cohen B., Arnold V S., Zimmerman R., Ziv M., 1992: Reconsideration of the term “vitrification” as used in micropropagation Plant Cell Tiss Organ Cult.; 30: 135-140

74 Debergh P C., Harbaaoui Y., 1981: Mass propagation of globe artichokea

(Synara scolymus): evaluation of different hypothesis to overcome vitrification with special reference to water potential Physiol Plant; 53: 181-187

Thành phần môi trường khoáng MS (Murashige và Skoog, 1962)

Na 2 MoO 4 2 H 2 O 0,25 mg/l CuSO4.5 H2O 0,025 mg/l CoCl 2 6 H 2 O 0,025 mg/l

Na 2 EDTA 37,3 mg/l FeSO 4 7 H 2 O 27,8 mg/l

Vitamin và các chất hữu cơ khác:

Myo-Inositol 100 mg/l Acid nicotinic 0,5 mg/l Pyridoxin-HCl 0,5 mg/l Thiamin-HCl 0,1 mg/l