Xá định nguyên nhân lây nhiễm vi sinh vật gây bệnh và độ hại trong quá trình sản xuất tương truyền thống để nâng ao vệ sinh an toàn thự phẩm ủa sản phẩm

43 Trang 8 DANH MỤC CÁC BẢNG STTBảng sốTên bảng Trang Trang 9 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 1 Hình 1.1 Quy trình nuôi cấy tạo chế phẩm mốc Koji 13 2 Hình 2.1 Đường chuẩn tyrozi

TỔNG QUAN

Công nghệ sản xuất tương

đã được sử dụng rộng rãi (phương pháp hoá học) Phương pháp này cho phép có sản phẩm nước tương đạt được chất lượng về mùi vị cũng như hiệu năng sản xuất và trở thành một phương thức chế biến nước tương phổ biến ở nước ta Trong khi đó phần đông các nước trên thế giới hạn chế việc sản xuất nước tương bằng phương pháp hoá học và đa số sản xuất bằng phương pháp lên men

Tại thành phố Hồ Chí Minh có trên 70 cơ sở sản xu nất ước tương từ khô đậu tương hoặc ậu đ tương, phần l n sản xuất ớ theo phương pháp hóa học Hầu hết các c sở sản xuất khi kiểm tra hàm lơ ượng (3-MCPD)-một chất gây ung thư trong sản phẩm đều v ợt quá mức cho phép thậm chí vư ượt tới hàng tr m lần, ă trong đó có cả các công ty sản xuất lớn có thương hiệu Trước tình hình đó việc sản xuất nước tương bằng phương pháp lên men vi sinh rất được quan tâm trong thời gian gần đây Tuy nhiên nước ta hiện nay chưa có một cơ sở sản xuất thực phẩm lên men nào có ứng dụng các chế phẩm vi sinh vật giống khởi động cho nước tương lên men Hầu hết các cơ sở sản xuất đều ở dạng sản xuất thủ công, sản xuất theo kinh nghiệm nên sản phẩm khó ổn định chất lượng, quản lý vệ sinh rất khó khăn

1.2 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT NƯỚC TƯƠNG

1.2.1 Các nguyên liệu sử dụng trong quá trình sản xuất nước tương

Nước tương được sản xuất từ nguồn nguyên liệu chính có đặc tính là giàu protein và tinh bột [13] [16]

1.2.1.1 Nguyên liệu giàu protein Đậu tương Đậu tương có tên khoa học là Glycine Max Merril Đậu tương có nhiều màu sắc khác nhau Trong đó đậu tương màu vàng là loại tốt nhất được trồng và sử dụng nhiều Đậu tương được sử dụng là chủ yếu vì hàm lượng protein cao của nó Ngoài ra đậu tương chứa đầy đủ các axit amin giống axit amin thịt, trứng Đậu tương là loại hạt giàu chất dinh dưỡng như protein, lipit, gluxit, muối khoáng và vitamin Chính vì thế, đậu tương là một nguồn thực phẩm quan trọng và được trồng rộng rãi ở Trung Quốc, Mỹ, Brazil Ở Việt Nam, đậu tương được trồng nhiều ở các tỉnh phía Bắc và Nam Thành phần hóa học của hạt đậu tương được thể hiện ở bảng 1.1

Bảng 1.1: Thành phần hóa học của hạt đậu tương ], [8] [6

Hydratcacbon (%) Đậu tương nguyên hạt 100 40 21 4,9 34

Trong thành phần hóa học của đậu tương, thành phần protein chiếm một tỷ lượng rất lớn trong đó globulin chiếm 85 – 95% ngoài ra còn có albumin, một lượng không đáng kể prolamin và glutenli Thành phần axit amin trong protein n của đậu tương ngoài methionin và triptophan còn có các axit amin khác với số lượng khá cao tương đương lượng axit amin có trong thịt (Bảng 1.2)

Bảng 1 2: Thành phần axit amin trong đậu tương ], [8] [6

Ngoài protein, hydratcacbon chiếm khoảng 34% hạt đậu tương Phần hydratcacbon có thể chia làm hai loại: loại tan và không tan trong nước Loại tan trong nước chỉ chiếm khoảng 10% tổng lượng hydratcacbon Thành phần khoáng chiếm khoảng 5% trọng lượng chất khô của hạt đậu tương Trong đó đáng chú ý nhất là Ca, P, Mn, Zn và Fe Ngoài ra, đậu tương còn chứa rất nhiều vitamin khác nhau trừ vitamin C và D

Bảng 1.3: Thành phần hydratcacbon trong đậu tương ], [8] [6

Trong quá trình sản xuất nước tương thì khô đậu tương cũng là nguồn nguyên liệu giàu protein được sử dụng thay thế cho đậu tương nguyên hạt Khô đậu tương được sử dụng từ rất sớm trong công nghệ sản xuất nước tương do tính kinh tế của loại nguyên liệu này [18 Thành phần hóa học chủ yếu của khô đậu tương ] gồm protein (47- 51%), hydratcacbon (19 22%), chất béo (0,1 1,5 %), chất xơ – –

( 3 – 5%), khoáng (4 – 6%) Độ ẩm của khô đậu tương thường là 11 13% [16– ]

1.2.1.2 Nguyên liệu giàu tinh bột

Lúa mỳ là một nguồn nguyên liệu giàu tinh bột phù hợp nhất trong công nghệ sản xuất nước tương Những nguồn nguyên liệu giàu tinh bột khác cũng có thể được sử dụng như gạo, lúa mạch, ngô Lúa mỳ chỉ chứa một lượng nhỏ protein Thành phần hóa học chủ yếu của lúa mỳ gồm hydratcacbon (68 – 74%), protein (8 – 15%), chất béo (1,8 2,0 %), chất xơ (2,5 – – 3,5%), khoáng (1,4 – 2,0%) Độ ẩm của lúa mỳ thường là 10 – 14% [13]

Ngoài ra, axit glutamic chiếm một tỷ lệ cao trong số axit amin của protein lúa mỳ, chiếm khoảng 32% tổng số protein Trong thành phần hydratca bon của c lúa mỳ thì khoảng 10% là pentosan, chủ yếu là xylan Chính thành phần này đã tạo phản ứng melanoidin trong quá trình tạo màu cho nước tương [18]

Muối dùng trong sản xuất nước tương thường là NaCl, phải có độ tinh khiết 92 – 97%, khi pha vào nước không có vị chát

Nước dùng trong sản xuất nước tương có độ cứng trung bình 8 – 17 o (1 o tương đương 10 mg CaO/ lít hay 7,19 mg MgO/ lít nước) Các chất khoáng và các chất hữu cơ khác không được quá 500 600 mg/l Lượng vi sinh vật không được quá –

Nấm mốc đóng vai trò quan trọng nhất trong quá trình sản xuất nước tương bằng phương pháp lên men Chủng mốc giống được sử dụng trong sản xuất nước tương phải có các đặc tính sau: có số lượng bào tử nhiều, tỷ lệ bào tử nảy mầm cao, chủng mốc giống phải có hoạt lực sinh enzim proteaza cao và chế phẩm mốc giống phải được bảo quản khô [15]

Trong sản xuất nước tương sử dụng hai dạng mốc chính là Aspergillus oryzae và Aspergillus sojae có màu vàng như hoa cau Các loại mốc này có khả năng sinh hệ enzim như invertaza, amylaza, glucoamylaza, maltoza, proteaza thủy phân protein và tinh bột tạo ra các dạng đường, axit amin [5] Các dạng đường được nấm men và vi khuẩn chuyển thành rượu, este, acit lactic… tạo hương thơm đặc tr ng cho sản phẩm cuối Các chủng nấm mốc này thuộc Lớp ư Nang Khuẩn, bộ Cúc Khuẩn Plectascales, họ Aspergillaceae, giống Aspergills, là loài nấm thượng đẳng, có cấu tạo đa bào có hệ sợi phát triển, sinh sản bằng đính bào tử Cuống đính bào tử là đơn bào, đây là đặc điểm duy nhất để phân biệt với Penicillium Mỗi loài có hạt đính bào tử có màu sắc khác nhau là hệ sợi có màu sắc [1] [4] [9] Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang chia sợi thành nhiều tế bào khác nhau Vì thế nó là một loại nấm đa bào Khuẩn ty hay còn gọi là hệ sợi của Asp oryzae và Asp sojae khi trẻ có màu vàng xanh, càng già màu trở nên xanh đậm hơn Từ những hệ sợi, khi phát triển sẽ mọc lên những cuống đính bào tử không phân nhánh, dài 1- 2 mm, ở đầu có cơ quan sinh sản vô tính Phần đầu của cuống đính bào tử phồng lên thành “ bọng” Từ bọng này phân chia thành những bào tử đính vào nhau nên được gọi là đính bào tử có màu vàng xanh Asp oryzae, Asp sojae sinh sản vô tính nhờ cơ quan sinh sản ở phần trên của cuống đính bào tử, hình thành các tế bào hình chai và tạo thành các đính bào tử

1.2.2 Các phương pháp sản xuất nước tương

Hai phương pháp chính được sử dụng trong sản xuất nước tương là: phương pháp lên men từ nấm mốc và ph ng pháp hóa học.ươ

1.2.2.1 Ph ươ ng pháp lên men

Quá trình sản xuất n ớc tư ương được tạo ra chủ yếu bằng sự thủy phân protein, gluxit trong nguyên liệu nhờ hệ enzim proteaza và amylaza tạo ra từ nấm mốc giống Mốc giống d ới dạng bào tử được cấy vào khối nguyên liệu đã hấp chín ư và ủ tạo chế phẩm nấm mốc Koji (có l ợng enzim ạt tối ư đ ưu) Khi giai đoạn nuôi mốc kết thúc, làm t i nguyên liệu ơ đã lên mốc, pha trộn dung dịch n ớc ư muối và lên men ở các giai oạn nhiệt đ độ khác nhau trong khoảng 3 đến 6 tháng Trong quá trình lên men có bổ sung các dạng nấm men, vi khuẩn lactic nhằm tạo hương vị tốt cho sản phẩm Sau quá trình lên men, dịch thủy phân được tách ra nhờ phương pháp lọc ép Dịch sau lọc được thanh trùng, hoàn thiện sản phẩm và đóng chai

1.1.2.2 Ph ương pháp hoá học (thủy phân bằng axit)

Nguyên liệu được ngâm, nấu sôi ở nhiệt độ 110-120 0 C với HCl 15-16% trong khoảng 18-24 giờ sau khi sôi ể nguội hoàn toàn, lọc rửa dịch thủy phân, sau Đ đó trung hoà axit bằng NaOH hoặc Na2CO3 đến pH 5,0 6,0 (thấp hơn pH 5,0 có - vị chua; cao hơn pH 6,0 có vị đắng, mùi nồng) Thêm muối, cô đặc đến hàm lượng ạm cần thiết Sau ó qua thanh trùng đóng chai, tiêu thụ đ đ

Trong nguyên liệu sản xuất n ớc tư ương có hai thành phần chính là protein và lipit Quá trình thủy phân protein tạo axit amin, đồng thời ở nhiệt ộ cao với đ sự có mặt của HCl, lipit tạo ra glyxerin và axit béo kết hợp với gốc Clo tạo thành 3-monoclopropan 1,2 diol (3 MCPD) và 1,3 diclopropan (1,3 DCP) Các chất - - - - - này có thể gây bệnh ung thư cho người tiêu dùng Quá trình thủy phân bằng phương pháp axit gần như không khống chế được l ợng chất ộc 3ư đ -MCPD dưới mức cho phép

1.1.2.3 Ưu nhược điểm của hai phương pháp

Nước tương được sản xuất bằng phương pháp lên men do không có phản ứng sinh ra glyxerin và không sử dụng axit để thuỷ phân ở nhiệt độ cao nên không tạo thành 3-MCDP, rất an toàn cho người sử dụng Hơn nữa nhờ hương thơm chiết tách từ chế phẩm nấm mốc (Koji) mà sản phẩm nước tương làm theo công nghệ này thường có hương vị hấp dẫn hơn sản phẩm theo công nghệ axit và do không dùng nhiệt độ cao nên màu sắc sản phẩm cũng tươi sáng hơn Ngoài ra do lựa chọn chủng mốc giống thuần chủng có hoạt lực thuỷ phân protein và tinh bột cao nên nước tương sản xuất theo phương pháp này cũng sẽ không bị nhiễm độc tố aflatoxin – cũng là một tác nhân gây bệnh ung thư được sinh ra từ nấm Aspergillus flavus khi sản xuất nước tương theo phương pháp truyền thống sử dụng các chủng nấm mốc tự nhiên Tuy nhiên nước tương sản xuất bằng phương pháp này cũng có một số hạn chế như thời gian thuỷ phân kéo dài, hiệu suất thành phẩm thấp

Công nghệ sản xuất chế phẩm nấm mốc (Koji)

1.3.1 Định nghĩa và phân loại

Mốc Koji là hệ chế phẩm enzim thuỷ phân được tạo thành khi nuôi nấm mốc trên môi trường nguyên liệu đã hấp chín Tuỳ vào nguồn nguyên liệu nuôi mốc mà chế phẩm nấm mốc sẽ có tên gọi khác nhau Koji gạo, Koji đại mạch, Koji đậu tương…

Trong quy trình công nghệ sản xuất nước tương lên men thì quá trình tạo chế phẩm mốc Koji là một trong những quá trình quan trọng nhất, quyết định đến chất lượng, thành phần và hương vị của nước tương thành phẩm Quá trình tạo mốc Koji là một công nghệ của các nước phương Đông với lịch sử 3000 năm Quá trình tạo mốc Koji cũng là quy trình quan trọng không thể thiếu được trong công nghệ sản xuất Miso (một loại tương đặc của Nhật), rượu Sakê và Shochu

1.3.2 Hệ emzim được tạo thành trong quá trình nuôi mốc Koji [7] [10]

Vì nguồn nguyên liệu dùng trong sản xuất nước tương lên men rất giàu protein và tinh bột nên trong quá trình nuôi cấy nấm mốc nhằm thu enzim thì hệ enzim mong muốn cần thu được là enzim proteaza và enzim α-amylaza

- Enzim α amylaza (α-1,4 glucanhydrolaza): xúc tác thuỷ phân đặc hiệu - liên kết α-1,4 glucozit nằm sau trong chuỗi mạch một cách ngẫu nhiên không theo một trật tự nào cả, sản phẩm tạo thành là các đoạn dextrin phân tử lượng thấp, các oligo saccharit chứa từ 2 7 gốc glucoza, - – trong đó có một gốc glucoza cuối cùng ở dạng α

- Enzim roteaza: xúc tác thuỷ phân các hợp chất protein, chuỗi poly p peptit ở liên kết peptit Nguồn enzim này có vai trò quan trọng để tạo ra nguồn nitơ để vi sinh vật sử dụng trong suốt quá trình nuôi mốc cũng như là lên men

Ban đầu nấm mốc sẽ hấp thụ các thành phần dinh dưỡng dễ hấp thụ có sẵn trong môi trường như: đường glucoza, sacaroza, axit amin và khoáng để sinh trưởng Trong quá trình trao đổi chất nấm mốc sinh tổng hợp tạo nên các enzim thuỷ phân Các enzim thuỷ phân α-amylaza, proteaza tạo ra sẽ được hoạt động, chúng phân cắt các mối liên kết glucozit và peptit trong chuỗi mạch amyloza, amylopectin, polypeptit của tinh bột và protein để tạo thành các chất có phân tử lượng thấp Một phần chúng được nấm mốc sử dụng, phần còn lại sẽ làm nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn lactic và nấm men sử dụng [17] [18]

1.3.3 Phương pháp nuôi cấy tạo chế phẩm nấm mốc (Koji)

Chủng vi sinh vật được dùng để nuôi cấy tạo chế phẩm mốc trong sản xuất nước tương chủ yếu là nấm mốc Aspergillus oryzae hoặc Aspergillus sojae Nấm mốc nói chung cũng như loài Asp oryzae và loài Asp sojae nói riêng có đặc tính là hô hấp hiếu khí Vì vậy có thể nuôi mốc bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt và phương pháp nuôi cấy bề sâu có sục khí Đối với mỗi phương pháp đều có những nhược điểm và ưu điểm riêng, nhưng khi nuôi mốc Koji thì chủ yếu dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt Tuỳ thuộc vào từng loại nguyên liệu và mục đích công nghệ mà cách xử lý nguyên liệu và các thông số trong quá trình nuôi cấy tạo mốc Koji là khác nhau Quy trình nuôi cấy mốc Koji được thể hiện ở hình 1.1 Để tiến hành nuôi cấy tạo mốc Koji trước tiên phải trải qua giai đoạn xử lý nguyên liệu Đậu tương được ngâm nước qua đêm, tách vỏ rồi đem hấp chín Lúa mỳ được rang chín và nghiền nhỏ Sau đó, đậu tương và lúa mỳ được làm nguội đến nhiệt độ phòng rồi giải đều hỗn hợp lên các khay gỗ Bào tử mốc giống Asp oryzae hoặc Asp sojae được cấy vào hỗn hợp nguyên liệu, trộn đều mốc giống lên khối nguyên liệu đảm bảo mật độ bào tử mốc đồng đều trong toàn khối Tiếp đó đưa các khay gỗ lên giá và vào phòng nuôi cấy

Trong quá trình nuôi cấy mốc Koji nhiệt độ, độ ẩm cần phải được kiểm soát chặt chẽ Theo quy trình nuôi cấy mốc Koji truyền thống thì nhiệt độ, độ ẩm được kiểm soát bằng cách đảo trộn thủ công Tuy nhiên theo quy trình nuôi cấy mốc Koji hiện đại nhiệt độ, độ ẩm được kiểm soát bằng một hệ thống điều chỉnh tự động Vào giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy (khoảng 24 giờ đầu) nhiệt độ khoảng 33-35 0 C là thích hợp cho sự phát triển, hình thành hệ sợi của nấm mốc và ngăn chặn sự xâm nhập của vi khuẩn Bacillus [19] Giai đoạn sau nhiệt độ được giảm xuống khoảng 25-28 0 C, là nhiệt độ tối thích tạo lượng enzim cực đại Sau khoảng 3 đến 4 ngày (72 giờ), khi hỗn hợp hình thành các bào tử mốc màu xanh- vàng thì quá trình nuôi cấy mốc Koji đã được hoàn thiện Đậu tương/hoặc Lúa mỳ

Hấp chín Làm nguội Nghiền

Bào tử mốc giống Trộn đều Đưa vào khay Để trên giá

Nuôi cấy ở điều kiện thích hợp

Hình 1.1: Quy trình nuôi cấy tạo chế phẩm mốc Koji( )

Khi tiến hành nuôi cấy ngoài những thông số kỹ thuật trong điều kiện nuôi cấy cần duy trì ở điều kiện tối ưu thì cũng cần chú ý một số điều sau:

- Trước khi nuôi cấy, các dụng cụ, khay, giá, phòng nuôi phải đảm bảo ở điều kiện vô trùng

- Khi nuôi cấy, nấm mốc thực hiện quá trình trao đổi chất làm tăng nhiệt độ và độ ẩm giảm, chính vì vậy phải tiến hành phun không khí ẩm vô trùng ở dạng sương mù vào phòng nuôi

- Tiến hành đảo trộn theo đúng chu kì, giai đoạn nuôi cấy.

Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzim của nấm mốc

HỢP ENZIM CỦA NẤM MỐC

1.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có vai trò chủ yếu trong sự sinh trưởng của sợi nấm, nó cũng tác động đến việc sản sinh bào tử và sự nảy mầm của chúng Mỗi loài nấm mốc có khoảng nhiệt độ sinh trưởng và phát triển nhất định Phần lớn nấm mốc phát triển trong khoảng 15- 32 0 C và sinh trưởng tốt nhất ở khoảng 25- 30 0 C Một số rất nhỏ loài nấm mốc có thể tăng trưởng ở cả các kho lạnh đến -6 0 C , thậm chí 20- 0 C như Cladosporium herbarum, một số loài thuộc chi Penicilium Một số ít loài khác có nhiệt độ tăng trưởng đến 50 0 C [9] Các chủng Asp oryzae và Asp sojae phát triển tốt ở 33 – 35 0 C và tạo enzim tốt ở 25 – 28 0 C

Nếu nhiệt độ xuống dưới 24 0 C hay trên 45 0 C nấm mốc sẽ phát triển chậm do đó làm giảm quá trình sinh tổng hợp enzim Nhiệt độ không những có ảnh hưởng đến sinh trưởng và sản sinh bào tử của nấm mốc mà còn tác động lên sự trao đổi chất của chúng, đặc biệt là lên số lượng và chất lượng của các chất được tạo thành Nhưng không phải bao giờ nhiệt độ tốt nhất cho sự sinh trưởng cũng là thích hợp nhất cho sự tạo thành tất cả các sản phẩm trao đổi chất

1.4.2 Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường

Trong những nhân tố tác động tới sự phát triển của nấm mốc, độ ẩm có ảnh hưởng lớn Độ ẩm của môi trường cũng như độ ẩm tương đối của không khí là những yếu tố quan trọng qui định sự phát triển cũng như sinh tổng hợp enzim nói chung và proteaza nói riêng Asp.oryzae cũng như đa số các chủng nấm mốc khác là những vi sinh vật ưa ẩm Độ ẩm thích hợp cho Asp.oryzae sinh tổng hợp proteaza nằm trong khoảng 40- 60%.

1.4.3 Ảnh hưởng của thành phần môi trường

Thành phần môi trường thích hợp cho sự phát triển và sinh tổng hợp enzim bao gồm hỗn hợp của nguồn cacbon, các nguồn nitơ, các chất kích thích sinh trưởng và muối khoáng Nguồn cacbon có thể sử dụng từ ngô, lúa mỳ, gạo Trong đó maltoza, sacaroza, fructoza là những nguồn cacbon tốt nhất [11] Nguồn nitơ có thể sử dụng từ bột đậu, các muối amoni, ure Các nguyên tố khoáng như canxi, magiê, sắt, mangan đều ảnh hưởng tốt đến sự sinh tổng hợp proteaza [11], [1 ].2

Môi trường nuôi mốc giống tốt nhất là môi trường Zapeck, nước chiết malt, nước chiết khoai tây Môi trường thích hợp cho Asp oryzae, Asp sojae là môi trường axit yếu hoặc trung tính ( 5,5-7 ) Các môi trường tự nhiên từ cám, đậu, ngô thường có sẵn pH ở khoảng này Các chủng Asp oryzae, Asp sojae khi phát triển trên môi trường có tinh bột và protein sẽ sinh ra một số enzim, chủ yếu là amylaza và proteaza [2]

1.4.4 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Thời gian sinh trưởng của nấm mốc cũng là yếu tố không kém phần quan trọng, ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzim Mặt khác, thời gian còn qui định năng suất của quá trình sản xuất chế phẩm nấm mốc Thời gian nuôi cấy tạo chế phẩm mốc Koji trong sản xuất nước tương là 3 ngày (72 giờ)

1.4.5 Ảnh hưởng của độ thoáng khí

Nấm mốc hoàn toàn hiếu khí và chỉ phát triển được trong điều kiện thoáng khí Các loài như Mucor và Trichoderma là những loài cần nhiều oxy Trong khí quyển nitơ, một số loài nấm phát triển rất tốt, một số khác lại sinh trưởng kém Một lượng nhỏ khí cacbon là cần thiết cho bào tử Aspergillus nảy mầm nhưng nếu nồng độ này quá cao lại ức chế sự phát triển của chúng Độ thoáng khí cũng ảnh hưởng lớn tới hoạt độ enzim proteaza Mức độ thoáng khí của môi trường giảm dẫn tới sự đình chỉ sinh tổng hợp enzim proteaza Hoạt độ enzim cao hay thấp đều có quan hệ chặt chẽ với sự thỏa mãn hay không thỏa mãn nhu cầu về oxy trong quá trình nuôi cấy mốc Lượng không khí cần để nuôi cấy một tấn nấm mốc là khoảng 600m 3 Khi nuôi cấy nấm mốc bằng phương pháp bề mặt trên các môi trường cám gạo, bã đậu v.v cần chú ý tới độ dầy khối môi trường để đảm bảo độ thoáng khí cần thiết cho sự phát triển của nấm mốc [3]

Giá trị pH của môi trường cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm mốc Phần nhiều nấm mốc phát triển trong khoảng pH từ 4 8 nhưng một số nấm mốc có khả - năng chịu được những cơ chất có pH axit hơn hoặc kiềm hơn.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu

2.1.1.1 Đậu tương Đậu tương được sử dụng trong nghiên cứu là loại đậu tương vàng ở các tỉnh phía Bắc và tiêu thụ rộng rãi trên thị trường nước ta

Lúa mỳ được sử dụng trong nghiên cứu là loại lúa mỳ được nhập khẩu từ Mỹ và tiêu thụ rộng rãi trên thị trường nước ta

Khô đậu tương được sử dụng trong nghiên cứu là loại khô đậu tương trong nước và được mua trên thị trường

2.1.1.4 Chủng giống vi sinh vật Đối tượng nghiên cứu gồm 6 chủng nấm mốc có nguồn gốc từ Nhật Bản và Việt Nam (Bảng 2.1 ).

Bảng 2.1: Một số chủng nấm mốc sử dụng trong quá trình tuyển chọn

Thứ tự Tên và ký hiệu chủng Nguồn gốc

1 Aspergillus oryzae No1 Nhật Bản

2 Aspergillus oryzae No2 Nhật Bản

3 Aspergillus oryzae No3 Nhật Bản

4 Aspergillus oryzae TV Viện Công Nghiệp Thực Phẩm

5 Aspergillus oryzae TQ Viện Công Nghiệp Thực Phẩm

6 Aspergillus oryzae VA Viện Công Nghiệp Thực Phẩm

Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu có nguồn gốc Trung Quốc và đạt độ tinh khiết phân tích Các hóa chất sử dụng gồm casein, glucoza, tinh bột tan, axit triclo axetic, axit axetic, dung dịch Folin, thạch, CH3COONa.3H2O, Na2CO3, NaCl , K2HPO4, dung dịch I2, KH2PO4, NaNO3, MgSO4, KCl, FeSO4

2.1.2 Các dụng cụ thiết bị sử dụng

- Tủ cấy vô trùng Bioblock Scientific háp ( , P )

- Tủ nuôi vi sinh vật Sanyo, Nhật ( )

- Cân điện tử Precica 62A, Mỹ) (

- Máy ổn nhiệt Eppendorf – ( Đức)

- Máy li tâm Universal 16A Đức ( , )

- Máy đo độ ẩm Precica HA60 Thụy sĩ( , )

- Máy đo quang Cecil CE 1021 Trung Quốc ( , )

- Nồi hấp áp lực (Trung Quốc)

Các thiết bị trong phòng thí nghiệm bao gồm: bình tam giác, giấy lọc, pipetman, đèn cồn, giấy lọc, ống nghiệm

- Môi trường 1: Môi trường tinh bột thuần khiết

- Môi trường 2: Môi trường casein thuần khiết

Các phương pháp nghiên cứu

2.2.1.1 Phương pháp thu nhận dịch enzim thô

Cân 5 g chế phẩm nấm mốc đã nuôi cấy được, cho vào bình tam giác 100 ml đã có 50 ml dung dịch CH3COONa pH 5 Giữ trong 3 giờ trên máy lắc, sau đó lọc bằng giấy lọc Dịch trong thu được là dịch enzim thô

2.2.1.2 Phương pháp đục lỗ thạch Đục lỗ đĩa thạch có chứa môi trường 1 hoặc môi trường 2 Nhỏ dịch chiết enzim thô vào lỗ thạch, đem nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 30 0 C trong 24 48 gi– ờ Sau đó đo vòng phân giải xung quanh

A Xác định khả năng sinh enzim α-amylaza của nấm mốc bằng phương pháp đục lỗ thạch

Dựa vào sự thuỷ phân tinh bột của enzim α-amylaza tạo thành các phân tử thấp lượng thấp hơn khi nhỏ dịch chiết enzim vào môi trường 1 (môi trường thạch có chứa tinh bột) Khi đổ dung dịch I2 lên môi trường, tại vị trí đó sẽ có màu của môi trường còn các vị trí khác sẽ có màu xanh Những chủng nào cho vòng thuỷ phân tinh bột càng rộng thì khả năng thuỷ phân tinh bột càng lớn Độ rộng vòng thuỷ phân tinh bột được tính bằng đường kính vòng thuỷ phân trừ đi đường kính lỗ đục

Chuẩn bị môi trường 1 (môi trường tinh bột thuần khiết) rồi tiến hành nhỏ dịch chiết enzim vào các lỗ đã đục trên đĩa thạch Nhỏ dịch chiết enzim thật chính xác vào lỗ đục sao cho dịch chiết enzim không được rớt trên mặt thạch sẽ khó quan sát sau này Tiến hành nhỏ dịch chiết enzim bên cạnh ngọn lửa đèn cồn trong tủ cấy sao cho thật chính xác Tiếp theo đem nuôi ở nhiệt độ 30 0 C trong tủ ấm từ 24-48 giờ Sau đó đổ dung dịch Iot đã chuẩn bị sẵn lên trên bề mặt đĩa thạch và đo độ rộng của vòng thuỷ phân

B Xác định khả năng sinh enzim proteaza của nấm mốc bằng phương pháp đục lỗ thạch

Dựa vào sự thuỷ phân casein của enzim proteaza khi nhỏ dịch chiết enzim vào môi trường 2 (môi trường casein thuần khiết), proteaza làm mất màu trắng đục của casein trên đĩa thạch tạo thành vòng trong suốt Độ rộng vòng thuỷ phân casein được tính bằng đường kính vòng thuỷ phân trừ đi đường kính lỗ đục

Chuẩn bị môi trường 2 (môi trường casein thuần khiết) rồi tiến hành nhỏ dịch chiết enzim vào các lỗ đã đục trên đĩa thạch Nhỏ dịch chiết enzim thật chính xác vào lỗ đục sao cho dịch chiết enzim không được rớt trên mặt thạch sẽ khó quan sát sau này Tiến hành nhỏ dịch chiết enzim bên cạnh ngọn lửa đèn cồn trong tủ cấy sao cho thật chính xác Tiếp theo đem nuôi ở nhiệt độ 30 0 C trong tủ ấm từ 24-48 giờ Sau đó lấy ra và đo độ rộng của vòng thuỷ phân

2.2.2.1 Phương pháp xác định hoạt độ enzim α -amylaza

Tinh bột bị enzim có trong chế phẩm nghiên cứu thuỷ phân đến các dextrin có phân tử lượng khác nhau Đo cường độ màu tạo thành giữa tinh bột và các sản phẩm thuỷ phân của nó với Iod bằng máy so màu quang điện

Hoạt độ enzim α amylaza: là số gam tinh bột tan được chuyển hoá thành - các dextrin có phân tử lượng khác nhau khi sử dụng 1 g chế phẩm enzim ở 40 0 C và trong thời gian 30 phút tại pH 5

• Hoá chất và cách thu dịch chiết enzim:

- Dung dịch đệm axetat pH 5 :

Dung dịch A (CH3COOH 0,2M): cân 11,55 g axetic axit hoà tan trong 1 lít nước cất

Dung dịch B (CH3COONa 0,2M): cân 27,21 g CH3COONa.3H2O hoà tan trong nước cất rồi định mức đến 1000 ml Sau khi chuẩn bị xong dung dịch A và dung dịch B, lấy 5,9 ml dung dịch A trộn với 14,1 ml dung dịch B rồi điều chỉnh pH 5 bằng dung dịch A hoặc dung dịch B

- Dung dịch tinh bột 1% : cân 1 g tinh bột tan, hoà tan bằng một ít nước cất (đun nóng trên bếp đến khi dung dịch trong suốt), thêm 20 ml dung dịch đệm pH

5 đã chuẩn bị ở trên rồi định mức đến 100 ml bằng nước cất

- Dung dịch Iod phân tích Cân 0,0317 g I: 2 + 0,1 g KI, thêm 50 ml HCl 10% Hoà tan rồi định mức đến 1000 ml bằng nước cất

- Dung dịch NaCl 0,5% ân 5 g NaCl hoà tan với nước cất rồi định mức tới : c

- Thu dịch chiết enzim: ân 10 g chế phẩm nấm mốc và cho 100 ml dung c dịch NaCl 0,5% Đưa hỗn hợp vào máy lắc trong thời gian khoảng 3 giờ, sau đó hỗn hợp được tiến hành lọc và thu được dịch chiết enzim

Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml tinh bột 1% Bổ sung vào ống nghiệm 1 – mẫu đối chứng 0,1 ml nước cất Bổ sung vào ống nghiệm 2 mẫu thí nghiệm – 0,1 ml dịch chiết enzim Tiến hành lắc đều hai ống và để ổn định trong máy ổn nhiệt ở 40 0 C trong 30 phút

Lấy từ 2 ống nghiệm trên mỗi ống 0,05 ml hỗn hợp và cho vào 2 ống nghiệm đã có sẵn 5 ml dung dịch Iod phân tích, đem lắc đều và đi đo màu Cường độ màu được đo ở bước sóng λ = 670 nm so với mẫu nước cất Đối với mẫu thí nghiệm tiến hành mẫu đôi và lấy giá trị trung bình của hai mẫu sau khi đo quang

• Kết quả: Hoạt độ α-amylaza từ nguồn chế phẩm nấm mốc Koji được tính theo công thức:

T t : Mật độ đo quang của mẫu thí nghiệm

To: Mật độ đo quang của mẫu đối chứng t : Thời gian phản ứng , phút

12,75 là hệ số thu được từ thực nghiệm đã tính ra 30 phút tác dụng.

100 là tỷ lệ trích ly enzim.

2.2.2.2 Phương pháp xác định hoạt độ enzim proteaza

Phương pháp dựa trên cơ sở thuỷ phân casein bởi enzim có trong dịch chế phẩm nghiên cứu Định lượng lượng axit amin được tạo thành trong phản ứng thuỷ phân bằng phản màu với thuốc thử Folin Dựa vào đồ thị chuẩn của tyrozin để tính lượng sản phẩm tương ứng do enzim xúc tác tạo nên Đơn vị hoạt độ proteaza là lượng enzim chuyển hoá được một lượng caseinat natri thành dạng không bị kết tủa bởi axit trichloaxetic tương đương với một micromol tyrozin ở 37 0 C trong thời gian 1 phút

• Hoá chất và cách thu dịch chiết enzim:

- Dung dịch đệm pH 7,5 ấy 9,4 ml dung dịch K: l 2HPO4 1M và 40,6 ml dung dịch KH2PO4 1M vào bình định 1 lít, lắc đều rồi định mức bằng nước cất đến ngấn

- Dung dịch casein 1% ân 1 g casein, thêm 80 ml dung dịch đệm pH 7,5 : c rồi gia nhiệt đến 80 0 C trong 30 phút, khuấy đều cho đến khi tan hoàn toàn Chuyển hỗn hợp vào bình định mức 100 ml, định mức bằng dung dịch đệm pH 7,5 đến vạch