báo cáo khoa học phân lập các chủng BACILLUS THURINGIENSIS KURSTAKI ở việt nam

PHÂN LẬP CÁC CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS KURSTAKI Ở VIỆT NAM Bùi Thị Hương, Đỗ Thị Ngọc Huyền, Nguyễn Tuấn, Nguyễn Thuỳ Châu Bộ môn Vi Sinh, Viện Công Nghệ Sau Thu hoạch Đinh Duy Khán

PHÂN LẬP CÁC CHỦNG BACILLUS

THURINGIENSIS KURSTAKI Ở VIỆT NAM

Bùi Thị Hương, Đỗ Thị Ngọc Huyền, Nguyễn Tuấn, Nguyễn Thuỳ Châu

Bộ môn Vi Sinh, Viện Công Nghệ Sau Thu hoạch

Đinh Duy Kháng

Phòng Vi Sinh Phân tử, Viện Công Nghệ Sinh học

Ngày nay các chế phẩm sinh học an toàn cho phòng trừ sâu hại cây trồng và nông sản bảo quản đã được khuyến khích, ứng dụng để thay thế dần các thuốc trừ sâu hoá học, trong

đó thuốc trừ sâu vi sinh Bacillus thuringiensis (gọi tắt là

Bt) được dùng rộng rãi nhất Trong những năm gần đây các nhà khoa học đã có rất nhiều cố gắng để phân lập vi khuẩn này từ môi trường của nhiều nước trên thế giới với hy vọng

tìm ra những chủng B thuringiensis có phổ gây bệnh mới

và khoảng vật chủ rộng hoặc nâng cao hoạt tính các chủng

B.thuringiensis đối với các nhóm côn trùng mới, hay tìm

kiếm nguồn gen từ những chủng phân lập cho các kỹ thuật

nghệ sinh học hiện đại, đặc biệt là công nghệ gen đã mở ra những tiềm năng hết sức to lớn cho việc phát triển thuốc trừ

sâu sinh học B thuringiensis Việc làm giàu thêm bộ sưu

tập các chủng B thuringiensis phân lập ở Việt Nam và

nguồn gen quý từ những chủng này nhằm tạo ra các chủng tái tổ hợp mới có phổ diệt sâu rộng hơn đối với một số loài côn trùng quan trọng là rất cần thiết Chúng tôi đã tiến hành

phân lập, phân loại các chủng B thuringiensis có hoạt tính

diệt sâu từ nguồn tự nhiên của Việt Nam, sử dụng một số

kỹ thuật sinh hoá và sinh học phân tử để xác định tính chất

của các chủng B thuringiensis var kurstaki phân lập được

I VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:

I.1 Thu thập mẫu để phân lập các chủng B thuringiensis

Tiến hành thu thập 137 mẫu gồm có 55 mẫu đất nông

nghiệp, 56 mẫu lá, 26 mẫu mùn thóc từ các nguồn khác nhau của một số tỉnh có sinh thái khác nhau ở miền Bắc Việt nam

I.2 Phân lập các chủng B thuringiensis:

Cắt một phần của lá (2-3 cm2) nghiền với 0,5 ml dịch nước muối Đối với các mẫu đất và mùn thóc cân 0,5 gam trộn với 5 ml môi trường T3 lỏng chứa 0,25 M đệm natri acetate (pH = 6,8) và lắc trong 4 giờ ở 150 vòng/phút, nhiệt độ 30

0

C Mẫu được xử lý nhiệt ở 800C trong 3 phút Lấy 0,2 ml dịch nổi trải trên đĩa petri có môi trường T3 nuôi ở 30 0C

trong 3 ngày Quan sát hình dạng tinh thể của các chủng B thuringiensis phân lập bằng kính hiển vi đối pha Olympus

I.3 Thử sinh học hoạt tính diệt sâu:

Tiến hành theo phương pháp của S.H.Park [10]: Đối tượng

sâu được thử là sâu tơ (Plutella xylostella), sâu keo

(Spodoptera exiqua) và sâu khoang (Spodoptera litura): lá

bắp cải tươi được cắt thành các khoanh tròn có đường kính

3cm vào hỗn dịch bào tử tinh thể B thuringiensis có nồng

độ 5x107 bào tử/ml, sau đó đặt vào đĩa petri và cho vào mỗi đĩa 10 con sâu; mỗi mẫu thử với 30 con sâu Đối với

tương tự trên lá bông Hoạt tính diệt sâu ngài gạo (Corrcyra cephalonia) được đánh giá như sau: bỏ 30 con sâu ngài gạo

vào bình thuỷ tinh 400g gạo đã được nhiễm bào tử và tinh

thể của B thuringiensis với liều 5x107 bào tử/gam gạo, nuôi

ở 300C với độ ẩm 70-80%

I.4 Xác định tính chất 10 chủng B thuringiensis kurstaki phân lập

Điện di protein (SDS-PAGE) bào tử và tinh thể của các

chủng B thuringiensis

Chủng B thuringiensis phát triển trên môi trường thạch T3

đã được tạo hỗn dịch trong 5 ml dịch 0,02% Triton X-100

Ly tâm trong 1 phút Cặn được hoà tan với 30 l đệm SDS (1x SDS gel- loading buffer) Các mẫu được đun sôi trong

5 phút, ly tâm ở 8000vòng/phút trong 5 phút, lấy dịch nổi

và chạy điện di trên gel polyacryamide 10% ở 30 mA theo phương pháp của Sambrook và Maniatis

I.5 Phát hiện gen cry1Ab, cry1C bằng kỹ thuật PCR

Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 25l đựng trong ống Eppendorf bao gồm các thành phần: nước khử ion 13,6l, dNTP 2,5l, buffer 2,5l, primer 2l, enzim Tag-polymeraza 0,4l, MgCl2: 2l, ADN 2l ( nồng độ 50ng/l)

Sử dụng cặp mồi

TY6(5’-GGTCGTGGCTATATCCTTCGTGTCACAGC-3’) và TY14(5’-GAATTGCTTTCATAGGCTCCGTC-3’); TYIC (5’-CAAC CT CTAT TT G GTGCAGGTTC-3’) và

TYIUNI

(5’-ATCACTGAGTCGCTTCGCATGTTTGACTTT CTC-3’) theo thứ tự, để nhân bản đoạn ADN đặc hiệu nằm trong gen

cry1Ab và cry1C Các sản phẩm PCR được phân tích bằng

điện di trên gel agaroza 1%

II KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN:

II.1 Phân lập các chủng B thuringiensis

showed two core fragments, 130 kDa and 70 kDa, and

several other minor proteins Ten B thuringiensis kurstaki isolates were screened for cry1Ab and cry1C genes by PCR method Total DNA of these B thuringiensis strains were

isolated then analyzed by electrophoresis on 1% agaroza gel The result showed that total DNA isolated was not

broken, it could be used as DNA template for the PCR

Oligonucleotit primer pairs of TY6 and TY14, TYIC and TYIUNI respectively were used to amplified the specific

DNA fragments of cry1Ab gene as well as of cry1C gene

by PCR The PCR conditions were: denaturation at 940C for 3 min, followed by 30 amplification cycles (940C, 50 sec; 600C, 50 sec; 720C, 1min and 20sec) and extension at

720C for 8 min The content of 5l of PCR products were analyzed by electrophoresis on 1% agaroza gel The result

showed that all ten isolated B thuringiensis var kurstaki

strains produced only one PCR product of about 236 bp

This result indicated that all of them harboured cry1Ab

gene, but no cry1C gene Interestingly, B thuringiensis var kurstaki 28S strain inspire of habouring cry1Ab gene but it

has no insecticidal activities to Plutella xylostella and Spodoptera exiqua We supposed that this strain contain

“silent” cry1C crystal toxin gene which is carried on the

genome and it was not expressed Because of this, we are

interested in screening B thuringiensis strains at the

molecular level for their gene content

Người thẩm định nội dung khoa học: TS Lê Quang Huấn