Luận văn thạc sĩ Sinh học: Xác định kiểu gen của virus gây viêm gan siêu vi B (HBV) và mối liên quan giữa kiểu gen với một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng trên bệnh nhân nhiễm HBV tại Đắk Lắk

Trang 1 ĐỖ THỊ THÙY DƯƠNG XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CỦA VIRUS GÂY VIÊM GAN SIÊU VI B HEPATITIS B VIRUS-HBV VÀ MỐI LIÊN QUAN GIỮA KIỂU GEN VỚI MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, CẬN LÂM SÀNGTRÊN BỆNH NHÂN

ĐỖ THỊ THÙY DƯƠNG

XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CỦA VIRUS GÂY VIÊM GAN SIÊU VI B (HEPATITIS B VIRUS-HBV) VÀ MỐI LIÊN QUAN GIỮA KIỂU GEN VỚI MỘT

SỐ ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, CẬN LÂM

SÀNGTRÊN BỆNH NHÂN NHIỄM HBV TẠI

ĐẮK LẮK LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

BUÔN MA THUỘT, NĂM 2010

ĐỖ THỊ THÙY DƯƠNG

XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CỦA VIRUS GÂY VIÊM GAN SIÊU VI B (HEPATITIS B VIRUS-HBV) VÀ MỐI LIÊN QUAN GIỮA KIỂU GEN VỚI MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, CẬN LÂM SÀNG TRÊN BỆNH NHÂN

NHIỄM HBV TẠI ĐẮK LẮK

Chuyên nghành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Huyền Ái Thúy

BUÔN MA THUỘT, NĂM 2010

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn ñề

Viêm gan siêu vi B do HBV (Hepatitis B virus) gây ra là một bệnh phổ biến trên toàn cầu, có diễn tiến phức tạp, tỷ lệ chuyển sang mạn tính cao, thường dẫn tới xơ gan hay ung thư gan

Theo báo cáo của tổ chức Y tế thế giới (WHO) có khoảng 2 tỷ người nhiễm virus gây viêm gan siêu vi B (HBV) trên toàn thế giới, trong ñó có khoảng 6% nhiễm viêm gan siêu vi B cấp và 5 – 10% trong số này chuyển sang mạn tính ở người lớn, riêng ñối với trẻ em tỷ lệ này lên ñến 90% Tỷ lệ tử vong trong giai ñoạn cấp tính là 1%, biến chứng của viêm gan B cấp là viêm gan mạn,

xơ gan, xơ gan mất bù và ung thư gan nguyên phát, dẫn ñến tử vong vào khoảng một triệu người mỗi năm Một số kết quả ñiều tra cho thấy các nước ở Đông nam Châu Á, Trung quốc và Châu Phi là những nơi có tỷ lệ người nhiễm HBV cao nhất trên thế giới [10], [44], [42] Tại Việt Nam có khoảng 15% - 20% người nhiễm HBV, trong ñó có khoảng 80- 92% bệnh nhân xơ gan và ung thư gan nguyên phát có nhiễm HBV [4]

Có ñến 8 kiểu gen (genotype) HBV, từ kiểu gen A ñến H và 4 kiểu gen phụ là adw, adr, ayw và ayr Sự hiểu biết về sự phân bố giữa các kiểu gen của virus HBV có vai trò rất quan trọng trong công việc ñiều trị và theo dõi diễn tiến của bệnh, phòng ngừa ñược các biến chứng của bệnh Đặc biệt ñiều này cũng rất

có ý nghĩa trong công tác quản lý và giám sát về mặt dịch tễ học phục vụ cho công tác phòng chống bệnh viêm gan siêu vi B Xuất phát từ thực tế trên chúng

tôi tiến hành ñề tài “Xác ñịnh kiểu gen của virus gây viêm gan siêu vi B (HBV)

và mối liên quan giữa kiểu gen với một số ñặc ñiểm lâm sàng, cận lâm sàng trên bệnh nhân nhiễm HBV tại Đắk Lắk ”

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- Xác định các kiểu gen (genotype) của virus gây viêm gan siêu vi B trên các bệnh nhân nhiễm virus gây viêm gan siêu vi B (HBV) tại khu vực tỉnh Đắk Lắk

- Xác định mối liên quan giữa các kiểu gen của virus HBV với một số đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng trên bệnh nhân

3 Ý nghĩa khoa học

Bằng việc hỗ trợ của các kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đốn y khoa, cĩ thể định danh được đến kiểu gen của virus HBV với độ nhạy cao và độ đặc hiệu tuyệt đối Kết quả nghiên cứu giúp chúng ta hiểu rõ hơn về bệnh, các đặc thù nhiễm virus HBV của cơng đồng dân cư khu vực tỉnh Đắk Lắk Đây cũng là tiền đề để phát triển nghiên cứu ở mức cao hơn, mang tầm vĩc của một nghiên cứu dịch tễ học phân tử bệnh nhiễm virus HBV ở khu vực Tây nguyên

4 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu sẽ chỉ ra được các kiểu gen của HBV ở những bệnh nhân nhiễm HBV khu vực tỉnh Đắk Lắk, điều này rất quan trọng trong cơng tác điều trị, quản lý và phịng chống bệnh viêm gan siêu vi B trên địa bàn tỉnh

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đại cương về virus gây bệnh viêm gan siêu vi B (HBV)

1.1.1 Lịch sử phát hiện bệnh viêm gan siêu vi B

Năm1965, Blumberg và các cộng sự ñã tìm thấy một loại kháng thể ở hai bệnh nhân bị bệnh máu không ñông ñược truyền máu nhiều lần Kháng thể này

có thể phản ứng với một loại kháng nguyên trong mẫu huyết thanh của một thổ dân châu Úc nên ñược gọi là kháng nguyên Úc Châu (Asutralia antigen) Sau ñó kháng nguyên này ñược tìm thấy trong huyết thanh của những bệnh nhân bị viêm gan siêu vi Ngày nay kháng nguyên Úc Châu ñược xác ñịnh là kháng nguyên bề mặt viêm gan siêu vi B, viết tắt là HBsAg Dần qua nhiều nghiên cứu trên khắp thế giới, các nhà khoa học ñã thiết lập ñược bản ñồ dịch tễ viêm gan siêu vi B trên toàn cầu, nêu ra một số ñặc ñiểm nổi bật giúp chúng ta có thể phân biệt với các loại siêu vi gây viêm gan khác

Có ba loài siêu vi có cấu trúc giống nhau: loài thứ nhất ñược tìm thấy ở ñộng vật có vú – khỉ Marmot (Woodchucks) sống ở miền ñông Hoa Kỳ, loài thứ

2 ñược tìm thấy ở loài sóc xám (Grey squirrels) sống ở California, loài thứ ba là ngỗng Bắc Kinh (penking ducks) Đặc ñiểm quan trọng nhất của các họ này là có enzyme reverse transcriptase có ái tính ñặc biệt với tế bào gan [8]

1.1.2 Tình hình nhiễm HBV trên thế giới và ở Việt Nam

1.1.2.1 Trên thế giới

Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO), trên thế giới có khoảng 2 tỷ người bị nhiễm HBV và 350 triệu người bị nhiễm mạn tính Ước lượng có khoảng 600.000 người chết mỗi năm do nhiễm HBV cấp tính [46]

1.1.2.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, cứ 5-7 người dân thì có một người nhiễm Virus B xâm nhập tế bào gan, biến chúng thành nơi sản xuất virus mới Khi phát hiện ra sự bất thường này, hệ miễn dịch sẽ tấn công kẻ xâm lược Nếu “cuộc chiến” thắng lợi,

tế bào gan tổn thương sẽ ñược thay thế bằng những tế bào khỏe mạnh và bệnh nhân sẽ phục hồi Nhưng ở một số người hệ miễn dịch không loại trừ ñược virus

và họ trở thành người mang virus viêm gan B mạn tính Khoảng 10% số người nhiễm virus B rơi vào trường hợp này Trong các trường hợp xấu nhất, các tế bào gan bị virus phá hoại bị thay thế bằng các mô sợi bất thường, dẫn ñến ung thư gan và xơ gan

Trên bản ñồ dịch tễ của tổ chức Y tế Thế giới, tỷ lệ dân số Việt Nam mang kháng nguyên HBsAg (chứng tỏ nhiễm HBV) là trên 8%, xếp vào hàng quốc gia có tỷ lệ nhiễm HBV cao nhất thế giới Nhận ñịnh này cũng ñược một số công trình nghiên cứu về dịch tễ học trong và ngoài nước xác nhận Tuy rằng không phải tất cả các trường hợp nhiễm HBV ñều cần phải ñặt ra vấn ñề phải ñiều trị vì ña số bệnh nhân ñều có thể tự khỏi nhờ cơ thể có thể tạo ra ñáp ứng miễn dịch bằng kháng thể bảo vệ là kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt của virus Tuy nhiên vẫn có một tỷ lệ người nhiễm HBV cần phải ñược ñiều trị ñặc hiệu bằng thuốc kháng virus một khi có dấu hiệu viêm gan mạn tính và lượng virus tăng cao [6]

1.1.3 Dịch tễ học của bệnh viêm gan siêu vi B

Hiện nay, theo thống kê của các tổ chức Y tế Thế giới (WHO), ước tính

có khoảng 2 tỷ người bị nhiễm HBV, trong ñó có khoảng 350 triệu người mang mầm bệnh mạn tính Viêm gan siêu vi B thường là nguyên nhân dẫn ñến viêm

gan mạn, xơ gan và ung thư gan nguyên phát với tỷ lệ tử vong là 1-2 triệu người

Tình hình nhiễm HBV thay ñổi theo từng khu vực ñịa dư Tùy theo tỷ lệ người mang HBsAg (+) mà người ta chia làm 3 khu vực chính:

1.1.3.1 Vùng nội dịch lưu hành cao (high endemic area)

Tỷ lệ HBsAg (+) vào khoảng 5-20% như khu vực Đơng Nam Á, Trung Quốc và Châu Phi Đặc điểm dịch tễ học của vùng này là sự nhiễm HBV chủ yếu xảy ra theo chiều dọc (vertical contamination) từ mẹ lây sang con, thường gặp ở các nước châu Á, cho nên tuổi bị nhiễm thường rất sớm như các trẻ sơ sinh Ngồi ra người ta cũng ghi nhận sự lây nhiễm cịn xảy ra ở tuổi thiếu niên do các trẻ bị lây lẫn nhau trong gia đình hoặc trong bạn bè Kiểu lây theo chiều ngang (horizontal contamination) thường gặp ở trẻ em Châu Phi Vì vậy, hầu hết dân số

bị nhiễm cĩ huyết thanh chẩn đốn HBV dương tính rất sớm, thường là sau 10 tuổi Tuy nhiên bệnh lại thường được phát hiện ở tuổi trưởng thành, lúc mà các biến chứng mạn tính của nhiễm HBV cĩ thể đã xuất hiện như viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan nguyên phát Do bị nhiễm ở tuổi cịn nhỏ nên nguy cơ mang siêu vi mạn tính rất cao Những phát hiện này chứng tỏ rằng những người trẻ mang HBV là những người cĩ khả năng lây nhiễm cao nhất [2],[41],[47]

1.1.3.2 Vùng nội dịch lưu hành trung bình (intermediate endemic area)

Tỷ lệ HBsAg (+) vào khoảng 2-7% ở một số quốc gia miền Nam châu Âu

và Đơng Âu, Nga, Nam Mỹ Kiểu lây truyền thường là phối hợp nhưng lây nhiễm qua đường tình dục thường là quan trọng hơn Tuổi bị lây nhiễm cao nhất

là từ 25 tuổi (khoảng 50% dân số)[2],[41],[47]

1.1.3.3 Vùng nội dịch lưu hành thấp (low endemic area)

Tỷ lệ HBsAg (+) rất thấp vào khoảng 0,1-1% dân số như ở Bắc Mỹ, Tây

Âu và Úc Tỷ lệ người mang HBsAg cao nhất ở khoảng tuổi từ 20-40, trẻ em hiếm khi bị nhiễm HBV và tình trạng nhiễm HBV thường được phát hiện ở đối tượng cĩ nguy cơ theo kiểu lây truyền hàng ngang [2],[41],[47]

1.2 Cấu trúc của HBV(Hepatitis B virus)

Chỉ vài năm sau khi phát hiện rất quan trọng dẫn đến giải Nobel Y học của Blumberg và cộng sự về kháng nguyên Australia (1964), các nhà nghiên

cứu ñã xác ñịnh ñược mối liên quan giữa kháng nguyên này với bệnh viêm gan

B Tiếp theo ñó, kháng nguyên Australia ñã ñược chứng minh là ñại diện cho các quyết ñịnh kháng nguyên bề mặt của HBV, vì vậy ñược thay thế bằng thuật ngữ

“kháng nguyên bề mặt virus viêm gan virus B” (Hepatitis B surface Antigen), ký hiệu HBsAg Năm 1970, nghiên cứu dưới kính hiển vi ñiện tử Dane ñã mô tả hạt virus HBV hoàn chỉnh, ñược gọi là hạt Dane

HBV thuộc họ Hepadnaviridae Cấu trúc của lõi (core) của HBV là một

DNA mạch ñôi không khép kín, với trọng lượng phân tử 2×106 dalton, ñược cấu tạo bởi 3200 nucleotide Vỏ capsid hình hộp có kích thước khoảng 27 nm, vỏ bao ngoài (precore) cấu tạo bởi 3 protein cấu trúc là prôtêin lớn, prôtêin trung bình và prôtêin nhỏ dày khoảng 7 nm Vỏ bao tạo cho virus có hình cầu ñường kính 42 nm (hạt Dane) [5],[10]

Hình 1.1 Sơ ñồ cấu trúc của hạt Dane [10]

1.2.1 Thành phần cấu trúc kháng nguyên

HBV có 2 loại kháng nguyên chính: kháng nguyên bề mặt là HBsAg,

kháng nguyên lõi là HBcAg và HBeAg

HBsAg: ñược tìm thấy ở huyết thanh và trong tế bào gan của người bị nhiễm HBV dưới dạng hoàn chỉnh hay không hoàn chỉnh Kháng nguyên bề mặt này có hai dạng hình cầu và hình ống Ống phần cấu tạo của hai dạng này gồm prôtêin, lipid, cacbohidrat, nhưng không có acid nucleic nên ñược xem là dạng không hoàn chỉnh HBV HBsAg là chỉ ñiểm huyết thanh học thường ñược dùng

ñể xác ñịnh nhiễm HBV

HBsAg xuất hiện rất sớm trước khi có triệu chứng lâm sàng, tăng cao dần

và biến mất sau 4-8 tuần kể từ khi có triệu chứng Nếu sau 6 tháng mà vẫn còn HBsAg thì có nguy cơ chuyển thành người mang HBsAg mạn tính

Sự hiện diện của HBsAg trong huyết thanh chứng tỏ có DNA của virus trong tế bào gan Định lượng HBsAg có giá trị tiên lượng, nếu trong giai ñoạn bình phục hàm lượng HBsAg không nhỏ hơn ¼ so với trị số ban ñầu thì có nguy

cơ trở thành người mang virus mạn tính

HBcAg: tìm thấy trong tế bào gan của người nhiễm HBV Trong huyết thanh, HBcAg hiện diện như một thành phần của virus hoàn chỉnh chứ không ở dạng tự do

HBcAg chỉ xuất hiện trong tế bào gan và chỉ có thể phát hiện ñược khi làm sinh thiết gan Khi trong một tế bào gan có HBcAg bao giờ cũng có HBsAg trên màng tế bào và nồng ñộ DNA polymeraza luôn luôn tăng cao

HBeAg: là loại kháng nguyên hòa tan trong huyết thanh, ở tế bào gan HBeAg hiện diện trong tế bào chất và sẽ ñược giải phóng khỏi tế bào lõi của virus khi sử dụng chất tẩy mạnh

HBeAg xuất hiện sớm trong giai ñoạn tiền vàng da Sự biến mất của HBeAg và xuất hiện Anti-HBe là dấu hiệu của bệnh ñang lui dần Ngược lại,

trong viêm gan mạn tấn công thường thấy HBsAg(+) và HBeAg (+) thì có tỷ lệ làm lây nhiễm rất cao Đặc biệt ở phụ nữ có thai nếu ñồng thời HBsAg(+) và HBeAg (+) thì hầu hết con của họ bị lây nhiễm [5],[6]

1.2.2 Cấu trúc bộ gen của HBV

Hình 1.2 Minh họa cho vị trí các vùng gen của HBV [42]

- DNA của HBV gồm một sợi ñôi: kích thước của sợi xuôi từ 3.0 – 3.3 kb (kích thước thay ñổi giữa các hepadnavirus) và sợi ngược là 1.7 – 2.8 kb

- Gen S là gen mã hóa cho các cấu trúc vỏ và bề mặt của HBV gồm 3 vùng: pre S1 (108 aa) và pre S2 (55 aa); hai vùng này mã hóa cho kháng nguyên

bề mặt HBsAg, vùng S (226 aa) mã hóa các kiểu gen

- Gen C mã hóa cho các cấu trúc lõi bao gồm hai vùng: pre C (29 aa) mã hóa cho HBeAg và vùng C (183 aa) mã hóa cho HBcAg

- Gen P (832 aa) là gen dài nhất mã hóa cho DNA polymerase và cùng với RNA trung gian tham gia vào quá trình sao chép ngược của virus

- Gen X gồm 154 aa mã hóa cho hai protein của HBV mà chức năng của chúng là tham gia vào các giai ñoạn phiên mã và sao chép trong quá trình nhân

đơi của HBV, cũng như đĩng một vai trị chủ yếu trong sự phát triển thành ung thư gan trên bệnh nhân [10], [42]

Sự thay đổi trình tự của các nucleotide trên gen S dẫn đến sự thay đổi trong quá trình dịch mã và sao chép trong gen của HBV, dẫn đến cĩ các sự khác biệt về cấu trúc tại vùng vỏ và bề mặt của HBV là nguyên nhân tạo thành 8 kiểu gen khác nhau của virus này

1.2.3 Sự đột biến trên gen của HBV

Sự thay đổi trình tự các nuclêotide trên gen S dẫn đến sự thay đổi trong quá trình dịch mã và sao chép trong gen của HBV, dẫn đến cĩ sự khác biệt về cấu trúc tại vùng vỏ và bề mặt của HBV là nguyên nhân tạo thành 8 kiểu gen (genotype) khác nhau (được ký hiệu từ A- H) của virus này Đặc biệt hai vùng gen Pre S1 và PreS2 mã hĩa cho sự tạo thành kháng nguyên bề mặt HBsAg, nếu

sự đột biến xảy ra ở đây cĩ thể dẫn đến sự vắng mặt của HBsAg trong huyết thanh của bệnh nhân nhiễm HBV, đây là nguyên nhân dẫn đến sự sai lệch kết quả trong các xét nghiệm nhanh phát hiện HBsAg trong chẩn đốn huyết thanh miễn dịch, điều này làm tăng nguy cơ lan truyền của HBV trong cộng đồng Tại vùng gen S với hai alen, một trong hai alen này mã hĩa cho thành phần cấu trúc a là một thành phần cấu trúc khơng đổi giữa các HBV, alen cịn lại thay đổi mã hĩa cho bốn thành phần cấu trúc là: r, d, w và y Sự đột biến xảy ra trên vùng gen S cĩ thể dẫn tới các HBV vacxin và HBIg bị mất tác dụng Ngồi

ra cịn cĩ giả thiết cho rằng sự đột biến trên gen S làm tăng tỷ lệ a/w đây được coi là nguy cơ cao dẫn đến viêm gan tối cấp và mạn tính cũng như ung thư gan trên những người nhiễm HBV

Đột biến trên gen C dẫn đến đột biến sẽ xảy ra tại vùng lõi của virus, thường gặp nhất là sự đột biến G1869A, G1764A và A11762 sẽ làm biến mất của kháng nguyên HBeAg trên bệnh nhân ngay ở trong giai đoạn tăng sinh của HBV và làm tăng nguy cơ dẫn đến sự viêm gan tối cấp, viêm gan mạn hoạt động

và xơ gan Đặc biệt sự ñột biến trên gen này cũng làm tăng khả năng kháng interferon alpha của HBV

Đột biến trên gen P sẽ phiên mã cho sự ñột biến xảy ra tại DNA polymerase, ñặc biệt nó làm giảm tác dụng ñiều trị của các thuốc theo cơ chế cạnh tranh với các nucleotide trên HBV

Đột biến trên gen X làm thúc ñẩy quá trình nhân ñôi của virus và làm giảm khả năng tế bào chết theo chương trình (apotosis) Các sự ñột biến này còn làm tăng khả năng tiến triển sang ung thư gan nguyên phát từ các bệnh nhân nhiễm HBV [10], [42]

1.3 Biểu hiện lâm sàng của viêm gan siêu vi B

1.3.1 Viêm gan siêu vi B cấp

Thời kỳ ủ bệnh: khoảng 4-28 ngày, hầu hết các trường hợp có khoảng thời gian là 60-110 ngày

Thời kỳ khởi phát (thời kỳ tiền hoàng ñản) : 10-20% số bệnh nhân có biểu hiện có ban hồng, mày ñay, ñau khớp, ñôi khi viêm khớp và sốt vài ngày trước khi xuất hiện các biểu hiện lâm sàng Theo GS Lê Đăng Hà và cộng sự, các triệu chứng lâm sàng thời kỳ này hay gặp nhất là sốt nhẹ (51,1-55,6%), mệt mỏi (89,4-98,1%), nước tiểu vàng (89,488,9%), chán ăn (89,4-92,6%)

Thời kỳ toàn phát (thời kỳ hoàn ñản) : Mức ñộ nặng nhẹ rất thay ñổi ở từng cá thể Các triệu chứng của viêm gan siêu vi B có thể nhẹ và không vàng da hoặc nặng hơn kết hợp với vàng da Trong trường hợp ñiển hình, gồm ñau ñầu, mệt mỏi, chán ăn, buồn nôn và nôn, sốt nhẹ (37,5-390C) là những dấu hiệu sớm xuất hiện 2-7 ngày trước khi vàng da trong các trường hợp có vàng da Đầy bụng hoặc ñau cư trú ở hạ sườn phải hay gặp Nước tiểu trở nên sẩm màu và phân thì lại nhạt màu hơn Ngứa nhẹ gặp ở những ngày sau và chỉ có trong ít ngày ở 50% trường hợp, ñau khớp 10-20% số bệnh nhân

Gan to (tới 15cm đo theo đường vú), nhu mơ đều, ít khi thấy gan rất to Lách cĩ thể sờ được ở 15% số bệnh nhân

Cĩ thể sờ thấy hạch to, nhất là vùng sau cổ Dấu sao mạch sưng vú nhất thời Trong thời gian tồn phát, dấu hiệu rối loạn tiêu hĩa vẫn tồn tại Tuy nhiên các biểu hiện nặng như mệt lả, gan nhỏ, lách to, phù chi và hơn mê chỉ gặp ở một

số trường hợp ở thể kéo dài Đây cũng là các dấu hiệu giúp thầy thuốc thực hành

cĩ những dự đốn về tiên lượng viêm gan siêu vi B cấp

Khi bắt đầu thấy ăn ngon, tiểu nhiều, vàng da, vàng mắt giảm dần là lui bệnh Trẻ nhỏ hồi phục sau 2 tuần cịn người lớn từ 4-6 tuần Trong thời kỳ hồi phục, dấu hiệu mệt mỏi và chán ăn cĩ thể kéo dài nhiều tháng sau

Với các dấu hiệu lâm sàng khơng đặc hiệu, các dấu hiệu sinh học mang tính hướng dẫn, muốn xác định chắc chắn viêm gan siêu vi B phải dựa vào các chỉ điểm huyết thanh học và chẩn đốn virus học

* Các thể lâm sàng của viêm gan siêu vi B

- Thể khơng triệu chứng: 80-90% các trường hợp nhiễm trùng HBV là khơng cĩ triệu chứng

- Thể vàng da thơng thường: cĩ một giai đoạn ủ bệnh 50-150 ngày Giai đoạn tiền hồng đản khơng ổn định, giao động 5-15 ngày, kết quả với một số triệu chứng như đau đầu, đau cơ, đau khớp, mệt mỏi, nổi mày đay, rối loạn tiêu hĩa (chán ăn, buồn nơn, đau bụng) và sốt vừa (38-38,50C)

Vàng da tiến triển tăng dần, đầu tiên ở củng mạc, sau vàng da và niêm mạc

Thường kèm theo nước tiểu sẫm màu và phân cĩ nhạt màu hơn Khi vàng

da xuất hiện, các dấu hiệu của giai đoạn trước mất đi, trừ dấu hiệu mệt mỏi Đơi khi cĩ ngứa Gan đơi khi to lên, thường sờ thấy, lách cũng cĩ thể sờ thấy Bệnh nhân thường gầy đi khoảng 2-4kg Sau 2-6 tuần, vàng da dần đỡ đi, bệnh nhân thấy ăn ngon miệng trở lại và đỡ mệt mỏi Bệnh khỏi khơng để lại di chứng

* Các thể ñặc biệt

- Thể không vàng da: có các dấu hiệu lâm sàng nhưng không vàng da

- Thể ứ mật: biểu hiện ứ mật trong trường hợp này trầm trọng hơn trong thể thông thường, hay có ngứa Tiến triển thường rất chậm, sau vài tuần ñến vài tháng

- Thể kéo dài: diễn biến lâm sàng và các xét nghiệm sinh học kéo dài sau

6 tuần và mất ñi sau 3-4 tháng

- Thể tái phát: trong một số ít trường hợp, sự tái phát có thể xảy ra, sau khi

ñã khỏi bệnh hoàn toàn

- Thể viêm gan tối cấp: nguy cơ bị viêm gan tối cấp chiếm 0,1-1% trong viêm gan siêu vi B cấp Viêm gan tối cấp ñược ñịnh nghĩa bởi sự kết hợp một bệnh não gan và sự suy tế baò gan Bệnh não gan xuất hiện 3 tuần sau khi bắt ñầu vàng da và tiến triển nhanh (giai ñoạn I: run giật ngắn; giai ñoạn II: hội chứng lú lẫn ; giai ñoạn III: hôn mê) kèm theo những dấu hiệu khác của suy gan nặng: hội chứng xuất huyết, hạ ñường huyết Trong trường hợp không ghép gan,

1.3.2 Viêm gan siêu vi B mạn

* Viêm gan mạn tồn tại:

Thường không có triệu chứng, có thể ñi kèm với mệt mỏi, chán ăn, ñau tức nhẹ vùng hạ sườn phải

Thăm khám bình thường hoặc có vẻ thấy gan to nhẹ Tiên lượng nói chung tốt, với những thương tổn tồn tại không tiến triển Tuy nhiên, có thể tiến triển thành viêm gan mạn hoạt ñộng, nhất là nếu vẫn có sự nhân lên của virus

* Viêm gan mạn hoạt ñộng:

Thường có mối tương ứng giữa các biểu hiện lâm sàng, dấu sinh học và tổ chức học

Các dấu hiệu lâm sàng gồm mệt mỏi, ñau hạ sườn phải, vàng da và ngứa khi có ứ mật nhiều Biểu hiện tăng áp lực tĩnh mạch cửa (cổ trướng, xuất huyết tiêu hóa) xuất hiện ngay khi không có xơ gan Khám thấy gan chỉ có to vừa, ñôi khi ñau, có thể thấy lách to

Tiến triển theo hướng nặng lên, hoặc thành ñợt dẫn tới xơ gan sau nhiều năm tiến triển [5]

1.4 Chu kỳ sinh sản của HBV trong cơ thể

Thông thường DNA của những virus ñược sao chép trực tiếp ñể trở thành những phân tử DNA mới, nhưng ñối với virus viêm gan B, có bước sao chép trung gian qua mARN Trước tiên virus vào tế bào gan, giải phóng khỏi lớp vỏ, rồi sau ñó thoát khỏi lớp capside DNA của virus ở trong nhân tế bào gan nhưng ñại ña số các trường hợp không tích hợp vào DNA của tế bào gan Giai ñoạn ñầu

là sự thành lập một DNA, sau ñó ñược sao chép thành RNA nhờ RNA Polymerase của tế bào gan và giai ñoạn sau là sự tổng hợp DNA của virus

Trong một vài trường hợp, DNA của virus viêm gan B có thể sát nhập vào DNA của tế bào gan, sự sao chép chỉ dừng lại, chỉ có kháng nguyên HBsAg (vỏ

rỗng) ñược sản xuất mà không hình thành hạt virus hoàn chỉnh (những người này mang HBsAg), nhưng về nguyên tắc có thể có kháng nguyên HBeAg, và luôn phải dè chừng có sự sao chép trở lại của virus ở những người này Một trong những ñặc ñiểm của nhiễm trùng HBV là sự tổng hợp dư thừa Lipoprotein vỏ gấp hàng chục nghìn lần số lượng hạt virus hoàn chỉnh

Trong quá trình nhiễm trùng cấp máu có chứa những hạt virus (virion), HBsAg, HBeAg, tất cả có thể ñược phát hiện thấy trong huyết thanh ngoài giai ñoạn sao chép của virus Trong trường hợp virus nhân lên, có thể phát hiện bằng miễn dịch huỳnh quang các kháng nguyên HBsAg và HBcAg trong tế bào gan của người bị nhiễm HBV Sự nhân lên của DNA virus và Nucleocapside phối hợp với kháng nguyên HBcAg có trong tế bào gan bị nhiễm, trong khi vỏ của virus ñược sản xuất trong bào tương

Quá trình lâm sàng và những thay ñổi dịch tễ học sau khi phơi nhiễm với virus viêm gan siêu vi B (HBV) thể hiện sự tương tác giữa vật chủ, virus và kháng nguyên ñặc hiệu Trong trường hợp ñiển hình nhiễm trùng HBV cấp, HBsAg xuất hiện sớm 2-6 tuần trước khi xuất hiện triệu chứng và biểu hiện sinh học của viêm gan, thường ñạt tới ñỉnh cao trong giai ñoạn cấp, sau ñó 4-6 tháng giảm từ từ cho ñến khi không phát hiện ñược Kháng nguyên Pre-S1 và Pre-S2

có từ rất sớm trong giai ñoạn ủ bệnh, với mức ñộ thấp, tăng và giảm cùng với HBsAg và chỉ phát hiện ñược khi có HBsAg

HBV DNA, DNA polymerase và HBeAg xuất hiện ñồng thời hoặc tiếp theo sau Khả năng lây nhiễm cao nhất trong giai ñoạn sớm của nhiễm trùng là

do ñộ tập trung cao của virus trong máu (1010 hạt virus/ml) Rất hiếm khi phát hiện ñược HBcAg tự do trong huyết thanh

Sự tăng nồng ñộ IgM Anti-HBc xuất hiện ñồng thời với sự tăng Amino alanin transferase (ALT) Do kháng thể này ñược sản xuất khi có sự tổng hợp của Nucleocapside của virus, sự xuất hiện của Anti-HBcIgM trong huyết thanh phản ánh ñang có sự nhân lên của virus và bệnh ñang ở giai ñoạn cấp Kháng thể

Anti-HBcIgM mất ñi trong giai ñoạn hồi phục, kháng thể HBc IgG nói chung tồn tại rất lâu dài Trong giai ñoạn sớm của thời kỳ hồi phục và trước khi HBsAg biến mất, Anti-HBe xuất hiện thay thế HBeAg mất ñi, chỉ ra sự tiến triển tốt của bệnh

Dưới 5% trường hợp viêm gan siêu vi B cấp có biểu hiện nặng như hoại

tử gan cấp, HBsAg có thể không phát hiện ñược Xét nghiệm huyết thanh có thể thấy Anti-HBc IgM (có hoặc không có Anti-HBe) như một chỉ ñiểm về sự hoạt ñộng nhân lên của virus

Kết thúc của nhiễm HBV là sự biến mất của HBsAg và xuất hiện HBs (chuyển ñổi huyết thanh) Kháng thể Anti-HBs thường ñược phát hiện sau HBsAg 2-8 tuần

Anti-Khoảng 30-50% bệnh nhân không phát hiện ñược Anti-HBe sau 6 tháng

Sự xuất hiện của các dấu ấn HBeAg, DNA của HBV (ñược xác ñịnh bằng kỹ thuật PCR) tùy thuộc vào giai ñoạn nhân lên của virus

Trong quá trình nhân lên của virus-giai ñoạn hoạt ñộng : HBeAg và DNA của HBV(HBV-DNA) xuất hiện, không có Anti-HBe Ở giai ñoạn sau, HBV-DNA giảm xuống và biến mất khi có sự chuyển ñổi huyết thanh ñối với HBe (xuất hiện Anti- HBe và biến mất HBeAg)

Trong giai ñoạn viêm gan không hoạt ñộng, Anti- HBe xuất hiện và các dấu ấn khác biến mất

Giai ñoạn tái hoạt ñộng có sự xuất hiện trở lại trong huyết thanh của HBeAg và HBV-DNA, thường xuyên ñi kèm với sự có mặt của Anti-HBc IgM [5]

1.5 Tình hình nghiên cứu về kiểu gen HBV trong và ngoài nước

Sự khác nhau giữa các kiểu gen của HBV chính là sự khác nhau hơn 8% trong trình tự của các nucleotid trên DNA của HBV Sự phân bố của các kiểu gen khác nhau tùy thuộc các vùng ñịa lý khác nhau:

- Kiểu gen A: thường gặp ở các nước ở tây bắc châu Âu, phía nam Sahara,

Ấn ñộ và Mỹ

- Kiểu gen B và C: Thường gặp ở các nước Đông nam châu Á, Nhật Bản và các nước ở Thái bình dương

- Kiểu gen D: thường gặp ở các nước vùng Địa trung hải

- Kiểu gen E: thường thấy gặp ở một số nước tại châu Phi

- Kiểu gen F: thường gặp tại một số nước ở trung và nam châu Mỹ [32] Bảng sau mô tả sự phân bố kiểu gen HBV của một số tác giả trong nước và các nước trong khu vực [1]

Bảng 1.1 Sự phân bố kiểu gen HBV của một số tác giả trong nước và các nước

Yang J (2002,Trung quốc) 45% 38,7% 16,7%

Lui C J (2002, Đài loan) 1% 81% 12% 6% Kato H (2002,Uzbekistan) 13% 87%

Mức ñộ nặng của bệnh cũng như sự tiến triển sang viêm gan B mạn tính trong các nghiên cứu trên cho thấy có sự giống nhau ở kiểu gen B và C Theo tác giả Norio Akuta thì sự tiến triển sang xơ gan và ung thư gan trên bệnh nhân nhiễm HBV chiếm tỷ lệ 63% ñối với kiểu gen C và 16% ở kiểu gen D và cũng theo tác giả này thì tại Tokyo trong 57 trường hợp viêm gan B cấp thì kiểu gen A chiếm 22,8%, B là 14%, C là 43,9% , D và F chỉ chiếm 1,8%, trong ñó có 15,8%

không xác ñịnh ñược kiểu gen, còn trong 1.077 trường hợp viêm gan B mạn tính kiểu gen C chiếm một tỷ lệ cao là 87,7% Tiếp theo là B với 9,4% còn A là 1,9%, kiểu gen D và F chỉ chiếm 0,2%, có 0,6% không xác ñịnh ñược kiểu gen Cũng theo tác giả này thì biến chứng nặng trên các bệnh nhân viêm gan mạn thường hay gặp trên các bệnh nhân mang HBV kiểu gen B và C, ñặc biệt xơ gan

và ung thư gan gặp trên các bệnh nhân mang HBV kiểu gen C hơn kiểu gen B [31]

Dưới ñây là một số các kết quả nghiên cứu của một số tác giả tại châu Á [10]:

Quốc gia Biểu hiện lâm sàng Kiểu gen của HBV

Hồng Kông Nhiễm HBV Kiểu gen B nhiều hơn C Nhật Nhiễm HBV Kiểu gen B nhiều hơn C Đài Loan Nhiễm HBV Kiểu gen B nhiều hơn C Hồng Kông Biến chứng tại gan Kiểu gen C nhiều hơn B Đài Loan Biến chứng UTGNP Thường gặp ở kiểu gen C Nhật Viêm gan mạn tính Thường gặp ở kiểu gen C

Nhật Biến chứng ñến xơ gan và

UTGNP Thường gặp ở kiểu gen B hơn C

Hồng Kông Kháng thuốc ñiều trị

Lamivudine Gặp kiểu gen B & C

Đài Loan Kháng thuốc ñiều trị

Lamivudine Gặp kiểu gen B & C

Nhật Kháng thuốc ñiều trị

Lamivudine Gặp kiểu gen B & C Đài Loan Đáp ứng Lamivudine Kiểu gen B nhiều hơn C

Một nghiên cứu khác của Xin Ding tại Trung quốc thì kiểu gen C chiếm

tỷ lệ cao nhất lên ñến 80% các kiểu gen còn lại lần lượt là: kiểu gen A (3%) Kiểu gen B (5,5%), kiểu gen D (0,5%) và kiểu gen B + C là 4,4% còn 3,3 % không xác ñịnh ñược kiểu gen [43]

Mối tương quan giữa kiểu gen và mức ñộ trầm trọng của bệnh cũng ñã

ñược nhiều báo cáo ñề cập trong những năm gần ñây Kiểu gen nhiễm ñược cho

là gắn mật thiết với tình trạng âm ỷ của bệnh (thông qua việc ñánh giá hai chỉ tiêu HBcAg, HBeAg); quá trình bệnh sinh của gan, sự trốn thoát khỏi hệ thống miễn dịch, sự ñáp ứng thuốc ñiều trị và kháng thuốc ñiều trị virus [29]

Một nghiên cứu ở Nhật chỉ ra rằng sự bất thường trong chức năng gan (mức aminotransferase trong huyết thanh bất thường) thường xuyên ñược ghi nhận ñối với nhiễm kiểu gen B hơn kiểu gen C; kiểu gen B có chỉ số hoạt tính

mô học (histological activity score – HAI score) thấp hơn [35]

Một nghiên cứu khác ở Nhật bản thực hiện trên 585 bệnh nhân viêm gan mạn cũng chỉ ra rằng những người nhiễm kiểu gen B có sự tiến triển sang xơ gan chậm hơn kiểu gen C [36] Kiểu gen B cũng ñược cho là có liên quan một cách

tự nhiên với sự tồn tại của HBeAg trong huyết thanh ở những người nhiễm ở ñộ tuổi trẻ hơn và bệnh lý gan cũng ít trầm trọng so với kiểu gen C [16]

Ba nghiên cứu khác thực hiện trên 490 người Trung quốc và 155 người Nhật cũng ñánh giá kiểu gen C phổ biến ở bệnh nhân xơ gan hơn kiểu gen B [19], [25], [33]

Nghiên cứu ở Mỹ cũng cho thấy xơ gan ở những người nhiễm kiểu gen B diễn ra chậm Ung thư gan cũng diễn ra chậm hơn với kiểu gen B; bệnh nhân có kiểu gen B phát triển thành ung thư gan ở ñộ tuổi già hơn Giả thuyết ñược ñặt ra

ñể lý giải cho các quan sát này là kiểu gen B cần một thời gian ngắn hơn ñể tái bản ở mức ñộ cao, chính vì vậy mà hệ quả là tính chất gây viêm sau ñó ñối với tế bào gan cũng kém hơn [15]

Tuy nhiên, một nghiên cứu khác ở Đài loan thì lại cho thấy kết quả ngược lại với những công bố trước Nghiên cứu này chỉ ra rằng kiểu gen B xuất hiện thường xuyên hơn các kiểu gen khác ở những bệnh nhân ung thư gan trước 50 tuổi [25]

Ở Ấn ñộ, nghiên cứu thực hiện trên 70 bệnh nhân cho thấy có chỉ số ALT trong gan ở mức cao hơn, kháng nguyên lõi dương tính và kháng thể anti-HBe

âm tính ở ñộ tuổi trên 25, và thường xuyên chuyển xơ gan ở những người nhiễm kiểu gen A hơn kiểu gen D [27]

Một nghiên cứu khác ở Tây Ban Nha cho thấy (kiểu gen A chiếm 52%, D 35% và F 7%) mức lưu hành của HBcAg trong huyết thanh là tương tự giữa kiểu gen A và D Tuy nhiên, sự lưu hành của HBeAg, khả năng duy trì tính sinh hóa của gan và ñáp ứng virus học thường kém hơn với bệnh nhân nhiễm kiểu gen A HBeAg cũng sụt giảm ở mức cao ở những bệnh nhân nhiễm kiểu gen A này [34]

Một số nghiên cứu khác chỉ ra rằng những người bệnh nhiễm kiểu gen F dường như chết vì những bệnh lý liên quan ñến gan sớm hơn kiểu gen A và D [35] Kiểu gen D cũng cho thấy liên quan ñến các hình thức phát bệnh nhanh chóng hơn trong một nghiên cứu ở Mỹ [21]

Nghiên cứu ở Thụy sĩ thì lại chứng minh rằng kiểu gen A có mức ñộ chuyển từ thể cấp sang mạn nhanh chóng hơn kiểu gen D, cũng như khả năng phục hồi sau giai ñoạn cấp của những kiểu gen là khác nhau [30]

Mặc dù dữ liệu về sự lưu hành HBeAg trong huyết thanh, bệnh lý của gan, tốc ñộ chuyển sang xơ gan và ung thư gan giữa tám kiểu gen là chưa thực sự ñầy

ñủ, nhưng một nghiên cứu trên 694 bệnh nhân ở Mỹ ñã thống kê kiểu gen A liên quan với sự tồn tại của HBeAg hơn kiểu gen B và D, kiểu gen A, C và D liên quan ñến tình trạng phân hủy tế bào gan hơn kiểu gen B [15]

Mối liên quan giữa mức HBV DNA và kiểu gen ở các nghiên cứu khác nhau cũng cho thấy có các kết qua trái ngược nhau Một nghiên cứu chỉ ra rằng HBV DNA trong máu cao ở người nhiễm kiểu gen C hơn B [26]

Một nghiên cứu khác trên 694 bệnh nhân giai ñoạn III ñiều trị bằng adefovir dipivoxil cho thấy HBV DNA cao hơn ở những người nhiễm kiểu gen

C (lúc này chỉ số HBeAg dương tính) Ngược lại, ở những bệnh nhân HBeAg âm tính, mức HBV DNA ở những người nhiễm kiểu gen D cao hơn [15]

Ngược lại, một số hồi cứu thì lại thất bại trong việc chứng minh sự tương quan giữa mức ñộ HBV DNA và các kiểu gen nhiễm [14], [36], [44]

Nghiên cứu trên 694 bệnh nhân ở Mỹ cũng không cho thấy có sự khác biệt nào giữa HBV DNA và các kiểu gen A, B, C và D [15] Tuy nhiên, cũng cần phải lưu ý rằng, các nghiên cứu nói trên ñều thực hiện việc kiểm tra mức HBV DNA tại một thời ñiểm cho nên kết quả công bố chưa thuyết phục

Ở châu Á, sự lưu hành của HBeAg ở những người nhiễm kiểu gen C cao hơn kiểu gen B [14], [15], [35], [36] Các nghiên cứu này cũng chỉ ra sự lưu hành HBeAg trong huyết thanh xảy ra sớm và ở mức cao ñối với bệnh nhân nhiễm kiểu gen B Hơn nữa, kiểu gen B dường như có ALT biểu hiện trước HBeAg lưu hành, sự mất các tính chất sinh hóa xảy ra sau khi HBeAg lưu hành [14] Mối tương quan giữa sự lưu hành HBeAg và kiểu gen HBV cũng là vấn ñề chưa ñược nghiên cứu ñầy ñủ

Sự thay ñổi trong cấu trúc vỏ bao ngoài (precore) của HBV dường như ñộc lập với kiểu gen Đột biến chiếm ưu thế tại vỏ bao ngoài là G
A tại vị trí

1896 (G1896A), chỉ khi nucleotide tại vị trí cuống (stem) ñối diện 1858 là T (thay vì A) HBV kiểu gen A hầu hết mang nucleotide C tại vị trí 1858 Điều này giải thích tại sao hầu hết các thay ñổi vỏ bao ngoài G1896A là không thường xuyên ñược ghi nhận tại Mỹ và Bắc Âu, trong khi kiểu gen A chiếm ưu thế [33] Ngược lại, kiểu gen B, C và D thường xuyên mang nucleotide T tại vị trí 1858,

kiểu ñột biến G1896A thường xuyên ñược ghi nhận ở những kiểu gen này, tương

tự ở châu Á và Địa trung hải [28] Hai nghiên cứu khác ở Tây Ban Nha và Pháp thực hiện lần lượt trên 70 và 151 bệnh nhân cho thấy, sự thay ñổi vỏ bao ngoài là thường xuyên ghi nhận với kiểu gen D (65-75%) và ít gặp ñối với kiểu gen A (9-18%) [23], [32] Nghiên cứu khác ở châu Á, bệnh nhân nhiễm kiểu gen B (48%) thường có thay ñổi tại vỏ bao ngoài hơn kiểu gen C (5%) [28] Nghiên cứu trên

694 người Mỹ cho kết quả thay ñổi vỏ bao ngoài là 3%, 46%, 24% và 73% trên các bệnh nhân nhiễm tương ứng các kiểu gen A, B, C và D [15] Hai thay ñổi phổ biến nằm ở vùng promoter lõi (core) (từ nucleotide 1742 ñến 1849) là A1762T và G1764A Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy có sự tương quan giữa hình thức ñột biến và kiểu gen Đã có các công bố cho thấy người châu Á mang kiểu gen C có các kiểu ñột biến A1762T và G1764A hơn kiểu gen B [28] Trên 694 người Mỹ, ñột biến vùng promoter lõi là 41%, 27%, 60% và 42% tương ứng với lần lượt các kiểu gen A, B, C và D [15]

Trên thế giới ñã có nhiều công bố phân tích mối tương quan giữa kiểu gen với cách ñáp ứng thuốc kháng virus Kiểu gen nhiễm ñược cho là có ảnh hưởng ñến ñáp ứng ñiều trị với interferon Hai nghiên cứu trên 58 bệnh nhân Đài loan

và 109 bệnh nhân Hồng Kông cho thấy, trong quá trình ñiều trị bằng interferon, kiểu gen B có tốc ñộ lưu hành HBeAg cao hơn kiểu gen C (41% so với 15%) [26], [39]

Một nghiên cứu khác ở Tây Ban Nha cho thấy tốc ñộ lưu hành HBeAg ở kiểu gen A cao hơn kiểu gen D [26] Một chương trình ñiều trị bằng inteferon và inteferon kết hợp với lamivudine kéo dài trong 52 tuần, khẳng ñịnh rằng HBeAg lưu hành xảy ra với kiểu gen A là 47%, B là 44%, C là 28% và D là 25% Nghiên cứu này thực hiện trên 266 bệnh nhân [24] Một nghiên cứu khác trên 64 người Đức cũng cho thấy sự lưu hành HBeAg cao hơn ở kiểu gen A (37%) so với kiểu gen D (6%) [20] Hiện vẫn chưa có nhiều công bố cho thấy mối tương

quan giữa kiểu gen HBV với các liệu pháp dùng lamivudine và adevofir dipivoxil

Một nghiên cứu gần ñây nhất cho thấy trên 78 bệnh nhân Đức, ñột biến kháng lamivudine bùng nổ nhanh chóng ñối với kiểu gen A hơn D [45] Nghiên cứu trên 31 bệnh nhân Đài loan cho thấy (kiểu gen B chiếm 13 và C chiếm 18) sau khi ñiều trị bằng lamivudine, sự tái phát của kiểu gen C là cao hơn B [13] Mặc dù nghiên cứu trên 24 bệnh nhân Ý (kiểu gen A chiếm 15 và D chiếm 9), chỉ ra tính chất sinh hóa và virus học không thay ñổi giữa hai kiểu gen A và D trong ñáp ứng ñiều trị bằng lamivudine [12], nhưng trên một nghiên cứu khác ở người Ấn (76 bệnh nhân, 28 kiểu gen A, 48 bệnh nhân kiểu gen D) lại cho thấy kiểu gen D duy trì tính chất virus học ñáp ứng với lamivudine hơn kiểu gen A [37] Nghiên cứu ở Đài loan cũng cho thấy lưu hành HBeAg của kiểu gen B là hơn C trong ñiều trị bằng lamivudine [26] Đáp ứng lâm sàng giai ñoạn III trong ñiều trị bằng adevofir dipivoxil trên 694 bệnh nhân cho thấy ở kiểu gen A, B, C

và D có sự giảm HBV DNA tương tự nhau sau 48 tuần ñiều trị [42]

Công trình của Norio Akuta và cộng sự [31] chỉ ra rằng: ñáp ứng với hai loại thuốc interferon và lamivudine ở những bệnh nhân viêm gan mạn, kiểu gen

B tốt hơn kiểu gen C Đối với những bệnh nhân nhiễm kiểu gen B (kiểu gen có

sự tái tổ hợp với kiểu gen C), ñáp ứng với lamivudine nghèo nàn hơn so với trường hợp kiểu gen B không tái tổ hợp Nhóm nghiên cứu cũng ñề nghị mở rộng nghiên cứu này trên các trường hợp nhiễm các kiểu gen khác, A hoặc D Trong mối tương quan giữa kiểu kiểu gen và sự nhiễm sau ghép gan, một nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng sự nhiễm kiểu gen D là cao hơn ở những bệnh nhân ghép gan [18] Mặt khác các nghiên cứu [11], [22] lại cho thấy không có mối liên hệ nào giữa sự nhiễm sau ghép với tất cả các kiểu gen A, B, C và D

Tóm lại, vẫn còn nhiều câu hỏi về vai trò của kiểu gen HBV ñã ñược ñặt

ra và các nhà chuyên môn vẫn ñang cố gắng ñể trả lời:

(1) Có hay không sự liên quan giữa kiểu gen HBV và khả năng tái bản của virus, mức HBV DNA trong máu, các thể bệnh của gan, sự lưu hành của HBeAg, sự khỏi bệnh, và ñáp ứng với các thuốc ñiều trị chính như interferon, lamivudine, adevofir.dipivoxil

(2) Kiểu gen nào chủ yếu ở các nước, sự phân bố kiểu gen HBV theo các vùng ñịa lý có liên quan với dịch tễ nhiễm HBV?

(3) Ảnh hưởng của kiểu gen HBV trong diễn tiến ñến viêm gan B mạn tính? Cho ñến nay, các nghiên cứu về kiểu gen HBV vẫn còn rải rác, số liệu không ñược nhiều cũng như các kết quả công bố về sự tương quan giữa kiểu gen với các yếu tố lâm sàng, cận lâm sàng chưa ñược thống nhất hoàn toàn [7]

1.6 Phương pháp xác ñịnh kiểu gen HBV

Có nhiều phương pháp ñã ñược nghiên cứu và dùng trong việc xác ñịnh kiểu gen HBV như giải trình tự chuỗi (sequencing), RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism), LiPA (Line Probe Assay), phản ứng miễn dịch men Phương pháp ñược chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu ñề tài là phương pháp Real-Time PCR TaqMan probe

1.6.1 Thế nào là một phản ứng Real-Time PCR

Trong phản ứng PCR truyền thống, sản phẩm khuếch ñại ñược phát hiện bằng cách ñiện di DNA trên gel agrose khi phản ứng kết thúc Ngược lại, Real-Time PCR cho phép phát hiện sự tích lũy DNA khuếch ñại ngay khi phản ứng ñang xảy ra, ñó là ý nghĩa của cụm từ “Real-Time”

Khả năng này ñược thực hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang báo hiệu sự gia tăng lượng DNA tỷ lệ với sự gia tăng lượng tín hiệu huỳnh quang Những hóa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và những trình tự gắn huỳnh quang liên kết ñặc hiệu với DNA mạch khuôn gọi là mẫu dò (probe) Những máy luân nhiệt ñặc biệt trang bị bộ phận phát hiện huỳnh quang ñược sử dụng ñể kiểm soát tín hiệu huỳnh quang

khi quá trình khuếch ñại xảy ra Tín hiệu huỳnh quang ñược ño lường phản ánh lượng sản phẩm khuếch ñại trong mỗi chu kỳ

Ưu ñiểm chính của Real-Time PCR so với PCR truyền thống là nó cho phép xác ñịnh số lượng bản sao khuôn mẫu ban ñầu với sự chính xác và ñộ nhạy cao trong phạm vi biến thiên rộng Kết quả Real-Time PCR có thể là kết quả ñịnh tính (hiện diện hay vắng mặt một trình tự DNA) hay ñịnh lượng (số lượng bản sao DNA) Real Time PCR sử dụng ñể ñịnh lượng DNA ñược gọi là PCR ñịnh lượng Ngược lại, PCR truyền thống chỉ ñược xem là bán ñịnh lượng Thêm vào ñó, dữ liệu Real-Time PCR có thể ñược ñánh giá mà không cần phải ñiện di trên gel, giúp tiết kiệm thời gian và tăng số lượng thí nghiệm thực hiện Cuối cùng, việc tiến hành phản ứng và ñánh giá dữ liệu trong một hệ thống ống ñóng kín giúp làm giảm nguy cơ ngoại nhiễm và loại bỏ những thao tác sau phản ứng khuếch ñại[3], [9]

1.6.2 Cơ chế hoạt ñộng Real-Time PCR

Để hiểu cơ chế hoạt ñộng Real-Time PCR, hãy xem ñồ thị khuếch ñại DNA mẫu (hình 1.3) Trong ñó, số chu kỳ PCR ñược thể hiện trên trục x, và tín hiệu huỳnh quang từ phản ứng, tỷ lệ với lượng sản phẩm khuếch ñại trong ống, ñược thể hiện trên trục y

0.3 Pha hàm mũ

Giai ñoạn bão hòa

0.2

Giá trị ngưỡng

0.1 Đường ngưỡng

0 10 20 30 40 Hình 1.3 Đồ thị khuếch ñại dựa trên hiệu số của tín hiệu nền huỳnh quang

Đồ thị khuếch ñại thể hiện 2 giai ñoạn, giai ñoạn một theo hàm mũ và giai ñoạn hai bão hòa không theo hàm mũ Trong giai ñoạn hàm mũ, lượng sản phẩm PCR gần như ñược gấp ñôi sau mỗi chu kỳ Khi phản ứng tiếp diễn, các thành phần phản ứng ñược sử dụng và sau cùng, một hay nhiều thành phần trở nên cạn kiệt Từ thời ñiểm này, phản ứng chậm lại và bước vào giai ñoạn bảo hòa (chu

kỳ 28-40 trong hình 1.3)

Ban ñầu, tín hiệu còn ở mức tín hiệu nền, và ta không thể phát hiện (chu

kỳ 1-18 ở hình 1.3) cho dù sản phẩm tăng theo hàm mũ Đến một thời ñiểm xác ñịnh, sản phẩm khuếch ñại ñã ñược tạo ra ñủ ñể tính hiệu huỳnh quang có thể ñược phát hiện Và chu kỳ mà tại ñó ñiều này xảy ra ñược gọi là chu kỳ ngưỡng (Cycle of Threshold-CT) Do chu kỳ ngưỡng ñược ño lường trong giai ñoạn hàm

mũ khi các thành phần phản ứng chưa cạn kiệt, Real-Time PCR có thể ñược sử dụng ñể tính toán một cách chính xác và tin cậy lượng ban ñầu của khuôn mẫu hiện diện trong phản ứng

Chu kỳ ngưỡng của một phản ứng ñược xác ñịnh chủ yếu bởi lượng khuôn mẫu hiện diện lúc phản ứng khuếch ñại ban ñầu Nếu lượng ban ñầu của mẫu lớn, chỉ sau một chu kỳ, sản phẩm khuếch ñại ñã tích lũy ñủ cho tín hiệu huỳnh quang cao hơn tín hiệu nền Vì vậy, phản ứng sẽ trễ hay có chu kỳ ngưỡng cao Mối quan hệ này là tiền ñề cơ bản cho việc ñịnh lượng của phương pháp Real-Time PCR [3]

1.6.3 Phản ứng sử dụng Taqman probe

Cấu tạo của TaqMan probe gồm một ñoạn oligonucleotide thẳng có ñánh

dấu ở ñầu 5’ bằng nhóm “phát” huỳnh quang (report dye), và ở ñầu 3’ bằng nhóm “dập” huỳnh quang (quencher dye) Probe này có vai trò bắt bổ sung một cách chính xác với vùng nào ñó trong trình tự nucleotide mà chúng ta cần

khuếch ñại Khi ở trạng thái tự do hoặc bắt vào trình tự (nhưng enzyme Taq

polymerase chưa hoạt ñộng) thì một chất huỳnh quang ở ñầu này sẽ dập tắt khả

năng phát huỳnh quang của ñầu kia Khi enzyme Taq polymerase tiến hành kéo

dài đến một lúc nào đĩ thì nĩ sẽ chạm vào đoạn probe đang bổ sung với một

mạch DNA Khi đĩ hoạt tính 5’exonuclease của Taq polymerase sẽ tiến hành

đánh bật và phân cắt tồn bộ probe cũng như giải phĩng chất huỳnh quang đang

bị kìm nén Chất huỳnh quang này sẽ phát sáng và được đọc bởi máy PCR Do đĩ số lượng bản sao khuếch đại càng nhiều thì cường độ huỳnh quang càng lớn Từ đĩ ta suy ra được hàm lượng DNA tương ứng với cường độ huỳnh quang mà máy đã đo

Realtime-1.6.4 Ứng dụng của Realtime PCR

Realtime PCR cĩ rất nhiều ứng dụng Một ứng dụng quan trọng là trong chẩn đốn xác định kiểu gen HBV Thơng thường các probe được thiết kế sao cho nĩ bắt bổ sung hồn hảo với vùng khảo sát của đoạn DNA khuếch đại (ví dụ vùng đặc trưng cho từng kiểu gen) Chỉ cần một nucleotide bắt sai thì probe khơng thể gắn chặt vào trình tự và sẽ bị rơi vào trạng thái tự do Do đĩ kết quả

phát huỳnh quang sẽ khơng thể hiển thị được trên màn hình

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn ñối tượng nghiên cứu

- Bệnh nhân: ñã ñược xác ñịnh là nhiễm HBV dựa theo các kết quả Real time PCR

- Tuổi không hạn chế

- Giới không hạn chế

2.1.2 Các chỉ số nghiên cứu

- Kiểu gen HBV

- Các thông số bệnh nhân như: tuổi, giới tính

- Các ñặc ñiểm lâm sàng: nhiệt ñộ, huyết áp, tình trạng gan, tình trạng màu da, tình trạng màu mắt

- Các ñặc ñiểm cận lâm sàng:

+ Nồng ñộ virus HBV trong máu

+ Chỉ số men gan

+ Chỉ số huyết học

+ Kháng nguyên HBeAg và kháng thể anti HBeAg

2.1.3 Địa ñiểm thu thập mẫu

Mẫu thu tại các phòng khám: 46A Phan Chu Trinh, 10 Ybih aleo (phòng khám Hoàn hảo)

2.1.4 Thời gian và kế hoạch nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 03/2009 ñến tháng 09/2010

- Kế hoạch nghiên cứu:

Từ tháng 03/2009 ñến tháng 10/2009: làm ñề cương

Từ tháng 11/2009 ñến ñến tháng 05/2010: thu thập số liệu

Từ tháng 6/2010 ñến tháng 09/2010: xử lý số liệu và viết luận văn

2.2 Nội dung nghiên cứu

Bao gồm những bước chủ ñạo sau ñây:

- Xác ñịnh kiểu gen của virus gây viêm gan siêu vi B (HBV) bằng các kỹ thuật sinh học phân tử: các kỹ thuật chủ ñạo bao gồm tách chiết DNA, thực hiện phản ứng Realtime PCR nhằm xác ñịnh kiểu gen (genotyping) của virus HBV (sử dụng bộ kít của công ty Việt Á) Các trường hợp không thể xác ñịnh ñược kiểu gen bằng Realtime PCR, chúng tôi sẽ tiến hành giải trình tự

- Phân tích kết quả xác ñịnh kiểu gen HBV theo tuổi và giới tính; các ñặc ñiểm lâm sàng (nhiệt ñộ, huyết áp, tình trạng gan, tình trạng màu da, tình trạng màu mắt); cận lâm sàng (nồng ñộ virus HBV trong máu, chỉ số men gan, chỉ số huyết học, kháng nguyên HBeAg và kháng thể anti HBeAg)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu chung là mô tả cắt ngang với cỡ mẫu thuận tiện

2.3.1 Phương pháp thu thập, xử lý và bảo quản mẫu bệnh phẩm

- Mẫu thu nhận là máu toàn phần ñã có kết quả ñịnh tính và ñịnh lượng dương tính với HBV

- Máu sau khi thu nhận ñược hòa trong dung dịch chống ñông, giữ lạnh, chuyển về công ty Việt Á (Tp Hồ Chí Minh) Nếu cần lưu trữ mẫu lâu hơn, nên tách phần huyết thanh, ñông lạnh ở -70oC ñể ñảm bảo chất lượng mẫu

- Số mẫu thu vào 100 mẫu

2.3.2 Tách chiết nucleic acid

2.3.2.1 Nguyên tắc

Tiến hành tách chiết DNA bằng phương pháp tủa (Chomczynski & Sacchi, 1987) Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là dùng các tác nhân biến tính mạnh ñể phá vỡ màng tế bào và loại bỏ các thành phần không mong muốn (protein, màng tế bào…) DNA sẽ ñược tủa bởi isopropanol ở ñiều kiện lạnh và thu lại qua các lần ly tâm Cặn DNA ñược huyền phù trong TE 1X và bảo quản ở -20oC

2.3.2.2 Một số dung dịch cho tách chiết DNA

Trizol pH 8,0: Trizol, phenol, guanidium thiocyanate, Natri citrate TE 1X: Tris-HCl, EDTA, cloroform, isopropanol, ethanol 70%

2.3.3 Phương pháp Realtime-PCR TaqMan Probe

2.3.3.1 Nguyên tắc

Dựa vào cấu tạo của TaqMan probe gồm một ñoạn oligonucleotide thẳng

có ñánh dấu ở ñầu 5’ bằng nhóm “phát” huỳnh quang (report dye), và ở ñầu 3’ bằng nhóm “dập” huỳnh quang (quencher dye) Probe này có vai trò bắt bổ sung một cách chính xác với vùng nào ñó trong trình tự nucleotide mà chúng ta cần

khuếch ñại Khi ở trạng thái tự do hoặc bắt vào trình tự (nhưng enzyme Taq

polymerase chưa hoạt ñộng) thì một chất huỳnh quang ở ñầu này sẽ dập tắt khả

năng phát huỳnh quang của ñầu kia Khi enzyme Taq polymerase tiến hành kéo

dài ñến một lúc nào ñó thì nó sẽ chạm vào ñoạn probe ñang bổ sung với một

mạch DNA Khi ñó hoạt tính 5’exonuclease của Taq polymerase sẽ tiến hành

ñánh bật và phân cắt toàn bộ probe cũng như giải phóng chất huỳnh quang ñang

bị kìm nén Chất huỳnh quang này sẽ phát sáng và ñược ñọc bởi máy PCR Do ñó số lượng bản sao khuếch ñại càng nhiều thì cường ñộ huỳnh quang càng lớn Từ ñó ta suy ra ñược hàm lượng DNA tương ứng với cường ñộ huỳnh quang mà máy ñã ño

Realtime-Hình 2.1 Cách thức hoạt ñộng của TaqMan probe

2.3.3.2 Tiến hành

Cho 5 µl mẫu chứng dương (+), chứng âm (-) hoặc dịch DNA tách chiết vào Realtime-PCR mix

- Đậy nắp tube thật kỹ và ñặt vào máy Realtime-PCR

- Cài ñặt chương trình ñịnh dạng vị trí các mẫu trong block nhiệt của máy (plate set up), chọn màu huỳnh quang tương ứng Cài ñặt chương trình như sau : + 1 chu kỳ: 95 0C – 5 phút

+ 40 chu kỳ : 95 0C – 15 giây

60 0C – 1 phút Sau khi kết thúc chương trình Realtime-PCR, chọn nút Report, chọn chế

ñộ hiển thị toàn phần (amp cycles) và in ra giấy kết quả thí nghiệm Nếu mẫu dương tính (chu kỳ ngưỡng vượt qua Threshold cycle) thì kết luận là kiểu gen A,

B hay C

2.3.3.3 Cách kiểm tra bộ kít ñược sử dụng

Trên thị trường hiện nay ñã có rất nhiều bộ kít ñược sản xuất trong và ngoài nước dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử phục vụ cho việc xác ñịnh kiểu gen của HBV Mỗi kít có những ưu và nhược ñiểm riêng, chúng tôi chọn bộ kít xác ñịnh kiểu gen HBV của công ty Cổ phần & Dịch vụ Việt Á bởi giá cả hợp lý nhất Tên thương mại của bộ kít này là HBV Genotype PCR plus Kit (VA.A.02-001E) Điểm ñặc trưng của bộ kít VA.A.02-001E là: trình tự gen mục tiêu cho phản ứng realtime PCR là vùng gen S trên bộ gen HBV Cặp mồi

sử dụng cho phép nhân bản mọi kiểu gen ñã xác ñịnh của virus (mồi bảo tồn – consensus primer) và mẫu dò (TaqMan probe) ñặc hiệu cho từng kiểu gen A, B

và C ñược thiết kế bên trong ñoạn trình tự nằm giữa hai mồi Chất ñánh dấu huỳnh quang là FAM và chất dập tắt tín hiệu huỳnh quang (quencher) là BHQ1 Mỗi kiểu gen A, B, C ñược phát hiện riêng biệt trong từng microtube khác nhau (phản ứng singleplex realtime PCR)

Trong bước ñầu học các kỹ thuật sinh học phân tử và áp dụng trên quy trình xác ñịnh kiểu gen HBV, công ty Việt Á cũng tạo ñiều kiện ñể chúng tôi

kiểm tra và khẳng ñịnh ñộ ñặc hiệu cũng như ñộ nhạy của bộ kít trước khi thử nghiệm trên bộ mẫu của mình

Những kết quả thử nghiệm ñộ nhạy, ñộ ñặc hiệu như sau:

Độ ñặc hiệu của mồi và mẫu dò

Đối với hệ mồi và mẫu dò trên gen S của HBV: chúng tôi thiết kế thí

nghiệm sử dụng DNA chứng dương là ñoạn amplicon (ñoạn DNA ñược tổng hợp hóa học, phỏng theo trình tự nucleotide ñặc trưng cho từng kiểu gen virus) HBV kiểu gen A ñược ñưa vào các hỗn hợp cho phản ứng realtime PCR chứa các mẫu dò ñặc trưng cho HBV kiểu gen A, B và C Việc bố trí thí nghiệm cũng ñược tiến hành tương tự cho các kiểu gen còn lại

Hình 2.2 Kết quả khảo sát khả năng khuếch ñại của mồi và mẫu dò trên gen S

tương tự cho phản ứng realtime-PCR chỉ thay acid nucleic bằng nước), các nguồn amplicon và các hệ mồi, mẫu dò không tương ứng Như vậy hệ mồi và các mẫu dò Probe A, Probe B và Probe C chỉ khuếch ñại ñặc trưng tương ứng

cho các amplicon HBV kiểu gen A, B và C

Độ nhạy của phản ứng

Thử nghiệm ñược tiến hành với từng amplicon kiểu gen A, B và C có các nồng ñộ bản sao ñã biết trước Các dạng ñồ thị biểu thị ở hình 3.2 cho thấy các kiểu gen tương ứng với các mồi và mẫu dò ñặc trưng, thì các tín hiệu huỳnh quang vượt trên tín hiệu nền, từ mẫu có nồng ñộ amplicon 107 bản sao/ml với chu kỳ ngưỡng (Ct) giảm dần ñến mẫu có nồng ñộ amplicon 102 bản sao/ml

Mẫu chứng âm có tín hiệu huỳnh quang thấp hơn tín hiệu nền

Hình 2.3 Kết quả khảo sát ñộ nhạy của mồi và mẫu dò trên gen S của HBV

2.3.4 Phương pháp thu thập số liệu

Thu thập số liệu theo các chỉ tiêu sau:

- Các thông số bệnh nhân như: tuổi, giới tính

- Các ñặc ñiểm lâm sàng: nhiệt ñộ, huyết áp, tình trạng gan, tình trạng màu da, tình trạng màu mắt

- Các ñặc ñiểm cận lâm sàng:

+ Chỉ số men gan (Phụ lục 1)

+ Chỉ số huyết học (Phụ lục 2)

+ Nồng ñộ virus HBV trong máu (Phụ lục 3)

+ Kháng nguyên HBeAg và kháng thể anti HBeAg (Phụ lục 4)

2.3.5 Phương pháp xử lý thống kê

- Các số liệu ñược xử lý bằng phần mềm Excel

- Sử dụng thuật toán thống kê Y- sinh học - [ Nguyễn Văn Đức (2002), phương pháp kiểm tra thống kê sinh học , NXBKH và KT, tr 268]

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Xác ñịnh kiểu gen HBV bằng kỹ thuật sinh học phân tử

100 mẫu máu toàn phần thu nhận ñã có kết quả ñịnh tính (nhiễm virus HBV) và ñịnh lượng (nồng ñộ virus trong máu) Máu ñược hòa trong dung dịch chống ñông, giữ lạnh, chuyển về công ty Việt Á (Tp Hồ Chí Minh) DNA ñã ñược tách chiết bằng phương pháp tủa (Chomczynski & Sacchi, 1987) Hàm lượng và ñộ tinh sạch của mẫu DNA sau tách chiết ñều ñược kiểm tra trước khi thử nghiệm realtime PCR Các kết quả ñều cho thấy DNA ñạt hàm lượng ổn ñịnh, tỷ số OD ño ở bước sóng 260 và 280 ñều nằm trong khoảng 1.8-2.0 Điều

ñó chứng tỏ DNA của chúng tôi tách ñược là sạch, không nhiễm protein, RNA

và phenol

3.1.1 Sự phân bố kiểu gen

Qua tìm hiểu kiểu gen của virus gây viêm gan siêu vi B (HBV) trên 100 bệnh nhân nhiễm HBV, chúng tôi thu ñược tỷ lệ các kiểu gen của HBV ñược trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Tỷ lệ các kiểu gen của HBV trên bệnh nhân tỉnh Đắk Lắk

KIỂU GEN Số lượng

(n = 100) Tỷ lệ %

p

1 B 63 63 (1-2) < 0,001

(1-3) < 0,001 (2-3) > 0,05

Trong 100 mẫu khảo sát, chúng tôi ghi nhận có 63 mẫu nhiễm kiểu gen B,

21 mẫu nhiễm kiểu gen C và 16 mẫu nhiễm ñồng thời kiểu gen B và C

Dưới ñây là kết quả của một số mẫu ñiển hình:

Hình 3.1 Kết quả xác ñịnh kiểu gen bằng realtime PCR trên mẫu số 3

Đồ thị biểu thị ở hình 3.1 biễu diễn kết quả xác ñịnh kiểu gen trên mẫu số

3, mẫu nhiễm kiểu gen B, với tín hiệu huỳnh quang vượt trên tín hiệu nền trong trường hợp tube chứa mẫu dò ProbeB Đối với hai trường hợp mẫu dò Probe A

và Probe C, tín hiệu huỳnh quang thấp hơn tín hiệu nền: mẫu âm tính với các kiểu gen A và C

Hình 3.2 Kết quả xác ñịnh kiểu gen bằng realtime PCR trên mẫu số 11

Đồ thị biểu thị ở hình 3.2 biễu diễn kết quả xác ñịnh kiểu gen trên mẫu số

11, mẫu nhiễm kiểu gen C, với tín hiệu huỳnh quang vượt trên tín hiệu nền trong

trường hợp tube chứa mẫu dò Probe C Đối với hai trường hợp mẫu dò Probe A

và Probe B, tín hiệu huỳnh quang thấp hơn tín hiệu nền: mẫu âm tính với các kiểu gen A và B

Hình 3.3 Kết quả xác ñịnh kiểu gen bằng realtime PCR trên mẫu số 19

Đồ thị biểu thị ở hình 3.3 biểu diễn kết quả xác ñịnh kiểu gen trên mẫu số

19, mẫu ñồng nhiễm kiểu gen B và C, với tín hiệu huỳnh quang vượt trên tín hiệu nền trong trường hợp các tube chứa mẫu dò Probe B và Probe C Đối với tube chứa mẫu dò Probe A, tín hiệu huỳnh quang thấp hơn tín hiệu nền: mẫu âm tính với kiểu gen A

Như vậy, sự phân bố kiểu gen ñược phát hiện trong nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với nhận ñịnh ñã ñược rút ra từ các nghiên cứu trước ñây, ñó là kiểu gen B và C thường gặp ở các nước Đông nam Á, Nhật bản và các nước ở khu vực Thái bình dương (Đông Thị Hoài An và cộng sự, 2003) [1] Tỷ lệ phân

bố kiểu gen trong cỡ mẫu nghiên cứu của chúng tôi là 63% (kiểu gen B), 21% (kiểu gen C) và 16% (ñồng nhiễm kiểu gen B và C) Tỷ lệ này khá phù hợp với kết quả ghi nhận trong công bố của hầu hết các tác giả Bùi Hữu Hoàng (2002), Đông Thị Hoài An và cộng sự (2003), Lui C J và cộng sự (2002, Đài loan), ñó

là kiểu gen B thường chiếm tỷ lệ cao so với C So với một số nghiên cứu dịch tễ

về tình hình phân bố kiểu gen tại một số nước châu Á: tại Hồng Kông, Nhật Bản

và Đài Loan, tỷ lệ nhiễm kiểu gen B luôn cao hơn kiểu gen C (trích dẫn bởi Alfredo Alberti và cộng sự, 2003) [10], ghi nhận trong nghiên cứu của chúng tôi

là hoàn toàn phù hợp

Một ñiểm khác trong nghiên cứu của chúng tôi là tỷ lệ bệnh nhân ñồng nhiễm hai kiểu gen B và C xuất hiện tương ñối cao (16%) Theo tác giả Xin Ding và Hongxi Gu (2003), tỷ lệ nhiễm ñồng thời B và C trong một nghiên cứu dịch tễ ở Trung Quốc là 4,4% [43] Tuy chưa có một báo cáo nào về sự ñồng nhiễm ở trong nước ñể chúng tôi có thể so sánh, nhưng những ghi nhận ñầu tiên

về tình hình ñồng nhiễm này cũng thật ñáng lo ngại về khả năng lây truyền của virus do ñiều kiện vệ sinh an toàn, ý thức bảo vệ sức khỏe của người dân,… trong cộng ñồng Vì vậy nên ñược mở rộng nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn ñể từ

ñó có thể ñưa ra những thông cáo cảnh báo cho các nhà chuyên môn, chức trách

và người dân trong khu vực

3.1.2 Kiểu gen HBV phân bố theo nhóm tuổi

Kiểu gen HBV của những bệnh nhân nhiễm HBV phân bố theo nhóm tuổi ñược trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Tỷ lệ các kiểu gen của HBV phân bố theo nhóm tuổi

C

(n=21) 6 628,57 15 71,43 < 0,05 B+C

(n=16) 6 637,50 10 62,50 > 0,05

Các số liệu trên bảng 3.2 cho thấy: tỷ lệ kiểu gen B, kiểu gen C và kiểu gen B+C ở các ñối tượng có ñộ tuổi trên 25 ñều cao hơn so với các ñối tượng có