Nghiên cứu phương pháp nhân giống in vitro và in vivo giống hoa Loa kèn màu mói nhập nội

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề: Sản xuất hoa đang là một ngành rất phát triển, đem lại nguồn thu nhập đáng kể cho nền kinh tế quốc dân của nhiều nước trên thế giới như: Hà Lan, New Zealand, Canada, Nhật bản, Trung quốc... Ở nước ta, so với các sản phẩm nông nghiệp khác, hoa là mặt hàng mang lại nhiều lợi nhuận (Ước tính gấp 6 lần so với trồng lúa). Chính vì vậy, đây là một lĩnh vực đầy hứa hẹn đối với các nhà đầu tư. Trên thị trường hoa hiện nay, hoa lily hay còn gọi là Loa kèn màu là một trong những loại hoa được ưa thích nhất và chiếm thị phần xuất khẩu lớn trong ngành sản xuất hoa trên thế giới. Với kích thước lớn, màu sắc phong phú, mọc thành chùm lớn trông như những chiếc kèn Trumpet và đặc biệt là có mùi hương ngào ngạt, độ bền hoa cắt cao, chính vì vậy loại hoa này ngày càng được mọi người, mọi lứa tuổi đều ưa chuông. Loa kèn cũng thích họp ở nhiều nơi như: Trang trí trong nhà, lễ hội, mừng thọ, mừng sinh nhật... Với những người chơi hoa Việt Nam, từ trước chỉ biết đến loại hoa Loa kèn trắng, ít thơm nên đã bị thu hút ngay bởi màu sắc và nhất là hương thơm đặc biệt khó quên của các loại hoa Loa kèn màu, vì vậy nhu cầu tiêu thụ loại hoa này ngày càng tăng trên thị trường Việt Nam. Ngoài tiêu dùng trong nước, Loa kèn màu còn là một mặt hàng xuất khẩu quan trọng, có giá trị kinh tế cao. Tuy nhiên, hiện nay Loa kèn màu mới chỉ được trồng chủ yếu ở Đà Lạt với số lượng còn hạn chế, giá thành mỗi cành hoa lại cao (15.000 T 30.000 đ cành) nên chưa đáp ứng được nhu cầu đông đảo của người tiêu thụ. Ngoài ra do chưa đủ lượng giống cần thiết nên chúng ta vẫn phải nhập nội củ giống từ nước ngoài với giá thành cao. Một vân đề nữa là Loa kèn màu ở nước ta đến nay mỗi năm chỉ trồng được một vụ (Từ tháng 4 T tháng 7). Trong khi đó, thị trường hoa nội địa, những ngày thường, có khi cung lớn hơn cầu nhưng trong các ngày lễ (Tết nguyên đán, 8 3...) thì giá thành lại tăng vọt, thiếu các giống hoa đẹp. Chính vì vậy sản xuất được giống hoa Loa kèn màu chất lượng cao, giá thành rẻ và đặc biệt là điều khiển ra hoa trái vụ là mong ước của cả nhà sản xuất lãn tiêu thụ. Để giải quyết khâu giống, chúng ta đã có những nghiên cứu về nhân giống Loa kèn màu bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, phương pháp này có ưu điểm là có hệ số nhân giống cao. Tuy nhiên quy trình nhân nhanh Loa kèn trong in vitro đến nay vẫn chưa được nghiên cứu hoàn thiện và chưa tạo được củ giống thương mại. Chính vì vậy, nhằm hoàn thiện quy trình nhân nhanh in vitro đồng thời khắc phục những yếu tố hạn chế trong nhân giống góp phần chủ động củ giống Loa kèn màu trong nước, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu phương pháp nhân giống ỉn vỉtro và ỉn vỉvo giống hoa Loa kèn màu mói nhập nội” 1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài: 1.2.1. Mục đích của đề tài: Nghiên cứu phương pháp nhân giống hoa Loa kèn màu mới nhập nội trên cơ sở đó tiến tới hình thành quy trình nhân giống phục vụ sản xuất. 1.2.2. Yêu cầu của đề tài: Phần 1: Nghiên cứu các khâu chính trong

PHẦN 1

MỞ ĐẦU1.1 Đặt vấn đề:

Sản xuất hoa đang là một ngành rất phát triển, đem lại nguồn thu nhập đáng

kể cho nền kinh tế quốc dân của nhiều nước trên thế giới như: Hà Lan, NewZealand, Canada, Nhật bản, Trung quốc Ở nước ta, so với các sản phẩm nôngnghiệp khác, hoa là mặt hàng mang lại nhiều lợi nhuận (Ước tính gấp 6 lần so vớitrồng lúa) Chính vì vậy, đây là một lĩnh vực đầy hứa hẹn đối với các nhà đầu tư

Trên thị trường hoa hiện nay, hoa lily hay còn gọi là Loa kèn màu là mộttrong những loại hoa được ưa thích nhất và chiếm thị phần xuất khẩu lớn trongngành sản xuất hoa trên thế giới Với kích thước lớn, màu sắc phong phú, mọcthành chùm lớn trông như những chiếc kèn Trumpet và đặc biệt là có mùi hươngngào ngạt, độ bền hoa cắt cao, chính vì vậy loại hoa này ngày càng được mọi người,mọi lứa tuổi đều ưa chuông Loa kèn cũng thích họp ở nhiều nơi như: Trang trítrong nhà, lễ hội, mừng thọ, mừng sinh nhật

Với những người chơi hoa Việt Nam, từ trước chỉ biết đến loại hoa Loa kèntrắng, ít thơm nên đã bị thu hút ngay bởi màu sắc và nhất là hương thơm đặc biệtkhó quên của các loại hoa Loa kèn màu, vì vậy nhu cầu tiêu thụ loại hoa này ngàycàng tăng trên thị trường Việt Nam Ngoài tiêu dùng trong nước, Loa kèn màu còn

là một mặt hàng xuất khẩu quan trọng, có giá trị kinh tế cao Tuy nhiên, hiện nayLoa kèn màu mới chỉ được trồng chủ yếu ở Đà Lạt với số lượng còn hạn chế, giáthành mỗi cành hoa lại cao (15.000 -T- 30.000 đ/ cành) nên chưa đáp ứng được nhucầu đông đảo của người tiêu thụ Ngoài ra do chưa đủ lượng giống cần thiết nênchúng ta vẫn phải nhập nội củ giống từ nước ngoài với giá thành cao Một vân đềnữa là Loa kèn màu ở nước ta đến nay mỗi năm chỉ trồng được một vụ (Từ tháng 4 -T- tháng 7) Trong khi đó, thị trường hoa nội địa, những ngày thường, có khi cung

lớn hơn cầu nhưng trong các ngày lễ (Tết nguyên đán, 8/ 3 ) thì giá thành lại tăngvọt, thiếu các giống hoa đẹp Chính vì vậy sản xuất được giống hoa Loa kèn màuchất lượng cao, giá thành rẻ và đặc biệt là điều khiển ra hoa trái vụ là mong ước của

“Nghiên cứu phương pháp nhân giống ỉn vỉtro và ỉn vỉvo

giống hoa Loa kèn màu mói nhập nội”

1.2 Mục đích và yêu cầu của đề tài:

1.2.1 Mục đích của đề tài:

Nghiên cứu phương pháp nhân giống hoa Loa kèn màu mới nhập nội trên cơ

sở đó tiến tới hình thành quy trình nhân giống phục vụ sản xuất

1.2.2 Yêu cầu của đề tài:

* Phần 1: Nghiên cứu các khâu chính trong kĩ thuật nhân giống in vitro hoa

* Phần 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ thấp đến quá trình sinh trưởng

và tạo củ của các củ Loa kèn màu vừa cho thu hoạch

+ Xác định thời gian xử lý lạnh thích hợp cho quá trình phá ngủ củ Loa kèn màu

+ Nghiên cứu hiệu quả của việc nhân giống bằng củ con

+ Xác định tỷ lệ củ con thu được từ củ mẹ

PHẦN 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1 Tình hình sản xuất hoa Loa kèn màu trên thế giới và Việt Nam:

2.1.1 Tình hình sản xuất hoa Loa kèn màu trên thế giới:

Trên thế giới, đặc biệt là các nước châu Âu, hoa Loa kèn màu đã gắn liền vớicuộc sống của họ từ rất lâu đời Là loại hoa không thể thiếu trong bất cứ lễ hội lớnnhỏ nào, vì vậy nhu cầu sản xuất và tiêu thụ Loa kèn màu ngày càng tăng qua cácnăm, điển hình ở một số nước như: Hà Lan, Đức, Bỉ, Italia

Hà lan được coi là xứ sở của nghề trồng hoa, năm 1995, giá tri nhập khẩucủa thế giới là 6,8 tỷ USD, trong đó thị trường Hà Lan chiếm gần 50% Ở đây, câyLoa kèn được phát triển mạnh chỉ riêng nguồn cung cấp từ cây nuôi cấy mô tế bàođạt 8.020 triệu cây (Năm 1982 so với năm 1980 chỉ là 802 triệu cây, tăng gấp 10lần) [5] Còn diện tích trồng Loa kèn lấy củ tăng từ 100 ha năm 1966 đến khoảng5.000 ha năm 2001 và thu được khoảng 1.000 triệu củ Từ số lượng giống nói trên,hàng năm, nước này sản xuất hàng trăm triệu bông và củ giống phục vụ cho thịtrường rộng lớn gần 80 nước trên thế giới [13]

Ở Italia, trong 8.000 ha diện tích đất trồng trọt sinh lời 1,1 tỷ USD thì hoaLoa kèn là một trong những loài hoa kinh tế quan trọng bậc nhất chiếm 280 -T- 300

ha với tổng giá trị thu nhập 71 triệu USD/ năm Nước này mỗi năm chi khoảng 152triệu USD cho việc nhập củ hoa Loa kèn thô từ Phần Lan Gần đây để giảm chi phísản xuất giống, viện nghiên cứu ở Pesia đã tiến hành nghiên cứu và sản xuất củ Loakèn với qui mô lớn [11]

Ở châu Mỹ, bắc Mỹ cũng là một địa chỉ chuyên nghiên cứu về giống và sảnxuất hoa Loa kèn với kĩ thuật cao như: Tạo giống ra hoa sớm, tạo cây có sức chốngchịu, lai giữa các loài [20] Ở Canada sản lượng Loa kèn tăng đều qua từng năm,thể hiện qua bảng sau:

Châu Á, với điều kiện khí hậu đa dạng, chi phí lao động thấp và nguồn đấtđai dồi dào đã trở thành nơi quan trọng cho việc sản xuất hoa.

Ở Nhật, có 1.558 ha trồng các loại hoa có củ cho sản lượng hàng năm là33,047 triệu Yên Nhật trong đó diện tích trồng Loa kèn chiếm 508 ha cho sản lượnghàng năm khoảng 15,068 triệu Yên Nhật [5]

Trung Quốc, là trung tâm lớn của sự phân bố hoa Loa kèn, với xấp xỉ 46loài, chiếm gần 50% tổng số loài của thế giới Loa kèn có mặt ở khắp đất nước, đặcbiệt là Vân Nam, Tây Tạng Tứ Xuyên [17]

2.1.2 Tình hình sản xuất hoa Loa kèn màu ồ Việt Nam:

Ở nước ta, hoa Loa kèn màu đang được xem là một trong bốn loại hoa quantrọng đang được nghiên cứu nhằm đưa loại hoa này thành mặt hàng xuất khẩu mũinhọn của ngành trồng hoa Việt Nam trong tương lai Hiện nay loại hoa này mới chỉđược trồng tập trung chủ yếu ở Đà Lạt, Sapa và một số vùng hoa ven Hà Nội vớidiện tích trồng nhỏ (Khoảng 80 ha) Như vậy với diện tích trồng còn nhỏ, hẹp,lượng hoa Loa kèn màu sản xuất ra trong một năm (Vài triệu cành hoa cắt) sẽ khôngđáp ứng được nhu cầu tiêu thụ ngày càng tăng của thị trường Do đó, chúng ta phảiđầu tư mở rộng quy mô sản xuất là biện pháp cần thiết phải giải quyết trước mắt,đồng thời về lâu dài, phải tập trung nghiên cứu nhân giống trong nước để giảm chiphí nhập nội củ giống từ nước ngoài Nếu làm được như vậy, hoa Loa kèn màu sẽđem lại một nguồn thu đáng kể cho ngành trồng hoa Việt Nam

Năm Loạihoa^\

2.2 Giới thiệu chung về cây Loa kèn màu:

Cây Loa kèn tên khoa học là Lilium longiflorum hybrids, thuộc nhóm một lá mầm {Monocotyendones), phân lớp hành (Lỉlỉdae), bộ hành {Liliales), họ hành

{Liliaceae), chi Lilium (Dương Đức Tiến, Võ Văn Chi, 1978) [1].

Hiện nay Loa kèn có khoảng hơn 100 loài khác nhau, ngoài ra còn chưa kểđến những giống lai rất đa dạng và phong phú về màu sắc, chủng loại

Cây hoa Loa kèn là cây thân thảo, sống lâu năm nhờ rễ củ dạng hành mập,ngoài có lớp vẩy bao bọc Thân tròn, cứng, mập, mọc thẳng đứng trên củ Lá mọcdày đặc trên thân, tập trung nhiều ở gốc Lá đơn, màu xanh bóng, hơi thẳng, thuôn

và mềm Hoa lưỡng tính, kích thước hoa lớn, mọc ở nách lá hoặc ở ngọn, có nhiềumàu sắc khác nhau tuỳ từng giống: trắng, đỏ, vàng, tím- đỏ, trắng - đỏ, da cam,vàng có đốm đen Các cánh hoa lớn giống nhau làm thành một ống dài, loe rộng ởđỉnh, thuỳ hoa lớn, uốn cong ra Hoa có thể mọc riêng rẽ hoặc thành cụm Bao hoa

có sáu mảng dạng cánh, sáu nhị, bao phấn dài màu vàng, bầu hình trụ, đầu nhuỵ có

ba thuỳ Quả nang có nhiều hạt Hiện nay có các loài Loa kèn màu trồng phổ biếnnhư:

+ Lỉlỉum longiflorum (Easter Lily): Là loài rất phổ biến, chủ yếu được trồng

nhiều để sản xuất hoa cắt; Loài này có nguồn gốc từ Nhật Bản, hoa to, dạng phễu,

có màu trắng tinh khiết, mùi hương dịu mát, cao khoảng 50 4- 90cm, ra hoa sớm

+ L.pardalinum: Có nguồn gốc từ Califocrnia (Mỹ), thường được gọi là hoa

Lily đốm do hoa có màu cam và những đốm nâu sẫm, hoa khi nở rủ xuống và đungđưa trước gió trông giống như những chiếc đèn lồng đẹp một cách kỳ lạ; Thân caokhoảng 150 “ĩ” 200 cm, thường được dùng để lai tạo các giống Lily mới

+ L.regale: Nguồn gốc từ Trung Quốc, hoa màu trắng, nở vào khoảng giữa

mùa hè, có hương thơm ngọt ngào

+ L.Tigrinum (Tiger Lily): Đến từ Trung Quốc, hoa dạng phễu, cánh uốn

cong, màu vàng nhạt, có sọc tía (Đen), nhị nhỏ, thân củ màu đen Ngoài ra hoa còn

có các màu như đỏ sẫm, hổng - da cam, đỏ nhạt.

+ L.Hansonỉỉ (Yellow Martagon Lily hay Japanese Turk’s - cap): Có nguồn

gốc từ Hàn Quốc và Siberia; Có từ 6 đến 10 hoa, màu vàng với những chấm màutối, hoa xuất hiện vào tháng 6, thân cây cao khoảng 100 4- 125 cm; Là loài đượcdùng phổ biến trong công tác lai tạo giống (Hansonii hybrids và Backhousehybrids)

+ LDavidii: Từ Trung Quốc, hoa màu đỏ vàng, cánh hoa uốn cong.

+ LAmabỉle: Hoa màu vàng da cam, với những đốm đen.

Ở Việt Nam, ngoài giống hoa Loa kèn trắng được trồng phổ biến nhất, thì

mới chỉ tìm ra 2 loài khác là cây hoa bách hợp (L.Brownii F.E Brown waroldiesterri wils) mọc hoang dại trên núi đá ở Lạng Sơn, Cao Bằng và loài L.Poilaneỉ Gagnep

có ở đồi cỏ Sapa - Hoàng Liên Sơn

2.3 Các phương pháp nhân giống Loa kèn màu:

2.3.1 Kỹ thuật nhân giống ngoài đồng ruộng (ỉn vivo):

cả bệnh virus do sử dụng thế hệ củ qua nhiều năm

23.1.2 Nhân giống bằng vẩy củ:

Từ củ hoa Loa kèn dạng vảy hành, ta tách các vảy củ sau đó đem trồng đểtạo củ giống Sau khoảng 2 tháng trồng, trên các vảy củ sẽ xuất hiện các chồi vàdạng củ nhỏ Ta tiếp tục trồng nuôi các củ con này trong 2 4- 3 vụ sẽ thu được củ

Loa kèn trưởng thành có khả năng cho năng suất [19].

Đây là phương pháp nhân giống mới, tuy vẫn còn tồn tại hiện tượng lây lanbệnh nhưng hệ số nhân giống cao hơn Phương pháp này được đánh giá là có triểnvọng trong sản xuất, vì vậy, việc khắc phục sự lây lan bệnh và rút ngắn thời giannuôi củ là rất cần thiết

2.3.13 Nhân giống bằng củ con phát sinh trên thân cây mẹ:

Trên thân cây hoa Loa kèn, sau khi đã thu hoạch một thời gian, ở vị trí gầngốc và đỉnh ngọn phát sinh ra những củ Loa kèn con Có thể tách những củ con nàyđem trồng nuôi cho củ lớn nhằm tạo được củ trưởng thành có khả năng cho năngsuất đồng thời làm tăng số lượng củ giống

Đây là phương pháp nhân giống Loa kèn mới, còn rất ít những nghiên cứu

về biện pháp này

23.1.4 Cơ sở sinh lý sự hình thành, sự ngủ nghỉ của củ và căn hành [9]:

Củ và căn hành là những cơ quan chứa nhiều chất dự trữ gluxit và lipit ởphần thân phình ra dưới mặt đất (Củ khoai tây), hoặc rễ (Củ cải) hoặc phần gốccuống lá (Củ hành, tỏi ) Củ sinh trưởng bằng sự phân chia và dãn của tế bào đổngthời có sự tích luỹ mạnh mẽ các hợp chất gluxit và tinh bột Trong khi đó căn hànhđược tạo nên do kết quả của việc tập trung gluxit ở phần gốc cuống lá non, đồngthời sự phân chia của mô phân sinh ngọn ngừng và sự sinh trưởng của căn hànhbằng sự dãn của tế bào ở gốc cuống lá

Sự hình thành củ và căn hành cũng là những quá trình có tính chất tươngquan sinh trưởng Hệ thống rễ phát triển có ảnh hưởng ức chế sự hình thành củ,trong khi đó các lá trưởng thành, nơi sản sinh nhiều tác nhân ức chế, lại kích thích

sản, khi các cơ quan dinh dưỡng ngừng hẳn sinh trưởng, các cơ quan sinh sản và dựtrữ hình thành mạnh mẽ.

Sự hình thành củ và căn hành được điều chỉnh bằng sự cân bằng hormontrong cơ thể Auxin kích thích sự hình thành rễ, ức chế sự hình thành củ và cănhành Gibberellin kích thích sự sinh trưởng của tia củ nhưng ức chế sự hình thành

củ và căn hành Axit absxixic là chất ức chế sinh trưởng của chồi và rễ, được hìnhthành trong lá, ức chế sự sinh trưởng của tia củ và kích thích sự phình to của củ.Cytokinin là chất cảm ứng hình thành chồi, hình thành trong rễ và kích thích sựhình thành tia củ và sự phình to của củ

Sự hình thành củ và căn hành được điều chỉnh bằng sự cân bằng hormontrong cây Sự cân bằng quan trọng nhất là sự cân bằng giữa Gibberillin (GA3) vàAxit absxixic (ABA)

Củ và căn hành sau khi thu hoạch bước và một thời kỳ ngủ nghỉ sinh lý.Trong thời gian ngủ nghỉ thì giảm sút một cách đáng kể cường độ trao đổi chất, hoạtđộng sinh lý, sinh hoá dẫn đến cây ngừng sinh trưởng Sự ngủ nghỉ được xem làmột đặc tính của loài

Nguyên nhân của sự ngủ nghỉ là do tích luỹ một lượng lớn các chất ức chếsinh trưởng như: Axit Absxixic, các hợp chất Phênol Trong khi đó làm giảm hàmlượng các chất kích thích sinh trưởng như: Auxin, Gibberellin, Cytokinin, làm chocân bằng hormon (Chủ yếu là ABA/ GA3 ) lệch về phía tích luỹ nhiều ABA

Người ta có thể phá ngủ củ và căn hành dựa trên nguyên tắc dùng các tácnhân lý, hoá như: Nhiệt độ thấp, thay đổi thời gian chiếu sáng, bổ sung chất kíchthích sinh trưởng (GA3) để cân bằng dịch chuyển về phía tích luỹ nhiều GA3

Năm 1994, bộ môn sinh lý thực vật, Đại học Nông nghiệp I - Hà Nội đãthành công với nghiên cứu phá ngủ củ Loa kèn trắng bằng xử lý lạnh kết hợp vớiphun GA3 đã điều khiển được cây Loa kèn ra hoa trái vụ [5]

2.3.2 Kỹ thuật nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào (ỉn virto) [10]:

2.3.2.1 Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống in vỉtro:

Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào là một phương pháp mới, hiện đại và

đã được áp dụng trên nhiều đối tượng khác nhau trong đó có cây hoa Loa kèn, quytrình nhân giống chung gồm các giai đoạn sau:

+ Giai đoạn chuẩn bị:

Nhằm tạo ra cây giống tốt, bước đầu tiên rất quan trọng là phải chọn cây mẹkhoẻ, sạch bệnh, có đủ những đặc tính mà ta quan tâm Trên cây mẹ, có thể sử dụngnhiều cơ quan, bộ phận khác nhau làm mô nuôi cấy như: Đỉnh chồi, mắt ngủ, mô lánon, vẩy củ, bao phấn

+ Giai đoạn 2: Khử trùng mô nuôi cấy

Do mô nuôi cấy đưa từ ngoài vào có chứa rất nhiều vi sinh vật Vì vậy cầnkhử trùng mô nuôi cấy trước khi đưa vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo nhằm tạo

ra nguyên liệu thực vật vô trùng có tỷ lệ nhiễm vi sinh vật thấp, tỷ lệ mẫu sống sinhtrưởng tốt và cao Giai đoạn này phụ thuộc vào hai nhân tố là thời gian khử trùng vànồng độ chất khử trùng

Các hoá chất thường được sử dụng để khử trùng là HgCl2 0,1% từ 5 đến 10phút, Ca(OCl)2 5 + 7% từ 15 đến 20 phút, NaClO 1% từ 15 + 20 phút

+ Giai đoạn 3: Nuôi cấy khởi động

Ở giai đoạn này mô nuôi cấy sau khi được khử trùng được chuyển vào môitrường thích hợp về tỷ lệ và hàm lượng các chất điều tiết sinh trưởng để kích thíchmẫu cấy hình thành chồi bất định, các phôi vô tính hay kích thích các chồi nách,mắt ngủ bật mầm

+ Giai đoạn 4: Nhân nhanh

Là giai đoạn quan trọng của quá trình nhân giống in vitro vì giai đoạn nàyxác định hệ số nhân của quá trình nhân giống in vitro Môi trường nuôi cấy nhân tạo

có các chất điều tiết sinh trưởng như: Auxin, Cytokinin, đồng thời phải chú ý đảmbảo những điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, quang chu kỳ

+ Giai đoạn 5: Tạo cây hoàn chỉnh

Là giai đoạn chuyển những chồi đã hình thành trong giai đoạn nhân nhanhsang môi trường tạo rễ để hình thành cây có đủ rễ, thân, lá, đủ tiêu chuẩn là câygiống Môi trường tạo rễ thường bổ xung auxin để kích thích hình thành rễ

+ Giai đoạn 6: Đưa cây in vitro ra đất

Đây là bước quyết định để đánh giá thực tiễn của quy trình nhân giống invitro Nên các loại giá thể trồng cây in vitro phải đảm bảo độ sạch vi khuẩn, xốp vàthoáng khí giúp cây con đạt tỷ lệ sống cao

Phương pháp nuôi cấy mô tế bào có một số ưu điểm đó là có hệ số nhângiống rất cao, nhân nhanh được các giống cây sạch bệnh, đa dạng hoá nguồn gen,đáp ứng được nhu cầu thưởng thức của người tiêu dùng

2.3.22 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giôhg:

* Môi trường nuôi cấy:

Là yếu tố quyết định cho sự sinh trưởng, phát triển của mô trong nuôi cấy.Môi trường nuôi cấy bao gồm một số thành phần cơ bản sau:

+ Các nguyên tố đa lượng: Gồm N, p, K, s, Mg, Ca Chúng có chức năng là

nguyên liệu để xây dựng nên các thành phần cấu trúc của mô tế bào và mô thực vật.Hàm lượng của các nguyên tố đa lượng phải > 30 mg/1 mặc dù tỷ lệ giữa cácnguyên tố này có thể biến đổi

+ Các nguyên tố khoáng vi lượng: Bao gồm Fe, Bo, Mn, I, Mo, Cu, Zn.Chúng tham gia vào thành phần của các enzim xúc tác cho phản ứng hoá sinh diễn

ra trong tế bào

Hàm lượng các yếu tố vi lượng thường < 30 mg/1

+ Nguồn cacbon hữu cơ: Trong nuôi cấy mô, cây sinh trưởng, phát triểnđược nhờ sự kết hợp cả 2 phương thức: Dị dưỡng và tự dưỡng Chính vì vậy, bổxung nguồn cacbon hữu cơ vào môi trường là cần thiết Nguồn cacbon hữu cơthường sử dụng là đường saccaroza 2 -T- 3%

+ Các vitamin: Các mô tế bào khi nuôi cấy in vitro vẫn có khả năng tổng hợpvitamin nhưng lượng đó không đủ để cung cấp cho hoạt động sống của cây do đóphải bổ xung các vitamin vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng thích hợp.Thường bổ xung các vitamin nhóm B như: Bl, B2, B3, B5, B6.

+ Các chất điều tiết sinh trưởng thực vật: Là các chất đảm bảo cho việc điềukhiển sự phân hoá và phản phân hoá trong nuôi cấy in vitro, thường sử dụng 2nhóm Auxin và Cytokinin

+ Các hợp chất tự nhiên như nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch nghiền củakhoai tây, chuối được bổ xung vào môi trường nhằm làm tăng cường thêm các axitamin, vitamin cũng như nhiều yếu tố dinh dưỡng khác

+ Agar: Là chất làm đông cứng môi trường tạo điều kiện cho mẫu cấy sinhtrưởng, phát triển tốt

+ PH môi trường: PH thích hợp cho phần lớn các mô nuôi cấy là 5,5 - 5,8

2.3.23 Cơ sở sinh lý của các biện pháp nhân giống ỉn vitro:

Là tính toàn năng của tế bào thực vật thể hiện qua quá trình phân hoá vàphản phân hoá tế bào Mỗi tế bào của bất kì sinh vật nào cũng đều mang toàn bộlượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của sinh vật đó Khi gặp điều kiện thíchhọp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh gọi là tính toànnăng của tế bào

Sự phân hoá tế bào là sự chuyển từ các tế bào phôi sinh thành các tế bào của

mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau

Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hoá

Sự phản phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào chuyên hoá trở lại dạng tếbào phôi sinh

Phân hoá tế bào

Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hoá

Phản phân hoá tế bào

Tính toàn năng của tế bào được thể hiện qua quá trình phân hoá và phảnphân hoá tế bào trong những điều kiện nhất định Trong môi trường nuôi cấy mô, sựphối họp hàm lượng và tỷ lệ của các chất điều tiết sinh trưởng thuộc 2 nhóm Auxin

và Cytokinin có tác dụng điều chỉnh quá trình phân hoá và phản phân hoá của mônuôi cấy

2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước:

2.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước:

Năm 1969, Gauthret nghiên cứu hàm lượng dinh dưỡng muối khoáng có vaitrò trong sự sinh trưởng và phân chia tế bào khi nuôi cấy mô hoa Loa kèn

Năm 1980, Van Aartriík và Blom, đã tìm ra môi trường thích hợp cho nuôicấy Loa kèn là môi trường MS có hàm lượng muối khoáng giảm một nửa sẽ chokhả năng tái sinh chồi cao

Khi nghiên cứu nguồn vật liệu nuôi cấy ban đầu Robb (1957) và Allen(1974) đã chỉ ra bộ phận nuôi cấy thích hợp nhất với cây Loa kèn là vẩy củ Khinuôi cấy vẩy củ đã rút ngắn thời gian tái sinh chồi và tỷ lệ tái sinh chồi luôn cao hơncác bộ phận khác

Năm 1993, Stanilova M và Zagorska (Bungari) cũng khẳng định vẩy củ lànguyên liệu tốt nhất cho việc tái sinh chồi từ mô nuôi cấy trên môi trường Skoog có

bổ xung 0,5 mg aNAA/1 và 0,1 mg Kinetin/1, tạo ra các cây giống đồng đều về chấtlượng

Năm 1981, Van và Blom đã xác định được vai trò của aNAA trong sự táisinh chồi Ngoài ra còn có BA cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển củachồi

Năm 2000, J Suh và J Lee đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và chất

lượng ánh sáng đến sự hình thành củ Loa kèn con và cho thấy ở nhiệt độ 20 -T- 25°c,

số lượng, khối lượng và đường kính của củ con tăng hơn so với ở nhiệt độ 30°c, số lượng củ con cũng cao hơn khi ở dưới ánh sáng đỏ [15].

Các nghiên cứu về sự xuân hoá củ bằng nhiệt độ thấp cũng được J Lee,Young A.Kim tiến hành và xác định được thời gian xử lý lạnh từ 4 tuần trở lên ở

5°c thì các củ nảy chồi và ra hoa sớm hơn, số lượng hoa cũng tăng lên [16].

2.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước:

Ở nước ta hiện nay, những nghiên cứu về nhân giống hoa Loa kèn trắngtrong nước hay một số giống Loa kèn màu mới nhập nội chỉ mới tập trung vào biệnpháp nhân giống in vitro chứ chưa tập trung đến các biện pháp nhân giống in vivo,

vì vậy có rất ít nghiên cứu về biện pháp này Nhân giống ngoài đồng ruộng in vivochỉ được nhắc đến như là biện pháp nhân giống cổ truyền trong một số tài liệu giớithiệu về kĩ thuật trồng và chăm sóc hoa - cây cảnh trong đó có cây hoa Loa kèn [5]

Năm 1993, Mai Xuân Lương và cộng sự đã thăm dò quy trình nhân giốngcây hoa Loa kèn trên môi trường đa lượng với các mức dinh dưỡng khác nhau như

MS, White, Knop cho thấy tốt nhất vẫn là môi trường MS và bổ sung các nguyên tố

vi lượng (Theo Heller), vitamin (Theo Morel), lOOmg inositol/1, 20g đườngsaccaroza và 15g Agar/1 [4],

Năm 1994, Dương Tấn Nhựt đã công bố kết quả nghiên cứu giống hoa Loakèn bằng phương pháp nuôi cấy vẩy củ vẩy củ được khử trùng bằng HgCl2 0,2%trong 5 phút, sau đó cấy lên môi trường MS có bổ sung các thành phần vitamin,chất hữu cơ và saccaroza Sau khi tạo được cây con, có thể tiếp tục nhân bằng cáchtách các vẩy củ đã được tạo thành đem cấy trên môi trường nhân [6]

Năm 1996, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Nhẫn, Nguyễn Phương Thảo

đã nghiên cứu sử dụng phương pháp nuôi cấy in vitro trên giống hoa Loa kèn tímmới nhập nội từ Pháp và đưa ra quy trình nhân giống kể từ khi đưa mẫu vào cho đếnkhi sản xuất ra củ giống [7]

Năm 2001, Dương Tấn Nhựt và cộng sự nghiên cứu nhân giống hoa Huệ tây

sạch bệnh qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Đỉnh sinh trưởng được tách từ chồi đỉnhcủa củ Loa kèn, được khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 7 phút sau đó cấy vào môitrường 1/2 MS Sau khi tạo được cây hoàn chỉnh có thân chính phân đốt, tiến hànhcắt thân chính thành nhiều đốt nhỏ để tiến hành nhân nhanh.

Cũng trong năm 2001, Nguyễn Thị Nhẫn và Nguyễn Quang Thạch đã thànhcông trong nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật tạo củ in vitro trong công tác nhân giốngcây hoa Loa kèn [8]

PHẦN 3

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DƯNG YÀ

3.1 Đối tượng nghiên cứu:

+ Hai giống Loa kèn màu nhập nội từ Trung Quốc có màu tím - đỏ và màu vàng

+ Nguyên liệu nuôi cấy ban đầu: vẩy củ loa kèn màu

+ Nguyên liệu cho thí nghiệm tạo củ: Cây con được tái sinh từ vật liệu nuôi cấy ban đầu

+ Nguyên liệu cho thí nghiệm ngoài vườn: Các cây có đủ số lá và số rễ trungbình trên cây

+ Nguyên liệu cho thí nghiệm phá ngủ: Các củ vừa cho thu hoạch hoa.+ Nguyên liệu cho thí nghiệm nhân giống từ củ mẹ: Những cây đã cho hoa nhưng vẫn tiếp tục trồng để hình thành củ con

+ Nguyên liệu cho thí nghiệm nhân giống bằng củ con: Những củ con được hình thành từ củ mẹ

Hình 1 : Lilium longiflorum X Aziatsche Gr “Centurion ”

Hình 2 : Lilỉum Oriental “Sta Gazer ”

3.2 Nội dung nghiên cứu:

3.2.1 Nhân giống in vitro:

3.2.1.1 Thí nghiệm khử trùng: Gồm 3 công thức về thời gian khử trùng.

CT1: Khử trùng mẫu trong 5 phút bằng HgCl2 0,1%

CT2: Khử trùng mẫu trong 7 phút bằng HgCl2 0,1%

CT3: Khử trùng mẫu trong 10 phút bằng HgQ2 0,1%

3.2.1.2 Thí nghiệm tái sinh mẫu: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh

trưởng đến khả năng tái sinh chồi của vảy củ

+ Thí nghiêm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của aNAA đến khả năng tái sinh của

mô nuôi cấy

CT1: MS (ĐC)CT2: MS + 0,1 ppm aNAACT3: MS + 0,3ppm aNAACT4: MS + 0,5ppm aNAA+ Thí nghiêm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng tái sinh của

mô nuôi cấy

CT1: MS (ĐC)CT2: MS + 0,5 ppm BACT3: MS + 1 ppm BACT4: MS + 2 ppm BACT5: MS + 3 ppm BACT6: MS + 4 ppm BA

+ Thí nghiêm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của sự tổ hợp BA và aNAA đến

khả năng tái sinh của mô nuôi cấy

CT1: MS (ĐC)CT2: MS + 0,3ppm aNAA + 0,5 ppm BACT3: MS + 0,3ppm aNAA + 1 ppm BA CT4: MS +

0,3ppm aNAA + 2 ppm BA CT5: MS + 0,3ppm aNAA +

3 ppm BA CT6: MS + 0,3ppm aNAA + 4 ppm BA

3.2.13 Thí nghiệm nhân nhanh:

+ Thí nghiêm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến sinh trưởng phát triển

và tốc độ nhân chồi của mẫu cấy

CT1: MS (ĐC)CT2: MS + 1 ppm BACT3: MS + 2 ppm BACT4: MS + 3 ppm BACT5: MS + 4 ppm BACT6: MS + 5 ppm BACT7: MS + 7 ppm BA+ Thí nghiêm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến sinh trưởng, phát triển và tốc độ nhân chồi của mẫu cấy

CT1: MS (ĐC)CT2: MS + 0,5ppm K CT3: MS + 1 ppm K CT4: MS + 2 ppm K CT5: MS + 3 ppm KCT1: MS (ĐC)

+ Thí nghiêm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và aNAA đến

sinh trưởng, phát triển và tốc độ nhân chồi của mẫu cấy

CT2: MS + 0,3ppm aNAA + 1 ppm BACT3: MS + 0,3ppm aNAA + 2 ppm BACT4: MS + 0,3ppm aNAA + 3 ppm BACT5: MS + 0,3ppm aNAA + 4 ppm BACT6: MS + 0,3ppm aNAA + 5 ppm BACT7: MS + 0,3ppm aNAA + 7 ppm BA

3.2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ thấp đến sự ngủ nghỉ và khả năng hình thành củ con từ củ mẹ vừa cho thu hoạch:

CT1: trồng củ mẹ không qua xử lý lạnh (ĐC)CT2: trồng củ mẹ qua xử lý lạnh 5 tuầnCT3: trồng củ mẹ qua xử lý lạnh 6 tuần CT4:

trồng củ mẹ qua xử lý lạnh 7 tuần CT5: trồng củ

mẹ qua xử lý lạnh 8 tuần Nhiệt độ xử lý lạnh là

4°c.

3.2.2.2 Nghiên cứu khả năng tăng trưởng của củ nhỏ (thu từ củ mẹ khi trồng):

- Trồng trong hai loại giá thể: Trấu hun và đất

- Gồm 2 CT:

CT1: trồng trong điều kiện bình thường (ĐC)

CT2: trồng trong điều kiện nhà khí hậu (18 -ỉ- 22°C)

3.3 Phương pháp nghiên cứu:

3.3.1 Cách bố trí thí nghiệm:

- Các thí nghiệm trên đều được bố trí 3 lần lặp lại

+ Với phần nuôi cấy in vitro: Mỗi lần nhắc lại gồm 3 ống nghiệm

+ Với phần nghiên cứu phá ngủ và tạo củ: Mỗi lần nhắc lại trung bình gồm

15 củ

3.3.2 Các chỉ tiêu theo dõi và cách đo đếm:

1 mẫu sạch

* Tỷ lệ mẫu sạch (%) = -X 100%

1 mẫu đưa vào

1 mẫu sạch tái sinh chồi

* Tỷ lệ tái sinh (%) = - X 100%

1 mẫu đưa vào

1 mẫu nhiễm

* Tỷ lệ mẫu nhiễm (khuẩn và nấm) = - X 100%

1 mẫu đưa vào

* Chiều cao trung bình (cm)

= -1 số cây theo dõi

* Tỷ lệ sống của cây nuôi cấy sau mỗi tuần: Theo dõi tỷ lệ sống của cây nuôi

cấy sau mỗi tuần khi đưa ra vườn ươm.

* Theo dõi thời gian xuất hiện lá mới của cây con

2 số củ con thu được

* Tỷ lệ củ con thu được từ củ mẹ (%) = - X 100

2 số củ mẹ theo dõi

2 trọng lượng của củ con

* Trọng lượng trung bình của củ con (g) =

PHẦN 4

4.1 Nhân giống in vitro:

4.1.1 Tạo nguồn nguyên liệu ban đầu:

4.1.1.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ mẫu sạch thu được:

Đây là giai đoạn chuyển mẫu nuôi cấy từ bên ngoài (Vô số vi sinh vật) vàođiều kiện nuôi cấy in vitro (Vô trùng) Vì vậy đối với tất cả các loại mẫu nuôi cấykhác nhau việc xác định phương pháp khử trùng thích hợp có ý nghĩa quyết địnhđến sự thành bại của quá trình nhân in vitro

Trong quá trình khử trùng, loại chất, nồng độ, thời gian khử trùng đều ảnhhưởng lớn đến tỷ lệ mẫu sạch, mẫu nhiễm nấm, khuẩn hay mẫu chết Nồng độ, thờigian khử trùng lớn quá hay nhỏ quá đều ảnh hưởng đến sự tái sinh mẫu trong quátrình nhân in vitro

Với nguồn mẫu là vẩy củ, chúng tôi chọn HgCl2 là chất khử trùng, chất này

có khả năng thấm sâu vào bên trong mẫu cấy Nồng độ HgCl2 là 0,1% ở 3 ngưỡngthời gian 5 phút, 7 phút và 10 phút, kết quả thu được trình bày ở bảng 1

Bảng 1: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng mẫu nuôi cấy bằng

HgCl 2 0,1% (Sau 2 tuần nuôi cấy) tới kết quả khử trùng

CT Thời gian khử

trùng (phút) Tỷ lệ mẫu sach(%)

Tỷ lệmẫu nhiễm(%)

Tỷ lệ mẫuchết(%)