báo cáo thực tập hóa sinh học tinh sạch và xác định hoạt tính enzyme amylase tái tổ hợp

- Định hoạt tính enzyme và hàm lượng protein của dịch enzyme ban đầu trước tủa.. Xác định hoạt tính enzyme và hàm lượng protein của dịch enzyme sau tủa.. Tinh sạch Amylase tái tổ hợp bằn

HỨA TRƯỜNG CHINH - MSHV: 20C61005

TỪ KHỞI THÀNH - MSHV: 20C61012

TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME

AMYLASE TÁI TỔ HỢP

BÁO CÁO THỰC TẬP HÓA SINH HỌC

Ngành: Hóa sinh học

Mã số ngành: 8420116

GVHD: TS Trần Quốc Tuấn

TP Hồ Chí Minh – Năm 2021

2

1 Tiến hành thí nghiệm

enzyme ngoại bào bỏ sinh khối tế bào

- Dịch sau ly tâm lấy 50ml tủa muối và 50ml tủa dung môi hữu cơ

- Định hoạt tính enzyme và hàm lượng protein của dịch enzyme ban đầu (trước tủa)

- 2 mẫu tủa sẽ ly tâm, thu tủa và hòa thành 10ml (dịch enzyme sau tủa) Xác định hoạt tính

enzyme và hàm lượng protein của dịch enzyme sau tủa

- Lấy mẫu tủa thích hợp tiếp tục tinh sạch bằng sắc ký ái lực

2 Tinh sạch Amylase tái tổ hợp bằng sắc kí ái lực Ni 2+ -NTA agarose Tiến hành thí nghiệm

Chuẩn bị cột

- Nhồi 1 lớp bông thủy tinh có độ dày khoảng 2 mm vào ống tiêm 3 ml (Lưu ý: bề mặt

lớp bông bằng phẳng)

- Đặt một lớp giấy lọc lên cột

- Cố định cột lên giá đỡ và nối dây truyền dịch với cột

- Rửa cột với 1 ml đệm chiết tách, lặp lại 3 lần

Cân bằng Ni 2+ -NTA agarose

loại bỏ dịch nổi, thu nhận tủa, bước này được thực hiện 3 lần

Tinh sạch protein

(FT – flow-through), để ổn định cột trong 10 phút

giải Xác định hoạt tính và hàm lượng protein trong dịch rửa

- Thôi giải protein mục tiêu với 1 ml đệm thôi giải, lặp lại 5 lần Thu nhận các phân đoạn

protein thôi giải và bảo quản ở nhiệt độ lạnh Xác định hoạt tính và hàm lượng protein trong các phân đoạn

4

3 Kết quả

Từ kết quả thu nhận được, ta nhận thấy ở nồng độ 0 µg/ml protein vẫn ghi nhận được giá trị OD, điều này không đúng với lý thuyết Nên giá trị OD ở nồng độ 0 µg/ml protein sẽ được hiệu chỉnh về 0, và giá trị OD ở các nồng độ khác cũng được hiệu chỉnh tương ứng (giá trị OD1, OD2 được trừ cho 0.075 ở các nồng độ khảo sát; giá trị OD3 được trừ cho 0.076 ở các nồng độ khảo sát) Từ đó tính toán ∆OD giữa 3 lần lập lại, ta được kết quả như bảng sau:

Xây dựng đường chuẩn protein

OD2

0.075 0.087 0.097 0.107 0.119 0.126

Đường chuẩn Bradford

Tương tự như trên, từ các giá trị OD ghi nhận được, ta nhận thấy ở nồng độ 0 µg/ml tinh bột vẫn ghi nhận được giá trị OD, điều này không đúng với lý thuyết Nên giá trị OD ở nồng độ 0 µg/ml tinh bột sẽ được hiệu chỉnh về 0, và giá trị OD ở các nồng độ khác cũng được hiệu chỉnh tương ứng (giá trị OD1, OD2, OD3 được trừ cho các giá trị tương ứng là 0.053, 0.054 và 0.055 ở các nồng độ khảo sát) Từ đó tính toán ∆OD giữa 3 lần lập lại, ta được kết quả như bảng sau:

Xây dựng đường chuẩn tinh bột

Đường chuẩn tinh bột

6

Nồng độ protein

Dựa vào phương trình đường chuẩn của protein: y = 0.001x + 0.0008 (phương trình 1) với

❖ Protein trong dịch nuôi cấy (enzyme thô trước tủa)

Cách tính: Giá trị OD tương ứng với hệ số y trong phương trình 1 Từ đó ta suy ra được giá trị x tương ứng với nồng độ protein có trong mẫu thử Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, nên nồng độ protein có trong mẫu thử tương đương với giá trị trung bình của 3 lần lặp lại trên + Với OD = 0.118 ➔ x = 117.2 µg/ml

+ Với OD = 0.120 ➔ x = 119.2 µg/ml + Với OD = 0.121 ➔ x = 120.2 µg/ml

Vì mẫu được pha loãng 20 lần trước khi đo OD, nên [protein] = 𝑥̅ × 20 = 2377.4 µg/ml =

237.34 mg

❖ Protein sau tủa cồn

Cách tính nồng độ protein của dịch enzyme sau tủa cồn tương tự như phần dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 1 ta được:

Vì mẫu được pha loãng 100 lần trước khi đo OD, nên nồng độ protein thực sự có trong 1 ml

Dịch

Enzyme thô trước tủa Enzyme tủa cồn Enzyme tủa muối

0.118 0.12 0.121 0.118 0.112 0.111 0.108 0.11 0.106

OD 595nm

Pha loãng 20 lần đo protein Pha loãng 100 lần đo protein Pha loãng 100 lần đo protein

❖ Protein sau tủa muối

Cách tính nồng độ protein của dịch enzyme sau tủa muối tương tự như phần dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 1 ta được:

Vì mẫu được pha loãng 100 lần trước khi đo OD, nên nồng độ protein thực sự có trong 1

Tinh sạch enzyme

❖ Protein có trong dịch thôi giải 1 (TG1)

Cách tính nồng độ protein có trong TG1 tương tự như phần dịch nuôi cấy, thế các giá trị

OD vào phương trình 1 ta được:

 0.119 mg/ml

pha loãng 30 lần (dịch rửa)

Dịch

OD thử không - thử thật

0.118 0.12 0.121 0.113 0.115 0.111 0.139 0.131 0.129 0.127 0.127 0.123 0.099 0.091 0.091 0.098 0.09 0.089

OD 595nm

8

❖ Protein có trong dịch thôi giải 2 (TG2)

Cách tính nồng độ protein có trong TG2 tương tự như phần dịch nuôi cấy, thế các giá trị

OD vào phương trình 1 ta được:

❖ Protein có trong dịch thôi giải 3 (TG3)

Cách tính nồng độ protein có trong TG3 tương tự như phần dịch nuôi cấy, thế các giá trị

OD vào phương trình 1 ta được:

❖ Protein có trong dịch thôi giải 4 (TG4)

Cách tính nồng độ protein có trong TG4 tương tự như phần dịch nuôi cấy, thế các giá trị

OD vào phương trình 1 ta được:

❖ Protein có trong dịch thôi giải 5 (TG5)

Cách tính nồng độ protein có trong TG5 tương tự như phần dịch nuôi cấy, thế các giá trị

OD vào phương trình 1 ta được:

+ Với OD = 0.091 ➔ x = 90.2 µg/ml

❖ Nồng độ protein trung bình có trong 5 phân đoạn thôi giải

5 = 118.87+112.2+132.2+125.2+92.87

Vậy trong 5 ml dịch thôi giải có [protein] = 0.016 x 5 = 0.58 mg

❖ Protein có trong dịch rửa (Flow-through)

Cách tính nồng độ protein có trong dịch rửa tương tự như phần dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 1 ta được:

Vì mẫu được pha loãng 30 lần trước khi đo OD, nên nồng độ protein thực sự có trong 1 ml

Vậy trong 5 ml dịch rửa có [protein] = 2.746 x 5 = 13.73 mg

Hoạt tính enzyme

Dịch

OD thử không - thử thật

OD thử không - thử thật

Pha loãng 15 lần đo hoạt tính Pha loãng 50 lần đo hoạt tính Pha loãng 50 lần đo hoạt tính

10

Công thức tính hoạt tính enzyme

𝐗 × 𝐊

Trong đó :

X : Số mg tinh bột suy ra từ đường chuẩn

v : Thể tích enzyme cho vào hỗn hợp phản ứng enzyme

t : Thời gian enzyme phản ứng

K : Hệ số pha loãng Giả sử thể tích enzyme cho vào hỗn hợp phản ứng là 1 ml, thời gian phản ứng là 10 phút

Dựa vào phương trình đường chuẩn của tinh bột: y = 0.0231x + 0.0073 (phương trình 2) với

❖ Enzyme trong dịch nuôi cấy (enzyme thô trước tủa)

Cách tính: Giá trị OD tương ứng với hệ số y trong phương trình 2 Từ đó ta suy ra được giá trị x tương ứng với lượng tinh bột có trong mẫu thử Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, nên lượng tinh bột có trong mẫu thử tương đương với giá trị trung bình của 3 lần lặp lại trên + Với OD = 0.157 ➔ x = 6.481 mg

+ Với OD = 0.167 ➔ x = 6.913 mg + Với OD = 0.143 ➔ x = 5.874 mg

Vì mẫu enzyme thô được pha loãng 15 lần, dựa vào công thức 1 ta được: Hoạt tính amylase

10 ×1 = 9.635 U

❖ Enzyme tủa cồn

Cách tính hoạt tính enzyme trong mẫu sau khi tủa cồn tương tự như cách tính hoạt tính enzyme có trong dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 2 ta được lượng tinh bột tương ứng sau:

Suy ra giá trị trung bình của 3 lần lặp lại: 𝑥̅ = 4.792+4.835+4.922

Vì mẫu enzyme sau tủa cồn được pha loãng 50 lần, dựa vào công thức 1 ta được: Hoạt tính

10 ×1 = 24.25 U

❖ Enzyme tủa muối

Cách tính hoạt tính enzyme trong mẫu sau tủa muối tương tự như cách tính hoạt tính enzyme

có trong dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 2 ta được lượng tinh bột tương ứng sau:

Vì mẫu enzyme sau tủa muối được pha loãng 50 lần, dựa vào công thức 1 ta được: Hoạt

10 ×1 = 47.265 U

Hoạt tính enzyme sau khi được tinh sạch bằng sắc ký ái lực

❖ Hoạt tính amylase trong dịch thôi giải 1 (TG1)

Cách tính hoạt tính enzyme trong TG1 tương tự như cách tính hoạt tính enzyme có trong dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 2 ta được lượng tinh bột tương ứng sau:

Dịch

OD thử không - thử thật

OD thử không - thử thật

Pha loãng 30 lần đo hoạt tính Pha loãng 20 lần đo hoạt tính Pha loãng 10 lần đo hoạt tính Pha loãng 5 lần đo hoạt tính

12

Vì mẫu enzyme trong TG1 được pha loãng 30 lần, dựa vào công thức 1 ta được: Hoạt tính

10 ×1 = 20.307 U

❖ Hoạt tính amylase trong dịch thôi giải 2 (TG2)

Cách tính hoạt tính enzyme trong TG2 tương tự như cách tính hoạt tính enzyme có trong dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 2 ta được lượng tinh bột tương ứng sau:

Vì mẫu enzyme trong TG1 được pha loãng 20 lần, dựa vào công thức 1 ta được: Hoạt tính

10 ×1 = 14.384 U

❖ Hoạt tính amylase trong dịch thôi giải 3 (TG3)

Cách tính hoạt tính enzyme trong TG3 tương tự như cách tính hoạt tính enzyme có trong dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 2 ta được lượng tinh bột tương ứng sau:

Vì mẫu enzyme trong TG1 được pha loãng 10 lần, dựa vào công thức 1 ta được: Hoạt tính

10 ×1 = 5.037 U

❖ Hoạt tính amylase trong dịch thôi giải 4 (TG4)

Cách tính hoạt tính enzyme trong TG4 tương tự như cách tính hoạt tính enzyme có trong dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 2 ta được lượng tinh bột tương ứng sau:

+ Với OD = 0.143 ➔ x = 5.874 mg

Vì mẫu enzyme trong TG1 được pha loãng 5 lần, dựa vào công thức 1 ta được: Hoạt tính

10 ×1 = 3.211 U

❖ Hoạt tính amylase trong dịch thôi giải 5 (TG5)

Cách tính hoạt tính enzyme trong TG5 tương tự như cách tính hoạt tính enzyme có trong dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 2 ta được lượng tinh bột tương ứng sau:

10 ×1 = 0.183 U

Hoạt tính chung trong phân đoạn thôi giải = 𝑡ổ𝑛𝑔 ℎ𝑜ạ𝑡 𝑡í𝑛ℎ 𝑐ủ𝑎 5 𝑝ℎâ𝑛 đ𝑜ạ𝑛 𝑡ℎô𝑖 𝑔𝑖ả𝑖

5

=20.307 + 14.384 + 5.037 + 3.211 + 0.183

5 = 8.624 U

❖ Hoạt tính amylase trong dịch rửa (Flow-through)

Cách tính hoạt tính enzyme trong dịch rửa tương tự như cách tính hoạt tính enzyme có trong dịch nuôi cấy, thế các giá trị OD vào phương trình 2 ta được lượng tinh bột tương ứng sau:

10 ×1 = 0.007 U

14

Fraction Thể tích

(ml)

Nồng độ protein (mg/ml)

Hàm lượng protein

(mg)

Hoạt tính enzyme (U)

Enzyme sau tủa

Enzyme sau tủa

Enzyme trong

❖ Tính hoạt tính riêng

Tổng hàm lượng protein

237.74= 0.04 U/mg

112.87= 0.215 U/mg

107.2 = 0.44 U/mg

13.73 = 0.0005 U/mg

❖ Tính độ tinh sạch

Hoạt tính riêng ban đầu + Độ tinh sạch của enzyme thô = 1

❖ Tính hiệu suất thu hồi hoạt tính enzyme

Tổng hoạt tính enzyme thô x 100 + Hiệu xuất thu hồi hoạt tính của enzyme thô = 100%

9.635x 100 = 251.7%

9.635 x 100 = 490.6%

9.635x 100 = 89.5%

9.635x 100 = 0.07%

❖ Tính hiệu suất thu hồi protein

Hiệu suất thu hồi protein = Tổng protein có trong phân đoạn

Tổng protein trong dịch thô x 100 + Hiệu xuất thu hồi protein của dịch enzyme thô = 100%

237.74x 100 = 47.47%

237.74x 100 = 45.1%

237.74x 100 = 0.24%

237.74x 100 = 5.78%

4 Kết luận

Fraction

Thể tích (ml)

Nồng độ protein (mg/ml)

Hàm lượng protein (mg)

Hoạt tính enzyme (U)

Hoạt tính riêng (U/mg)

Hiệu suất thu hồi protein (%)

Hiệu suất thu hồi hoạt tính (%)

Độ tinh sạch

Dịch enzyme

Enzyme sau

Enzyme sau

Enzyme thôi

Enzyme