Nghiên cứu kỹ thuật PCR chuẩn đoán virut gây bệnh ở tôm sú Nguyễn Thị Tần, Lê Quang Hưng, Phạm Anh Tuấn Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản I Đặt vấn đề Bệnh đốm trắng White spot syn
Trang 1Nghiên cứu kỹ thuật PCR chuẩn đoán virut gây bệnh ở tôm sú
Nguyễn Thị Tần, Lê Quang Hưng, Phạm Anh Tuấn
Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản I Đặt vấn đề
Bệnh đốm trắng (White spot syndrom virut - WSSV) đã và đang gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm sú không chỉ ở Châu á mà còn trên toàn thế giới (Flegel và ctv., 1997) Bệnh đốm
trắng đã phát hiện ở trên một số loài tôm khác nhau: P monodon, P japonicus và L vannameit WSSV nhiễm ở tôm bố mẹ có thể truyền sang tôm giống (Lo và ctv., 1997), tôm
giống mang mầm bệnh sau 1-2 tháng đầu thả nuôi phát triển bình thường, nhưng sau đó khoảng 80% số ao nuôi phát hiện bệnh đốm trắng và gây chết hàng loạt Nghiên cứu phát hiện bệnh đốm trắng bằng nhiều phương pháp khác nhau như mô bệnh học, nhuộm tươi và PCR Trong đó kỹ thuật PCR chính xác và nhạy cảm cao, cho phép phát hiện nhanh ngay từ khi tôm mới nhiễm bệnh ở giai đoạn sớm, do đó ngày nay phương pháp này được sử dụng rất rộng rãi
Để phát triển bền vững nghề nuôi tôm, rất nhiều tác giả nghiên cứu phát hiện bệnh đốm trắng bằng phương pháp PCR với các cặp mồi khác nhau (Kasornchandra và ctv., 1998) sử dụng cặp mồi 102F1&102R1 cho PCR đơn phát hiện virus gây bệnh đốm trắng trên tôm ở sáu nước Châu á Kim và ctv (1998) cũng sử dụng cặp mồi 1F&1R1 cho PCR đơn phát hiện WSSV trên tôm ở Hàn quốc Lo và ctv.,(1996 a,b) sử dụng các cặp mồi 146F1&146R1,146F2&146R2 cho PCR lồng trên tôm ở Đài Loan Peng và ctv.,(1998), Chou
và ctv., (1998) nghiên cứu phát hiện WSSV với cặp đoạn mồi theo nghiên cứu của Lo (1996) với các chu kỳ nhiệt khác nhau
Như vậy, có rất nhiều quy trình khác nhau để phát hiện WSSV Tuy nhiên việc ứng dụng các quy trình này và tìm ra quy trình tối ưu cho việc phát hiện bệnh đốm trắng ở tôm nuôi tại Việt Nam là lĩnh vực nghiên cứu hoàn toàn mới Nhằm đáp ứng mục tiêu phát hiện nhanh WSSV, hạn chế thiệt hại do bệnh đốm trắng gây ra, và tìm ra quy trình tối ưu nhằm ứng dụng rộng rãi trong chuẩn đoán phát hiện WSSV trên tôm nuôi tại Việt nam, chúng tôi tiến hành những nội dung nghiên cứu sau:
1 Các phương pháp tách chiết ADN
2 Pháp phát hiện bệnh đốm trắng bằng PCR đơn với các chu kỳ nhiệt khác nhau
3 Phát hiện bệnh đốm trắng bằng PCR lồng với các chu kỳ nhiệt khác nhau
4 Chạy PCR phát hiện virus gây bệnh đốm trắng trên tôm ở các mẫu mô khác nhau
5 Phát hiện bệnh bằng phương pháp PCR Kit
6 ứng dụng quy trình PCR tối ưu cho việc phát hiện virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú ở một số tỉnh miền Bắc và miền Trung
Trang 2Phương pháp nghiên cứu
1 Thu mẫu: Tất cả các mẫu được thu từ Nha Trang, Bình Thuận và Ninh Thuận
Stt Quần đàn Số mẫu Kết quả theo mô bệnh học
3 Ninh Thuận I 10 4 (+); 2 (-); 3 (++)
2 Tách chiết ADN
2.1 Phương pháp 1
Lấy một phần chân bơi hoặc mô cơ, nếu tôm nhỏ ta lấy mẫu cả con, rửa sạch Nghiền 1 lượng mẫu khoảng 0,05g trong 900 µl Cell Lysis Solution Dùng RNase - A (10mg/ml) loại ARN, kết tủa protein bằng 7.5 M Amonium Acetate, dùng cồn 960 để kết tủa ADN Sau đó ADN được hoà tan trong đệm TE hoặc nước cất tinh khiết, bảo quản ở 40C
2.2 Phương pháp 2
Dùng phenol, chloroform, isoamyl alcohol (tỷ lệ 25:24:1) Kết tủa ADN bằng cồn 960 hoặc isopropanol Sau đó ADN được hoà tan trong đệm TE hoặc nước cất tinh khiết, bảo quản ở 40C
2.3 Phương pháp 3
Dùng Lysis Buffer trong bộ kit IQ2000-WSSV, Đài Loan
3 Phản ứng PCR
3.1 Phương pháp 1: PCR đơn
Trình tự các đoạn mồi sử dụng cho phương pháp PCR đơn
102F1: 5’ - TCA CAT CGA GAC CTC TGT AC - 3’
và 102R1: 5’ - TCT AGG ACG GAC TAT GGC - 3’(Kaornchandra và ctv., 1998),
bệnh bắt cặp lên ở 520bp
1F: 5’ - ATC TGA TGA GAC AGC CCA AG - 3’
Trang 3và 1R: 5’ - GGG AAT GTT AAA TAT GTA TCG G - 3’ (Kim và ctv., 1998),
bệnh bắt cặp lên ở 365bp
3.2 Phương pháp 2: PCR lồng
Trình tự các đoạn mồi sử dụng cho phương pháp PCR lồng (Lo và ctv., 1996)
Cặp mồi cho PCR lần 1: 146 F1: 5' - ACT ACT AAC TTC AGC CTA TCT CG - 3'
146 R1: 5' -TAA TGC GGG TGT AAT GTT CTT ACG A - 3'
bệnh bắp cặp lên ở 1447bp Cặp mồi cho PCR lần 2:
146 F2: 5' - GTA ACT GCC CCT TCC TCC ATC CTC CA - 3'
146 R2: 5' - TAC GGC TGC TGC TGC ACC TTG T - 3'
bệnh bắp cặp lên ở 941bp
2.3 Phương pháp 3: phương pháp kit
Kết quả và thảo luận
1 Tách chiết ADN
Giếng 1 2 3 4 5 6
Hình 1: Kết quả kiểm tra ADN tách chiết trên gel agarose 1%
Giếng 1, 2: tách chiết phương pháp 1 Giếng 3, 4: Tách chiết phương pháp 2 Giếng 5, 6: tách chiết phương pháp 3
Trang 4Qua cả 3 phương pháp tách chiết trên cho thấy, sản phẩm ADN thu được đều đủ về số
lượng và độ tinh sạch cho các nghiên cứu tiếp theo Tuy nhiên chúng tôi muốn đưa ra cả 3
phương pháp tách chiết để tuỳ theo điều kiện và hoá chất của từng phòng thí nghiệm có
ứng dụng phương pháp thích hợp
2 Pháp phát hiện bệnh đốm trắng bằng PCR đơn với các chu kỳ nhiệt khác nhau
Chúng tôi tiến hành làm thí nghiệm 50 mẫu đã xác định là có nhiễm bệnh đốm trắng qua
phương pháp mô bệnh học, thành phần cho chạy PCR bao gồm:
+ 25pmol đoạn mồi F +dung dịch H2O 2.1.Kết quả chạy PCR đơn với cặp đoạn mồi 1F&1R với các chu kỳ nhiệt khác nhau
Chu kỳ nhiệt
94oC (30”) 55oC (45”) 72 oC (45”)
94oC (50”) 60 oC (1’) 72 oC (1’30”)
94oC (50”) 54oC (1’) 72 oC (1’30”)
+: Mẫu phát hiện có bị bệnh đốm trắng -: Mẫu không phát hiện được bệnh đốm
trắng
Chu kỳ nhiệt I chúng tôi tiến hành như tác giả đã công bố, tỷ lệ phát hiện bệnh dao động từ
10% đến 32%, tỷ lệ phát hiện đạt hiệu quả cao nhất (32%) với chu kỳ nhiệt 94oC (50”),
54oC (60”), 72oC (90”), và thấp nhất với chu kỳ nhiệt 94oC (50”), 60oC (60”), 72oC (90”)
Giếng 1 2 3 4 5 6 7 8
Trang 5Hình 2: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR dùng cặp mồi 1F, 1R
Giếng 8: Thang ADN chuẩn
Qua hình trên cho ta thấy giếng 2, 3 và 6 bị bệnh đốm trắng, các băng lên ở 365bp phù hợp
với kết quả nghiên cứu của (Kim và ctv.,1998)
2.2.Kết quả chạy PCR với cặp đoạn mồi 102F&102R với các chu kỳ nhiệt khác nhau
I II III
Chu kỳ nhiệt
95oC (50”) 58 oC (1’) 72 oC (1’)
94oC (50”) 55 oC (1’) 72 oC (1’)
95oC (50”) 57 oC (1’30)
72 oC (1’25”)
Tỷ lệ phát hiện
bệnh (%)
300bp
+: Mẫu phát hiện có nhiễm bệnh đốm trắng
-: Mẫu không phát hiện được bệnh đốm trắng Chu kỳ nhiệt I chúng tôi tiến hành như tác giả đã công bố, tỷ lệ phát hiện bệnh dao động từ
8% đến 26%, tỷ lệ phát hiện đạt hiệu quả cao nhất (26%) với chu kỳ nhiệt 95oC (50”), 57 oC
(1’30), 72 oC (1’25”), và thấp nhất (8%) với chu kỳ nhiệt 94oC (50”), 55 oC (1’), 72 oC (1’)
Giếng 1 2 3 4 5 6 7 8
300bp 400bp 500bp
Hình 3: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR dùng cặp mồi 102F, 102R
Giếng 8: Thang ADN chuẩn
Trang 6Qua hình 3 cho thấy giếng 2, 3 và 6 bị bệnh đốm trắng, các băng lên ở 520bp phù hợp với
kết quả nghiên cứu của Kaornchandra và ctv (1998)
3 Kết quả chạy Nested PCR với cặp đoạn mồi 146 của Lo (1996) với các chu kỳ nhiệt
khác nhau
Chu kỳ nhiệt
94oC (1’) 60 oC (1’)
72 oC (3’)
95oC (50”) 58 oC (1’) 72 oC (1’25”)
94oC (1’) 55 oC (1’)
72 oC (3’)
Tỷ lệ phát hiện
bệnh (%)
90% 10% 86% 14% 96% 4%
+: Mẫu phát hiện có nhiễm bệnh đốm trắng
-: Mẫu không phát hiện được bệnh đốm trắng Chu kỳ nhiệt I chúng tôi tiến hành như tác giả đã công bố, tỷ lệ phát hiện bệnh dao động từ
86% đến 96%, tỷ lệ phát hiện đạt hiệu quả cao nhất (96%) với chu kỳ nhiệt 94oC (1’), 55 oC
(1’), 72 oC (3’), và thấp nhất (86%) với chu kỳ nhiệt 95oC (50”), 58 oC (1’), 72 oC (1’25”)
1353bp
i m
ch m
Giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 PCR lần 2 PCR lần 1
2 -9 10 _15
Hình 4: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR dùng cặp mồi 146F1, 146R1; 146F2, 146R2
Giếng 1, 8, 15: thang ADN chuẩn (1353, 1078, 872, 603 bp)
Trang 7Qua hình 4 cho ta thấy, giếng 12 nhiễm bệnh nặng nên biểu hiện băng đặc hiệu ngay ở PCR lần 1 ứng với 1447bp Giếng 10, 11, 13, 14 không thấy biểu hiện bệnh Khi PCR lần 2
ta thấy giếng 2, 4, 7 có biểu hiện bệnh ứng với 941bp
Sản phẩm của phản ứng PCR lồng, có độ nhậy cao hơn phản ứng PCR đơn từ 103 - 104 lần (Peng, 1998), và phản ứng PCR đơn chỉ có khả năng phát hiện WSSV khi tôm đã nhiễm bệnh từ giai đoạn nặng đến rất nặng, còn PCR lồng có khả năng phát hiện WSSV ngay từ giai đoạn tôm nhiễm bệnh rất nhẹ (Lo và ctv, 1998)
Kết quả phát hiện bệnh của các cặp mồi khác nhau chạy với chu trình nhiệt tối ưu nhất
Cặp đoạn mồi 1F&1R 102F&102R 146F1&146R1 146F2&146R2
Tỷ lệ phát hiện
bệnh (%)
+: Mẫu phát hiện có nhiễm bệnh đốm trắng -: Mẫu không phát hiện được bệnh đốm trắng
Kết quả trên cho thấy các cặp đoạn mồi trên đều có khả năng phát hiện WSSV, khả năng phát hiện WSSV của các cặp đoạn mồi 1F&1R, 102F1&102R1 dùng cho phản ứng PCR đơn và cặp mồi 146F1&146R1 chỉ giao động trong khoảng 24% đến 38% Theo kết quả mô bệnh học chỉ có 27,08% mẫu bị bệnh nặng, còn 72,92% mẫu bị bệnh nhẹ Hơn nữa tất cả những mẫu mô bệnh học phát hiện là bệnh nặng, thì đều được phát hiện ở cặp 1F, 1R, 102F, 102R và 146F1, 146R1khi chậy PCR Như vậy cho ta thấy cặp mồi 1F, 1R, 102F, 102R và 146 F1, 146R1 chỉ có khả năng phát hiện được mẫu đã nhiễm bệnh nặng, chỉ có PCR lồng với cặp mồi 146F2, 146R2 có khả năng phát hiện được những mãu nhiễm bệnh
ở giai đoạn nhẹ Điều này phù hợp với nghiên cứu của Lo và ctv, 1996, Chang và ctv., 1998 PCR lồng nhạy cảm hơn PCR đơn từ 103 đến 104
4 Xác định mẫu mô nhiễm bệnh thích hợp cho PCR
Kết quả khả năng phát hiện bệnh đốm trắng ở các mô khác nhau, sử dụng cặp mồi của Lo
và theo phương pháp đã được chúng tôi tối ưu
Kết quả nhân bản PCR với các mô khác nhau
Trang 8-8 + + + 23 + +
Tỷ lệ phát hiện bệnh ở các mô khác nhau
Tỷ lệ phát hiện bệnh (%)
Số mẫu bị bệnh (Theo mô bệnh học)
Như vậy, khả năng phát hiện WSBV ở mô mang cho hiệu quả cao nhất, tiếp theo là chân
bơI, bụng và cuối cùng là đuôi Theo Chang (1996) tác nhân gây bệnh đốm trắng -
WSBV ở dạ dầy, mô mang được phát hiện ngay ở giai đoạn tôm nhiễm bệnh rất nhẹ, và số
lượng tác nhân không ngừng tăng cùng với thời gian nhiễm bệnh, và tác nhân gây bệnh chỉ
được phát hiện ở đuôi khi tôm đã nhiễm bệnh nặng (sau thời gian cảm nhiễm 64 giờ)-
Chang và ctv (1996) Lo (1996) Kim (1998) và Kaornchandra,1998 cũng đã nghiên cứu
WSBV trên các mô khác nhau và họ cho rằng khả năng phát hiện WSBV ở mô mang cho
hiệu quả rất cao Như vậy chúng ta nên sử dụng mô mang của tôm bệnh để tách chiết ADN
cho phản ứng PCR
Từ những kết quả nghiên cứu thu được chúng tôi đè xuất quy trình tối ưu để chuẩn đoán
bệnh đốm trắng cho tôm ở Việt Nam
- Tách chiết ADN từ mang (20-30mg), nồng độ ADN dùng cho phản ứng PCR từ
100 - 200ng
- Cặp mồi lên dùng: 146F1&146R1,146F2&146R2
- Thành phần phản ứng PCR
+ 10X PCR buffer
+ 1,5mM MgCl2
+ 25pmol đoạn mồi F
: + 25pmol đoạn mồi R
+ 2u Taq polymerase
+Dung dịch H2O
- Chu kỳ nhiệt chạy PCR với (chạy 40chu kỳ): 940C (1’); 550C (1’); 720C (3’);
chu kỳ cuối 720 C (7’); 40C (∞)
Trang 95 Phát hiện bệnh bằng phương pháp PCR kit với tổng thể tích mẫu khác nhau
Giếng M 2 3 4 5 6 7 8 M
Hình 5: Tổng thể tích cho quá trình chạy PCR là 20ul
Sản phẩm kiểm tra trên giếng dày 0,75mm, chiều dài 0,5cm, lượng mẫu chấm từ 10 - 13ul
Giếng 1 và 9: Thang ADN chuẩn (848, 630, 330bp) Giếng 2: Mẫu đối chứng không có ADN (Yeast tRNA) Giếng 3, 4, 5: không bị bệnh ứng với 848 bp
Giếng 6, 7: bệnh nặng lên 3 băng (910, 550, 296bp) Giếng 8: (P+ standard)
Qua hình trên cho ta kết quả giếng 6, 7 nhiễm bệnh nặng; giếng 3, 4, 5 không nhiễm bệnh Cũng vẫn tiến hành làm như các bước trên nhưng tổng thể tích chạy PCR giảm xuống 10ul
và 7ul, kết quả thu được ở hình dưới
M
Giếng M 1 2 3 4 5 6
Hình 6: Tổng thể tích 7ul Tổng thể tích 10ul
M: Thang ADN chuẩn (848, 630, 330bp)
Trang 10Sản phẩm kiểm tra trên giếng dày 0, 75mm, chiều dài 0,25cm, lượng mẫu chấm từ 4 - 5ul
Giếng 1 và 4 không bị bệnh; giếng 2 và 5 bị bệnh rất nhẹ; mẫu 3 và 6 bị bệnh nhẹ Như vậy
với thể tích rất nhỏ 10ul hoặc 7ul, chúng tôi vẫn có thể kiểm tra được mẫu có bị bệnh hay
không Bằng cách chấm mẫu kiểm tra trên bản gel có giếng chấm nhỏ 0,25 cm, khi đó
lượng mẫu chấm chỉ là 5ul Do đó hạ được chi phí xuống chỉ còn 1/2 đến 1/3 so với quy
trình bộ kit đưa ra 20ul
6 ứng dụng phương pháp PCR tối ưu cho việc phát hiện bệnh đốm trắng trên tôm sú
ở một số tỉnh miền Bắc và miền Trung Việt nam
Kết quả
mô
Kết quả PCR
STT Tỉnh Quần đàn Số
lượng mẫu + - + -
% sai giữa PCR và
mô
5
Miền Trung
8
Miền Bắc
Tổng 251 135 56 162 89 5,28%
Trang 11Tài liệu tham khảo
Chang P S, C F Lo, Y C Wang, G H Kou,1996: Indentification of white spot syndrom associate
baculovirus target organs in the shrimp by in situ hybridization, Diseases of aquaculture oganims 27,
131 - 139
Chou H Y, C Y Huang, C F Lo, G H Kou,1998: Studies tranmission of White spot syndrom
associated baculovirus in peneaus monodon DNA peneaus japonicus ia water born contact DNA oral ingetion, Aquaculture 164, 263 - 276
Hassan M D, M shariff, A H Sahtout, 2001: DNA fragmentation, an indicator of apotosis in culture
black tiger shrimp peneaus monodon infected with White spot syndrom baculovirus, Diseases of aquaculture oganims 44
Kasornchandra.J, S Boonyaratpalin,T Itami,1998: Detection of White spot syndrom inculture
penaeid shrimp in Asia: Microscopic observation ADN PCR, Aquaculture 164, 243 - 251
Kim C K, P K Kim, D S Sim, M A Park, M S Heo, T H Lee, J D Lee, H K Jun, K L Jang,1998:
Development of a polymerase chain reaction - PCR procedure for the detection of baculovirus associated with White spot syndrom baculovirus in penaeid shrimp, Journal of fish diseases 21, 11 -
17
LO C F, J H Leu, C H Ho, C H Chen, S E Peng, Y T Chen, c m Chou, P Y Yeh, C J Huang,
H Y Chou, Y L Chiu, C H Wang, G H Kou,1996a: Detecton of baculovirus associate with White
spot syndrom baculovirus in penaeid shrimp using PCR, Diseases of Aquaculture ogarnism 25, 133
- 141
LO C F, K F Liu, C H Ho, C H Chen, S E Peng, M S Su, C F Chang, H C HsuC H Wang, G
H Kou,1996b:White spot syndrom baculovirus detected in culture DNA capture shrimp, crabs DNA
other arthropods, Diseases of Aquaculture ogarnism 27, 215 - 225
LO C F, K F Liu, C H Ho, C H Chen, S E Peng, M S Su, C F Chang, H C HsuC H Wang, G
H Kou, Y L Chiu, P Y Yeh, 1997: Detection DNA tissue tropism of White spot syndrom
baculovirus in capture brooder of peneaus monodon with a special emphasis on reproductive organ, Diseases of Aquaculture ogarnism 30, 53 - 72
Peng S E, C F Lo, C F Chang, G H Kou,1998: Detection of White spot syndrom baculovirus in
giant fresh water prawn, Macrobrachium rosenbergii, using PCR , Aquaculture 164, 253 - 262
Peng S E, C F Lo, K F Liu, G H Kou,1998: The transition from prepatent to patent infection of
White spot syndrom baculovirus in peneaus monodon triggered pereiopod exsision, fish pathology
33, 395 - 400
