Tiêu chuẩn hóa dược liệu, cao alkaloid và cao flavonoid từ khổ sâm bắc (sophora flavescens ait ) trồng tại đắk nông

Khổ sâm bắc là dược liệu được sử dụng từ lâu trong y học cổ truyền phương đông, để chữa nhiều bệnh như chống loạn nhịp, các chứng viêm, xuất huyết tiêu hoá, lỵ và ký sinh trùng1-4.. trồn

PHAN NGUYỄN TRƯỜNG THẮNG

TIÊU CHUẨN HÓA DƯỢC LIỆU, CAO ALKALOID VÀ

CAO FLAVONOID TỪ KHỔ SÂM BẮC (Sophora flavescens Ait.)

TRỒNG TẠI ĐẮK NÔNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023

BỘ Y TẾ

PHAN NGUYỄN TRƯỜNG THẮNG

TIÊU CHUẨN HÓA DƯỢC LIỆU, CAO ALKALOID VÀ

CAO FLAVONOID TỪ KHỔ SÂM BẮC (Sophora flavescens Ait.)

TRỒNG TẠI ĐẮK NÔNG

NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 62.72.04.10

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS.TS NGUYỄN NGỌC VINH

2 PGS.TS TRẦN ANH VŨ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2023

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên

cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được công

bố ở bất kỳ nơi nào

Tác giả luận án

MỤC LỤC

Trang

Tổng quan về thực vật học của Khổ sâm bắc 3

Tổng quan về thành phần hóa học của Khổ sâm bắc 6

Chiết xuất và phân lập các thành phần flavonoid và alkaloid từ Khổ sâm bắc 13 Các phương pháp phân tích flavonoid và alkaloid Khổ sâm bắc 27

Tác dụng dược lý và công dụng của Khổ sâm bắc 33

Chuẩn hóa dược liệu và yêu cầu chất lượng Khổ sâm bắc theo các Dược điển hiện hành 39

Giới thiệu về cao dược liệu 43

Thiết kế nghiên cứu 48

Đối tượng nghiên cứu 49

Thời gian và địa điểm nghiên cứu 49

Cỡ mẫu của nghiên cứu 49

Xác định các biến số độc lập và phụ thuộc 50

Phương pháp và công cụ đo lường, thu thập số liệu 50

Quy trình nghiên cứu 53

Phương pháp phân tích dữ liệu 75

Xây dựng quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế các alkaloid, flavonoid từ rễ

Khổ sâm bắc 76

Thiết lập chất đối chiếu 104

Xây dựng quy trình định tính, định lượng alkaloid, flavonoid trong rễ Khổ sâm bắc, các cao chiết từ rễ Khổ sâm bắc 114

Đánh giá tác dụng sinh học của cao toàn phần, cao alkaloid, cao flavonoid và các chất phân lập 133

Tiêu chuẩn hóa cao chiết và dược liệu Khổ sâm bắc 138

Xây dựng quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế từ Khổ sâm bắc 142

Đánh giá chất đối chiếu 149

Xây dựng quy trình định tính, định lượng alkaloid, flavonoid trong rễ Khổ sâm bắc, các cao chiết từ rễ Khổ sâm bắc 150

Đánh giá tác dụng sinh các cao chiết và hoạt chất từ Khổ sâm bắc 157

Tiêu chuẩn hóa cao chiết và dược liệu Khổ sâm bắc 161

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ

ANH – VIỆT

Ký hiệu, chữ

viết tắt

AChE Acetylcholinesterase Acetylcholinesterase

13C-NMR Carbon nuclear magnetic resonance Phổ carbon

DEPT Distortionless Enhancement by

Polarization Transfer DMEM Dulbecco's modified Eagle's DMEM

DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

EC50 Half maximal effective concentration Nồng độ hiệu quả tối đa một nửa EMA European Medicines Agency Cơ quan Quản lý thuốc Châu Âu ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun điện

FeCl3 Ferric Chloride Sắt (III) clorid

HKCMMS The Hong Kong Chinese Materia

Medica Standards

Tiêu chuẩn dược liệu Hồng Kông Trung Quốc

1H-NMR Proton nuclear magnetic resonance Phổ proton

HPLC High Performance Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HSQC Hetetonuclear Single Quantum

Coherence HTCO Hoạt tính chống oxi hóa Hoạt tính chống oxi hóa

Ký hiệu, chữ

viết tắt

concentration

Nồng độ tối đa ức chế một nửa

IUPAC International Union of Pure and

Applied Chemistry

Hiệp hội Quốc tế về Hóa học thuần túy và ứng dụng

LC Liquid Chromatography Sắc ký lỏng

MTT

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromid)

diphenyl tetrazolium bromid)

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-N Number of therical plates Số đĩa lý thuyết

RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối

SDH Succinat dehydrogenase succinat dehydrogenase

SPE Solid Phase Extraction Chiết pha rắn

Tf, As Tailing factor, Asymmetry Hệ số kéo đuôi, hệ số bất đối xứng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là đất nước với nguồn tài nguyên phong phú và đa dạng sinh học, nhiều loài thực vật được phát hiện có tác dụng hỗ trợ và điều trị bệnh, là điều kiện rất thuận lợi trong việc nghiên cứu và phát triển các thuốc có nguồn gốc thảo dược, phù hợp với định hướng phát triển ngành dược Việt Nam Trong kho tàng cây thuốc Việt Nam, ngoài những cây có nguồn gốc bản địa thì nhiều cây thuốc di thực như Đương Quy, Đan Sâm, … thực sự là những nguồn cung cấp quan trọng, hạn chế nhập khẩu và giảm bớt sự phụ thuộc của ngành dược liệu Việt Nam vào nguồn cung bên ngoài Một trong những dược liệu quý được di thực đó là Khổ sâm bắc hay còn

gọi là Khổ sâm cho rễ (Sophora flavescens Ait.) và thường hay có sự nhầm lẫn với Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.) vì hay gọi chung là Khổ sâm.

Khổ sâm bắc (Sophora flavescens Ait.) được sử dụng nhiều ở Trung Quốc,

Nhật Bản và đã được di thực từ những năm 90 của thế kỷ XX, chúng thích nghi với khí hậu và phát triển tốt, đặc biệt ở các vùng núi như Đắk Nông, Sapa Một số chế

phẩm chứa dược liệu này được sản xuất tại Việt Nam như Ninh tâm vương được dùng hỗ trợ trong bệnh lý nhịp tim nhanh, Nữ vương hỗ trợ trong điều trị viêm nhiễm

phụ khoa ở nữ giới Khổ sâm bắc là dược liệu được sử dụng từ lâu trong y học cổ truyền phương đông, để chữa nhiều bệnh như chống loạn nhịp, các chứng viêm, xuất huyết tiêu hoá, lỵ và ký sinh trùng1-4 Hiện nay, trên thị trường thuốc trên thế giới có

nhiều sản phẩm thuốc và thực phẩm chức năng từ Sophora flavescens như “dung

dịch tiêm Yanshu, Fufang kushen” của công ty Dược phẩm Zhendong (Trung Quốc),

“thực phẩm bổ sung Kushen và Kushen hawaii pharm” của công ty Nature’s Health (Mỹ)

Chuyên luận về Sophora flavescens đã được đề cập trong các ấn bản của dược

điển Trung Quốc (2020), dược điển Nhật Bản (JP17) và dược điển Hồng Kông 2017 với chỉ tiêu định tính và định lượng dược liệu dựa vào 3 alkaloid chính là matrin, oxymantrin và sophoridin5, 6 Bên cạnh thành phần alkaloid, flavonoid cũng là một trong những nhóm hợp chất chính trong Khổ sâm bắc4, 7, 8 Trong hơn năm thập kỷ qua, hàng trăm hợp chất flavonoid đã được phân lập với nhiều tác dụng dược lý đã

được chứng minh in vitro và in vivo như diệt khối u, kháng khuẩn 9 kháng viêm 10 và kháng virus11 Tuy nhiên, flavonoid vẫn chưa có trong chỉ tiêu đánh giá chất lượng của dược liệu Khổ sâm bắc, với hàm lượng cao và tính chất dược lý của flavonoid, các nhà khoa học đề nghị đưa nhóm hoạt chất flavonoid trở thành một trong những chỉ tiêu đánh giá chất lượng của dược liệu này2 Tuy nhiên, một số hợp chất như kurarinon và sophoraflavanon G nằm trong nhóm hợp chất này có độc tính khi dùng liều cao Vì vậy, việc tiêu chuẩn hóa các cao chiết alkaloid, cao chiết flavonoid sẽ giúp chuyên biệt hóa tác dụng, giảm nguy cơ gây độc cho người dùng

Tuy vậy, Dược điển Việt Nam V hiện nay vẫn chưa có chuyên luận riêng về dược liệu Khổ sâm bắc, đồng thời hiện nay chỉ có một số công trình nghiên cứu về dược liệu Khổ sâm bắc tại Việt Nam12 gây khó khăn trong việc đánh giá chất lượng dược liệu thô và chế phẩm chứa dược liệu này trong nước và ngoại nhập Nhằm đáp ứng nhu cầu kiểm soát chất lượng và phục vụ công tác kiểm nghiệm thuốc và dược

liệu trong nước, luận án “Tiêu chuẩn hóa dược liệu, cao alkaloid và cao flavonoid

từ Khổ sâm bắc (Sophora flavescens Ait.) trồng tại Đắk Nông” được thực hiện với các mục tiêu nghiên cứu sau:

- Xây dựng quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế các alkaloid, flavonoid từ Khổ sâm bắc

- Thiết lập chất đối chiếu các chất phân lập từ Khổ sâm bắc

- Xây dựng quy trình định tính, định lượng alkaloid, flavonoid trong Khổ sâm bắc, các cao chiết từ Khổ sâm bắc

- Nghiên cứu thử tác dụng sinh học của các cao chiết và các chất phân lập được

từ Khổ sâm bắc

- Tiêu chuẩn hóa cao chiết và dược liệu Khổ sâm bắc

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Tổng quan về thực vật học của Khổ sâm bắc

Đặc điểm thực vật học của loài Khổ sâm bắc

Vị trí phân loại

- Tên khoa học: Sophora flavescens Aiton

- Tên thông thường: Khổ sâm bắc

- Tên gọi khác: Dã hòe, Khổ cốt, Khổ sâm cho rễ, Sơn đậu căn, Ðịa sâm…

- Theo hệ thống phân loại của Takhtajan A.L công bố năm 1987 và sửa đổi năm

200913, cây Khổ sâm bắc có vị trí phân loại thực vật như sau:

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)

Phân lớp Hoa hồng (Rosidae)

Liên bộ Đậu (Fabaceae)

Khổ sâm bắc là cây bụi nhỏ, cao khoảng 0,5 - 1,2 m hoặc hơn Rễ hình trụ dài,

vỏ ngoài màu vàng trắng Thân thường phân nhiều cành, cành non có lông tơ rải rác

Lá kép lông chim lẻ mọc so le, gồm 5 - 10 đôi lá chét hình mác dài khoảng 3 - 4 cm, rộng 1 - 2 cm, dốc thuôn, đầu nhọn hoặc hơi tù, mặt trên nhẵn, mặt dưới phủ lông mịn màu xám Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành chùm dài 10 - 20 cm Hoa màu vàng nhạt, đài 5 răng hình chuông, tràng 5 cánh không đều, nhị 10, rời nhau, bầu có lông mịn Quả đậu, thắt lại giữa các hạt, thuôn dài 5 - 12 cm, đường kính 5 -

8 mm, đầu có mỏ thuôn dài; hạt 3 - 7, hình cầu, màu đen 1, 14

(A) Các phần trên mặt đất (B) Rễ cây (C) Dược liệu được cắt lát

Cây Khổ sâm bắc Sophora flavescens Ait

Nguồn Xirui He, 20152

Đặc điểm vi học

Tzu Che Lin đã mô tả một số đặc điểm vi học rễ, thân, lá của S flavescens 15

Vi phẫu rễ: Rễ cắt ngang có tiết diện gần tròn Bần gồm 9 – 12 lớp tế bào hình chữ nhật dẹp, xếp xuyên tâm, thường bị bong tróc Vùng vỏ gồm 22 – 28 lớp tế bào

mô mềm Thượng tầng gồm 2 – 6 lớp tế bào mô phân sinh kích thước nhỏ Vùng trung trụ có 12 – 17 tia tủy

Vi phẫu thân: Thân cắt ngang có tiết diện gần tròn Biểu bì gồm 1 lớp tế bào hình chữ nhật Vùng vỏ gồm 6 – 11 lớp tế bào mô mềm hình đa giác góc tròn, chiếm khoảng ¼ tiết diện Vùng trung trụ có các tế bào mô mềm có kích thước lớn hơn

Vi phẫu lá: Phiến lá gồm biểu bì 1 lớp tế bào ở cả mặt trên và mặt dưới Mô giậu gồm 1 – 2 lớp tế bào hình chữ nhật dài, mô mềm khuyết gồm 2 – 3 lớp tế bào

mô mềm hình đa giác góc tròn, chừa các khuyết lớn Gân giữa có 1 bó mạch xếp hình vòng cung, kích thước lớn

Hình ảnh vi học của S flavescens (A - rễ, B - thân, C - lá, D – thân

phóng to)

Nguồn Zelin, 201115 Phân bố - sinh thái

Khổ sâm bắc có nguồn gốc từ Trung quốc, được nhập vào Việt Nam vào khoảng đầu những năm 1970 Đây là cây sống nhiều năm Về mùa đông, toàn bộ phần trên tàn lụi, từ phần gốc còn lại sẽ nảy mầm vào khoảng giữa mùa xuân năm sau Cây ưa sáng và ưa ẩm, thích nghi với điều kiện của nước ôn đới ẩm và vùng nhiệt đới núi cao (cao 1500 m), nhiệt độ trung bình năm khoảng 15 oC Cây trồng ở Sa Pa (Lào Cai) sinh trưởng tốt, ra hoa nhiều nhưng hầu như không có quả Số cây trồng hiện có

là do nhân giống bằng các nhánh con tách từ gốc1

Cây ra hoa tháng 6 – 8, có quả tháng 8 – 1014

Bộ phận dùng – thu hái và chế biến

Rễ củ - Radix Sophorae flavescentis, thường gọi là Khổ sâm - 苦参 14

Thu hái củ, rửa sạch đất cát, thái phiến, phơi khô hoặc đem củ tươi ngâm nước

vo gạo nếp một đêm, rửa sạch, để trong 3 giờ rồi mới thái phiến, phơi khô Bảo quản nơi khô ráo14

Tổng quan về thành phần hóa học của Khổ sâm bắc

Thành phần hóa học của loài S flavescens

Khổ sâm bắc đã được nghiên cứu về thành phần hóa học từ lâu với rất nhiều báo cáo đã được công bố Tính đến năm 2015, hơn 200 hợp chất đã được phân lập

và xác định cấu trúc từ loài S flavescens Trong đó, chủ yếu các nghiên cứu được

thực hiện trên bộ phận rễ củ, ngoài ra phần khí sinh, hoa, hạt cũng được quan tâm Alkaloid và flavonoid được coi là các thành phần hợp chất chính, bên cạnh các nhóm hợp chất khác như: triterpenoid, lignan, phenyl propanoid, coumarin, acid phenolic

…2

Thành phần flavonoid

Flavonoid là thành phần hóa học được tìm thấy với số lượng nhiều nhất của

loài S flavescens (…) với sự hiện diện của đa dạng các phân nhóm: flavanon,

flavanonol, flavonol, chalcon, isoflavonoid, biflavonoid

Các dẫn chất flavonoid của S flavescens được bắt đầu nghiên cứu từ năm 1985

Theo thống kê của Xirui He2, tính đến năm 2015 đã có 124 cấu trúc flavonoid được

công bố, trong đó nhiều hợp chất thể hiện các tác dụng dược lý in vitro và in vivo như: Kushenol A - C, E, F, H, K - X, kurarinon, isokurarinon, norkurarinon, (2S)-2’-

methoxykurarinon, kurarinol, neokurarinol, norkurarinol, kosamol A, leachianon A, leachianon G, sophoraflavanon G, 8 lavandulylkaempferol, formononetin, và isoxanthohumol2 Các flavonoid phân lập từ S flavescens đáng chú ý với một số dẫn

chất mang nhóm thế isoprenyl và lavandulyl trong cấu trúc Các nhóm thể này chủ yếu gắn tại vị trí C-8, một số ít ở vị trí C-6 trong khung flavonoid

Cho đến những năm gần đây các báo cáo về các flavonoid có cấu trúc mới phân

lập từ S flavescens vẫn còn được công bố, cụ thể:

8-(3-hydroxymethyl-2-butenyl)-5,7,2′,4′-tetrahydroxyflavanon (2017); sophoflavanon A và sophoflavanon B (2018);

kushenol Z (2019); sophoraflavanon M và sophoraflavanon N (2019); sophobiflavonoid A – H (2019); 4H-1-benzopyran-4-on,2-(4-hydroxyphenyl)-3,7-dihydroxy-5-methoxy-8-[5-methyl-2-(1-methylethenyl)-4-hex-enyl] (2021);

sophoflavonoid A và sophoflavonoid B (2021) [H.7]; kurarinol A và kurariol B (2021); (2R)-kurarinol, sophoraflavenochroman G, 2′ -methoxy kushenol I, sophoraflavanonol A, 5-methoxy-7,4′ -dihydroxy-8-lavandulylflavonol, 5-methoxy-7-hydroxy-8-lavandulylbenzochromon, 2-methoxy-2′ ,4′ ,4,6-tetrahydroxy-5-lavanduly dihydrochalcone (2021)

Một số cấu trúc flavonoid đáng chú ý trong Sophora flavescens

Hơn 20 hợp chất isoflavon được phân lập từ dược liệu này như daidzein,

formononetin, calycosin, ononin,… Trong đó, có formononetin có tác dụng ức chế

enzyme monoamin oxidase, một số isoflavon có tác dụng bảo vệ tế bào gan như

B OCH 3 OH

4’-Hydroxy-3’-

methoxyisoflavone-7-O-β- glucopyranoside

D-xylopyranosyl-(1-6)-β-D-A OH OCH 3

3’-hydroxy-4’-

methoxyisoflavone-7-O-β-D-xylopyranosyl-(1-6)-β-D- glucopyranoside

A OCH 3 OH

Ngoài ra còn có các pterocarpan được phân lập cũng có hoạt tính sinh học đáng quan tâm, điển hình là kushecarpin D, maackiain, pterocarpin, trifolirhizin2, sophorapterocarsid A – E

Cấu trúc một số pterocarpan từ rễ Khổ sâm bắc

Nguồn Xirui He, 2015 2 Thành phần alkaloid

Alkaloid là thành phần hoạt chất phổ biến nhất trong Khổ sâm bắc, và đã có nhiều nghiên cứu về thành phần này trong vài thập kỷ qua đặc biệt là ở Trung Quốc Ngoài các alkaloid được phân lập từ rễ củ, nhóm hợp chất này cũng được báo cáo trong các bộ phận khác của Khổ sâm bắc như phần trên mặt đất, hoa và hạt Các alkaloid được phân loại dựa vào cấu trúc chủ yếu bao gồm 4 phân nhóm: kiểu matrin, kiểu cytisin, kiểu anagyrin và kiểu sophocarpin

Các alkaloid có kiểu khung matrin: matrin, isomatrin, allomatrin, neomatrin, trans-neomatrin, 9α-hydroxy-7, 11-dehydromatrin, oxymatrin, 9α- hydroxymatrin, 14β-hydroxymatrin, sophoranol, sophoranol N-oxid, oxysophoranol

cis-N-oxid, 13, 14-dehydroxysophoridin, 7, 11-dehydromatrin, 5α,9 α-hydroxymatrin2, flavesines G−J, alopecurine B, 7,11-dehydro-oxymatrin, 10-oxy-5,6-dehydromatrin, 10-oxysophoridinsophcence A

Các alkaloid có kiểu khung sophocarpin: sophocarpin, oxysophocarpin, sophocarpin N-oxid, 9α-hydroxysophocarpin, 9α-hydroxysophocarpin N-oxid, 12α-

hydroxysophocarpin, sophoramin, 13-ethylsophoramin, tetrahydroneosophoramin, isosophocarpin, 5epi-sophocarpin, 5α-hydroxysophocarpin2,

Các alkaloid có kiểu khung cytisin: cytisin, methylcytisin, baptifolin, rhombifolin4, N-butylcytisin, kushenin

Các alkaloid có kiểu khung anagyrin: anagyrin, flavascensin, lupinin, 5, dehydrolupanin, lehmannin 2

Sophocarpin Isosophocarpin 7,11-Dehydromatrin Matrin

Sophoridin 9a-Hydroxysophocarpin Lupanin

9a-hydroxysophoramin

Isomatrin Oxysophocarpin 7a-hydroxysophoramin

Leontalbinin N-oxid Sophoranol Oxymatrin 9a-hydroxymatrin

Một số thành phần alkaloid của Khổ sâm bắc

Nguồn Xirui He, 2015 2 Các nhóm hợp chất khác

Hiện nay, chỉ có 9 hợp chất triterpenoid đặc trưng đã được phân lập từ rễ của Khổ sâm bắc, gồm: lupeol, lupenon, monogynol B, β-amyrenol, soyasaponin І, và sophoraflavosid І - IV2

Một loạt các hợp chất khác, bao gồm một số lignan, phenylpropanoid, coumarin

và phenolic acid, cũng đã được phân lập từ rễ Khổ sâm bắc Ba lignan đã được xác định bao gồm: citrusin A, citrusin B và alaschanioside A Trong một nghiên cứu,

mười hai dẫn xuất dibenzoyl mới (sophodibenzosid A-L) đã được tinh chế từ phân đoạn n-butanol của Khổ sâm bắc Một số hợp chất khác bao gồm: syringin,

corchionosid C, coniferin, acid piscidic và benzyl O-β-D-glucopyranosid cũng đã

được phân lập từ thân và lá của cây này2

Gần đây cũng có một số công bố mới về một số nhóm hợp chất khác phân lập

từ S flavescens như: Jian-Shuang Jiang (2020) phân lập được 2 dẫn chất benzoic

acid là sophophenosid A và B, Guo-Xian Li (2021) đã xác định được 2 dẫn chất lavandulylated acylphloroglucinol là flavescenol A và B

Chiết xuất và phân lập các thành phần flavonoid và alkaloid từ Khổ sâm bắc

Chiết xuất và phân lập flavonoid

Các phương pháp chiết xuất

Các phương pháp chiết xuất dược liệu thông dụng như ngâm lạnh, ngâm nóng, chiết bằng Soxlet, ngấm kiệt,…với dung môi như ethanol, methanol, nước,…có hoặc không có yếu tố phụ trợ như khuấy trộn, nhiệt độ, siêu âm, vi sóng…16 Đối với dược liệu Khổ sâm bắc, Komatsu và cộng sự (1970) đã chiết xuất dược liệu này với phương pháp ngâm lạnh bằng methanol ở nhiệt độ phòng17 Những công trình gần đây, S

flavescens được chiết xuất với quy mô lớn bằng ethanol có nồng độ cao, có hoặc

không có sử dụng nhiệt độ Nhìn chung, rễ Khổ sâm bắc thường được chiết xuất bằng những dung môi thông dụng, đa năng, dễ bay hơi như methanol, ethanol có độ cồn khác nhau bằng phương pháp chiết xuất đơn giản như ngâm lạnh, ngấm kiệt hay đun hồi lưu

Các phương pháp phân lập, tinh chế

Sau khi chiết xuất dược liệu, dịch chiết được cô đặc thành cao toàn phần, tiếp theo tiến hành chiết lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần, đây là

xu hướng thực hiện phân lập các hợp chất flavonoid trên dược liệu Khổ sâm mà được nhiều tác giả thực hiện trong nghiên cứu của mình Các dung môi có độ phân cực tăng dần như diethyl ether, dicloromethan, ethyl acetat, n-butanol và nước được sử

dụng trong phương pháp chiết lỏng – lỏng Sau đó các dịch chiết này được cô đặc thành cao, báo cáo khối lượng và được lựa chọn để thực hiện các phương pháp tinh chế khác dựa trên độ phân cực của phân đoạn

Các cao phân đoạn này được tinh chế qua sắc ký cột silica gel pha thuận với một số hệ dung môi như n-hexan – aceton, dicloromethan – methanol, dicloromethan – ethyl acetat, benzen - ethyl acetat có độ phân cực phù hợp Đặc biệt Ryu Shi Yong

và cộng sự (1997) đã tiến hành chọn lọc các phân đoạn sau sắc ký cột silica gel pha thuận dựa trên tác dụng kháng tế bào ung thư của cao để tiếp tục tinh chế trên sắc ký cột và thu được 15 hợp chất tinh khiết18 Trong các nghiên cứu gần đây hơn của Sook Kyung Hyun và cộng sự (2008); Hyung-Jun Won và cộng sự (2015); Chang-Won Kang và cộng sự (2016) đã tinh chế các phân đoạn từ sắc ký cột pha thuận như đã đề cập ở trên bằng sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi methanol – nước và thu được các hợp chất tinh khiết 19-21

Dạng pha tĩnh khác cũng được sử dụng trong sắc ký các cao phân đoạn để cô lập hợp chất từ Khổ sâm bắc Yi Shen và cộng sự (2013); Chang-Won Kang và cộng

sự (2016) và Rong Huang cùng cộng sự (2017) sử dụng pha tĩnh là sephadex LH-20

để tinh chế các cao phân đoạn từ sắc ký cột silica gel pha thuận 7, 19, 21.

Xu hướng gần đây đã ghi nhận việc ứng dụng các phương pháp phân lập, tinh chế mới trong nghiên cứu thành phần hóa học cây Khổ sâm bắc nói riêng và dược liệu học nói chung đặc biệt là sự hỗ trợ của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế (HPLC điều chế) Năm 2013, Yi Shen và cộng sự với phương pháp HPLC điều chế đã thu được 24 hợp chất tinh khiết đa phần là các isoflavonoid glycosid22 Gần đây nhất, năm 2017, Rong Huang cùng cộng sự đã cô lập được 5 flavonoid trong

đó có một chất mới chưa từng được công bố trước đây là butenyl)-5,7,2′,4′-tetrahydroxyflavanon bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế7

Một số công trình nghiên cứu phân lập flavonoid từ Khổ sâm bắc

Một số công trình nghiên cứu phân lập flavonoid từ rễ Khổ sâm bắc Sophora flavescens Ait

TT Năm [ ] Khối lượng, bộ phận

dùng, dung môi chiết

Chiết phân bố lỏng – lỏng Xử lý qua cột Thu được sản phẩm Quốc gia

1 1970

17

Rễ Sophora angustifolia (tên gọi

khác) - chiết xuất bằng MeOH

Sau đó chiết phân bố cao MeOH với ether – nước Lắc lớp ether với dung dịch KOH 5%, lấy lớp nước acid hóa và lắc lại với ether

Lớp ether được tinh chế bằng sắc ký cột pha thuận

isoxanthohumol, xanthohumol và isoanhydroicaritin,

Chiết phân bố với ether Tiến hành sắc kí cột lớp ether với

hexan – aceton (2:1 – 1:2) thu được các phân đoạn tách bằng SKLM

3 g isokurarinon, 5 mg formononetin, 10 g norkurarinol,

15 g kuraridinol, 0,5 g neokurarinol, 40 g kurarinol

Chiết phân bố với EA thu được

660 g cao EA

Sắc ký cột cao EA bằng các dung môi

độ phân cực tăng dần (hexan, benzen, cloroform, ete, ethyl acetat) Phân đoạn benzen chạy sắc ký cột

120 mg kushenol A, 600 mg kushenol B, 60 mg kushenol D, 30

mg kushenin, 150 mg kushenol C

Trung quốc

4 1997 18 Rễ Khổ sâm bắc khô

cắt nhỏ (3kg) - chiết xuất với methanol ở nhiệt độ phòng

Chiết phân bố cao methanol thu được 35 g cao DCM, 50 g cao

EA

Sắc ký cột pha thuận phân đoạn DCM với dung môi DCM-MeOH (gradient) thu 6 phân đoạn Tiến hành tương tự với cao EA Chọn các phân đoạn có hoạt tính độc tế bào cao để tinh chế

72 mg formononetin, 55 mg kushenol E, 250 mg kushenol B,

480 mg sophoraflavanone G, 30

mg kushenol L, 500 mg kushenol

M, 110 mg kuraridin, 120 mg kurarinone, 20 mg kushenol N

Hàn quốc

TT Năm [ ] Khối lượng, bộ phận

dùng, dung môi chiết

Chiết phân bố lỏng – lỏng Xử lý qua cột Thu được sản phẩm Quốc gia

5 2003 23 Rễ khô S flavescens

(3,65 kg) ngâm với ethanol 80% ở nhiệt

độ phòng,

Chiết cao ethanol thu được với DCM, EA và n-butanol thu được 128,4 g, 25,5 g và 280,3 g cao tương ứng

Từ cao DCM, tiến hành sắc ký silica gel rửa bằng DCM - EA (gradient) cho

43 phân đoạn

Phân đoạn 2 được tinh chế trên silica gel bằng benzen - ethyl acetat (10:1) Phân đoạn 33 được tinh chế trên silica gel sử dụng benzen-ethyl acetat (3: 2)

Phân đoạn 2: 120 mg sophoraflavanon G Phân đoạn 33: 80 mg kuraridin và

Cao MeOH chiết lắc phân bố với cloroform

Thu 27 g cao cloroform đem sắc ký cột

410 mg kushenol A, 270 mg kurarinon, 230 mg sophoraflavanon

G, 170 mg 2-methoxykurarinon, 890

mg kurarinol, 13 mg prenylkaempferol, 210 mg isoxanthohumol, 97 mg kuraridin và

Phân đoạn cao EA (23 g) được sắc

ký rửa giải trên cột silica gel bằng

Phân đoạn 15 (1,5 g) tinh chế trên cột silica gel (DCM-MeOH, gradient)

150 mg kurarinol và 50 mg kuraridinol

Hàn quốc

TT Năm [ ] Khối lượng, bộ phận

dùng, dung môi chiết

Chiết phân bố lỏng – lỏng Xử lý qua cột Thu được sản phẩm Quốc gia

DCM-MeOH (gradient) thu được

17 phân đoạn

Phân đoạn 16 (15,4 g) được tinh chế trên cột silica gel (hexan-EA, gradient), và sắc ký cột RP-18 (70%

Cao MeOH chiết phân bố lần lượt với n-hexan, cloroform, EtOAc và n-butanol được 3,9 g; 22 g; 33,5 g

và 38,9 g cao tương ứng

Tiến hành sắc kí cột cao EA với hệ dung môi cloroform-ethyl acetat (gradient) được 21 phân đoạn Sắc

ký cột pha đảo phân đoạn 15 (2 g) với hệ dung môi MeOH-H 2 O (gradient) được 12 phân đoạn

Tiến hành sắc ký cột pha đảo phân đoạn 9-15 (120 mg) với dung môi MeOH-H 2 O (70:30)

53 mg kuraridin Hàn quốc

TT Năm [ ] Khối lượng, bộ phận

dùng, dung môi chiết

Chiết phân bố lỏng – lỏng Xử lý qua cột Thu được sản phẩm Quốc gia

và HPLC điều chế

12 dẫn chất của dibenzoyl, 5 isoflavone glycoside mới cùng 8 hợp

chất đã biết trong rễ cây S flavescens

Phân đoạn B, C, D, E qua cột sephadex LH-20, cột pha đảo C-

18 và HPLC bán điều chế thu được 8 hợp chất flavonoid

công bố lần đầu là 2-butenyl)-5,7,2′,4′

8-(3-hydroxymethyl-tetrahydroxyflavanon,

7 chất còn lại đã biết: trihydroxy-5-methoxy-8-

(2R)-3α,7,4′-prenylflavanon, (2R)-3β,7,4′- trihydroxy-5-methoxy-8-

prenylflavanon, dihydroxycoumarin, shandougenines B, specionin, kushenol N và kushenol I

3,7-Trung quốc

TT Năm [ ] Khối lượng, bộ phận

dùng, dung môi chiết

Chiết phân bố lỏng – lỏng Xử lý qua cột Thu được sản phẩm Quốc gia

Phân đoạn C được tinh chế bằng cột sắc ký pha thuận MeOH – nước (gradient) cho 16 phân đoạn Các phân đoạn này sử dụng phương pháp HPLC điều chế

8 hợp chất biflavonoids lần đầu được công bố là Sophobiflavonoid A-H

Trung quốc

Chiết xuất và phân lập alkaloid

Các phương pháp chiết xuất

Một trong những nghiên cứu đầu tiên trên thành phần hóa học của dược liệu Khổ sâm bắc được thực hiện bởi Komatsu và cộng sự (1970) đã chiết xuất dược liệu này bằng methanol với phương pháp ngâm lạnh ở nhiệt độ phòng 17 Các nghiên cứu khác của thế kỷ trước cũng sử dụng dung môi chiết xuất tương tự là methanol nhưng với các phương pháp chiết xuất khác như đun hồi lưu và trích nóng Những công trình gần đây được các tác giả thực hiện chiết xuất bằng ethanol có nồng độ cao, có hoặc không có sử dụng nhiệt độ Nhìn chung các nghiên cứu trước đây chiết xuất

Sophora flavescens bằng những dung môi thông dụng, đa năng, dễ bay hơi như

methanol, ethanol độ cồn khác nhau với phương pháp chiết xuất đơn giản như ngâm lạnh, ngấm kiệt hay đun hồi lưu

Phương pháp chiết xuất đối với dược liệu khô được sử dụng là phương pháp ngâm hoặc phương pháp ngấm kiệt Đối với phương pháp ngâm, quá trình ngâm có thể được lặp lại thêm 1 hay vài lần để chiết kiệt hoạt chất trong dược liệu Sự khuấy trộn, các yếu tố phụ trợ như nhiệt độ, siêu âm, vi sóng, chất diện hoạt… có thể được

sử dụng để gia tăng quá trình chiết Các phương pháp ngâm thường được sử dụng:

phương pháp ngâm lạnh, phương pháp ngâm nóng, chiết bằng Soxhlet, chiết bằng dung môi ở nhiệt độ sôi

Phương pháp ngấm kiệt có thể sử dụng các yếu tố phụ trợ như nhiệt độ, chất diện hoạt… để gia tăng quá trình chiết26

Các phương pháp phân lập, tinh chế

Các alkaloid được tiến hành phân lập, tinh chế bằng các phương pháp hóa học

và phương pháp sắc ký

Các phương pháp hóa học được áp dụng cho các alkaloid gồm26:

- Tách riêng các alkaloid bằng cách tủa với các thuốc thử chung của alkaloid

- Tách riêng các alkaloid ra khỏi các chất tan trong dung môi hữu cơ bằng nước acid

- Tách riêng các alkaloid ra khỏi các chất tan trong nước bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm

Các phương pháp sắc ký thường được sử dụng để phân lập, tinh chế các alkaloid như sắc ký cột cổ điển, sắc ký rây phân tử và sắc ký lỏng điều chế Tuy nhiên, vì các alkaloid trong cây thường có cấu trúc khá giống nhau nên khó phân tách bằng các phương pháp sắc ký thông thường Hiện nay, các phương pháp sắc ký được ưu chuộng hơn gồm sắc ký trao đổi ion, sắc ký phân bố ngược dòng có thay đổi pH

Một số công trình nghiên cứu phân lập alkaloid từ Khổ sâm bắc

Một số công trình nghiên cứu phân lập alkaloid từ Khổ sâm bắc Sophora flavescens Ait

TT Năm

[ ]

Khối lượng, bộ phận dùng, dung môi chiết Chiết phân bố lỏng lỏng Xử lý qua cột Thu được sản phẩm Quốc gia

Cao alcaloid tổng + ether Oxymatrin 2 g Nhật

Dịch còn lại qua sắc ký cột pha thuận Al 2 O 3 ,

dung môi` ether ethylic - ethanol (19:1 – 1:10)

Dịch nước thêm NaOH đến

pH 9,6 và tiếp tục chiết với CHCl 3 Dịch CHCl 3 này được

cô quay đến cắn khô

Alkaloid được phân lập và tinh chế bằng phương pháp sắc ký phân bố ngược dòng điều chỉnh

pH

Từ 1,0 g cao thô tiến hành tinh chế

170 mg sophocarpin và 600 mg matrin với độ tinh khiết cao hơn 98%

Dịch chiết được tiến hành sắc ký pha rắn đánh dấu phân tử

hệ dung môi MeOH – H 2 O (3:7)

để rửa tạp, hệ dung môi acid acetic băng - MeOH (9:1) rửa giải matrin

38.7 µg/g -1 matrin (tinh khiết 71.4%) Trung quốc

TT Năm

[ ]

Khối lượng, bộ phận dùng, dung môi chiết Chiết phân bố lỏng lỏng Xử lý qua cột Thu được sản phẩm Quốc gia

4 2007 30 5,5 g bột khô được ngâm

lạnh hỗn hợp dung môi EtOH –NH 4 OH 25% (4:1)

Trung Quốc

5 2008 31 Rễ khô

Được chiết với nước ở nhiệt

độ 80 o C trong thời gian 4 giờ

Dịch chiết - sắc ký điều chế pha đảo - dung môi MeOH – H 2 O - acid trifluoroacetic (16:84:0.002)

Matrin 0,0091 mg/g (90,8%)

và oxymatrin 0,15 mg/g (88,1%)

Trung quốc

6 2008 32 1 kg dược liệu được chiết

với 3 lần mỗi lần 10 lít nước trong 10 giờ Cô dịch chiết lại còn 1 lít

Dịch chiết này được đưa qua các loại cột resin khác nhau để thu được 50 g alkaloid gồm 83%

TT Năm

[ ]

Khối lượng, bộ phận dùng, dung môi chiết Chiết phân bố lỏng lỏng Xử lý qua cột Thu được sản phẩm Quốc gia

7 2010 33 10,0 kg rễ chiết với hệ dung

môi aceton - H 2 O (7:3) ở nhiệt độ phòng

Sau đó là được hòa tan trong nước ấm đã được acid hóa bằng HCl đến pH 4 – 5, chiết phân bố với CHCl 3 Lớp nước được trung hòa với NaOH đến

pH 9 - 10 và chiết xuất với CHCl 3 một lần nữa Cô chân không dịch CHCl 3 này thu được 55,0 g cao đặc

Cao alkaloid được tiến hành sắc

ký cột silica-gel với hệ dung môi CHCl 3 - MeOH -NH 4 OH 28%

(50:1:0,1 → 2:1:0,1), thu được 6 phân đoạn Các phân đoạn được tiến hành sắc ký cột silica-gel lần

2 với các hệ dung môi khác nhau

và được tinh chế bằng cột sắc ký rây phân tử như sephadex LH-20 hay bằng sắc ký lớp mỏng điều chế

17 chất gồm:

9α – hydroxyl - 7,11 – dehydromatrin 5 mg, matrin > 1 g, N-methylcytisin 47 mg, isomatrin

26 mg, allomatrin 9 mg, hydroxymatrin 31 mg, 7,11- dehydromatrin 18 mg, sophocarpin

> 1g, oxymatrin 87 mg, hydroxysophoramin 23 mg, sophoridin 6 mg, oxysophocarpin >

9α-1 g, 9α-hydroxymatrin 39α-1 mg, 9α-hydroxysophocarpin 17 mg, 14β- hydroxymatrin 27 mg, flavascensin

4 mg, sophoramin 13 mg, hydroxysophoramin 23 mg và 5α- hydroxymatrin 54 mg

oxymatrin với độ tinh sạch 93,4% Trung quốc

TT Năm

[ ]

Khối lượng, bộ phận dùng, dung môi chiết Chiết phân bố lỏng lỏng Xử lý qua cột Thu được sản phẩm Quốc gia

9 2014 35 3 kg Khổ sâm bắc chiết xuất

ba lần với ethanol 95%

trong 1,5 h

Các dịch chiết được cô quay thu hồi dưới áp suất giảm thu được cao toàn phần Phân tán cao trong nước và kiềm hóa với amoniac đến pH 10 Chiết phân bố năm lần với cloroform Sau đó, các dịch chiết được kết hợp và cô quay thu được cao alkaloid

Cao alkaloid - sắc ký cột silica gel

và hệ dung môi CHCl 3

-MeOH-H 2 O

3 alkaloid gồm:

oxymatrin, matrin, lupeol

Trung quốc

10 2015 35 0,5 g dược liệu khô phân tán

trong hệ thống 2 dung môi gồm ethanol và amoniac sulfat

Có sử dụng vi sóng hỗ trợ Được dịch chiết alkaloid và các tạp

Sau đó, dược liệu được chiết với 500 ml dung dịch HCl 0,3% ở 90 o C trong 1 giờ

Dịch chiết được lọc và ly tâm

Dịch nổi phía trên được cô đặc

và sấy khô trong lò chân không ở 50 o C Hòa tan dịch chiết trong nước

Cột resin được kiềm hóa đến pH

10 bằng NaOH, sau đó nạp dịch alkaloid Tiến hành rửa giải bằng diethyl ete và EtOH 50%

Để thu được tương ứng là matrin và oxymatrin

Trung quốc

TT Năm

[ ]

Khối lượng, bộ phận dùng, dung môi chiết Chiết phân bố lỏng lỏng Xử lý qua cột Thu được sản phẩm Quốc gia

bố với ether dầu và ethyl acetat

Sắc ký cột silica-gel với cao 360

g cao etyl acetat với hệ dung môi CHCl 3 - MeOH) (100: 0 → 50:

50) thu được 13 phân đoạn (1–

13) Sau đó, phân đoạn 2 được phân tách thêm bằng cột silica gel, cột Sephadex LH-20 và HPLC điều chế

9 alkaloid gồm:

16 mg 5-hydroxylupanin, 15 mg sophoramin, 25 mg 7- hydroxylupanin, 23 mg oxylupanin,

12 mg kushenin, 18 mg butylcytisin, 18 mg lupanin, 36 mg oxymatin, 28 mg matrin

N-Trung quốc