Nghiên cứu trích ly hoạt chất từ lá hoàn ngọc bằng kỹ thuật co2 siêu tới hạn và thử nghiệm hoạt tính sinh học

Thực ughiệin- Trích ly polyphenol ừr lá Hoàn Ngọc bằng kỳ thuật CO: siêu tới hạn:- Kháo sát ánh hường từng yếu tố áp suất, thời gian, thể tích ethanol và nhiệt độ đến hàmlượng polyphenol

ĐẠI HỌC QUÓC GIA TP.HCM TRỮỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - oOo -

NGUYỀN PHAN HÒNG MAI

NGHIÊN CỨU TRÍCH LY HOẠT CHÁT TỪ LÁ HOÀN NGỌC

BẢNG KỸ THUẬT CO1 SIÊU TỚI HẠN

VÀ THI NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌCSTUDY ON EXTRACTING ACTIVE INGREDIENTS FROM HO AN NGOC

LEAVES BY SUPERCRITICAL CO 2 TECHNIQUE

AND BIO ACTIVITY TESTING

Chuyên ngành: KỸ THUẬT HÓA HỌC

Mà số: 8.52.03.01

LUẬN VÁN THẠC sì

TP HÒ CHÍ MINH, tháng 01 nãm 2023

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỮ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại Học Bách Khoa - ĐHQG-HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyền Hừu Hiếu

Cán bộ chấm nhận xét 1: TS Hoàng Minh Nam

2 ửy viên phản biện 1: TS Hoàng Minh Nam

3 ửy viên phán biện 2: TS Nguyền Quốc Thắng

4 Úy viên: TS Huỳnh Ngọc Oanh

5 Thư ký: TS Nguyền Tiến Giang

Xác nhận cũa Chú tịch Hội đồng đánh giá LV và Trường Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sứa chừa (nếu có)

(Họ tên và chữ ký)

ĐẠI HỌC QUÓC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC sĩ

Họ tên học viên: Nguyễn Phan Hồng Mai Ngày, tháng, năm sinh:

24 01/1994 Chuyên ngành: Kỳ thuật Hóa học

I TÊN ĐÈ TÀI

bang kỳ thuật CO: siêu tới hạn và thứ nghiệm hoạt tính sinh học

CO: technique and bioactivity testing

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

ly CO: siêu tới hạn quy hoạch thực nghiệm, phương pháp thứ nghiệm hoạt tính sinh học

2.2 Thực ughiệin

- Trích ly polyphenol ừr lá Hoàn Ngọc bằng kỳ thuật CO: siêu tới hạn:

- Kháo sát ánh hường từng yếu tố áp suất, thời gian, thể tích ethanol và nhiệt độ đến hàmlượng polyphenol;

- Kháo sát ánh hường đồng thời bốn yếu tố áp suất, thời gian, thể tích ethanol và nhiệt

độ đến hàm lượng polyphenol bằng phương pháp đáp ứng bề mặt thiết kế theo mô hình Belinken:

Box Đánh giá bề mặt nguyên liệu trước và sau trích ly bằng kính hiển vi điện tứ quét;

- Thứ nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa kháng khuẩn và kháng ung thư

Để hoàn thành luận văn này, đầu tiên tác giả xin trân trọng cám ơn đến người thân và gia đình

đà luôn quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tác giá trong suốt thời gian thực

MSHV: 1970649 Nơisinh: Đồng Nai Mà số: 8520301

CÁN Bộ HƯỚNG DẦN

hiện luận văn này

Tác giá xin chân thành cám ơn thầy PGS.TS Nguyền Hừu Hiếu đà tận tình hướng dần, tạo điềukiện thuận lợi cho tác giá trong suốt quá trình học tập vả thực hiện luận văn

Tác giả xin gứi lời cám ơn đến các học viên, nghiên cứu viên và các bạn sinh viên ờ Phòng thínghiệm Trọng điểm ĐHQG-HCM Công nghệ Hóa học & Dầu khí (Key CEPP Lab), Trường ĐạiHọc Bách Khoa - ĐHQG TP.HCM đà hồ trợ tác giá trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tác giả

Nguyền Phan Hồng Mai

TÓM TÁT

Trong luận vãn này cao Trích thu nhận tìr lá Hoàn Ngọc được trích ly bằng kỳ thuật trích lyCƠ2 siêu tới hạn Hàm lượng polyphenol trong cao trích được xác định bằng phương phápquang phổ hấp thu phân tir (ultraviolet-visible spectroscopy-UV-vis)

Ảnh hường cùa từng điều kiện trích ly như áp suất, thời gian, thể tích ethanol và nhiệt độ đếnhàm lượng polyphenol được kháo sát bàng phương pháp luân phiên n'rng biến để tim rakhoảng biến thiên phù hợp Sau đó, tiến hành kháo sát đổng thời bằng quy hoạch thí nghiệm sứdụng mô hình Box-Belinken số liệu được xứ lý bằng phần mềm Design Expert 11.0 để tìmđiều kiện trích ly cho hàm lượng polyphenol cao nhất

Hình thái cấu trúc bề mặt nguyên liệu trước và sau khi trích ly được phàn tích bằng kính hiển

vi điện tứ quét

Polyphenol thu nhận tại điều kiện tối mi được kháo sát hoạt tính sinh học thông qua khá năngkháng oxy hóa sứ dụng phương pháp bắt gốc nr do 1.1-diphenyl- l-picrylhydrazyl với đốichứng dương là axit ascorbic, khá năng kháng khuẩn cùa cao trích được thứ nghiệm trên

Escherichia coìì và Staphylococcus aureus bằng phương pháp đo đirờng kính vòng kháng

kliuần và ức chế tế bào ung thư trên hai dòng tế bào ung thư là dòng tế bào ung ung thư phổi(A549) và ung thư gan (MCF-7) bằng phương pháp tetrazolium

ABSTRACT

In this thesis, the extract obtained from Hoan Ngoc leaves was extracted by supercriticalCƠ2 extraction technique The polyphenol content in the extract was determined byultraviolet-visible spectroscopy

The influence of each extraction condition such as pressure, time, ethanokmaterial ratio andtemperature on polyphenol content was investigated by the method of alternating each variable

to find a suitable variation range Then, conduct a simultaneous survey by planning anexperiment using the Box-Belinken model Data were processed with Design Expert 11.0software to find extraction conditions for the highest polyphenol content

Surface structure morphology of raw materials before and after extraction was analyzed byscanning electron microscopy

Polyphenol obtained at optimal conditions were investigated for their biological activitythrough antioxidant capacity using the free radical scavenging method 1,1- diphenyl-l-picrylhydrazyl with a positive control of ascorbic acid, the antibacterial activity of the extract

was tested on Escherichia coii and Staphylococcus aureus by antibacterial inhibition diameter

measurement, and cytotoxicity with A549 and MCF-7 cell line by MTT assay

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả xin cam đoan luận văn nảy lả công trình nghiên cứu thực sự cùa cá nhân tác giả và đượcthực hiện dưới sự hướng dẫn cùa hai thầy TS Hoàng Minh Nam và PGS TS Nguyễn Hữu Hiếu,Phông thí nghiệm Trọng điểm ĐHQG HCM Công nghệ Hóa học và Dầu khí (Key CEPP Lab),Trường Đại học Bách Khoa - ĐHQG TP HCM

Các số liệu, kết quá nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực, chưa được công bốtrong bất cứ một công trình nào khác trước đây Mọi sự giúp đờ cho việc hoàn thành luận vănnày đều đà được cảm ơn, các thông tin trích dần trong luận văn này đều đà được chi rõ nguồngốc

Tác giá xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu cùa minh

Tác giả

Nguyền Phan Hồng Mai

I i

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN lii

TÓM TẮT iv

ABSTRACT V LỜI CAM ĐOAN vi

MỤC LỤC vii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TÁT xii

ĐẠT VÁN ĐẺ 1

CHƯƠNG 1: TỎNG QUAN 3

1.1 Tông quan về Hoàn Ngọc 3

1.1.1 Giới thiệu chung 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái 3

1.1.3 Thành phần hóa học 4

1.1.4 Công dụng 6

1.2 Hoạt tính sinh học cùa lá Hoàn Ngọc 7

1.2.1 Kháng oxy hóa 7

1.2.2 Kháng ung thư 9

1.2.3 Kháng khuẩn 10

1.3 Phương pháp trích ly 11

1.3.1 Kỹ thuật lưu chất siêu tới hạn 13

1.3.2 Nguyên lý hoạt động và sự biến đổi trạng thái cùa co? trong quá trình trích ly 14

1.3.3 Hệ thống trích ly bằng co2 siêu tới hạn 15

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 16

1.4.1 Trong nước 16

1.4.2 Ngoài nước 17

1.5 Mục tiêu, nội dung, phương pháp nghiên cứu, tính mới và đóng góp cùa luận văn 18

1.5.1 Mục tiêu 18

1.5.2 Nội dung nghiên cứu 19

1.5.3 Phương pháp nghiên cứu 19

1.5.4 Tính mới 23

1.5.5 Đóng góp 23

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 24

2.1 Nguyên liệu, hoá chất, dụng cụ, thiết bị và địa điểm thực hiện 24

2.1.1 Nguyên liệu 24

2.1.2 Hoá chất 24

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ 25

2.1.4 Địa điềm thực hiện 26

2.2 Thí nghiệm 26

2.2.1 Khảo sát ânh hưởng của các yếu tố đến hàm lượngpolyphenol 26

2.2.2 Phương pháp phân tích cấu trúc nguyên liệu trước vàsau kill trích ly 31

2.2.3 Thừ nghiệm hoạt tính sinh học cùa cao trích 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33

3.1 Ảnh hưởng cùa các yếu tố đến hàm lượng polyphenol 33

3.1.1 Ảnh hường của từng yếu tố 33

3.1.2 Khảo sát sự ânh hường đồng thời cùa các yếu tố đến hàm lượng polyphenol 36

3.2 Bề mặt nguyên liệu trước và sau khi trích ly 44

3.3 Hoạt tính sinh học cùa cao trích 45

3.3.1 Hoạt tính kháng oxy hoá 45

3.3.2 Hoạt tính kháng khuẩn 46

3.3.3 Hoạt tính ức chế tế bào ung thư 47

CHƯƠNG 4: KÉT LUẬN 49

4.1 Kết luận 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

PHỤ LỤC 56

Hình 1.1: (a) Cây, (b) hoa và (c) lá Hoàn Ngọc 4

Hình 1.2: Phân loại polyphenol 5

Hình 1.3: Công thức hóa học cùa axit gallic 6

Hình 1.4: Công thức hóa học cùa axit chlorogenic 6

Hình 1.5: Nguyên nhân gây ra gốc tự do 8

Hình 1.6: Phản ứng trung hòa gốc tự do cùaaxit ascorbic 9

o o v-x • Hình 1.7: Cơ chế kháng khuẩn cùa các hợp chất 10

Hình 1.8: Giãn đồ pha cùa CŨ2 15

Hình 1.9: (a) Thiết bị chính, (b) bơm đồng dung môi, (c) bộ điều khiên và (d) hệ thống làm lạnh 16

Hình 1.10: Mô hình Box-Behnken 20

Hình 1.11: Sơ đồ nguyên lý UV-vis 20

Hình 1.12: Nguyên tắc hoạt động máy FE-SEM 21

Hình 1.13: Phân ứng mất màu cùa DPPH với chất kháng oxy hoá 22

Hình 2.1: Bột lá Hoàn Ngọc 24

Hình 2.2: Quy trình thu nhận cao trích từ lá Hoàn Ngọc bằng kỳ thuật CO2 siêu tới hạn 26

Hình 3.1: Ảnh hường cùa áp suất đến hàm lượng polyphenol 33

Hình 3.2: Ảnh hường cùa thời gian đến hàm lượng polyphenol 34

Hình 3.3: Ánh hường cùa thể tích ethanol đến hàm hrợng polyphenol 35

Hình 3.4: Ảnh hường cùa nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol 36

Hình 3.5: Ảnh hường đồng thời cùa áp suất và thời gian đến hàm lượng polyphenol 39 Hình 3.6: Ảnh hường đồng thời cùa áp suất và thể tích đến hàm lượng polyphenol 40 Hình 3.7: Ảnh hường đồng thời cùa áp suất và nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol 41 Hình 3.8: Ảnh hường đồng thời cùa thời gian và nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol42 Hình 3.9: Ánh hưởng đồng thời cùa thể tích ethanol và nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol 43

Hình 3.10: Hàm lượng polyphenol cữa mẫu tối ưu và các mẫu đối chứng 44

Hình 3.11: Hình ảnh FE—SEM cùa bột lá Hoàn Ngọc trước (a) và (b) sau khi trích ly 45

Hình 3.12: Phần trăm bắt gốc tự do DPPH của a) axit ascobic và b) cao trích 45

Hình 3.13: Vùng ức chế (a) S' aureus và (b) E co!i cũa cao trích lá Hoàn Ngọc 47

Hình 3.14: Hoạt tính kháng ung thư của dịch chiết Hoàn Ngọc đối VỚI hai dòng tế bào ung

thư A549 và MCF7 48

DANH MỤC BẢNG•

Bâng 1.1: Thành phần hóa học của cây Hoàn Ngọc 4

Bâng 1.2: ưu và nhược điểm của phương pháp trích ly 11

Bàng 1.3: Trạng thái tới hạn cừa số của một số lưu chất 13

Being 1.4: Tình 1111111 nghiên cứu trong nước 16

Bâng 1.5: Tình hình nghiên cứu ngoài nước 17

Bâng 2.1: Danh mục hoá chất 24

Bàng 2.2: Thiết bị và dụng cụ sử dụng 25

Bâng 2.3: Các yếu tố khảo sát 27

Bâng 2.4: Khảo sát ànli hưởng của áp suất 27

Being 2.5: Kliào sát ảnh hường cùa thời gian 28

Beàng 2.6: Khảo sát ânh hường cùa thể tích ethanol 28

Being 2.7: Khảo sát ânh hường cùa nhiệt độ 29

Bâng 2.8: Thiết kế thí nghiệm theo mô hình BBD 29

Being 3.1: Kết quả thí nghiệm thiết kế theo mô hình Box-Behnken 36

Bảng 3.2: Kết quâ phân tích ANOVA 37

tới hạn

ĐẠT VẤN ĐÊ

Ung thư là một vấn đề sức khỏe lớn, được xếp hạng là nguyên nhân gây từ vong hàng đầutrên toàn thế giới Đẻ điều tri ưng thư, hóa trị là một trong những phương pháp điều trị được sừdụng phồ biến nhất vì có khả năng tiêu diệt tế bào ác tính đang tăng trưởng và phân chia nhanhtrong cơ thê người bệnh Tuy nhiên, hóa trị có nhiều tác dụng phụ do sử dụng hóa chất tổnghợp Đe giãi quyết nhược điềm này, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để phát triển các sânphẩm có nguồn gốc từ tự nhiên như một giãi pháp thay thế có độc tính thấp hơn đối VỚI cơ thểcon người và cho hiệu quả tốt hơn trong điều trị ung thư Ngoài ra, tình trạng vi khuẩn khángkháng sinh cùng tác động đáng kể đến tỳ lệ gia tăng các bệnh nhiễm khuẩn Theo Tổ chức Y Tếthế giới, ước tính có khoảng 33.110 người tử vong trong năm 2015 ở châu Ầu do nhiễm khuẩnkháng kháng sinh và nhiễm khuẩn kháng thuốc Trên thế giới có khoảng 700.000 người tữ vong

hảng năm do các chúng vi khuẩn nhir Staphylococcus aureus, Escherichia coỉi, Klebsiella

pneumoniae, v.v Đến năm 2050 tình trạng vi khuẩn kháng kháng sinh có thể cướp đi sinh

mạng cùa 10 triệu người Các phương pháp hiện đại để điều trị các căn bệnh trên tuy hiệu quànhưng có nhiều tác dụng phụ và vân còn hạn chế do điều kiện kinh tế mồi quốc gia là khácnhau Do đó, việc tìm ra các hợp chất có khả năng ngăn ngừa và nâng cao sức đề kháng của cơthể là rất cần thiết Các hợp chất có nguồn gốc từ thực vật có kliâ nâng kháng VI rút, khángkhuẩn, tăng cường sức đề kháng, ức chế tể bào ung thư Một trong số các loài thảo dược nổi bậc

có hoạt tính sinh học là cây Hoàn Ngọc, đây cũng là loại cây được sừ dụng phổ biến trong y học

cổ truyền cùa Việt Nam

Dxrợc liệu có thê được trích ly bang nhiều phương pháp khác nhau như trích ly bangphương pháp truyền thống sữ dụng dung môi hữu cơ hoặc nước nóng, những phương pháp này

có nhiều hạn chế như hiệu quâ trích ly thấp, làm biến tính các hoạt chất, tồn tại các dung môihữu cơ độc trong sàn phẩm thu được Phương pháp trích ly co? siêu tới hạn sừ dụng dung môi làCO2 có một số tính chất như dung môi sạch, an toàn, ít tốn kém, không bắt lừa không độc, thânthiện với môi trường, không gây ô nhiễm, chính vì thế trích ly bằng CO2 siêu tới hạn được lựachọn để phân tách các cấu tử mong muốn mà không đế lại các chất thải độc hại trong quá trìnhtrích ly và giảm rùi ro về sự biến tính vì nhiệt của các sân phẩm trong quá trình trích Trích lybằng hru chất siêu tới hạn có thể thay thế khá quan cho những phương pháp sir dụng dung môithông thường trong quá trình trích ly và sản xuất các sàn phẩm dược thào Đồng thời, CO2 siêu

CHƯƠNG 1: TỎNG QUAN1.1 Tổng quan về Hoàn Ngọc

/ / / Giới thiệu chung

Hoàn Ngọc có tên khoa học (Pseuderanthennnnpcilatiferuin (Nees)., Ralk) thuộc họ Ô rô

(Acanthaceae) Cây Hoàn Ngọc có tên gọi khác là Xuân Hoa Nhật Nguyệt và Trạc mà Thần tượnglinh [1], Cây Hoàn Ngọc là cây thuốc bân địa cùa Việt Nam và được phát hiện lần đầu tiên trongrừng Cúc Phương, miền Bắc Việt Nam vào cuối nhùng năm 1990 Cây Hoàn Ngọc được định danhnhư sau:

Chi: Xuân hoa (Pseuderantheiììuuì)

Loài: Xuân hoa vòm (Pseuderanthennunpalatiferuin)

1.1.2 Đặc diêm hình thái

Cây Hoàn Ngọc là dạng cây bụi, cao từ 1 - 2 m phần gốc hoá gồ màu nâu thân non màu xanh lục,chia nhiều cành mãnh như thể hiện ở hình l.la Hoa lường tính, 5 lá đài rời tồn tại đến kill trànghợp, màu trắng, ống tràng hẹp và dài khoáng 2,5 cm như thể hiện ờ hình l.lb Quâ nang, hai ô, mỗi

ô chứa hai hạt Cày ra hoa từ tháng 4-5 Lá có phiến thon, lá mọc đối, có cuống, phiến lá hình lưỡimác, hai đầu nhọn, dài 12-17 cm rộng 3,5-5 cm như thể hiện hình l.lc [2]

Hình 1.1: (a) Cây, (b) hoa và (c) lá Hoàn Ngọc

1.1.3 Thành phần hóa học

Thành phần hóa học cùa Hoàn Ngọc gồm nhiều hợp chất như phenolic, phytosterol, lipit, saponin

có thể góp phần tạo nên các hoạt tính sinh học như ức chế tăng trường tế bào ung thư, hồ trợ điềutrị tiểu đường, hạ huyết áp, chống viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa Hàm lượng một số hoạt chấtđược trích ly bằng các phương pháp khác nhau được trình bày ở bâng 1.1

Bâng 1.1: Thành phần hóa học của cây Hoàn Ngọc

Phenolic tổng

Flavonoid tồng

40,94 ± 0,5232,25 ± 0,46

1.13.1 Polyphenol

Lá Hoàn Ngọc chứa nhiều các hoạt chất có hoạt tính sinh học thuộc nhóm polyphenol [6, 7].Polyphenol là các hợp chất mà phân từ chứa nhiều vòng benzen trong đó có một hai hoặc nhiềunhóm hydroxyl Là hợp chất chuyền hóa thứ cấp có mặt trong hầu hết các loài thực vật, polyphenol

đa dạng về cấu trúc từ các hợp chất có cấu trúc đơn giãn như vanilin, axit gallic và axit chlorogenicđến các polyphenol như stibene, flavonoid và lignan [8] Chi riêng nhóm flavonoid đà phát hiệnđược hơn 8000 cấu trúc phân từ và danh sách này vẫn liên tục được bổ sung Điều đó đã cho thấy

sự đa dạng và phân bố rộng lớn cùa hợp chất polyphenol trong cấu trúc thực vật Dưa vào đặctrưng của cấu trúc hóa học mà hợp chất polyphenol được chia thành ba nhóm chính như ờ hình 1.2

Hình 1.2: Phân loại polyphenolNhóm phenolic được chú ý bời kliâ năng chống oxy hóa khả năng chuyển electron trong chuồi hôhấp bình thường trong ty thế vì phenolic có klià năng tạo phức bền với các kim loại, do đó làm mấthoạt tính cùa các gốc tự do đồng thời nhóm phenolic còn có khả năng tiling hoà các gốc tự do làmngừng các quá trình tạo gốc tự do Ngoài ra các axit gallic và axit chlorogenic góp phần vào kliânăng kháng khuẩn, hấp thụ tia cực tím, phòng tránh các bệnh về tim mạch và xơ vừa động mạch(nghiên cứu trên chuột), khả năng ngăn ngừa ung thư, ngăn ngừa những ảnh hưởng bất lợi của độc

tố nấm đến sức kliòe con người Công thức hoá học cùa axit gallic và axit chlorogenic được thềhiện như hình 1.3 và 1.4 [9]

Hình 1.3: Công thức hóa học của axit gallic

Khác Axit phenolic

Anthocyanin

Hình 1.4: Công thức hóa học cùa axit chlorogemc

1.1. ỉ 2 Các thành phần khác

Các nguyên tố đa lượng và vi lượng trong lá cây Hoàn Ngọc khá cao so với các loại cây khác.Không phát hiện các nguyên tố kim loại nặng như Cd, Pd, As, Cr Đáng chú ý là hàm lượngVanadi khá cao (3,75 mg/100 g lá tươi) Ngoài ra lá Hoàn Ngọc còn chứa đầy đu các axit aminthiết yếu với hàm lượng tống số khá cao (751 đến 1365 mg)

Nghiên círu về thành phần hóa học của lá Hoàn Ngọc có chứa p-Sitosterol, Phytol, 3- O-(p-Dglucopyranosyl)-Sitosterol, hỗn hợp hai đồng phân epune stigmasterol và poiiferasterol, n-pentacosan-l-ol và hỗn hợp cùa kaumpferol 3-methyl ether 7-0- P- glucoside, apigenin 7-0-p-glucoside, 1-triacontanol, glycerol 1-hexdecanoate, axit palmitic và acid salicylic [10] NguyềnVăn Hùng và cộng sự (2004) [4] đã phân lập được tiếp theo là 1-triacontanol, glycerol 1-hexdecanoate, axit palmitic và axit salicylic

1.1.4 Công đụng

Theo kinh nghiệm dân gian, lá Hoàn Ngọc chita đirợc nhiều loại bệnh như:

- Rối loạn tiêu hóa viêm loét dạ dày, tá tràng: Mỗi lần 7 lá, ngày 2 lần dùng trong 3 - 5 ngày;

- Điều trị các bệnh về gan như xơ gan, viêm gan, bằng cách lấy khoảng 10 lá Hoàn Ngọc tươilira sạch rồi nhai kỹ hoặc ăn sống khi bụng đói mồi ngày 3 lần Đối với lá khô thì nên nghiềnthành bột rồi hòa với bộ: tam thất theo tỷ lệ 1:1 Mồi lần người bệnh uống 1 muỗng cà phêvới nước ấm uống với liều 3 lần/ngày;

- Ngoài các tác dụng chữa trị trên người, lá Hoàn Ngọc còn được dừng để trị nhiễm khuẩnđường tiêu hóa như tiêu chày, lỵ trực khuẩn, viêm đại tràng màn tính, chữa bệnh cho gia súcnlnr tiêu chày ở lợn và ở gia cầm làm tăng hồng cầu tăng hàm lượng hemoglobin và tăngtrọng lượng cùa lợn con saư cai sữa và giâm tỷ lệ còi cọc

Theo các nghiên cứu khoa học về dược lý cừa lá Hoàn Ngọc:

- Hồ trợ điều trị các chứng bệnh như gan nhiễm mờ, u xơ huyết áp, tiều đường, nhiễm khuẩn

và rối loạn chức năng theo nghiên círu cũa Viện Nghiên cứu Quốc tế và Nông nghiệpFuchu (Nhật Bân) phối hợp VỚI Đại học cần Thơ vào năm 2001

- Theo nghiên cứu cùa Viện Hóa học công bổ trên Tạp chí Y tế Thế giới cúa Đức PlantMedica vào năm 2001, lá Hoàn Ngọc có tác dụng hồ trợ ngăn ngừa, hạn chế sự phát triểncùa khối u ác tính Bên cạnh đó công trình nghiên cứu của Đại học Chiang Mai, Thái Lan

đà chi ra dịch chiết ethanol từ lá Hoàn Ngọc tươi có khả năng ức chế tế bào ung thư Vil

MDA-MB-231 ở người, hồ trợ trong điều trị ung thư và khác phục được những tác dụngphụ do thuốc gây ra.

- Các nhà khoa học thuộc khoa Y, Đại học Hồng Kông đà tiến hành nghiên cứu và cho kếtquà, hipeol làm giâm số lượng tế bào ưng thư đồng thời ngăn chặn quá trình trao đồi chấtxung quanh khối u từ đó ngăn ngừa khá năng di căn mà không gây độc VỚI các tế bàoklioẻ mạnh

1.2 Hoạt tính sinh học của lá Hoàn Ngọc

ĩ 2.1 Khảng oxy hóa

Hiện nay ngày càng có nhiều mối quan tâm về các chất chống oxy hóa thứ cấp từ thực vật như lànguồn bổ sung cho các hệ thống bão vệ chống lại sự oxy hóa có hại tồn tại sẵn có trong cơ thề.Trong quá trình hô hấp chúng đà tạo ra các hợp chất trung gian là các gốc tự do anion superoxide,hydroxyl, chất oxy hóa như H2O2 có hoạt tinh phân ứng rất lớn mà từ các chất này cũng như cácsàn phẩm phàn ứng cùa gốc tự do là nguyên nhân phá hủy các phân tử sinh học như axitdeoxyribonucleic (ADN), lipit và protein Mạc dù bản thân cùa sinh vật đã tự phát triển các hệthống enzyme nhàm điều hòa các loại phân tữ oxỵ hoạt tính cao này như superoxide dismutase,catalae glutathione peroxidase là các enzyme điều hòa nhằm duy trì sự an toàn trong giới hạn chophép của anion superoxide, H2O2 Đôi kill hệ thống bào vệ bị quá tải không kill bị ô nhiễm, khóithuốc lá, bức xạ tứ ngoại các loại oxy hoạt tính cao này vượt quá giới hạn cho phép sè là nguồn gâybệnh, thúc đẩy nhanh quá trình lão hóa như thể hiện ờ hình 1.5 Các chất chống oxy hóa từ thực vậtgóp phần hỗ trợ cho hệ thống bâo vệ cùa cơ thể, ngăn chăn oxy hóa không mong muốn như cácphenolic, carotenoid, flavonoid, vitamin c, E và các hợp chất trao đồi chất thứ cấp từ thực vật

Hình 1.5: Nguyên nhân gây ra gốc tự doVitamin c hay axit ascorbic là một chất bắt gốc tự do phổ biến Vitamin c có thể thay đổithành gốc ascorbate (hình 1.6) bằng cách cho một điện tử cho gốc lipit để kết thúc chuỗi phân ứngperoxit hóa Các cặp gốc ascorbat phản ứng nhanh chóng tạo ra một phân tử ascorbat và một phân

tư dehydroascorbat Dehydroascorbate không có bất kỳ khả năng chống oxy hóa nào Do đó,dehydroascorbate được chuyền đồi trở lại thành ascorbate bằng cách thêm hai điện tữ Giai đoạncuối cùng cùa việc bổ sung hai electron vào dehydroascorbate được thực hiện bời oxyoreductase(một enzym xúc tác cho quá trình chuyển điện từ từ một phân tử, chất khử, còn được

gọi là chất cho điện từ sang một phân tử khác, chất oxy hóa,còn được gọi là chất nhận điện tử).

DehydroascorbsteHình 1.6: Phàn ứng tiling hòa gốc tự do cùa axit ascorbic

1.2.4 Kháng ung thư

Klià năng ức chế tế bào ung thư cữa các hoạt chất có thề là do quá trình apoptosis [17] Apoptosis

là quá trình đóng vai trò thiết yếu trong sự phát triển và tồn tại bằng cách loại bô tế bào bị hư hònghoặc không mong muốn Một loạt các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng, hầu hết các chấthóa trị diệt khối u gây ra quá trình apoptosis ớ các tế bào Các hợp chất như triterpenoid vàpolyphenol đã được chứng minh là gây ra quá trình apoptosis ờ một số dòng tế bào ung thư, đồngthời không ảnh hường đến các tế bào binh thường Tuy cơ chế phân tữ mà hoạt chất gây ra quátrinh apoptosis vẫn chưa được làm rò, nhưng một số cơ chế có thể liên quan bao gồm ức chế hoạtđộng cùa DNA topoisomerase III, tăng mức độ oxy hoá và phá huý màng ty thể điều hoà conđường truyền tín hiệu, giải phóng cytochrome c với sự kích hoạt tiếp theo của caspase - 9 vàcaspase - 3, điều hòa giâm biểu hiện Bcl - 2, nlnrng thúc đẩy biểu hiện Bax và Bak kích hoạtendonuclease và ức chế Mcl - 1 protein [18]

1.2.5 Kháng khuân

Các hợp chất có trong lá Hoàn Ngọc xâm nhập vào tế bào và màng tế bào và tác động lênprotein nội bào enzyme ADN (hình 1.7) Trong đó các chất, phenol là thành phần có hoạt tínhkháng khuẩn ca và có tác động kháng khuẩn bảng cách phá Inly màng tế bào và nhóm adenosinetriphosphate (ATP) của vi khuẩn [16] Ngoài các thành phần chính, các thành phần phụ cùng đóngmột vai trò quan trọng đối VỚI hoạt động kháng khuẩn, chủ yếu tạo ra tác dung hiệp đồng với cácthành phần chính Bên cạnh đó kliâ năng kháng khuẩn cùa các hợp chất còn phụ thuộc vào cấu tạocủa vi khuẩn 90 - 95 % thành phần trong tế bào cùa vi khuẩn Gram dirơng là peptidoglycan, chophép khuếch tán các thành phần kỵ nước vào tế bào và hoạt động trên các mục tiêu khác nhau ĐốiVỚI tế bảo cùa vi khuẩn Gram âm lớp peptidoglycan của nó mỏng hơn, được bao phũ bời màngngoài bao gồm lớp phospholipid kép Màng ngoài và màng trong được hên kết chắc chắn bờilipopolysaccharid Lipopolysaccharid được tạo thành từ lipid A và chuỗi bên o, điều này làm cho

vi khuẩn Gram âm dễ bị tổn thương hơn so với vi khuẩn Gram dương

Hình 1.7: Cơ chế kháng khuân của các hợp chất

1.3 Phương pháp trích ly

Trích ly là một trong những phương pháp được sir dụng để tách hợp chất sinh học từ nguyên liệu

có nguồn gốc thực vật Hiện nay các nhà nghiên cứu đà sừ dụng nhiều phương pháp trích ly khácnhau ờ quy mô phòng thí nghiệm, pilot và công nghiệp để trích ly các hợp chất có trong thực vật.Các hợp chất có hoạ: tính sinh học là các chất chuyền hóa thứ cấp ựr nhiên được trích ly từ các bộ

phận khác nhau cùa thực vật chẳng hạn như lá, thân rễ hạt, hoa và quà bàng cách sừ dụng một sốphương pháp trích ly Mỗi phương pháp trích ly đều có tru nhược điềm riêng như thế hiện ờ bâng1.2 [11, 12].

Bâng 1.2: Ưu và nhược điếm cùa phương pháp trích ly

Năng suất thấp, thao tác thủ

Phương

pháp

truyền

dụng lượng dung môi lớn

Lượng mẫu lớn (khoảng vài gam

định, dễ dàng thực hiện

Thiết bị dễ sừ dụng, vận hànhđơn giản, thời gian trích lyngắn, hiệu suất trích

bình trích cao (bằng nhiệt độđun), thời gian trích dài, hoạt chất

có khả năng bị phân hủy

Dung môi khó được làm mớitrong suốt quá trình trích ly, vìvậy hiệu suất trích ly bảng

tán cùa các chất vào trongdung môi, lượng hóa chất sừdụng ít

và lira cao trích kéo dài, vi vậy sètốn nhiều dung môi, làm mất mộtlượng cao trích hoặc cao trích cóthể bị nhiễm bẩn

Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm

Không có quán tính nhiệt độ

hiệu suất trích ly cao thiết bị Không áp dụng cho các hợp chất

dễ sử dụng, an toàn và bảo vệ không phân cực, quy mô thừ

lượng sạch, thời gian trích ly dung môi đạt được rất nhanh vànhanh, có tác dụng đặc biệt với

các phân tử phân cực

có thế gây nổ

lượng dung môi cần thiết cho protein, khác với các chất xúc tácquá trình chiết Từ đó giâm

thời gian chiết và cải thiệnnăng suất cùa hợp chất cầntrích ly

hóa học thông thường

Kỳ thuật

CO? là một chất dề kiếm, rẻtiền, là một chất trơ, ít có phânứng kết hợp VỚI các chất cầntách chiết, không bắt lừa,không duy trì sự cháy, khônglàm ô nhiễm

môi trường, CO2 không độc Chi phí cao, yêu cầu phải nắm

c Ơ2 siêu

thiết bị, có sự chọn lọc khi hoàtan, không hoà tan các cỏ kimloại nặng và dễ điều chinh cácthông số trạng thái để có thểtạo ra các tính chất lựa chọnkhác nhau cùa

vững thao tác vận hành

Ưu điểm

dung môi sân phẩm thu được không lẫn

dung môi

1.3.4 Kỹ thuật lưu chất siêu tới hạn

1.3.4.1 Trạng thái siêu tới hạn của lưu chất

Bất kỳ dung môi nào cùng sè ờ trạng thái siêu tới hạn nếu tồn tại ở nhiệt độ và áp suất trên giátrị tới hạn Một số dung môi có thể được sữ dụng trong trích ly siêu tới hạn do như ethanol, hexan,metanol, pentan, butan nhưng CƠ2 được sừ dụng để trích ly hợp chất tự nhiên [13] Điều kiện tớihạn cùa một số dung môi được thể hiện trong bâng 1.3 [14] CO2 siêu tới hạn không làm thay đỗithành phần hóa học hay phân hùy hợp chất nhờ vào điều tới hạn ờ nhiệt độ và áp suất thấp Ngoài

ra CO2 không cháy, ít độc hại, tiết kiệm chi phí so với dung môi hữu cơ [15]

Báng 1.3: Trạng thái tới hạn của số cùa một số lưu chất

- Là một chất trơ, ít có phán ứng kết hợp VỚI các chất cần tách chiết;

- Không bắt lửa, không duy trì sự cháy;

- Không làm ô nhiễm môi trường;

- CO2 không độc với cơ thê, không ăn mòn thiết bị;

- Có sự chọn lọc khi hoà tan không hoà tan các cỏ kim loại nặng và dễ điều chình các thông

số trạng thái đề có thể tạo ra các tính chất lựa chọn khác nhau của dung môi

1.3.1.4 ưu điểm cùa kỹ thuật ỉ ưu chất siêu tới hạn so với các phương pháp truyền thống

- Sân phẩm có chất lượng cao: Đối VỚI tinh dầu thì có màu, mùi tự nhiên, không lẫn nhiềuthành phần không mong muốn, với các hợp chất tư nhiên thì tách được các chất có hoạt tínhcao;

- Là kỳ thuật hiện đại và an toàn với các sân phẩm tự nhiên;

- Không gây ô nhiễm môi trường

1.3.2 Nguyên lý hoạt động và sự biến đôi trạng thải cửa co2 trong quá trình trích ly

Khí CO2 lúc ban đầu trong bình chứa ở trạng thái 1 thường là áp suất trong khoảng 45 - 55 bar.nhiệt độ 12 - 20°C Kill được hạ nhiệt độ ờ điều kiện đắng áp từ trạng thái 1 sang trạng thái 2, CO2lông tới nhiệt độ 0 - l°c và tỷ trọng tăng dần lên, ở điều kiện này CO2 lỏng có thề pha trộn VỚI cácđồng dung môi dề dàng Kill CO2 ờ thể lóng và có tỷ trọng cao, thì dễ sữ dụng bơm cao áp để nénlên áp suất cao và điều chinh lưu lượng vào bình chiết thuận lợi Qua bộ phận làm lạnh, CO2 lóngđược bơm cao áp nén qua van điều chinh lưu lượng vào bộ phận trao đổi nhiệt đề điều chình tỷtrọng và độ nhớt phù hợp với yêu cầu công nghệ, CO2 đạt tới trạng thái 3 bên trong bình chiết.CO? lỏng từ trạng thái 3 được giừ ở điều kiện đắng áp và tăng nhiệt độ dần dần đề chuyển CO2lông sang trạng thái siêu tới hạn 4 trong bình chiết Quá trình trích ly bang CO2 siêu tới hạn có thếthực hiện hên tục hoặc gián đoạn tùy theo yêu cầu công nghệ Van an toàn áp suất cho hệ thốngchiết được lắp trên đường dẫn CO2 vào bình chiết Kết thúc quá trình chiết, dịch chiết được dẫnvào bình phân tách Trạng thái nì 4 trở về trạng thái 5 là quá trình giảm áp Kill dịch chiết vào bìnhphân tách đề tạo các phân đoạn khác nhau thì có thể chọn các giá trị áp suất và nhiệt độ thích hợp.Với hệ thống thiết bị được sử dụng trong đề tài, do lưu lượng nhò nên thiết bị không thu hồi CO2.Trong sàn xuất công nghiệp, kill CO2 tách ra được sữ dụng tuần hoàn trờ lại Hình 1.8 mô tả giản

đồ pha của CO2

Hệ thống làm lạnh được thể hiện ờ hình 1.9d.

Hình 1.9: (a) Thiết bị chính, (b) bơm đồng dung môi, (c) bộ điều khiển và

cứu

Bộ phận

liệu tham khảo

Doanh

Phân lập được hai hợpchất mới thuộc nhómhgnan đặt tên là

palatiferin B Các hợp

Các hợp chất được phân lập

có khả năng ức chế tế bàoung thư như ung thưTù’ nhân

Hoàn Ngọc

7 Nga

HoànNgọc

chất thuộc nhómtriterpenoid cũng đượcphân lập bao gồmepilatiferin, lupeol,betulin và axit pomolic

gan và ung thu’ da với giátrị ICỉolần lượt là 104.8

và 77,8 111M

[16]

Viện Hàn

Dung môi ethanol 25

%, tỷ lệ nguyênliệu:dung môi (1:10),nhiệt độ chiết rút70°C, thời gian chiếtrút 12 giờ

Hàmlượnghọc và Công •

nghệ Việt Nam • Hoàn

Ngọc

polysaccharide tinh sạch đạt 1,79 ±0,24 %

54,9°c và thời gianchiết là 80,8 phút

hạ huyết áp, chống viêm

và chống oxy hoá và chống ung thư

[1]Dầu kill

ì.4.2 Ngoài nước

Trên thế giới đã có công trình nghiên cứu trích ly hoạt chất sinh học trong cây

Hoàn Ngọc như trình bày ờ bâng 1.5

Đại học

Pukyong

Lá câyHoàn Ngọc

25°c trong 19 giờ

khuấy ở tốc

(104,66 ± 7,63 mgBSA/g), lượng đường

[18]

211,73 ± 1,58 mgglucose/g và 20,71 ±0,42 mg RE/g)

Qua bâng 1.4 và 1.5 cho thấy trong nước và trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên círu về cây Hoàn Ngọc cùng như các hợp chất có trong cây Tuy nhiên, nghiên cím về điều kiện trích ly bằng kỳ thuật CO2 siêu tới hạn và tối ưu hoá điều kiện trích ly vẫn chưa có nhiều công bố Do đó,

đề tài nghiên cứu trích ly hoạt chất và đưa ra quy trình trích ly bang kỹ thuật CO2 siêu tới hạn với hiệu suất trích ly cao

1.5 Mục tiêu, nội dung, phương pháp nghiên cứu, tính mới và đóng góp của luận văn 1.5.1 Mục

- Đưa ra điều kiện trích ly phù hợp để hàm lượng polyphenol cao nhất;

- Khẳng định hoạt tính sinh học của cao trích thông qua đánh giá hoạt tính kháng oxy hoá,kháng khuẩn và kháng ung thư

1.5.2 Nội dung nghiên cứu

bằng kỳ thuật co? siêu tới hạn;

Lá khô được trích

Mahasara

kham

nhiệt độ phòngtrong 7 ngày

Thái Lan

[20]

1.5.3 Phương pháp nghiên cứu

1.5.3.1 Phương pháp kháo sớt ánh hướng của các yểu tố đến hàm lượng polyphenol

a) Kháo sát ánh hưởng cùa từng yếu tố

Nghiên cứu này sè tiến hành khâo sát 4 yếu tố có khả năng ảnh hường đến quá trình trích ly

đó là áp suất, thời gian, thể tích ethanol và nhiệt độ Khảo sát được thực hiện theo phương phápluân phiên từng biển và mỗi yếu tố được kháo sát theo 5 mức VỚI hàm mục tiêu là hàm lượngpolyphenol, mỗi mức được thực hiện ba lần lấy giá trị tiling bình Sau quá trình khảo sát, các yếu

tổ ânh hưởng nhiều đến hàm lượng polyphenol được chọn lọc và xác định khoảng biến thiên củacác yếu tố để thực hiện kháo sát ảnh hường đồng thời

b) Anh hưởng đồng thời cùa các yếu tố

Sau khi lựa chọn khoảng biến thiên phù hợp, tiến hành kliâo sát ãnh hường đồng thời cácyếu tố bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (response surface methodology - RSM) Phương phápRSM bao gồm các kì thuật toán học và thống kẻ dùng để kháo sát mối quan hệ giữa hàm mục tiêu

và các yếu tố ảnh hường dựa trên sự phù hợp cùa mô hình thiết kế và dữ liệu thực nghiệm Phươngpháp này được áp dụng sau khi đă xác định các yếu tố quan trọng có thề kiểm soát được và xácđịnh giá trị các yếu tố đề có kết quâ tối ưu Phương pháp RSM VỚI im điềm khối lượng thí nghiệm

ít, mọi hệ số hồi quy được xác định độc lập với nhau, tìm các điều kiện tiến hành thỏa màn các đặcđiểm cùa quá trình và xác định được điềm cực trị [21.] Trong đề tài này, sừ dụng phương phápRSM theo mô hình Box - Behnken vì đó là một thiết kế có ít điểm mẫu và chi đòi hỏi ba cấp độcho mỗi yếu tố trong đó, các thiết lập là - 1, 0, +1 như trình bày ở hình 1.10

Hình 1.10: Mô hình Box-BehnkenHàm lượng polyphenol có trong cao trích được xác định bàng phương pháp quang phổ tưngoại klià kiến (Ultraviolet-visible spectroscopy-UV-vis) dựa theo đường chuẩn của axit gallicxây dựng bằng chất chuẩn tinh khiết.

c) Phương pháp phởn tích hàm lượng polyphenol bằng quang phổ tữ ngoại khờ kiến

Phương pháp dựa trên định luật Lambert - Beer Mỗi chất đều có một bước sóng hấp thucực đại đặc trưng Độ hấp thu tia sáng phụ thuộc vào nồng độ của chất nghiên cứu trong dungdịch Từ đỏ có thề xác định được nồng độ chất trong dung dịch [22,23] Sơ đồ nguyên lý máyUV-Vis được thể hiện ở hình 1.11

Hình 1.11: Sơ đồ nguyên lý UV-vis

(ppm) nên áp dụng cho phương pháp phân tích polyphenol là phù hợp

Tế bào quang điện

1.5.3.2 Phân tíclì bề mặt nguyên liệu liệu bằng kính điện từ quét

Kính hiển vi điện tữ quét phân giãi cao (Field emission Scanning Electron Microscope FE-SEM) là một loại kính hiền vi điện từ có thể tạo ra anh VỚI độ phân giải cao của bề mặtmẫu bằng cách sừ dụng một chùm điện từ hẹp quét trên bề mặt mẫu Việc tạo ảnh của mầuđược thực hiện thông qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ tương tác cùa chùmđiện từ với bề mặt mẫu Phương pháp SEM VỚI tru điểm là có thề thu được những bức ảnh bachiều rỗ nét và không đòi hỏi phức tạp trong khâu chuẩn bị mẫu Độ phân giãi cùa ảnh SEMlớn gấp nhiều lần so với kính hiển vi quang học, có thể đạt tới 10 - 100 nm (Hình 1.12)

-Nguồn phát điện tứ

Chùm tia hội tụAnode

Vật kínhCuộn quétĐầu dò ghi dòng diện tứ

Đầu dò ghi dòng điện tứMầu

Đế để mầuHình 1.12: Nguyên tắc hoạt động máy FE-

SEM

1.5.3.3 Phương pháp thừ nghiệm hoạt tỉnh sinh học

a) Hoợt tinh kháng oxy hoá

Phương pháp Ế t gổc tự do DPPH

linh động cùa DPPH (2,2-diphenyl-l-picrylhydrazyl CisHiỉNsOé), DPPH là một gốc tự donhân tạo, ổn định, có màu tím độ hấp thu cực đại ờ bước sóng 517 nm và có thề tham gia phânứng với các chất có khả nãng cho nguyên từ hydro, sau phân ứng sẽ làm giảm cường độ màutím của dung dịch và chuyển sang màu vàng Từ đó, có thẻ đánh giá khả năng kháng oxy hóa

thông qua việc đo độ hấp thu cùa dung dịch màu ờ bước sóng 517 nm [24] Cơ chế phân ứngtiling hòa gốc tự do DPPH được thể hiện ờ hình 1.13.

Hình 1.13: Phân ứng mất màu cùa DPPH với chất kháng oxy hoáGiá trị ICỈO cùa cà axit ascorbic và dịch chiết được tính toán từ mô hình hồi quy và phầntrăm bắt gốc DPPH được tính bàng công thức 1.1

, , , „ _ Ao — A _

Aotrong đó Ao là độ hấp thụ cùa mầu trắng và A là độ hấp thụ cùa mẫu

b) Hoạt tính kháng kììầ n

Hoạt tính kháng khuẩn cũa chiết xuất trong điều kiện tối uu đà được đánh giá các hoạt

động kháng khuẩn chổng lại Escherichia coìi (E.coìí) và Staphylococcus aureus (S aureus)

bang phương pháp khoanh giấy kháng sinh [25] Cao trích sè được tẩm vào một khoanh giấy

có đường kính 6 min, sau đó được đặt vào môi trường thạch có chứa vi khuẩn Mức độ nhạycâm cùa vi khuẩn với cao trích được biều hiện bằng đường kính các vòng kháng khuẩn xungquanh khoanh giấy

c) Kháng ung thư

Mầu thử được pha loãng thành một dày nồng độ và bổ sung 200 11L dung dịch tế bào ờ phalog nồng độ 3*104 tế bào/mL vào mỗi giếng (đìa 96 giếng) trong môi trường RPMI 1640 chocác dòng tế bào A549 và MCF-7

Sau 72 h thêm 50 jxl MTT (1 mg/mL pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh) và

ù tiếp ở 37°c trong 4 giờ Tế bào sống phản ứng với MTT để tạo thành formazan màu xanhlam Hiệu ứng gây độc tế bào của các mẫu được đo bằng độ hấp thụ cùa mồi giếng ờ bướcsóng 540 mn trên máy quang phổ Genios TECAN Phần train ức chế tế bào (%I UT) có thề

được dựng bằng phần mềm máy tính table curve.

nghệ Phòng 601, 18A Hoàng Quốc Việt, cầu Giấy, Hà Nội

và kháng khuẩn góp phần khẳng định giá trị dược liệu cùa cây Hoàn Ngọc

1.5.5 Đóng góp

Với sự gia tăng về bệnh tật và ô nhiễm môi trường thì con người đang đối mặt với nhiềunguy cơ ảnh hường đến sức khoẻ, việc sữ dụng các hoạt chất có hoạt tính sinh học từ thàodược, đặc biệt là cây Hoàn Ngọc đang được quan tâm vì loại cây này dề trồng và sinh trưởngtốt, phù hợp với khí hậu Việt Nam Trích ly bàng kỳ thuật CO2 siêu tới hạn là phương pháphiệu quà và ít độc hại góp phần làm giâm ô nhiễm môi trường Khí CO2 rất dồi dào và phù hợp

đề làm dung môi cho quá trình trích ly Đồng thời, cao chiết có hàm lượng hoạt chất cao sè mở

ra hướng ứng dụng mới trong y học dược phẩm và mỹ phẩm

CHƯƠNG 2: THựC NGHIỆM2.1 Nguyên liệu, hoá chất, dụng cụ, thiết bị và địa điểm thực hiện

1 Ethanol Lõng Tiling Quốc