Bài giảng Thực hành sinh lý người và động vật

Trang 4 AN TOÀN SINH HỌC PTN- Nguy cơ từ mẫu kiểm nghiệm, mẫu nghiên cứu, mẫu bệnh phẩm:o Vi khuẩno Viruso Ký sinh trùngo Động vật thí nghiệmNhóm nguy cơPhòng thí nghiệmMối liên quan giữ

MÔN SINH LÝ HỌC NGƯỜI VÀ ĐỘNG VẬT

Hà Nội 2022

Giảng viên: TS.NCVC Nguyễn Văn Hạnh

Viện Công nghệ sinh học, Viện HL KHCN Việt Nam

Đt: 0399939245, email: vanhanhnguyenbio@gmail.com

Bài 1

An toàn phòng thí nghiệm

MỤC TIÊU HỌC TẬP

Sau khi học, học viên có khả năng:

Trình bày được các nguyên tắc an toàn PTN

Trình bày và thực hiện được một số kỹ thuật

về sử dụng các thiết bị/dụng cụ cơ bản trong

PTN.

NỘI DUNG BÀI GIẢNG

2 Nội quy phòng thí nghiệm

3 Một số kỹ thuật cơ bản phòng thí nghiệm

AN TOÀN SINH HỌC PTN

An toàn sinh học:

-Thao tác an toàn trên vật liệu sinh học, và tác nhân truyền

nhiễm

-Những nguyên tắc phòng ngừa, các kỹ thuật và thực hành

để ngăn chặn sự phơi nhiễm không mong muốn với các tác

nhân gây bệnh và các độc chất, hoặc vô tình làm thất

thoát/phát tán chúng

Biosafety is the safe working practices associated with handling of biological

materials, particularly infectious agents It addresses containment principles,

technologies and practices that are implemented to prevent the unintentional

exposure to pathogens and toxins, or their accidental release

http://www.emro.who.int/health-topics/biosafety/

AN TOÀN SINH HỌC PTN

- Nguy cơ từ mẫu kiểm

nghiệm, mẫu nghiên

Mối liên quan giữa các nhóm nguy cơ với cấp độ,

tiêu chuẩn thực hành và trang thiết bị an toàn sinh học

AN TOÀN SINH HỌC PTN

AN TOÀN HÓA CHẤT CHÁY, NỔ PTN

Nguy cơ hóa học:

-Hóa chất gây cháy, nổ

- Phản ứng hóa chât nhầm

- Hóa chất độc

- Hóa chất dễ bay hơi

Phơi nhiễm với hóa chất nguy hiểm:

Never taste, smell, or touch chemicals

Quy định chung với những hóa chất kỵ nhau

AN TOÀN HÓA CHẤT CHÁY, NỔ PTN

Các loại bình cứu hỏa và cách sử dụng

Tài liệu: Cẩm nang ATSH PTN – WHO - 2004

AN TOÀN HÓA CHẤT CHÁY, NỔ PTN

AN TOÀN HÓA CHẤT CHÁY, NỔ PTN

AN TOÀN HÓA CHẤT CHÁY, NỔ PTN

Một số biểu tượng cảnh báo nguy hiểm trong PTN

NỘI QUY PHÒNG THÍ NGHIỆM

NỘI QUY PHÒNG THÍ NGHIỆM

BẠN KHÔNG NÊN…

Tuân thủ các nội quy PTN

KHI CÓ VẤN ĐỀ XẢY RA TRONG PTN?

SỬ DỤNG CÂN PHÂN TÍCH

Kiểm tra nguồn điện trước khi cắm.

Nhấn phím ON/OFF để bật cân, màn hình hiển thị chữ số 0.00g

Nếu màn hình không hiển thị chữ số 0.00g phải nhấn vào phím

T chờ các số trên màn hình ổn định và hiện 0.00g Khi cân đã ổn

định, màn hình hiển thị số 0.00g, bắt đầu thực hiện phép cân.

Đặt nhẹ nhàng mẫu cần cân lên đĩa cân.

Chờ đến khi các số hiển thị trên màn hình ổn định, ghi nhận giá

trị cân được.

Lấy vật cân ra.

Khi xong phải nhấn phím ON/OFF để cân ở trạng thái không làm

việc.

THỰC HÀNH CÂN

- Cân và pha 100 ml môi trường LTS

- Cân và pha 50 ml môi trường peptone

- Cân và pha 100 ml môi trường EC

- Cân và pha 50 ml môi trường trypton

Pipet pasteur bằng thủy

tinh không chia vạch

Pipet chia vạch bằng nhựa

hoặc bằng thủy tinh

- Cắm sâu đầu dưới của pipet vào dung dịch

-Hút tráng pipet hai hoặc ba lần bằng dung dịch định

hút

-Cầm pipet ở tư thể thắng đứng, chạm đầu dưới của

pipet vào thành bình hứng để ở tư thế nghiêng, cho

dung dịch chảy từ pipet vào bình

-Để cho dung dịch chẩy tự do xuống bình, đợi 3 giây,

đầu pipet vẫn chạm vào thành bình hứng Không sử

dụng quả bóp cau su hoặc trợ pipet đẩy hết giọt cuối

cùng còn đọng lại ở đầu pipet để tránh tạo khí dung

PIPET CHIA VẠCH

Rửa pipet và các quy trình cần thực hiện để tái sử

dụngPipet thủy tinh sau khi sử dụng cần được sấy khử

trùng, dùng kẹp nhỏ lấy bông ở đầu trên ra rồi ngâm vào

dung dịch tẩy rửa đồ thủy tinh, sau đó rửa, sấy khô,

đóng gói để tái sử dụng

Pipet chia vạch chất liệu bằng nhựa đã vô trùng

(sử dụng một lần): cách sử dụng như pipet chia vạch

chất liệu bằng thủy tinh: lấy ra khỏi bao giấy, sử dụng,

sấy khử trùng rồi hủy

PIPET CHIA VẠCH

Cách cầm pipet

a Cái móc: cầm Pipet nghiêng về một phía hơi cách

lỏng lẻo trên sống bàn tay khi không sử dụng, như vậy

sẽ làm cơ tay ít bị quá sức

b Cầm chặt bằng cả bàn tay: Tránh cầm pipet quá

chặt để giảm mỏi cơ tay và cơ vai sau khi sử dụng pipet

lâu

c Để lộ phần ghi số thể tích: có thể nhìn trong suốt

thời gian để có thể kiểm soát thể tích lấy ngay cả khi

đang sử dụng

d Nút bật lớn: để một khoảng cách thuận lợi trong

khoảng với của ngón tay cái và có một diện tích bề mặt

rộng để làm giảm mỏi ngón tay cái

PIPET BÁN TỰ ĐỘNG

PIPET BÁN TỰ ĐỘNGCách cầm pipet

PIPET BÁN TỰ ĐỘNG

Chuyển tất cả

phần còn lại của chất lỏng

ở đầu pipet tip

ra, ấn tới nấc dừng thứ hai (để phụt hết

Để cho mẫu,

ấn tới nấc dừng thứ nhất

vào dung dịch.

Thả pittông ra

từ từ.

Để cho mẫu, ấn tới nấc dừng thứ nhất Loại bỏ phần dung dịch còn lại ở pipet tip.

PIPET BÁN TỰ ĐỘNGKiểm tra lấy mẫu

THỰC HÀNH SỬ DỤNG PIPET

- Sử dụng pipet bán tự động lấy 200 μl đỏ

phenol.

- Sử dụng pipet chia vạch hút 9 ml dung dịch

cho vào ống nghiệm.

-Chịu hóa chất: là thủy tinh trung tính, chịu được hầu hết

các hóa chất, dung dịch ăn mòn mạnh ở nhiệt độ cao

(ngoại trừ HF là dung dịch acid có độ ăn mòn cao nhất

thậm chí tại nồng độ thấp)

- Tính chất nhiệt: chịu được nhiệt độ cao, shock nhiệt

- Dụng cụ thủy tinh dùng cho phòng thí nghiệm cần phải

sạch về mặt hoá học (không dính các chất hữu cơ hoặc

vô cơ) và sạch về mặt vi sinh vật học (không chứa bất

kỳ tế bào vi sinh vật hay bào tử của chúng) Do vậy,

trước khi sử dụng thì cần được rửa sạch và khử

YÊU CẦU VỚI DỤNG CỤ THỦY TINH TRONG PTN

Bình tam giác, bình cầu:

-Chuẩn độ; chứa đựng môi trường,

dung dịch; nuôi cấy vi sinh vật;

Đĩa petri:

- Nuôi cấy, phân lập các chủng vi

sinh vật hoặc làm các test chẩn

đoán, kháng sinh đồ khoanh giấy,

các thử nghiệm tính cạnh tranh giữa

các chủng vi sinh

Ống nghiệm:

- Chứa đựng dung dịch với

dung tích nhỏ; nuôi cấy VSV

trên môi trường lỏng hoặc môi

trường thạch, thử các tính chất

sinh vật hoá học

DỤNG CỤ THỦY TINH TRONG PTN

- Sau khi tiệt trùng dụng cụ bẩn, tháo bỏ nút bông, môi trường, thạch,

cặn bẩn chứa trong dụng cụ.

- Tráng dụng cụ bằng nước để loại hết cặn bẩn.

- Dùng miếng nhám thấm xà phòng hoặc bông thấm cồn để lau sạch

các ký hiệu ghi bằng bút dạ trên thủy tinh.

- Nếu dụng cụ bẩn nhiều hoặc dính dầu mỡ, ngâm các dụng cụ đó

vào dung dịch sunfocromic trong nhiều giờ sau đó rửa lại.

- Dụng cụ sau khi rửa phải đảm bảo pH đạt đến trung tính, úp ngược

dụng cụ cho ráo nước, làm khô ở nhiệt độ phòng hoặc đem sấy ở

nhiệt độ 600C - 800C trong vài giờ Sau đó cất giữ đồ thủy tinh khô

hoặc bao gói chúng để đem đi khử trùng.

RỬA DỤNG CỤ THỦY TINH

-Tiệt trùng: dụng cụ kim loại, đồ

vải, cao su, một số chất dẻo và

dung dịch lỏng

• Kiểm tra chất lượng tiệt

trùng bằng chỉ điểm:

Giấy chỉ thị khử trùng

SỬ DỤNG NỒI KHỬ TRÙNG

Kiểm tra: nước, đồng hồ đo áp suất, van xả hơi nước

Cho dụng cụ/môi trường cần khử trùng vào lồng inox và

Theo dõi quá trình hoạt động (ERROR, T 0 , ATM)

Khi nồi dừng hoạt động (stand by complete: ~50 o C-0atm)

mở cửa nồi (Unlock)

Dùng găng tay chịu nhiệt lấy đồ khử trùng

Kiểm tra nước

Tắt nguồn điện (Power ON/OFF)

TỦ NUÔI CẤY

- Nhiệt độ nuôi cấy: 28, 37, 44oC

- Khí CO2

SỬ DỤNG TỦ NUÔI CẤY

- Bật nguồn điện (Power ON/OFF)

- Chọn nhiệt độ thích hợp (SET + INCREASE/DECREASE)

- Đặt đĩa thạch/ống nghiệm cần nuôi cấy vào trên giá

- Đóng cửa tủ và chốt

- Theo dõi (ERROR, To)

Hà Nội 2022

Giảng viên: TS.NCVC Nguyễn Văn Hạnh Viện Công nghệ sinh học, Viện HL KHCN Việt Nam Đt: 0399939245, email: vanhanhnguyenbio@gmail.com

Đếm hồng cầu- Bạch cầu

Mục tiêu

bạch cầu, tiểu cầu và phân loại bạch cầu

của máy đo huyết đồ tự động

 Giải thích được ý nghĩa của các thông số

chính của huyết đồ

 Phân tích và biện luận các huyết đồ

– Công thức bạch cầu ( WBC –F)

• Tiểu cầu:

– Số lượng tiểu cầu ( PLT.count)

– HC, TC được cho đi qua khe có đường kính 7- 8

m

 Đếm BC

– Máu được pha loãng với một dung dịch chứa axít

để làm vỡ HC

– BC được cho đi qua khe có đường kính 100 m

Máy đếm tế bào máy tự động

 Máy đếm tế bào nguyên lý tổng trở: phân biệt từng loại tế bào dựa

vào kích thước tế bào

 Các máy thế hệ sau: ứng dụng laser và xung điện đa chiều nên có

tốc độ cao và phân loại tế bào chính xác hơn

 trước 1996 khả năng phân loại chính xác các thành phần bạch

cầu nói chung không quá 90%

 Các máy model gần đây, với việc áp dụng tổng hợp các cơ chế

tổng trở, xung điện đa chiều, laser và scatter nên khả năng nhận

diện tế bào được nâng đến 95% Một số serie máy có thể phân

biệt được các loại bạch cầu ưa a xít, ưa baso, hồng cầu lưới

bằng việc kết hợp với các phương pháp nhuộm men

peroxydase, nhuộm RNA/DNA, nhuộm huỳnh quang, phân tích

huyết sắc tố

 (CellDyn 4000 của hãng ABBOTT, SE-Advance của hãng

Sysmex…)

- Dung tích hồng cầu

- Các chỉ số hồng cầu : MCV, MCH, MCHC

- Hồng cầu lưới

1 Số lượng hồng cầu (RBC)

Ý nghĩa HC chứa Hb có vai trò chuyên

chở oxy Lượng oxy cung cấp thay đổi theo số lượng HC Giới hạn

Thiếu máu do thiếu sắt Đa hồng cầu

Thiếu máu HC Bình thường

sắt và thalassemia Giới hạn BT 11,5% - 14,5%

• RDW không  trong thalassemia

Tủy xương có khả năng đáp ứng tình trạng thiếu máu

bằng cách tăng sản xuất HCL gấp 6-8 lần bình thường

Nếu thiếu máu mà HCL thấp hoặc bình thường  tủy

giảm sản xuất HC

.Nếu thiếu máu mà HCL tăng là do tăng phá hủy ngoại vi

hoặc do mất máu cấp tính

Hồng cầu lưới (Reticulocytes)

Hồng cầu lưới với nhuộm Supravital HCL dạng (polychromatophilia)

Ý nghĩa BC chống lại sự xâm nhập của vật

lạ (vi trùng, siêu vi, ký sinh trùng…)

Giới hạn BT 5,0 – 10 x 109/L

Nhiễm trùng, dị ứng, viêm, tổn thương mô, ung thư, bệnh bạch cầu…

Nhiễm trùng nặng, AIDS, suy tủy, điều trị ung thư, thiếu vitamin …

K (kilo) = 10 3

• Số lượng BC lymphô

bình thường

• Số lượng BC lynmphô tăng cao trong bệnh bạch cầu dòng lymphô

Công thức bạch cầu

Bạch cầu

hạt

Trung tính (NEUT)

BC ái toan (EOS)

BC ái kiềm (BASO)

Số lượng 1,9 – 8 K/L 0 – 0,8 K/L 0-0,2 K/L

Nhiễm trùng, viêm, CML ,stress

Dị ứng, nhiễm ký sinh trùng

Nhiễm độc

Số lượng 0,16 - 1 K/L 0,9 - 5,2 K/L

Nhiễm trùng, viêm, ung thư Nhiễm siêu vi

Chuẩn bị dụng cụ

1 Ống trộn máu (ốhg Potanh, hình 9): ống trộn máu bằng

thủy tinh giốhg như một pipet

2 Hai đầu ông là 2 đoạn mao quản, ở giữa là phần phình,

bên trong có viên thủy tinh nhỏ màu đỏ ở đầu ốhg mao

quản dài có hai vạch chia 0,5 và 1 ở đoạn ống mao

quản ngắn có một vạch được ghi 101 Các vạch chia

này chỉ thể tích bên trong của toàn bộ Ống trộn Tính

từ đầu ốhg mao quản dài đến vạch 101 thì thể tích gấp

200 lần và 100 lần so vói thể tích của đoạn ống đến

vạch 0,5 và đoạn ốhg đến vạch 1 Khi hút máu ngưòi ta

nối ống cao su vào đầu mao quản ngắn

Tương tự cho đếm hồng cầu, đếm bạch cầu cần

chuẩn bị dung dịch pha loãng là dung dịch Lazarus

có thành phần như sau:

 Acid acetic 3%.

 Xanh methylen (cho vài tinh thể vào dung dịch)

Acid acetic có tác dụng phá hủy hết hồng cầu, còn

xanh methylen để bạch cầu bắt màu xanh dễ đếm.

Bông y tế, cồn 70%,….

mâu trước khi tay phải cầm kim chọc thẳng vă nhanh,

(hình)

3 Nặn giọt mâu đầu, dùng bông khô vô trùng lau sạch, nặn

giọt thứ hai sao cho giọt mâu tròn, gọn

Câc bước tiến hănh (HC)

4 Ngậm miệng văo đầu ốhg cao su đê được nốỉ vằ ốhg

trộn, đặt nghiíng 45® đầu ống mao quản dăi của ống trộn sât

vối giọt mâu (Nếu để thẳng đứng đầu mao quản dễ bị bịt kín

lại, nghiíng quâ 45“ bọt k h í dễ tră n văo ống) rồi h ú t nhẹ n

h ăn g m ột cột m âu liín tục (không bị bọt lăm câch đoạn)

đến vạch 0,5 Nếu lượng mâu vượt quâ vạch, dùng bông khô

vuốt nhẹ ỏ đầu ốhg để rút mâu ra đến vạch chính xâc) Lăm

nhẹ nhăng, nhanh vă chính xâc để mâu không bị đông

“dán” lamen vào phòng đếm (hình 13) Lắc nhẹ ống trộn máu

thổi bỏ giọt đầu rồi chấm nhẹ đầu dài ốhg trộn vào cạnh

lamen trên phòng đếm Theo sức mao dẫn, dung dịch máu

pha loãng sẽ tràn đều vào phòng đếm Nếu dung dịch thừa

nhiều, dùng bông khô thấm nhẹ bên cạnh để rút bớt dung

Các bước tiến hành (BC)

Hà Nội 2022

Giảng viên: TS.NCVC Nguyễn Văn Hạnh Viện Công nghệ sinh học, Viện HL KHCN Việt Nam Đt: 0399939245, email: vanhanhnguyenbio@gmail.com

trước kháng thể, dựa vào hiện tượng ngưng kết hay

không ngưng kết hồng cầu mà xác định nhóm máu

Thời gian đông máu:Xác định thời gian chảy máu từ lúc

ra khỏi thành mạch đến lúc máu đông trên phiến kính,

đó là thời gian đông máu

Chuẩn bị dụng cụ

- Lammen, cồn sát trùng kim trích máu , bông

- Huyết thanh chuẩn nhóm II ( AntiB) và nhóm III

bằng cồn rồi trích lấy máu, khi đã trích xong thì lặn giọt máu

đầu tiên rồi bỏ , rồi lặn

lấy máu một giọt vào lam kính kí hiệu là B, một giọt cho vào

lam kính kí hiệu là A,

dùng đũa lấy huyết thanh vào từng antiB, antiA ( đũa không

được dùng chung ) rồi

khuấy đều đẻ một thời gian ta quan sát

Các bước tiến hành Đánh giá thời gian đông máu

- Sát trùng, chích máu đầu ngón tay đeo nhẫn

- Cho máu chảy ra hai phiến kính, mỗi phiến kính một giọt có

đường kính 1cm, bấm đồng hồ ngay khi máu chảy ra Đặt

phiến kính thứ nhất ở ngoài Đặt phiến kính thứ 2 vào hộp

petri

Sau hai phút bắt đầu nghiêng nhẹ phiến kính thứ nhất một

góc 45o xem giọt máu đã đông chưa; sau đó cứ 30 giây

nghiêng 1 lần cho đến khi máu đông (giọt máu không thay đổi

hình dạng khi nghiêng phiến kính)

Tiếp tục xem phiến kính thứ hai cho tới khi máu đông Bấm

đồng hồ dừng lại Thời gian đông máu tính cho đến khi máu

đông ở phiến kính hai

- Nếu ngưng kết ở giọt ba (AntiA) là nhóm máu A

- Nếu cả hai huyết thanh đều ngưng kết là nhóm máu AB

Hà Nội 2022

Giảng viên: TS.NCVC Nguyễn Văn Hạnh Viện Công nghệ sinh học, Viện HL KHCN Việt Nam Đt: 0399939245, email: vanhanhnguyenbio@gmail.com

 Thụ cảni thể Meissner nhận cảm giác cơ học ma sát

 Thụ cảm thể Paccini nhận cảm giác cơ học áp lực

 Thụ cảm thể Ruffini, uhậu cảm giác nhiệt độ nóng

 Thụ cảm thể Krause, nhận cảm giác nhiệt độ lạnh

 Các tận cùng thần kinh nhậu cảm giác đau

Đánh giá phân bố và hoạt động của các thụ thể trên

Mục tiêu

giác

Mật độ phân bố các thụ cảm thể trên bề mặt da không

đồng đều những vùng như môi, má, lòng ngón tay và

bàn tay (có mật độ thụ cảm thể cao hơn các vùng khác

trêu cơ thể như lưng, chân v.v Mỗi vùng lại có khả

năng nhậu cảm giác này hay cảm giác khác nhậy hơn

Chuẩn bị dụng cụ

Bài 2 Đánh giá khả năng cảm nhận

đau của da

Tiến hành:

Châm kim nhẹ nhàng hoặc vạch mũi kim trên các vùng da

đối xứng giữa hai bên cơ thể

Có thể yêu cầu người thử nghiệm đếm từ 1, 2, 3 trong

khi tiến hành châm kim trên các vùng da khác nhau giữa

hai bên cơ thể với cường độ giảm dần

Có thể thấy tăng, giảm hoặc mất cảm giác đau ở một

vùng da nào đó hoặc thấy loạn cảm đau

Mỗi vị trí vùng da khác nhau có cường độ cảm giác ghi

nhận khác nhau

Bài 3 Đánh giá khả năng cảm nhận

nhiệt độ của da

Tiến hành:

Lần lượt đặt các ống nghiệm đựng nước nóng (40oC) và

lạnh (20oC) lên các vùng da khác nhau trên cơ thể người

thử nghiệm

Có thể thấy giảm hoặc mất cảm giác nhiệt độ, ở

một số vùng da nhất định.

Bài 4 Đánh giá khả năng cảm nhận

không gian của da

Tiến hành:

Dùng kim đầu tù viết các chữ hoặc chữ số trên

vùng da khác nhau của người thử nghiệm và hỏi

xem đó là chữ gì hoặc số mấy Bắt đầu viết nhỏ,

nếu người thử nghiệm không nhận biết được thì

viết to hơn.

bình thường người ta có thể nhận biết được các

chữ hoặc số có độ lớn từ 0,5 - 25 mm (tùy theo

vùng da) Trong trường hợp bệnh lý, chiều cao

các chữ hoặc các số phải lớn hơn bệnh nhân mới

nhận biết được.