BÁO cáo THỰC HÀNH SINH học PHÂN tử cơ bản COLONY PCR

Chuẩn bị một số lượng eppendorf 1,5 ml mới có đánh số tương ứng với số lượng mẫu.. Chuẩn bị 1 loạt eppendorf 1,5 ml có đánh số tương ứng với số lượng mẫu và thêm 1 eppendorf cho Chứng âm

BỘ MÔN XÉT NGHIỆM

BÁO CÁO THỰC HÀNH SINH HỌC PHÂN TỬ CƠ BẢN

Buổi 1: 03/10/2022 COLONY PCR  II M Mụ ục c đ đíícch h::

IIII D Dụ ụn ng g ccụ ụ::

cho vào đầu tube eppendrof chứa 30 µL dung dịch KTS5

TYPE DNA: 50 ng/ µL CONC: 54.6 NG/ µL A260: 1,093

A280: 0,561 A260/A280: 1,95 A260/A230: 0,91

 Nhận xét:

chuẩn, dụng cụ chưa đạt độ sạch

Đồ thi có đỉnh tại 260nm -> Có DNA trong mẫu với tỉ lệ cao

Đồ thị có thêm 1 đỉnh tại 230nm -> có sự xuất hiện của các chất hữu cơ 

Đồ thị không có đỉnh tại 280 nm -> ít có sự ngoại nhiễm của proteinA260/A280 > 1.8 : Đạt độ tinh khiết

A260/A230 < 1.8 : Hiện diện 1 lượng đáng kể các chất hữu cơ 

IIIIII Q Qu uy y ttrrììn nh h::

Gồm 17 bước:

1

lượng mẫu Bật bồn ủ nhiệt khô ở 60ºC

nhất 5 giây cho tan hoàn toàn protein biến tính Để yên 10 phút

5 Cho

6 Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng

7 Chuẩn bị một số lượng eppendorf 1,5 ml mới có đánh số tương ứng với

số lượng mẫu

8 Chuyển 600

 Lưu

biến tính) ở giữa hai pha nước (trên) và chloroform (dưới)

9

10 Vortex nhẹ để trộn đều Để yên 10 phút

11 Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng

12 Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, chỉ giữ lại cặn

13 Nhẹ

14 Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng

15 Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, chỉ giữ lại cặn

16 Làm khô cặn trong 10 phút ở 60ºC trong bồn ủ nhiệt khô

17 Hòa cặn trong 10 µl

RT Nếu chưa chạy PCR liền thì bảo quản ở 28ºC trong 23 ngày, hoặc 20ºC trong vòng 6 tháng

-* Sau đó, đo DNA trên máy Nanodrop và ghi nhận kết quả

IIV V K Kếết t q qu uảả::

TYPE DNA: 50 ng/ µL CONC: 533,4 ng/ µL A260: 10,669

A280: 5,621 A260/A280: 1.90 A260/A230: 2.4

Nhận xét:

Buổi 3: 05/10/2022 KỸ THUẬT PCR 

II M Mụ ục c đ đíícch h::

động xúc tác của enzyme DNA polumerase

IIII C Ch hu uẩẩn n b bịị::

IIIIII Q Qu uy y tr trììn nh t h th hự ực h c hiiệện n::

1

ly tâm nhẹ 3000-4000 rpm và đặt vào rack lạnh

2

(ngày làm mẫu, người thực hiện, số) và thêm 1 eppendorf 0.2ml để chứa mẫu

IIV V K Kếết t q qu uảả::

Buổi 4: 06/10/2022 KỸ THUẬT ĐIỆN DI TRÊN GEL II N Nggu uyyêên n ttắắcc::

các đoạn DNA (hoặc các đại phân tử khác, RNA và protein) dựa trên kíchthước và điện tích của chúng

đường khác nhau trong cùng điện trường và cùng thời gian

IIII D Dụ ụn ng g ccụ ụ::

IIIIII Q Qu uy y ttrrììn nh h::

Tiến hành đổ gel Agarose và nhỏ mẫu:

(Tris-Acetate-ED

(làm nóng chảy gel và không tạo bọt)

vào khuôn gel và lắp lược

vào khay gel sao cho buffer ngập gel, cao hơn mặt gel khoảng 2 – 5 mm

Pha buffer: 10ml TAE + 490 ml ED

 bromopheno

điện cực

IIV V K Kếết t q qu uảả::

Các vạch sáng màu: là điện di đạt hiệu quả

Không có vạch: do PCR thất bại, quá trình tách chiết bị ngoại nhiễm

Buổi 5: 17/10/2022 TÁCH CHIẾT VI KHUẨN H.PYLORI II M Mụ ục c đ đíícch h::

 AccuPid H.pylori Detection Kit 

 pháp tách c

IIII N Nggu uyyêên n ttắắcc::

điều kiện môi trường đệm khác nhau, màng lọc silica sẽ giữ lại DNA và loại bỏcác chất không mong muốn bằng lực ly tâm

trình ly giải

 pH cao làm

được bảo vệ bởi EDTA

IIV V Q Qu uy y ttrrììn nh h::

1 Chuẩn bị 1 loạt eppendorf 1,5 ml có đánh số tương ứng với số lượng mẫu và thêm

1 eppendorf cho Chứng âm tách chiết

2 Cho tiếp 5 μl DNA IC (DNA IC được cung cấp theo bộ kit)

3 Cho 200 μl dung dịch KTC1 vào loạt eppendorf

4 Cho tiếp 200 μl dịch sinh thiết đã xử lý vào mỗi eppendorf tương ứng

6 Thêm vào 100 μl dung dịch KTC2 và trộn đều

7 Đưa hỗn hợp ở bước 6 vào cột Ly tâm 8000 vòng / phút trong 1 phút 8 Chuẩn bị

1 loạt eppendorf 2,0 ml có đánh số tương ứng với số lượng mẫu Dùng kéo vô trùngcắt bỏ nắp eppendorf (nếu eppendorf có nắp)

9 Chuyển cột sang eppendorf 2,0 ml mới Cho vào cột 600μl dung dịch KTC3 Lytâm 8.000 vòng / phút trong 1 phút

( Sử dụng muối có ở nồng độ thích hợp để loại bỏ protein và các thành phần xác tế bào có tro

10 Chuyển cột sang eppendorf 2,0 ml mới Cho vào cột 600μl dung dịch KTC4 Lytâm 8.000 vòng / phút trong 1 phút Đổ bỏ dịch lọc

( Sử dụng ethanol để loại bỏ các thành phần muối chaotropic có ở trước đó)

11 Ly tâm 13.000 vòng / phút trong 3 phút để loại bỏ hết tất cả các dấu vết của dungdịch KTC4

( Ly tâm để loại bỏ hoàn toàn ethanol có trong mẫu để tránh ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng

12 Chuẩn bị 1 loạt eppendorf 1,5 ml tương tự như bước 1 Chuyển cột sang

13 Ly tâm 13.000 vòng / phút trong 3 phút để thu DNA Lưu mẫu sau khi tách chiết ở -20

oo

C (tối đa 3 tháng) nếu không thực hiện phản ứng PCR ngay

  V Kết quả:

Sample: NHUNG – PHUC – PHONG

chưa chuẩn dẫn đến chưa thể tách được hoàn toàn DNA, 1 lượng DNA vẫncòn sót lại trong lưới silica

Buổi 6 -7 : 18-19/10/2022

REAL TIME PCR DNA H.PYLORI II M Mụ ục c đ đíícch h::

DNA ban đầu lên một lượng tùy ý

trình PCR (nghĩa là trong thời gian thực), chứ không phải ở phần cuối của nónhư trong PCR thông thường

IIII N Nggu uyyêên n ttắắcc::

chuyên biệt để hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn

IIV V Q Qu uy y ttrrììn nh h::

Q01HPY01.2-PC hoàn toàn bằng cách đặt ở nhiệt độ phòng trong tối đa 30 phút Sau đ

2 Vortex mạnh ống PrimobeMix, ly tâm nhẹ (spindown) và hút ra 200 μl chuyểnvào ống MasterMix

3 Trộn đều hỗn hợp có trong ống MasterMix bằng micropipette Hút ra lần lượt

20 μl hỗn hợp cho vào từng eppendorf/ strip đã được ghi sẵn tên mẫu

Lưu ý:

4 Vortex nhẹ từng dung dịch DNA xét nghiệm, Chứng âm tách chiết và dung dịchChứng dương

5 Cho 5 µl dung dịch DNA xét nghiệm, dung dịch Chứng âm tách chiết, dungdịch Chứng dương và nước cất 2 lần lần lượt vào các ống eppendorf/ strip riêng lẻ

đã chuẩn bị ở Bước 18

Lưu ý:

 bổ sung dị

chiết, 1 phản ứng cho Chứng dương và 1 phản ứng với nước cất lần làm chứng

âm PCR

->Mẫu xét nghiệm -> Chứng dương

6 Đậy nắp các eppendorf 0,2 ml thật kỹ, ly tâm nhẹ (3.000-4.000 rpm) và đặt vàomáy Real-time PCR

6.1 Cài đặt vị trí các mẫu trong block nhiệt của máy (Plate set up), chọn màuhuỳnh quang FAM, HEX.

6.2 Cài đặt chương trình như sau:

V V K Kếết t q qu uảả::

DNA HP

Buổi 8: 20/10/2022  

THỰC HÀNH GIẢI TRÌNH TỰ THỰC HÀNH GIẢI TRÌNH TỰ HBV HBV II M Mụ ục c đ đíícch h::  

IIII C Ch hu uẩẩn n b bịị::

Dựa vào kết quả PCR, theo phương pháp stranger, phần mềm đã giải mã được bộ gen của  bộ gen của HBV như hDựa vào kết quả PCR, theo phương pháp stranger, phần mềm đã giải mã đượcHBV như hình trên.ình trên.

BUỔI 9 – NGÀY 1/11/2022

TÁCH CHIẾT HCV RNA II M Mụ ục c đ đíícch h::

IIII C Ch hu uẩẩn n b bịị

Micropipette (10 µl, 200 µl, 1000 µl)Máy quay ly tâm

Máy lắc trộn (votex)Bồn ủ nhiệt khô

nhất 5 giây cho tan hoàn toàn protein biến tính Để yên 10 phútB

tính) ở giữa hai pha nước (trên) và chloroform (dưới)

IV IV Ki Kiểm ểm tr tra đ a độ t ộ tin inh s h sạc ạch c h của ủa mẫ mẫu b u bằn ằng m g máy áy Na Nano nodr drop op::

tay máy lại và đo blank, sau đó dùng khăn giấy lau sạch

máy, ấn Measure để thực hiện đo mẫu

V V N Nh hậận n xxéét t k kếết t q qu uảả::

- Mẫu tách chiết không được tinh sạch

- Nguyên nhân: Do thao tác kỹ thuật, không tuân thủ đúng thời gian phản ứng, dothuốc thử, dụng cụ được tái sử dụng dẫn tới có sự ngoại nhiễm của chất hữu cơ 

BUỔI 10 – NGÀY 3/11/2022

CHẠY KẾT QUẢ REAL TIME PCR HCV

II M Mụ ục c đ đíícch h::

động xúc tác của enzyme RNA polymerase

IIII C Ch hu uẩẩn n b bịị::

IIIIII N Nggu uyyêên n ttắắcc::

 pH của dun

IIV V Q Qu uy y ttrrììn nh h tth hự ực c h hiiệện n::

Bước

toàn bằng cách đặt ở nhiệt độ phòng trong tối đa 30 phút Sau đó ly tâmnhẹ 5 – 10 giây và đặt vào rack lạnh

Hút lần lượt 18 µl hỗn hợp trên cho vào từng Eppendorf 0.2 ml

Bước

âm tách chiết, dung dịch chứng dương

Lưu ý:

Bước 5 Cho 10 µl dung dịch RNA xét nghiệm, dung dịch chứng âm tách chiết,dung dịch chứng dương vào các ống Eppendorf 0.2 ml riêng lẻ đã chuẩn bị ở bước 3

Lưu ý:

khi bổ sung dịch RNA

Mỗi lMỗi lần chần chạy mạy máy Reáy Real-tal-time Pime PCR cầCR cần tối n tối thiểthiểu 1 pu 1 phản hản ứng cứng cho Cho Chứng hứng âm tâm tácháchchiết, 3 phản ứng cho 3 ống Chứng dương và 1 phản ứng với nước cất 2 lần(hoặc dung dịch KTS5) làm Chứng âm PCR.

chiết → Mẫu xét nghiệm → 3 Chứng dương

Bước 5.Đậy nắp các Eppendorf 0.2 ml thật kỹ, ly tâm nhẹ và đặt vào máy Real –time PCR

Bước 6 Cài đặt chương trình định dạng vị trí các mẫu trong block nhiệt của máy(Plate set up), chọn màu huỳnh quang FAM (đặc trưng cho RNA của HCV) và HEX(đặc trưng cho RNA chứng nội ngoại sinh) Khai báo dạng mẫu cho các giếng chứngdương là Standard, khai báo nồng độ DNA Chứng dương trên máy khi sử dụng cácmẫu chứng dương E3, E5 và E7 lần lượt là 5x103, 5x105 và 5x107 copies

BUỔI 11 – NGÀY 8/11/2022

THỰC HÀNH GIẢI TRÌNH TỰ HCV II M Mụ ục c đ đíícch h::

 Biết được thứ tự sắp xếp RNA của virus gây nên HCV

IIII C Ch hu uẩẩn n b bịị::

Bước

ddNTPsBư