MÔN VI SINH y học bài báo cáo THỰC HÀNH kỹ THUẬT cấy RIA là kỹ thuật cấy VSV từ môi trường hiện tại sang môi trường khác

+ Không sử dụng que cấy nóng để cho ống vi khuẩn để lấy vi khuẩn vì làm như thế sẽ dẫn đến vi khuẩn chết và khi cấy vào thì vi khuẩn sẽ không xuất hiện trên phần thạch.. - Ống N2.1: Xuất

MÔN VI SINH Y HỌC BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH

Lớp: PH20A1A

2 Nguyễn Thị Kiều Chinh

4 Nguyễn Thị Dung (54729)

Đà Nẵng, 06/2022

1.1.Vật liệu 3

1.2.Dụng cụ 3

1.3.Thiết bị 3

2.Các bước thực hiện 3

3.Kết quả và biện luận 4

3.1.Kết quả 4

3.2.Biện luận 4

II.KẾT QUẢ ĐỊNH DANH 6

1.Xác định hình thái VK dựa vào đặc tính sinh lý 6

1.1.Vật liệu – Dụng cụ - Thiết bị 6

2.Các bước thực hiện 7

3Kết quả và biện luận 8

3.1.Kết quả 8

3.2.Biện luận 8

2 Định danh được VSV theo PP sinh hoá 9

2.1.Khả năng sử dụng URE 9

2.2 Thử nghiệm khả năng sử dụng acid amin chứ lưu huỳnh sinh H2S 10

2.3.Thử nghiệm MR (Methy red) 12

2.4.Thử nghiệm khả năng sử dụng citrate như nguồn carbon duy nhất của vi khuẩn 13

III.KẾT QUẢ KHÁNG SINH ĐỒ - ETEST 15

1.Phương pháp kháng sinh đồ: 15

1.1: Vật liệu - dụng cụ - thiết bị 15

1.2: Các bước thực hiện 16

1.3: Kết quả và biện luận 17

2.Phương pháp E-test 18

IV.PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TẾ BÀO VI KHUẨN 20

4.Mục đích thực hiện: 20

4.1 Vật liệu- Dụng cụ- Thiết bị: 20

4.2 Các bước thực hiện: 21

4.3 Kết quả và biện luận: 21

Tài liệu tham khảo 23

BÀI BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC TẬP MÔN VI SINH

I.KỸ THUẬT CẤY RIA : là kỹ thuật cấy VSV từ môi trường hiện tại sang môi

trường khác

Mục đích thực hiện: khảo sát hình thái, tính chất sinh lý, sinh hóa, thu hoạch

số lượng lớn vi sinh, giữ giống,

1 Vật liệu – Dụng cụ - Thiết bị:

1.1.Vật liệu: Vi khuẩn 0,5F 1.2.Dụng cụ :

Kỹ thuật cấy bề mặt đĩa thạch

Bước 1 :Ghi đầy đủ thông tin bệnh phẩm ( tên mẫu, tên nhóm-người thực hiện),

ngày nuôi cấy lên đĩa thạch.

Bước 2: Sử dụng cồn 70 độ và giấy mềm không vân tiến hành làm sạch bề mặt

bàn thí nghiệm Chuẩn bị số lượng đĩa petri ( đã ghi đầy đủ thông tin bệnh phẩm) theo khối lượng môi trường đổ.

Bước 3: Làm sạch bao tay của người làm thí nghiệm bằng cồn và để bao tay khô

rồi tiến hành thực hiện

Bước 4: Sử dụng que cấy vòng để lấy bệnh phẩm ra môi trường nuôi cấy và tiến

hành phân lập.

Bước 5: Hơ qua ống vi khuẩn trên đèn cồn ( không mở nắp ống vi khuẩn).

Bước 6: Đốt que cấy vòng cho nóng, làm nguội, lấy 1 vòng dây cấy vi khuẩn Bước 7: Hơ quanh đĩa petri

Bước 8:Trải VK đường số 1: trải vi khuẩn sang hai bên bằng đường zig-zag sát

nhau cho đến khi vệt vi khuẩn khô Đốt dây cấy, để dây cấy nguội Xoay đĩa thạch 90 độ.

Bước 9: Trải VK đường số 2: trải vi khuẩn từ bước trên ra theo đường zig-zag,

chỉ chạm vào đường số 1( 3 đến 4 lần) Xoay đĩa thạch 90 độ

Bước 10: Trải VK đường số 3: trải vi khuẩn từ bước trên theo đường zig-zag

(bản to khác với đường cấy số 1) , chỉ chạm vào đường 2 ( 1 đến 2 lần) và không chạm vào đường 1.

Bước 11: Đốt dây cấy.

Bước 12: Sau khi cấy xong thì cần giữ môi trường nuôi cấy trong tủ ấm 37 độ C.

Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn sau 18 – 24h.

Lưu ý một số lỗi thường gặp:

- Vệ sinh sạch khu vực bằng cồn 70 độ và dùng giấy mềm lau sạch trước và sau khi thực hiện thao tác cấy

- Khi thao tác, tay trái cầm đĩa thạch và xoay đều để hơi xung quanh ngọn lửa đèn cồn Tay phải cầm dây cấy và hơ nóng xung quanh ( đợi 5 – 10 giây để dây cấy nguội bớt) trước khi lấy vi khuẩn.

- Cấy mạnh rách thạch.

- Hơ que cấy quá nóng -> chết vi khuẩn

- Cấy sai đường cấy Đường số 2 chạm vào đường số 1 Đường số 3 chạm đường

số 2 Đường số 1 và 3 không được chạm vào

- Khi trải vi khuẩn -> không khô -> chảy dịch vi khuẩn

- Không hơ que cấy sau đường cấy 1 Khi cấy đường số 2 thì tiếp tục cấy đường

số 3 và không được hơ que cấy.

- Không làm gần khu vực đèn cồn.

3 Kết quả và biện luận 3.1.Kết quả:

Với kỹ thuật cấy ria yêu cầu kết quả cần đạt được là : 3 đường cấy rõ ràng và

sự xuất shiện của các vi khuẩn lạc đơn lẽ ở môi trường số 3

sau đường cấy số 1 hơ que cấy quá nóng dẫn đến chết vi khuẩn tại nơi cấy đưòng tiếp theo.

- Đĩa số 2 (BHI N2.2): Có sự xuất hiện của 3 đường cấy vì thực hiện tốt theo đúng quy trình cấy 3 đường Tuy nhiên đường cấy không đều và không được đẹp

- Đĩa số 3 (BHI N2.3): Có sự xuất hiện của 3 đường cấy Ở môi trường số 3, ta thấy sự xuất hiện của khuẩn lạc đơn lẽ tuy nhiên nó xuất hiện không nhiều vì khi cấy đường 2 qua đường 3 ngắn.

- Đĩa số 4 (BHI N2.4): Chỉ xuất hiện đường cấy số 1 và 2 vì khi cấy từ đường

số 2 sang 3 đường cấy không nối liền.

Kết luận: Vì khuẩn lạc có bề mặt và màu sắc không đồng đều, thuần nhất

nên chứng tỏ giống mới phân lập không tinh khiết

Mục đích thực hiện:

1.Xác nh hình thái VK d a vào c tính sinh lý đị ự đặ

2 nh danh Đị đượ c VSV theo PP sinh hoá

1.Xác nh hình thái VK d a vào c tính sinh lý đị ự đặ 1.1.Vật liệu – Dụng cụ - Thiết bị :

c.Thiết bị:

2.Các bước thực hiện:

Bước 1 :Ghi đầy đủ thông tin bệnh phẩm ( tên mẫu, tên nhóm-người thực hiện) Bước 2: Sử dụng cồn 70 độ tiến hành làm sạch bề mặt bàn thí nghiệm Chuẩn bị các

ống KIA ( thạch nghiêng) đã ghi sẵn thông tin

Bước 3: Làm sạch bao tay của người làm thí nghiệm bằng cồn và để bao tay khô rồi

tiến hành thực hiện

Bước 4: Nếu ta quan sát thấy trong ống thạch có nước thì ta dùng giấy mềm làm

khô phần nước trong đó đến khi bên trong ống thạch khô hoàn toàn thì ta mới tiến hành cấy

Bước 5: Tay trái cầm ống nghiệm chứa dung dịch VK và ống nghiệm môi trường

Tay phải cầm que cấy vòng và khử trùng trên ngọn đèn cồn.

Bước 6: Dùng ngón út và áp út kẹp nắp ống nghiệm vào lòng bàn tay, xoay nhẹ mở

nắp ống nghiệm

Bước 7: Hơ nóng để khử trùng phần miệng ống.

Bước 8: Đợi que cấy nguội, đưa que cấy vào bên trong tiếp xúc với dung dịch chứa

Bước 11: Khử trùng que cấy.

Bước 12: Khử trùng phần miệng và đậy nắp 2 ống nghiệm.

Lưu ý: + Khi đưa que vào cấy nên nhẹ nhàng để tránh làm rách thạch

+ Không sử dụng que cấy nóng để cho ống vi khuẩn để lấy vi khuẩn vì làm như thế sẽ dẫn đến vi khuẩn chết và khi cấy vào thì vi khuẩn sẽ không xuất hiện trên phần thạch

3 Kết quả và biện luận:

- Ống N2.1: Xuất hiện vi khuẩn vì ổng đổi màu từ đỏ sang vàng , ta thấy đường cấy thẳng, thấy được đường zig – zic hơi mờ bởi vì trong quá trình lấy sinh viên lấy ít vi khuẩn.

- Ống N2.2: Phần thạch nghiêng : phản ứng có sử dụng lactose có màu vàng (-) và xuất hiện rõ VK trên đường Zigzac Phần thạch tròn : có hiện tượng nứt thạch => có sự sinh Gas.

- Ống N2.3: Phần thạch nghiêng : phản ứng có sử dụng lactose có màu vàng (-) và xuất hiện rõ VK trên đường Zigzac Phần thạch tròn : có hiện tượng nứt thạch và bị đẩy thạch lên => có sự sinh Gas

- Ống N2.4: Phần thạch nghiêng và thạch tròn có màu đỏ (-) và thấy rõ đường cấy Không xuất hiện vi khuẩn vì trong quá trình lấy vi khuẩn , hơ lửa nóng quá vi khuẩn bị chết nên vi khuẩn không mọc được.

=> Cả 4 ống nghiệm đều có phản ứng dương (-) vì môi trường không xuất hiện màu đen

2 nh danh Đị đượ c VSV theo PP sinh hoá :

5 Bút lông dầu

2 1 .3 .Các bước thực hiện:

Bước 1 :Ghi đầy đủ thông tin bệnh phẩm ( tên mẫu, tên nhóm-người thực hiện) Bước 2: Sử dụng cồn 70 độ tiến hành làm sạch bề mặt bàn thí nghiệm Chuẩn bị các

ống đã ghi sẵn thông tin

Bước 3: Làm sạch bao tay của người làm thí nghiệm bằng cồn và để bao tay khô rồi

tiến hành thực hiện

Bước 4: Làm nóng đầu que cấy thẳng trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội và lấy 1

lượng vi khuẩn vừa đủ

Bước 5: Dùng que cấy thẳng cấy đâm sâu vào giữa khối thạch tròn 1 đường cấy

thẳng Hơ thành miệng bình ống vừa cấy xong trên ngọn lửa đèn cồn để tiệt các vi khuẩn lỡ bám trên miệng ống sau đó đặp nắp lại

Bước 6: Tiệt trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn

2.1.4 Kết quả và biện luận:

a Kết quả

- Phản ứng âm (-): môi trường màu cam

b Biện luận : Vì môi trường có phản ứng âm nên phản ứng trên không xảy ra phản

ứng  vi khuẩn không có enzyme urease thủy phân ure thành NH3 và CO2.

Lỗi gặp phải: Khi que cấy còn nóng đã vội lấy vi khuẩn  vi khuẩn chết  không

còn tồn tại VK  phản ứng không xảy ra

2.2 Thử nghiệm khả năng sử dụng acid amin chứ lưu huỳnh sinh H2S

Mục đích: Khảo sát tính di động của vi khuẩn.

2.2.1.Vật liệu – Dụng cụ - Thiết bị.

a.Vật liệu:

- Môi trường nuôi cấy SIM (hydrogen sulfite-indol-motility)

- Vi khuẩn.

ống đã ghi sẵn thông tin

Bước 3: Làm sạch bao tay của người làm thí nghiệm bằng cồn và để bao tay khô rồi

tiến hành thực hiện

Bước 4: Làm nóng đầu que cấy thẳng trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội và lấy 1

lượng vi khuẩn vừa đủ

Bước 5: Dùng que cấy thẳng cấy đâm vào giữa khối thạch tròn 1 đường cấy thẳng

(chỉ đâm ½ lọ tránh trường hợp chạm đáy lọ để quan sát rõ sự di động của vi khuẩn) Hơ thành miệng bình ống vừa cấy xong trên ngọn lửa đèn cồn để tiệt các vi khuẩn

lỡ bám trên miệng ống sau đó đặp nắp lại

Bước 6: Tiệt trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn.

2.2.3 Kết quả và biện luận :

- Khi cấy chỉ đâm 1 đường ngắn, nhưng sau một thời gian ủ trong nhiệt độ 37

độ, thì thấy đường cấy vi khuẩn có kéo dài xuống đáy lọ môi trường → vi khuẩn có khả năng di động ( N6.2)

+ Vi khuẩn có khả năng di động vì vi khuẩn đang khảo sát là vi khuẩn E.coli

và vì E.coli có tiêm mao (thành phần chủ yếu là protein và các flagelin)  giúp vi khuẩn di chuyển

- Khi cấy chỉ đâm 1 đường ngắn, nhưng sau một thời gian ủ trong nhiệt độ 37

độ, thì thấy đường cấy vi khuẩn không kéo dài xuống đáy lọ môi trường , vi khuẩn chỉ xuất hiện trên đường cấy→vi khuẩn không có khả năng di động (N6.5)

2.3 Thử nghiệm MR (Methy red)

Mục đích: Khảo sát vi khuẩn lên men tạo hỗn hợp acid.

ống đã ghi sẵn thông tin

Bước 3: Làm sạch bao tay của người làm thí nghiệm bằng cồn và để bao tay khô rồi

tiến hành thực hiện

Bước 4: Làm nóng đầu que cấy thẳng trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội và lấy 1

lượng vi khuẩn vừa đủ

Bước 5: Dùng que cấy vòng cấy vào môi trường Bước 6: Tiệt trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn.

2.3.3 Kết quả và biện luận:

2.4 Thử nghiệm khả năng sử dụng citrate như nguồn carbon duy nhất của vi khuẩn:

Mục đích: Xác định khả năng sử dụng citrate như nguồn carbon duy nhất

ống đã ghi sẵn thông tin

Bước 3: Làm sạch bao tay của người làm thí nghiệm bằng cồn và để bao tay khô rồi

tiến hành thực hiện

Bước 4: Làm nóng đầu que cấy thẳng trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội và lấy 1

lượng vi khuẩn vừa đủ

Bước 5: Dùng que cấy thẳng cấy vào môi trường

Bước 6: Tiệt trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn.

2.4.3 Kết quả và biện luận :

a Kết quả:

- Phản ứng âm (-): môi trường màu xanh rêu.

- Biện luận: Vì phản ứng xảy ra âm nên E.coli không khả năng sử dụng

citrate như nguồn carbon duy nhất

Hình 3: Kết quả định danh bằng đặc tính sinh hoá

BẢNG TỔNG KẾT ĐỊNH DANH MÔI TRƯỜNG CỦA VI KHUẨN

MR Phản ứng âm (-) : Môi trường cấy có màu vàng nhạt

SIM Phản ứng dương (+): Vi khuẩn có thể di động xung quanh đường

cấy, xoắn ốc và làm đục toàn bộ ống thạch Phản ứng âm (-): vi khuẩn không có khả năng di động xung quanh đường cấy, xoắn ốc và làm đục toàn bộ ông thạch

Simmon citrate agar Phản ứng âm (-): môi trường màu xanh rêu.

Urea Broth Phản ứng âm (-): Môi trường màu cam

III KẾT QUẢ KHÁNG SINH ĐỒ - ETEST

- Đĩa giấy kháng sinh đã tẩm kháng sinh

ống đã ghi sẵn thông tin

Bước 3: Làm sạch bao tay của người làm thí nghiệm bằng cồn và để bao tay khô rồi

tiến hành thực hiện

Bước 4: Trải vi khuẩn : Dùng que bông vô trùng thấm dung dịch vi khuẩn đã được

pha loãng 0,5 McFarland, ép sát que bông vào thành ống eppendorf cho bớt lượng dịch chứa VK rồi trải lên mặt thạch thật đều, kín và khô Khi trải được ½ đĩa, xoay 60° đĩa và trải lần 2, xoay đĩa petri 60° và trải lần 3 Cuối cùng, dùng que bông quét

1 vòng xung quanh thành đĩa petri

Bước 5: Sau khi trải vi khuẩn, ấp khô mặt thạch ở 37°C trong quá trình 15 phút Bước 6: Đặt kháng sinh: Dùng kẹp được tiệt trùng (đốt trên đèn cồn, làm nguội) kẹp

khoanh giấy (kháng sinh) rồi đặt lên mặt thạch sao cho tiếp xúc đều, các đĩa cách nhau tối thiếu 2,5 cm vat cách thành đĩa tối thiểu 2 cm, không được xê dịch đĩa kháng sinh sau khi đặt Chỉ được phép đặt khi bề mặt thạch đã khô.

Bước 7: Tiệt trùng kẹp.

Bước 8: Ủ ở 37°C trong 24 giờ

Bảng: Tiêu chuẩn đọc kết quả đường kính vùng kháng khuẩn đối với nhóm vi khuẩn

Acinetobacter spp Và khoảng chấp nhận về đường kính của chủng E.coli ATCC

25922 STT Kháng sinh Hàm lượng

kháng sinh Đường kính tiêu chuẩn E.coli ATCC

- N2.1: Tb=18 mm > 15mm (đường kính tiêu chuẩn) => nhạy(S) và nằm trong khoảng cho phép (18-26) => đáng tin cậy

- N2.2: Im= 33 mm > 22mm(đường kính tiêu chuản) => nhạy(S) và chủng chuẩn

E.coli ATCC nằm trong khoảng cho phép (26 - 32) => không đáng tin cậy

- N2.3: + Ge= 17 mm > 15mm(đường kính tiêu chuẩn) => nhạy(S) và chủng chuẩn

E.coli ATCC nằm trong khoảng cho phép (19-26) => không đáng tin cậy.

+ Ci= 23 mm > 21mm(đường kính tiêu chuẩn) => nhạy(S) và chủng chuẩn

E.coli ATCC nằm trong khoảng cho phép (30-40) => không đáng tin cậy.

-N2.4: + Cz = 28 mm >18mm (đường kính tiêu chuẩn) => nhạy (S) và chủng

chuẩn E.coli ATCC nằm trong khoảng cho phép (25-32) => đáng tin cậy.

+ Me = 30 mm > 18 mm ( đường kính tiêu chuẩn) => nhạy (S) và chủng

chuẩn E.coli ATCC nằm trong khoảng cho phép (28-34) => đáng tin cậy

Hình 4: Kết quả kháng sinh đồ MIC

2 Phương pháp E-test:

- Vi khuẩn được phát sinh trên môi trương BHA, ủ 18 -24 giờ cho chủng vi khuẩn phát triển.

- Pha loãng vi khuẩn với nước muối sinh lí đến độ chuẩn 0,5 McFarland.

- Trải đĩa, để khô mặt thạch trong 3-5 phút.

- Đặt que E-test lên mặt thạch đã trải vi khuẩn, ủ ở 37 o C.

- Sau 16-18 giờ, đọc kết quả đường kính vòng vô khuẩn trên các đĩa bằng thước đo.

Hình 5: Kết quả E-Test

Kết quả: Đường kính vòng vô khuẩn( E-test) = mm

IV PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢ NG TẾ BÀO VI KHUẨN

Mục đích thực hiện: Xác định số lượng vi khuẩn/ vi sinh vật tổng số hay số lượng

vi khuẩn/ vi sinh vật riêng biệt trên một đơn vị vật phẩm đem nghiên cứu (trên g hoặc ml dung dịch).

+ Lấy các mẫu có tính chất đại diện + Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vô tùng + Mẫu lấy xong, phải phân tích ngay, không để quá 24h + Mẫu lấy phải có nhãn ghi ký hiệu đồng thời phải ghi vào sổ những đặc điểm của mẫu và nơi thu mẫu.

4.2.2 Pha loãng mẫu và thực hiện thao tác:

- Pha loãng mẫu:

+ Ta đồng nhất mẫu bằng cách pha 1ml (1000 um) dung dịch nước cất vào 9ml dd nước muối sinh lý 0.9%

+ Lắc đều ống nghiệm => Ta được độ pha loãng 10 −1 và lần lượt lấy từ mẫu này sang mẫu kế tiếp 1ml cho đến mẫu cuối cùng 10 −4

 Lưu ý : Từ ống nghiệm thứ 2 tức từ 10 −2 , ta phải tráng mẫu trước.

+ Cho số khuẩn lạc thích hợp vào đĩa ( 25-250 khuẩn lạc/ đĩa).

 Lưu ý: Khi đưa khuẩn lạc vào đĩa ta phải luôn chắc chắn rằng đĩa luôn ở gần

đèn cồn.

4.3 Kết quả và biện luận:

4.3.1 Kết quả: Ta có thể xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số

lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch

4.3.1 Biện luận:

Nhìn vào hình 6 ta thấy mật độ càng thấp thì vi khuẩn sẽ xuất hiện rõ hơn và có thể đếm được.

- Đĩa N2.1 có lượng vi khuẩn dày đặc, nhỏ li ti, rất nhiều nên không thể đếm được và trải trên bề mặt đĩa thạch

- Đĩa N2.2 VK bắt đầu to hơn, thưa dần ra và số lượng giảm so với N2.1.

- Đĩa N2.3 Vi khuẩn to ra, ít dần ( lượng VK đã dần biến mất chỉ còn 1 lượng nhỏ xuất hiện trên bề mặt thạch) và rời rạc dần so với đĩa N2.2

- Đĩa N2.4 Vi khuẩn đã ít dần và có thể đếm được số lượng VK so với đĩa N2.3.

 Vì dung dịch pha loãng từ dung dịch gốc có nồng độ giảm dần từ 10 −1 −10 −4 nên khi đưa vào các đĩa thì lượng vi khuẩn cũng giảm dần.

Hình 6: Kết quả của phương pháp trải vi khuẩn

Tài liệu tham khảo