(LUẬN VĂN THẠC SĨ) Ứng dụng mô hình SAAS xây dựng phần mềm quản trị tổng thể doanh nghiệp

Tên một loại polyme dẫn DNA Deoxyribonucleic acid Axít đêoxyribônuclêic – AND EDC 1–ethyl-3-dimethyl-aminopropylcarbodiimide Tên chất để hoạt hóa gốc phốt phát của ADN ELISA Enzyme Li

Trần Quang Huy

CẢM BIẾN SINH HỌC TRÊN CƠ SỞ POLYME DẪN

TRONG PHÁT HIỆN VI RÚT GÂY BỆNH

Chuyên ngành : Vật liệu và linh kiện nanô

LUẬN VĂN THẠC SỸ

Hà Nội - 2007

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

MỞ ĐẦU

1.1 Lịch sử phát triển cảm biến sinh học ……… 3

1.2 Cảm biến sinh học……… 5

1.2.1 Khái niệm cảm biến sinh học……… 5

1.2.2 Nguyên lý cảm biến sinh học……… 9

1.2.3 Phân loại cảm biến sinh học……… 10

1.3 Polyme dẫn……… 15

1.3.1 Khái niệm polyme dẫn ……… ……… 15

1.3.2 Cơ chế dẫn của polyme dẫn……… 16

1.3.3 Ứng dụng polyme dẫn trong cảm biến sinh học………… 18

1.4 Một số khái niệm về sinh học phân tử, vi rút học, vi rút Herpes 21 1.4.1 Một số khái niệm về sinh học phân tử……… 21

1.4.2 Một số khái niệm về vi rút học……… 24

1.4.3 Vi rút Herpes……… 27

2.1.2 Hóa chất……… 31

2.2 Thiết kế và chế tạo cảm biến vi điện cực……… 32

2.2.1 Thiết kế cảm biến vi điện cực……… 32

2.2.2 Qui trình chế tạo vi cảm biến……… 33

2.3 Lựa chọn DNA đầu dò……… 37

2.4 Lựa chọn polyme dẫn……… 38

2.5 Cố định DNA đầu dò lên bề mặt vi cảm biến……… 39

2.6 Đo đạc các thông số……… 41

2.6.1 Kính hiển vi điện tử quét (KHVĐTQ)……… 41

2.6.2 Phổ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier (FTIR)……… 42

2.6.3 Kỹ thuật phản ứng chuỗi tổng hợp polymerase (PCR)… 42

2.6.4 Xây dựng hệ đo tín hiệu cảm biến sinh học……… 43

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Cảm biến vi điện cực……… 49

3.2 Tạo màng polyme dẫn APTS ….……… 52

3.3 Phổ hồng ngoại FTIR……… 52

3.4 Dò tìm axit nucleic từ mẫu phân tích……… 53

3.4.1 Dò tìm DNA bổ sung……… 53

3.4.2 Dò tìm DNA đặc hiệu của HSV……… 60

KẾT LUẬN

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA

TÁC GIẢ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

To remove the watermark, you need to purchase the software from

http://www.anypdftools.com/buy/buy-pdf-splitter.html

(Tên một loại polyme dẫn)

DNA Deoxyribonucleic acid

(Axít đêoxyribônuclêic – AND)

EDC 1–ethyl-3-(dimethyl-aminopropyl)carbodiimide

(Tên chất để hoạt hóa gốc phốt phát của ADN)

ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

(Kỹ thuật miễn dịch gắn men)

IF ImmunoFlourescence

(Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang)

FTIR Fourier Transform Infrared Spectroscopy

(Phổ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier)

HSV Herpes Simplex Viruses type 1 & 2

(Vi rút Herpes týp 1 và 2)

ITIMS International Training Institute for Material Science

(Viện Đào tạo Quốc tế về Khoa học Vật liệu)

KHVĐTQ Kính hiển vi điện tử quét

MIA 1-methylimidazole

(Tên chất để làm ổn định hóa DNA hoạt hóa trong nước)

NCBI National Center of Biotechnology Information

(Trung tâm Quốc gia về Thông tin Công nghệ sinh học)

PCR Polymerase Chain Reaction

(Kỹ thuật phản ứng chuỗi tổng hợp polymeraza)

RNA Ribonucleic acid

(Axít ribônuclêic - ARN)

WHO World Health Organization

(Tổ chức Y tế Thế giới)

Bảng 2.1 Thông số quá trình oxy hoá bề mặt phiến silic 34

Bảng 2.2 Thông số quá trình phún xạ tạo màng kim loại trên phiến silic 36

Bảng 2.4 Bảng mẫu thực hiện các phép đo theo nồng độ, nhiệt độ, thời gian 48

Bảng 3.1 So sánh ưu, nhược điểm của hai loại cảm biến vi điện cực 51 Bảng 3.2 Tín hiệu lai hóa khi nồng độ mẫu thấp tại nhiệt độ phòng 54

Bảng 3.3 Tín hiệu lai hóa của DNA đầu dò và DNA bổ sung trong mẫu phân

tích

55

Bảng 3.4 Tín hiệu lai hóa theo sự thay đổi của nhiệt độ, nồng độ và thời gian 57

Bảng 3.5 Tín hiệu lai hóa khi đo với sản phẩm PCR của HSV 61

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Trang Hình 1.1 Hình thái bề mặt của cảm biến trước và sau khi lai hoá 7

Hình 1.5 Mô hình cảm biến miễn dịch sợi nano phát hiện vi rút 14

Hình 1.6 Vị trí của cảm biến sinh học so với các kỹ thuật truyền thống

khác để chẩn đoán bệnh

15

Hình 1.7 Tốc độ phát triển cảm biến sinh học trong 20 năm trở lại đây

và dự báo xu hướng phát triển

15

Hình 1.9 Cấu trúc và sự lai hóa của phân tử DNA 21

Hình 1.10a Ảnh hiển vi điện tử truyền qua của vi rút Herpes - nhuộm âm

bản

27

Hình 2.1b Mô hình cấu trúc vi điện cực của cảm biến 70µm x 30µm 32

Hình 2.2b Mô hình cấu trúc vi điện cực của cảm biến 20µm x 20µm 32

Hình 2.5 Mô phỏng quá trình quang khắc trên phiến silic 35

Hình 2.6 Mô phỏng quá trình phún xạ cao tần tạo màng Pt… 35

Hình 2.7 Quá trình loại bỏ lớp cảm quang và lớp màng kim loại Pt/Cr

không cần thiết

36

Hình 2.8 Kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường lạnh S-4800-Hitachi 41

Hình 2.9 Máy phân tích phổ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier 43

Hình 2.11 Hệ đo vi sai sử dụng máy khuyếch đại Lock-in SR830 45

Hình 2.12 Mạch tương đương của hệ đo vi sai 45

Hình 3.1B Vùng điện cực hoạt động của vi cảm biến 30µm x 70µm 49

Hình 3.2B Vùng điện cực hoạt động của vi cảm biến 20µm x 20µm 50

Hình 3.3 Hình ảnh HVĐTQ của màng polyme dẫn APTS trên bề mặt vi

Hình 3.7 Tín hiệu lai hóa theo thời gian tương ứng với các nồng độ

mẫu phân tích khác nhau

58

Hình 3.8 Sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng phát hiện DNA bổ

sung của vi cảm biến theo nồng độ mẫu phân tích

Thank you for evaluating AnyBizSoft PDF Splitter.

A watermark is added at the end of each output PDF file

To remove the watermark, you need to purchase the software from

http://www.anypdftools.com/buy/buy-pdf-splitter.html

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, rất nhiều các nhà khoa học trong nước và Quốc tế

đã tập trung nghiên cứu chế tạo ra loại cảm biến sinh học có độ nhạy, độ chọn lọc cao, thiết bị nhỏ gọn, sử dụng tiện ích và cho kết quả tin cậy Thiết bị này được đánh giá với nhiều tính năng vượt trội và có khả năng khắc phục được hầu hết nhược điểm của các thiết bị phân tích truyền thống khác như ELISA, PCR Trong tương lai gần, các nhà khoa học dự đoán rằng các thiết bị truyền thống sẽ dần bị thay thế bởi các thế hệ cảm biến sinh học do chính những tiện ích của nó mang lại Trong lĩnh vực chẩn đoán bệnh, ba loại cảm biến sinh học chủ yếu thường được tập trung nghiên cứu chế tạo là :

i) cảm biến enzyme trên cơ sở phản ứng đặc hiệu enzyme – cơ chất; ii) cảm biến miễn dịch trên cơ sở phản ứng đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể; iii) cảm biến DNA trên cơ sở lai hóa đặc hiệu giữa hai sợi đơn DNA có trình tự bổ sung nhau

Trong phát hiện vi rút gây bệnh, hai loại cảm biến sinh học thường được tập trung

nghiên cứu hơn cả là: cảm biến miễn dịch và cảm biến DNA Với mục tiêu phát triển

và chế tạo ra loại vi cảm biến sinh học để có thể ứng dụng trong phát hiện vi rút gây bệnh tại Việt Nam, đồng thời phục vụ cho luận văn cao học, tác giả đã đề xuất đề

cương đề tài ‘‘Cảm biến sinh học trên cơ sở polyme dẫn trong phát hiện vi rút gây bệnh’’ với các nhiệm vụ:

- Chế tạo bộ vi cảm biến thích hợp cho việc phân tích, dò tìm những mẫu sinh học có nồng độ thấp

- Lựa chọn loại polyme dẫn thích hợp, tương thích với mẫu sinh học và có khả năng tạo màng trên bề mặt vi cảm biến, không tham gia vào các phản ứng sinh hóa giữa phần tử sinh học đầu dò và phần tử đích

- Lựa chọn phần tử sinh học đầu dò, cố định lên bề mặt vi cảm biến

- Đo đạc thử nghiệm với mẫu phân tích để xác định độ nhạy và các thông số khác của vi cảm biến trong phát hiện vi rút gây bệnh

Đề cương này đã được Trường Đại học công nghệ - Đại học Quốc gia Hà Nội

chấp thuận

Dưới sự hướng dẫn khoa học của Tiến sỹ Mai Anh Tuấn, sự giúp đỡ của nhóm nghiên cứu cảm biến sinh học - Viện Đào tạo Quốc tế về Khoa học Vật liệu, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, tác giả đã triển khai nghiên cứu phát triển loại cảm biến

sinh học DNA trên cơ sở polyme dẫn 3-aminopropyl–triethoxy-silance (APTS) để phát hiện axit nucleic của vi rút Herpes týp 1 và 2 (HSV) thông qua việc dò tìm đoạn DNA đặc hiệu của loại vi rút này So với mục tiêu và nhiệm vụ đề ra, tác giả đã hoàn thành

đề tài với những kết quả khả quan Một số kết quả đã được tác giả công bố trên các tạp chí, hội nghị chuyên ngành trong nước và Quốc tế Tác giả nhận thấy rằng, loại cảm biến này có độ nhạy rất cao, tín hiệu lai hóa giữa DNA đầu dò trên bề mặt vi cảm biến

và DNA bổ sung xuất hiện rất nhanh khoảng 1 phút tại nồng độ 0,5nM ở nhiệt độ phòng và kết quả cũng đạt được tương tự đối với DNA đặc hiệu của HSV ở nhiệt độ 50°C – 55°C Tuy nhiên, tín hiệu đầu ra thu được từ sự lai hóa thường xuất hiện rất nhỏ, do đó để đưa vào ứng dụng thực tế cần phải có nghiên cứu sâu hơn, đồng bộ hơn

để khuyếch đại, tăng tín hiệu đầu ra Quá trình thực nghiệm, các kết quả cũng như những bàn luận được tác giả trình bày chi tiết trong luận văn

Bố cục của luận văn được trình bày như sau :

Chương 1 Tổng quan

Trong chương này, tác giả trình bày tổng quan về lịch sử, khái niệm cũng như nguyên lý, phân loại của cảm biến sinh học Bên cạnh đó, những kiến thức về polyme dẫn, cách lựa chọn, cố định polyme dẫn lên bề mặt cảm biến và một số khái niệm cơ bản về vi rút học, sinh học phân tử cũng được tác giả nêu ra

Chương 2 Chế tạo cảm biến sinh học

Chương này mô tả toàn bộ quá trình thực nghiệm để thực hiện đề tài Bắt đầu từ việc lựa chọn vật liệu, hóa chất, tiếp theo là mô tả việc thiết kế, chế tạo loại cảm biến

vi điện cực thế hệ mới loại 70µm x 30µm và 20µm x 20µm, quá trình lựa chọn, pha tạp và tổng hợp polyme dẫn lên bề mặt vi cảm biến Cuối cùng, mô tả cách cố định phần tử sinh học đầu dò lên vi cảm biến, đo đạc các thông số và thiết lập hệ đo, phương thức đo đối với mẫu phân tích

Chương 3 Kết quả và bàn luận

Trong chương này, toàn bộ kết quả của quá trình thực nghiệm được trình bày và những bàn luận của tác giả đối với những kết quả đạt được, từ đó đưa ra kết luận và những ý kiến đề xuất

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Lịch sử phát triển cảm biến sinh học

Giáo sư Lenan C Clark là người đầu tiên phát minh ra điện cực oxy năm 1956, khởi nguồn của Công nghệ cảm biến sinh học [16] Năm 1962, tại Hội thảo khoa học của Viện Hàn lâm Khoa học New York, ông đã đề xuất một hướng nghiên cứu mới :

‘‘Làm thế nào để tạo ra cảm biến điện hóa thông minh hơn (pH, phân thế, độ dẫn,…) ?’’ khi đưa thêm vào ‘‘lớp chuyển tiếp enzyme giống như màng kẹp giữa, theo kiểu xếp chồng’’ Khái niệm này sau đó được làm sáng tỏ bằng thực nghiệm khi người

ta sử dụng điện cực oxy Clark để bẫy men đường (glucose oxidase) thông qua màng thẩm tách Độ giảm của nồng độ oxy đo được tỷ lệ với nồng độ glucose Trong một công trình công bố năm 1962, Clark và Lyon lần đầu tiên đưa ra khái niệm điện cực enzyme [15] Updike và Hick đã triển khai chi tiết thực nghiệm để chứng minh sự cần thiết để tạo ra điện cực enzyme chức năng đo nồng độ glucose mặc dù nhận được rất nhiều phê bình từ các nhà chuyên môn [59] Năm 1969, Guilbault và Montalvo công

bố chi tiết về điện cực enzyme bằng phương pháp đo thế [28] Hai ông mô tả cảm biến urea trên cơ sở cố định chất urease tại điện cực màng chất lỏng lọc lựa amoniac Năm

1975, ý tưởng của Clark trở thành hiện thực khi công ty thiết bị Yellow Springs (Ohio, Mỹ) giới thiệu lần thứ hai (lần đầu năm 1973) về thiết bị phân tích glucose sử dụng phương pháp đo thế Năm 1974, Cooney và đồng nghiệp đề xuất sử dụng bộ chuyển đổi nhiệt cho cảm biến sinh học Những thiết bị mới loại này được đặt tên tương ứng với đầu dò enzyme nhiệt [18] và men cặp nhiệt [40]

Sự phát triển cảm biến sinh học đã tạo bước đột phá mới vào năm 1975, khi Divis cho rằng có thể sử dụng vi khuẩn làm yếu tố nhận biết sinh học trong các điện cực vi sinh vật để đo nồng độ cồn [25] Công trình của ông đã khởi đầu cho hướng nghiên cứu chính ở Nhật Bản nhằm tạo ra các loại cảm biến sinh học có khả năng ứng dụng trong kiểm soát môi trường và Công nghệ sinh học Cũng trong năm 1975, Lubbers và Optitz đưa ra thuật ngữ optode để mô tả cảm biến sợi quang học có gắn chất chỉ thị để đo oxit cácbon II (CO2) hoặc oxy Trên cơ sở đó, hai ông và đồng nghiệp đã tạo ra cảm biến sinh học tín hiệu quang để đo nồng độ cồn [60]

Năm 1976, Clemens và đồng nghiệp đã tích hợp thành công cảm biến sinh học glucose điện hoá trong tuyến tụy nhân tạo [17], sau đó được Miles (Elkhart) tung ra thị

trường với thương hiệu: Biostator Cùng thời gian này, La Roche (Thuỵ Sỹ) đã giới thiệu bộ phân tích Lactat LA 640 sử dụng chất trung gian dehydrogenase để truyền tải điện tích từ lactat đến điện cực Mặc dù không thành công về mặt thương mại nhưng thiết bị này lại là một dự báo quan trọng cho một thế hệ cảm biến sinh học mới ra đời Một tiến bộ lớn của cảm biến sinh học đo glucose ứng dụng trong cơ thể sống được công bố bởi Shichiri và đồng nghiệp năm 1982, khi lần đầu tiên họ mô tả điện cực enzyme kiểu hình kim cấy dưới da [54] Nhiều công ty vẫn đang theo đuổi triển vọng

để phát triển loại thiết bị này, nhưng hiện nay sản phẩm vẫn chưa xuất hiện trên thị trường Trong khi đó, ý tưởng tạo ra bộ cảm biến miễn dịch trực tiếp bằng cách cố định kháng thể lên bộ phận chuyển đổi điện thế hay áp điện đã được khảo sát ngay từ những năm 1970 [38], các nhà khoa học đã mô tả khả năng sử dụng cộng hưởng plasmon bề mặt để kiểm soát ngay trong thời gian các phản ứng ái lực xảy ra Năm

1990, BIAcore (Pharmacia, Thuỵ Điển) đã cho ra mắt loại cảm biến dựa vào công nghệ này Năm 1984, rất nhiều công trình công bố sử dụng ferrocene và dẫn xuất của

nó làm môi trường trung gian để cố định phần tử đầu dò trong cấu trúc điện cực enzyme với giá thành rẻ [13] Loại cảm biến này được chế tạo trên cơ sở điện cực enzyme bằng kỹ thuật in lưới do MediSense (Cambridge, Mỹ) đề xuất năm 1987 nhằm tạo ra thiết bị kiểm tra nồng độ glucose trong máu có kích cỡ nhỏ như chiếc bút viết Doanh thu bán hàng của công ty Medisense tăng theo hàm mũ, đạt tới 175 triệu USD năm 1996 Các tạp chí chuyên ngành hiện nay đăng tải một số lượng lớn các công trình nghiên cứu về các thiết bị khai thác các tính năng của enzyme, axit nucleic, thụ thể tế bào, kháng thể,… kết hợp với các bộ chuyển đổi nhiệt, quang, áp điện, điện hoá [58] Mỗi phương pháp có thể được sử dụng cho rất nhiều các yếu tố phân tích khác nhau như trong chăm sóc sức khỏe, thực phẩm, kiểm soát môi trường, an ninh quốc phòng, chống khủng bố sinh học,… [8,24,35,60]

Theo Fuji-Keizai Group (Mỹ) dự đoán rằng doanh thu của thị trường cảm biến trên toàn thế giới năm 2007 sẽ đạt khoảng 10,8 tỷ đô la với tốc độ tăng trưởng 10,4% [64] Với những ưu điểm vượt trội như độ nhạy, độ đặc hiệu, tính chọn lọc cao, thiết bị đơn giản, gọn nhẹ, khả năng phát hiện nhanh, tại chỗ, giá thành rẻ, nên cảm biến sinh học có triển vọng vượt qua hầu hết nhược điểm của các thiết bị thông thường khác Vì vậy, loại cảm biến này ngày càng được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu nhằm tối ưu hóa các tính năng và khả năng ứng dụng trong phân tích chất lượng thực phẩm

[7], kiểm soát môi trường [52], công nghiệp dược [19], chống khủng bố sinh học [31]

và đặc biệt là trong chẩn đoán bệnh nhằm phát hiện ra các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn [42], vi rút [9,46,47,48,50]

Tại Việt Nam, trong những năm gần đây, cảm biến sinh học đang thu hút được rất nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học như ở Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, Đại học Quốc gia Hà Nội, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, Một số kết quả về cảm biến sinh học được nghiên cứu chế tạo trong nước đã được công bố như: cảm biến enzyme để phát hiện nồng độ thuốc trừ sâu, cảm biến DNA, [4,5,29,39] Với tiềm năng phát triển và ứng dụng của cảm biến sinh học trong khoa học sự sống, nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học nhằm phát hiện gen của một số loại vi rút gây bệnh trên người như vi rút Herpes týp 1&2 – tác nhân gây bệnh lở loét vùng mặt và vùng sinh dục phổ biến nhất trên toàn cầu, vi rút cúm A - loại vi rút đang được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) quan tâm hàng đầu, Việt Nam là một trong những nước nằm trong vùng nóng về dịch và nguy cơ xảy ra đại dịch của cả hai loại vi rút này Một số kết quả ban đầu về nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học ứng dụng trong y sinh học đã được tác giả công bố trên các tạp chí, hội nghị trong nước và Quốc tế [4,5,29,39]

1.2 Cảm biến sinh học 1.2.1 Khái niệm cảm biến sinh học Hiệp hội quốc tế về hoá học ứng dụng - IUPAC năm 1999 đã định nghĩa: cảm biến sinh học là một thiết bị tích hợp độc lập, nhỏ gọn, có khả năng cung cấp những

thông tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng đặc trưng, sử dụng một yếu tố nhận biết sinh học (thụ thể sinh hóa) duy trì sự tiếp xúc không gian trực tiếp với một phần tử chuyển đổi [22] Theo Daniel R Thévenot và đồng nghiệp, hệ thống nhận biết sinh học chuyển thông tin từ vùng sinh hoá, thường là nồng độ chất phân tích thành tín hiệu vật lý hoặc hóa học ở đầu ra với độ nhạy xác định Mục đích chính của hệ thống nhận biết này nhằm tạo cho cảm biến có độ chọn lọc cao đối với chất cần phân tích Phần tử nhận biết sinh học có thể là enzyme, DNA/RNA, kháng nguyên/kháng thể, tế bào,…như mô tả trong bảng 1.1 Để phát hiện vi rút gây bệnh có thể dựa trên việc phát hiện kháng thể/kháng nguyên thông qua cảm biến miễn dịch hoặc phát hiện DNA/RNA đặc hiệu của từng loại vi rút thông qua cảm biến DNA Trong khuổn khổ

của luận văn, tác giả chỉ tập trung giới thiệu về cảm biến DNA với phần tử nhận biết sinh học là DNA để phát hiện axit nucleic đặc hiệu của vi rút gây bệnh

Bảng 1.1 Các loại thụ thể sử dụng trong cảm biến sinh học và kỹ thuật đo điện hoá [22]

Chất phân tích Hệ thống ghi nhận thụ thể/hóa học Kỹ thuật đo lường/ phương thức chuyển đổi

1 Ion

Thể mang ion sinh học, tinh thể

vô cơ dẫn ion, enzyme, thủy tinh trao đổi ion,…

Điện thế; Thế-dòng

2 Khử mùi, khí, gas

Màng kỵ nước hoặc lớp lipid kép;

Điện cực kim loại trơ;

Enzyme;

Kháng thể, thụ thể

Điện thế; Thế-dòng Dòng điện;

Dòng điện hoặc điện thế Dòng điện, điện thế hoặc trở kháng, áp điện hoặc quang học

Kháng nguyên/ Kháng thể;

Oligonucleotid;

Gắn enzyme; gắn chất phát huỳnh quang hoặc quang hoá

Điện thế, dòng điện, trở kháng, áp điện, quang học hay cộng hưởng

plasmon bề mặt

5 Protein hoặc các loại ion, chất nền có khối lượng phân tử thấp

Các kênh , thụ thể protein phối tử đặc biệt; gắn enzyme hoặc các chất phát huỳnh quang

Điện thế, dòng điện, trở kháng, áp điện, quang học hay cộng hưởng

như các bon (C), platin (Pt) hay vàng (Au) hoặc trên một dãy điện cực so với một điện cực chuẩn so sánh Dòng thu được liên quan trực tiếp đến nồng độ khối đối tượng phân tích hoạt hóa điện tích hoặc mức tiêu hao sinh ra trong lớp chất xúc tác sinh học Tốc

độ phản ứng của chất xúc tác sinh học được chọn phụ thuộc trước tiên vào nồng độ khối chất phân tích, cũng giống như dòng ổn định thường tương ứng với nồng độ khối chất phân tích [30,44]

+ Phép đo thế: liên quan đến việc xác định sự chênh lệch thế giữa một điện cực

chỉ thị và một điện cực chuẩn so sánh hoặc hai điện cực chuẩn so sánh cách nhau bởi một lớp màng mỏng nào đó không có dòng đi qua Bộ chuyển đổi này có thể là điện cực lựa chọn ion (ISE) Hầu như các thiết bị đo thế phổ biến nhất hiện nay là các điện cực pH; và một vài loại điện cực lựa chọn khí như (CO2, NH3) hay ion (F-, I-, CN-,

Na+, K+, Ca2+, NH4+) Điện thế khác nhau giữa điện cực chỉ thị và điện cực chuẩn so sánh tỷ lệ với hàm lôgarit độ hoạt động của ion, sự giảm nồng độ khí [53]

+ Đo độ dẫn: Độ dẫn điện là đại lượng đặc trưng cho khả năng dẫn điện của vật

liệu Phản ứng giữa đầu dò và các phần tử đích làm thay đổi thành phần của chất dẫn điện khiến độ dẫn điện của chất đó thay đổi Các phản ứng enzyme, như urease và nhiều thụ thể màng sinh học có thể được kiểm soát bởi các thiết bị đo trở kháng hay độ dẫn ion sử dụng các vi điện cực xen kẽ nhau [45]

Nguyên lý hoạt động của phép đo độ dẫn của cảm biến DNA dựa trên sự lai hoá giữa các chuỗi đơn DNA trên bề mặt cảm biến Khi có sự lai hoá, liên kết hydro được hình thành giữa các bazơ tạo nên chuỗi xoắn kép (mạch đôi), làm thay đổi mật độ các ion tích điện ở lân cận bề mặt cảm biến (hình 1.1), kết quả là làm thay đổi trở kháng hay độ dẫn của môi trường giữa hai điện cực của cảm biến

(a) Không có liên kết ái lực điện

(b) Có liên kết ái lực điện Hình 1.1 Hình thái bề mặt của cảm biến trước (a) và sau khi lai hoá (b) [45]

+ Tranzito hiệu ứng trường (FETs): sự thay đổi quan trọng của các hệ thống

thường xác định nồng độ ion là tranzito hiệu ứng trường (ISFET) ISFETs được tạo bởi một loại màng lựa chọn ion gắn trực tiếp với cực cửa cách điện của FET [34] Khi ISFETs gắn với lớp phức hợp sinh học hay xúc tác sinh học, chúng trở thành cảm biến sinh học và thường được gọi là tranzito hiệu ứng trường miễn dịch (IMFETs) hay enzyme (ENFETs) Các thuộc tính hoạt động của các thiết bị dựa trên ENFETs hay IMFETs liên quan rất lớn đến cảm biến sinh học trên cơ sở ISE

Bảng 1.2 mô tả một số kiểu đo tương ứng với các bộ chuyển đổi của những đối tượng phân tích khác nhau

Bảng 1.2 Kiểu đo tương ứng với các bộ chuyển đổi điện hoá và đối tượng phân tích [22]

1 Điện thế

Điện cực lựa chọn ion (ISE);

Điện cực thuỷ tinh;

Điện cực khí Điện cực kim loại

K+, Cl-, Ca+, F-;

H+, Na+,…;

CO2, NH3; Các loại oxy hoá khử

2 Dòng điện

Điện cực kim loại hoặc các bon;

Các điện cực tạo bởi phương pháp hoá học

O2, đường, cồn,…

Đường, cồn, phenol, oligonucleotid,…

3 Độ dẫn, trở kháng

Các điện cực đan xen; điện cực kim loại

Urea, loại mẫu tích điện, oligonucleotid,…

4 Hiệu ứng trường hoặc mang ion

Tranzito hiệu ứng trường lựa chọn ion (ISFET); enzym FET (ENFET)

H+, K+,…

- Chuyển đổi quang học: Khi có sự tương tác giữa các phần tử sinh học đầu dò

và phần tử đích tạo ra một số đặc tính quang học như khả năng kích thích phát huỳnh quang, sự hấp thụ, khúc xạ hay nhiễu xạ ánh sáng, [33] Từ đó, người ta có thể gắn vào các phần tử đích một chất đặc biệt như chất có khả năng phát quang khi xảy ra tương tác, đồng thời tạo ra bộ chuyển đổi thích hợp để chuyến đổi các tín hiệu quang thu được thành tín hiệu điện đầu ra [19,51]

- Chuyển đổi áp điện: Phần tử sinh học đầu dò và phần tử đích khi tương tác với

nhau sẽ tạo ra sự thay đổi khối lượng Thay đổi này có khả năng làm cho tần số dao động của tinh thể áp điện thay đổi tới 2% và được đo bởi một mạch điện đơn giản Lợi dụng các đặc tính này, người ta chế tạo ra bộ chuyển đổi áp điện cho cảm biến sinh

học Tuy nhiên, cản trở lớn nhất của cảm biến sinh học kiểu này là ảnh hưởng của độ

ẩm không khí và khó khăn khi phân tích mẫu trong dung dịch [49]

- Chuyển đổi nhiệt: Hầu hết các phản ứng có enzyme hay vi sinh vật xúc tác đều

giải phóng nhiệt, nên người ta thiết kế thiết bị đặc biệt theo dõi sự thay đổi của nhiệt

có thể được ứng dụng làm phần tử chuyển đổi trong cảm biến sinh học Tuy nhiên, chuyển đổi nhiệt đòi hỏi thiết lập hệ thống rất phức tạp (hệ đo điện dung,…), hệ thống phải được cách nhiệt tốt, không xảy ra sự trao đổi nhiệt [26]

1.2.2 Nguyên lý cảm biến sinh học

Cảm biến sinh học hoạt động trên cơ sở thu nhận các tín hiệu từ sự tương tác giữa các phần tử dò trong hệ thống nhận biết sinh học với các phần tử đích trong mẫu cần phân tích thông qua bộ chuyển đổi [36] Nguyên lý của cảm biến sinh học được

mô tả ở hình 1.2

Hình 1.2 Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học

Thông thường, mỗi phần tử nhận biết sinh học chỉ nhận biết được một hay một nhóm đối tượng phân tích Khi cho cảm biến sinh học tiếp xúc với mẫu phân tích, nếu phần tử đầu dò tương thích với phần tử đích phản ứng sinh hóa sẽ xảy ra, đồng thời tạo

ra một tín hiệu: thay đổi nồng độ ion, kích thích huỳnh quang, hấp thụ ánh sáng, nhiệt, thay đổi khối lượng,…Tuỳ theo từng loại tín hiệu mà người ta thiết kế bộ chuyển đổi

phù hợp để chuyển thành tín hiệu điện Nếu phần tử đầu dò không tương thích với phần tử đích thì tín hiệu thay đổi sẽ không xảy ra hoặc xảy ra rất yếu

1.2.3 Phân loại cảm biến sinh học

Với các hệ thống nhận biết sinh học và bộ chuyển đổi khác nhau, ta có thể phân loại cảm biến sinh học theo nhiều cách nhưng chủ yếu là dựa vào hai yếu tố trên Hiện nay, trong chẩn đoán bệnh, người ta chủ yếu quan tâm đến ba loại cảm biến sinh học: i) cảm biến enzyme, ii) cảm biến miễn dịch, iii) cảm biến DNA [42]

1.2.3.1 Cảm biến enzyme (Enzyme biosensors)

Hầu hết các phản ứng sinh hoá trong hệ thống sống được xúc tác bởi các enzyme đặc biệt Chức năng của enzyme gồm có: phần đầu là tên loại phần tử làm cơ chất cho enzyme, phần sau thêm đuôi ase ; như nuclease để cắt axit nucleic Hai đặc trưng cơ bản của enzyme là khả năng xúc tác lớn và tính đặc hiệu cao Các đặc tính này không những phụ thuộc vào cấu trúc bậc 1 mà còn được qui định bởi sự sắp xếp trong không gian của phần tử enzyme để hình thành các vị trí hoạt động [2] Cơ chất tương tác với enzyme theo hai cơ chế :

- Cơ chế 1 : Điện tích hay/và hình dạng bổ sung của hai phần tử này phù hợp hoàn toàn với nhau hình thành nên một cơ chất bền vững

- Cơ chế 2 : Sự gắn cơ chất vào enzyme làm thay đổi cấu hình của enzyme và đưa toàn bộ phức hợp vào một trạng thái thuận lợi cho phản ứng xúc tác

Trong các phản ứng xúc tác, các enzyme không gắn lên mọi phần tử, mà chúng chỉ có ái lực đặc biệt với chính cơ chất của chúng bằng một loại liên kết yếu có năng lượng khoảng 5-10 kcal mol-1 Do đó, liên kết này dễ bị phá huỷ bởi chuyển động nhiệt Tốc độ của các phản ứng sinh hoá khi có enzyme xúc tác thường có tốc độ cao hơn nhiều so với khi không xúc tác Enzyme sử dụng rộng rãi trong cảm biến sinh học

có vai trò như một chất xúc tác Tuy nhiên, nhóm quan trọng nhất là những enzyme oxy hóa khử, thủy phân oxy hóa hay sự khử sử dụng hoặc oxy hoặc những đồng tác nhân (cofactors) Enzyme có thể được sử dụng riêng lẻ như trong những cảm biến sinh học xúc tác hoặc có thể được sử dụng kết hợp hợp với các thành phần khác, giống như kháng thể đóng vai trò như phần tử nhận biết để tạo thành bộ khuyếch đại tín hiệu Nhiều enzyme không thích hợp để sử dụng trong các thiết bị do sự không ổn định và

biến đổi của enzyme Vì vậy, phải cải thiện tính ổn định theo mong muốn bằng một số cách, bao gồm: sự ổn định hóa học, quá trình cố định nhằm tạo ra sự ổn định và đòi hỏi enzyme từ các nguồn khác như những sinh vật ưa nhiệt

Cảm biến sinh học enzyme được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay là cảm biến đo nồng độ glucose trong máu [32]

Hình 1.3 Mô hình một loại cảm biến enzyme đo nồng độ glucose Trong đó, lớp enzyme được cố định cộng hóa trị lên bề mặt điện cực kim cương Tầng phản ứng điện hóa bắt đầu bởi sự xuất hiện của glucose sẽ được chuyển đổi thành dòng điện đo được tại điện cực

Nguồn: http://images.iop.org/ /news/thumb/3/9/13/garrido.jpg

1.2.3.2 Cảm biến DNA (DNA biosensors)

Nguyên lý của cảm biến DNA cơ bản dựa trên sự lai hoá của DNA Khi hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau dưới tác động của “nhiệt độ biến tính” (Tm), sẽ không xảy ra sự tái bắt cặp trở lại nếu nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột dưới nhiệt

độ biến tính, lúc đó phân tử DNA sẽ tồn tại trong môi trường ở dạng mạch đơn dưới một cấu hình không gian mất trật tự Ngược lại, nếu sau khi hai mạch đơn tách rời, nhiệt độ giảm từ từ, cộng với những điều kiện thí nghiệm thích hợp thì hai mạch sẽ bắt cặp trở lại Hiện tượng này gọi là lai hoá phân tử [2] Sự lai hóa có hai đặc điểm sau:

- Đặc hiệu tuyệt đối: Sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa hai trình tự hoàn toàn bổ sung cho dù chúng chỉ có hai bản sao nằm lẫn giữa hàng triệu trình tự khác

- Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA, dẫn đến hình thành các phân tử DNA - DNA, RNA - RNA, hay các phân tử lai DNA - RNA

Để sự tái bắt cặp giữa hai mạch đơn xảy ra, các trình tự bổ sung phải tiến đến gần và ở vị trí đối diện nhau Tần số gặp gỡ giữa hai trình tự bổ sung sẽ quyết định quá trình tái bắt cặp Ở mỗi nhiệt độ xác định, hai chỉ tiêu ảnh hưởng đến tần số gặp gỡ là nồng độ DNA và thời gian phản ứng Nếu nồng độ DNA cao thì xác suất bắt cặp càng lớn Tương tự, thời gian phản ứng càng dài thì xác suất trên càng lớn và số lượng phân

tử lai tăng dần cho đến khi hầu hết các trình tự bổ sung đều tái bắt cặp Hai thông số: nồng độ và thời gian được xem xét đồng thời, tích của chúng được gọi là Cot (C: concentration-nồng độ, t:time-thời gian) Cot1/2 là giá trị tại đó có 50% số phân tử lai Tốc độ phản ứng lai cũng phụ thuộc vào nhiệt độ Thông thường, tốc độ phản ứng lai đạt cực đại ở nhiệt độ thấp hơn Tm của chính axit nucleic đó 25% [2] Tốc độ lai cũng

tỉ lệ thuận với căn bậc hai của độ dài các trình tự bổ sung Hơn nữa, khi có nồng độ NaCl 1M sẽ làm tăng tốc độ phản ứng lên từ 5-10 lần Nồng độ NaCl vượt quá 1,2M lại mất hết tác dụng

Chi tiết hơn về cấu trúc phân tử DNA sẽ được giới thiệu chi tiết trong phần 4.2 Với cảm biến DNA, một trình tự đầu dò có độ dài xác định sẽ được cố định lên trên bề mặt của một điện cực nào đó Mục đích của trình tự dò này là để phát hiện ra những đoạn axit nucleic có trình tự bổ sung có trong mẫu cần phân tích Minh hoạ cho quá trình này được thể hiện trên hình 1.4

Hinh 1.4 Nguyên lý của cảm biến sinh học DNA [55]

Để tăng cường độ nhạy và hiệu quả của cảm biến sinh học, người ta thường sử dụng một số loại polyme dẫn thích hợp để phủ thành màng mỏng lên vùng điện cực nhạy cảm như 3-aminopropyl–triethoxy-silance (APTS), polypyrrole (Ppy), polyaninile (PANi),…[10,29,58] Các loại polyme này không những có đặc tính tương thích với các phần tử sinh học mà chúng còn có khả năng liên kết chặt chẽ với điện cực Các mạch dò được cố định lên bề mặt cảm biến thông qua lớp polyme dẫn Nhờ

đó, tín hiệu thu được sau khi có sự lai hoá giữa mạch dò trên cảm biến và mạch đích trong mẫu phân tích được cải thiện đáng kể

1.2.3.3 Cảm biến miễn dịch (immunosensors)

Tính đặc hiệu trong liên kết giữa kháng thể với kháng nguyên được ứng dụng như một nguyên lý cơ bản cho rất nhiều các kỹ thuật chẩn đoán như : kỹ thuật miễn dịch gắn men (ELISA), miễn dịch huỳnh quang (IF),… Mỗi kháng thể đặc hiệu với một kháng nguyên tương ứng có thể được đánh dấu phóng xạ hay huỳnh quang hoặc các enzyme tạo màu rồi sử dụng như một đầu dò để tìm kháng nguyên đó Cảm biến sinh học có thể được sử dụng cùng với kỹ thuật ELISA Kỹ thuật này được sử dụng để

dò tìm và khuyếch đại một phản ứng kháng nguyên-kháng thể, lượng kháng nguyên gắn enzyme liên kết với kháng thể đặc hiệu đã cố định được xác định bởi nồng độ tương ứng của kháng nguyên đã phản ứng và còn tự do dựa theo tốc độ phản ứng enzyme xúc tác Hiện nay, để tăng phạm vi chẩn đoán, tốc độ và độ nhạy, cảm biến miễn dịch có nhiều tiến bộ hơn được phát triển dựa trên nguyên lý của các kỹ thuật miễn dịch pha rắn, trong đó kháng thể/kháng nguyên được cố định trên bề mặt cảm biến để phát hiện trực tiếp kháng nguyên/ kháng thể trong mẫu phân tích [14]

Năm 2004, Paltosky và đồng nghiệp đã công bố việc sử dụng thành công cảm biến miễn dịch sợi nanô dựa trên nguyên lý hiệu ứng trường để phát hiện đồng thời vi rút cúm A và vi rút adeno Trong hình 1.5, mô phỏng kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên của vi rút cúm A được gắn lên sợi nano màu đỏ, kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên vi rút adeno gắn lên màu sợi nano màu xanh, tương ứng với hai tín hiệu đầu ra Khi không có sự hiện diện của vi rút cúm A hoặc adeno, thì không xuất hiện tín hiệu Khi cho cảm biến tiếp xúc với cúm A, tín hiệu từ sợi đỏ sẽ xuất hiện (có sự tăng hoặc giảm độ dẫn), nhưng tín hiệu của sợi vàng tương ứng với vi rút adeno không xuất hiện Ngược lại khi cho cảm biến tiếp xúc với vi rút adeno, thì tín hiệu từ sợi dây màu vàng

sẽ xuất hiện trong khi không có tín hiệu từ phía dây màu đỏ Khi đồng thời phá vỡ sự liên kết giữa hai loại vi rút với kháng thể đặc hiệu cho từng loại, tín hiệu trở lại trạng thái ban đầu Dựa vào tín hiệu thay đổi đó, người ta có thể biết được chính xác loại vi rút nào có trong mẫu phân tích [46,47]

Hình 1.5 (A) Mô hình cảm biến miễn dịch sợi nano Si sử dụng hiệu ứng trường để phát hiện nhiều vi rút khác nhau trong cùng thời gian Phản ứng đặc hiệu hoặc không đặc hiệu tương ứng với sự thay đổi độ dẫn đo được

(B) Tín hiệu thực tế đo được của cảm biến miễn dịch sợi nano Si phát hiện

vi rút cúm A và vi rút adeno Đầu mũi tên đen 1→ 4 tương ứng chỉ ra vi rút adeno, cúm A, đệm khi phát hiện tỷ lệ hỗn hợp 1:1 giữa vi rút adeno và vi rút cúm A Đầu mũi tên màu đỏ nhỏ và xanh biểu thị sự thay đổi độ dẫn tương ứng với sự phân tán của các hạt vi rút theo sợi nanô và không gắn đặc hiệu [46]

Xu hướng phát triển cảm biến sinh học trong phát hiện bệnh

Sự kết hợp sử dụng kỹ thuật chế tạo micro/nano [12,21] và những tiến bộ của các kỹ thuật khác như : cố định các phần tử nhận biết sinh học lên bề mặt cảm biến, polyme dẫn,…trong lĩnh vực cảm biến sinh học là sự hứa hẹn rất lớn để phát triển loại thiết bị này nhằm phát hiện các tác nhân gây bệnh [10,41,57]

Hình 1.6 so sánh các phương pháp khác nhau được sử dụng để chẩn đoán bệnh dựa theo các công trình đã công bố trong 20 năm trở lại đây [42]

Hình 1.6 Vị trí của cảm biến sinh học so với các kỹ thuật truyền thống khác để chẩn đoán mầm bệnh dựa theo 2500 bài báo đã công bố trong 20 năm trở lại đây [42]

1.3.1 Khái niệm polyme dẫn

Polyme dẫn là loại bán dẫn polyme hữu cơ hay là bán dẫn hữu cơ Hầu hết các sản phẩm sử dụng polyme hữu cơ không dẫn điện Tuy nhiên, nó có độ dẫn nằm trong khoảng giữa bán dẫn và kim loại, vào khoảng 10-8-10-6 S/cm Nhưng nếu pha tạp với một số chất thích hợp thì độ dẫn của chúng được tăng lên rất nhiều Lợi dụng tính chất này, các nhà nghiên cứu đã cải tiến và đưa vào ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong các thiết bị điện tử

Người ta phân biệt ra 03 loại polyme dẫn sau:

- Polyme dẫn điện

- Polyme dẫn proton

- Polyme dẫn ion

1.3.2 Cơ chế dẫn của polyme dẫn

Tùy theo mục đích sử dụng mà các polyme dẫn được pha tạp chất thích hợp nhằm tăng độ dẫn Quá trình pha tạp thực chất là quá trình thêm các điện tử (phản ứng khử) hoặc loại bỏ các điện tử (phản ứng oxi hóa) từ polyme Trong quá trình pha tạp chất, các điện tử trong liên kết pi (π) có thể “nhảy” xung quanh chuỗi polyme Điện tử dịch chuyển dọc theo phân tử tạo ra dòng điện Mặc dù vậy, độ dẫn của vật liệu bị giới hạn vì các điện tử phải “nhảy” qua các phân tử, như vậy để có độ dẫn tốt hơn, các phân

tử phải có trật tự sắp xếp tốt, gần nhau để hạn chế khoảng cách “nhảy” Ngoài ra, độ dẫn điện phụ thuộc rất lớn vào cấu trúc của polyme Chuỗi phân tử polyme có cấu trúc phẳng, mạch ngắn và độ kết tinh thấp thì độ dẫn điện kém Ngược lại những polyme

có mạch liên kết dài, độ kết tinh cao, ít mạch nhánh thì độ dẫn điện cao hơn Quá trình truyền điện tử gồm 03 cách:

• Truyền dẫn điện tử nội phân tử (Intramobility)

• Truyền dẫn điện tử giữa các phân tử (Intermobility)

• Truyền dẫn điện tử giữa các sợi của vật liệu polyme (Inter-fibril mobility

of charge carrier)

1.3.2.1 Quá trình dẫn trong polyme

Cơ chế dẫn trong polyme khác so với trong vật liệu vô cơ do sự bất đẳng hướng của các liên kết hóa học Dọc theo một chuỗi polyme, các liên kết đồng hóa trị liên kết các nguyên tử các bon rất chặt chẽ với nhau Nhưng giữa các chuỗi polyme lại không

có liên kết ion hay liên kết đồng hóa trị mạnh Do đó, sức hút giữa các chuỗi này yếu hơn nhiều so với lực Van der Waals hay liên kết hydro, dẫn đến độ dẫn bất đẳng hướng cao trên thước phân tử Sự tương tác yếu giữa các chuỗi polyme liền kề rất dễ làm cho các phân tử bị lệch hướng Sự thay đổi về hình thái cũng lần lượt tác động đến cấu trúc vùng điện tử và tạo nên các trạng thái mới nằm trong vùng cấm Sự gấp khúc,

đầu mút của polyme, độ pha tạp và sự khác nhau giữa các vùng vô định hình và vùng tinh thể sẽ ảnh hưởng đến cấu trúc vùng của polyme Do không ổn định về cấu trúc nên dẫn đến khó đo được độ dẫn chính xác Các phương pháp chế tạo cho những polyme giống nhau có thể thu được các thuộc tính rất khác nhau Dung môi, nồng độ hóa chất, nhiệt độ, thế cho điện kết tủa và sự thay đổi trong phản ứng polyme hóa, tất

cả đều có thể ảnh hưởng đến cấu trúc của polyme

1.3.2.2 Quá trình pha tạp của chuỗi polyme dẫn

Người ta tin rằng tạp chất góp phần tăng độ dẫn ở bên trong chuỗi bằng quá trình truyền điện tích Các ion tạp chất tan vào trong dung dịch điện hóa có thể được vận chuyển vào bên trong hoặc bên ngoài nền của polyme khi cung cấp một điện trường Sự thay đổi độ dẫn có thể được điều khiển bằng cách cung cấp điện trường để điều khiển số soliton, polaron hoặc bipolaron trên các phân tử polyme Các ion tạp chất hoặc các phân tử cũng có thể khuyếch tán vào trong cấu trúc polyme trong không khí

Quá trình pha tạp được tiến hành theo hai phương pháp: hóa học và điện hóa

- Quá trình pha tạp hóa học: xảy ra khi pha tạp chất (dopping Donor (D) hoặc Acceptor (A)) vào polyme dẫn (P) Quá trình này được biểu diễn theo các công thức sau:

Px+xyA -> [Py+Ay-]x (1.1)

Px+xyD -> [Dy+Py-]x (1.2)

- Quá trình pha tạp điện hóa học: là quá trình tổng hợp polyme dẫn bằng phương pháp trùng hợp điện hóa học, trong đó chất điện li đóng vai trò như chất pha tạp Khi đó, ở điện cực dương xảy ra phản ứng nhận điện tử hình thành lỗ trống (loại p):

Px+xyA- -> [Py+Ay-]x + xye- (1.3)

Ở điện cực âm xảy ra phản ứng cho điện tử (loại n)

Px+xyD+ +xye- -> [Dy+Py-]x (1.4) Một số loại polyme liên hợp như polyacetylene (cis-trans: có độ dẫn 10-9 đến

10-12 S/cm, trans-trans: 10-6 đến10-5S/cm) Độ dẫn này mang tính chất của bán dẫn loại

p Độ dẫn thấp của các polyme này là do năng lượng vùng cấm cao Năng lượng hoạt hóa ion thấp nhưng lực entropy cao

Trong polyme dẫn, lượng tạp chất đóng vai trò là chất tạo sự liên kết cho quá trình dẫn Trong đó có các chất, hoặc ion nhường điện tử duy trì trạng thái ôxy hóa của polyme Độ dẫn của polyme có thể được tăng rất cao phụ thuộc vào nồng độ tạp chất nhưng đến mức độ nào đó chúng đạt tới tình trạng bão hòa

Bảng 1.3 Một số tạp chất tiêu biểu dùng để pha tạp trong polyme dẫn [56]

Halogen: Cl2, Br2, I2, IBr, IF Kim loại kiềm: Li, Na, K, Rb, Cs Lewis acid: PF5, AsF5, SbF5, BF3,

FSO3H, ClSO3H Kim loại kiềm thổ: Ca, Sr, Ba Proton acid: HF, HCl, HNO3,

H2SO4, FSO3H, ClSO3H Hợp chất kim loại chuyển tiếp:

FeCl5, FeOCl, TiCl4, ZrCl4, NbF5, NbCl5, TaCl5, MoF5, MoCl5, WF6,

UF6, LnU Các chất điện li: Cl-, Br -, ClO-4,

PF6-, AsF6-, BF4-

Các kim loại khác: R4N+, R4P+, R4As+, R4S+

1.3.3 Ứng dụng polyme trong cảm biến sinh học

Ứng dụng của polyme dẫn trong cảm biến sinh học gần đây đã được quan tâm rất nhiều Đó là do những vật liệu điện tử phân tử này có khả năng điều chỉnh được các thông số khác nhau như: độ màng polyme, thuộc tính điện tử và quá trình dẫn truyền điện tử, Hơn nữa, cảm biến sinh học trên cơ sở polyme dẫn đáp ứng được yêu cầu về

độ tương thích sinh học, khả năng cảm nhận in vivo, kiểm soát thuốc, tạo thiết bị nhỏ

gọn và mật độ thông tin cao [10]

Những polyme dẫn thường được sử dụng trong cảm biến sinh học như: polypyrrole (PPy) và các dẫn xuất, polyaninile (PANi), Polythiophene (PT), 3- Amino

- propyl – triethoxy - silance (APTS), [10, 27,29,41]

Polyme dẫn cũng được định dạng bằng các phương pháp lý hoá khác nhau để thay đổi độ dẫn, hoạt tính sinh học hay tạo hình vật lý được mô tả trong hình 1.8

Hình 1.8 Mô hình ứng dụng của màng polyme dẫn

Polyme dẫn thường được tổng hợp lên trên bề mặt diện tích hiệu dụng của cảm biến Các phần tử cảm nhận sinh học được cố định trong nền polyme dẫn đó (bảng 1.4) Khi có tương tác sinh hóa giữa các phần tử cảm nhận sinh học với các chất phân tích, tín hiệu sẽ được truyền qua bộ chuyển đổi thành tín hiệu điện Polyme dẫn đóng vai trò cố kết phần tử cảm nhận sinh học lên trên bề mặt cảm biến, làm tăng quá trình truyền dẫn điện tử khi có phản ứng sinh hóa xảy ra giữa: enzyme – cơ chất, các ssDNA có trình tự bổ sung nhau hoặc kháng thể - kháng nguyên,…

Bảng 1.4 Cố định các phân tử sinh học lên lớp polyme dẫn trong các thiết bị cảm biến [10]

1.Tương tác yếu

Hút bám

- Lực tĩnh điện, liên kết hydro, lực Van

der Waals,…

- Đơn giản

- Mất mát dần các phân tử sinh học theo thời gian

- Kiểm soát bị hạn chế quá trình cố định

- Định hướng ngẫu

nhiên trên bề mặt

Bẫy

- Kết hợp phân tử trong quá trình trùng hợp điện

- Đơn giản

- Chuyển tiếp tốt giữa các nguyên tố lân cận

- Mất mát thế của hoạt tính phân tử sinh học

- Kìm hãm sự khuyếch tán và sắp xếp không gian

- Đòi hỏi nồng độ phân tử sinh học cao

Liên kết bằng ái lực

- Tương tác ái lực cao như avidin-biotin

- Kiểm soát được hướng phân tử

- Tác động lớn tới chất phân tích

- Giảm thiểu sự mất mát hoạt tính phân tử sinh học

- Đòi hỏi phải cố định ban đầu bởi một loại phân tử ái lực ( như biotin,…)

2 Đồng hóa trị

Liên kết hoá học

- Phản ứng hóa học

bề mặt giữa các nhóm chức

- Kiểm soát chặt chẽ hơn quá trình cố định

- Tác động lớn tới chất phân tích

- Giảm thiểu sự mất mát phân tử theo thời gian

- Kiểm soát được hướng phân tử sinh học

- Phức tạp

- Các điều kiện liên kết khác nhau đối với phần tử sinh học khácnhau

- Mất mát thể của hoạt tính phân tử sinh học

1.4 Một số khái niệm về sinh học phân tử, vi rút học, vi rút Herpes 1.4.1 Một số khái niệm về sinh học phân tử

1.4.1.1 Axit nucleic [2]

Axit nucleic là một loại vật chất mang thông tin di truyền của các hệ thống sống Bản chất là một polyme hình thành từ các monome là nucleotide Mỗi nucleotide gồm ba thành phần: nhóm phosphate, đường pentose (đường 5 các bon) và một base hữu cơ (vì các nucleotide chỉ khác nhau ở các base nên ta dùng từ “base” thay cho từ

“nucleotide”) Các base hữu cơ thuộc hai nhóm: purine bao gồm: adenine (A) và guanine (G); pyrimidine gồm: thymine (T), cytocine (C) và uracil (U)

Axit nucleic gồm hai loại phân tử có cấu tạo rất giống nhau: DNA (desoxyribonucleic acid) và RNA (ribonucleic acid)

- Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đơn, mỗi mạch đơn là một

chuỗi nucleotide Mỗi nucleotide gồm một nhóm phosphate, đường desoxyribo và một trong bốn base (A, C, G và T) Hai mạch đơn liên kết với nhau nhờ các liên kết hydro hình thành giữa các base bổ sung nằm trên hai mạch, A bổ sung với T và C bổ sung với G Mỗi mạch đơn là một trình tự có định hướng với một đầu là 5’ phosphate tự do, đầu kia là 3’ hydroxyl tự do (hướng qui ước là 5’→ 3’) Hướng của hai mạch đơn trong chuỗi xoắn kép ngược nhau, người ta gọi chúng là mạch đối song song (hình 1.9) Hai mạch đơn liên kết với nhau bởi một quan hệ bổ sung Chính quan hệ này giải thích được cấu trúc chặt chẽ của phân tử DNA và đặc biệt là phương cách tự sao chép

để tạo ra hai phân tử con từ một phân tử mẹ

Hình 1.9 Cấu trúc và sự lai hóa của phân tử DNA

Nguồn: http://academic.brooklyn.cuny.edu/biology/ /16-05-doublehelix.jpg

- Phân tử RNA có cấu trúc tương tự DNA, nhưng khác nhau ở ba điểm:

+ Phân tử RNA là chuỗi đơn + Pentose của phân tử RNA là đường ribose thay vì đường desoxyribo + Thymine trong DNA được thay thế bằng Uracil trong phân tử RNA Trong tế bào, có ba loại RNA chính với các vai trò khác nhau:

+ RNA thông tin (mRNA): là bản sao những trình tự nhất định trên phân tử

DNA, chứa vai trò trung gian để chuyển thông tin mã hoá trên phân tử DNA đến bộ máy giải mã thành phân tử protein tương ứng mRNA có cấu trúc đa dạng, kích thước nhỏ, chiếm 2-5% tổng số RNA trong tế bào

+ RNA vận chuyển (tRNA): Vận chuyển các amino axit cấn thiết đến bộ máy

dịch mã để tổng hợp protein từ mRNA tương ứng tRNA có cấu trúc ba lá

+ RNA của ribosome (rRNA): Chiếm 80% tổng số RNA tế bào Các rRNA kết

hợp với các protein chuyên biệt tạo thành ribosome, một thành phần quan trọng của bộ máy dịch mã của tế bào

1.4.1.2 Các liên kết hoá học yếu trong hệ thống sống

Có bốn loại liên kết hoá học yếu cơ bản trong hệ thống sống:

- Liên kết hydro: là tương tác yếu hình thành giữa một nguyên tử mang điện tích

âm (nguyên tử nhận A – acceptor) và một nguyên tử hydro (H) đang nằm trong một nối cộng hóa trị với một nguyên tử khác (nguyên tử cho D –donnor)

D—H + A ↔ D—H···A (1.5) Năng lượng cần để phá vỡ một liên kết hydro là khoảng 5kcal mol-1

- Liên kết ion là tương tác tĩnh điện giữa hai nhóm có điện tích ngược dấu

Người ta cho rằng tương tác tĩnh điện này không đóng vai trò quan trọng quyết định cấu hình không gian của các phân tử hữu cơ

- Liên kết Van der Waals: là các tương tác không đặc hiệu xuất hiện giữa hai

nguyên tử khi chúng tiến gần tới nhau Lực liên kết này không phụ thuộc vào tính phân cực của các phân tử mà chỉ phụ thuộc vào khoảng cách giữa chúng Lực Van der

Waals là kết quả của lực hút và lực đẩy Hai lực này cân bằng ở một khoảng cách nhất định, đặc trưng cho từng loại nguyên tử Khoảng cách này gọi là bán kính Van der Waals Đây là lực liên kết yếu nhất, với giá trị chỉ khoảng 1kcal mol-1 Để liên kết này

có ý nghĩa, nó phải tồn tại với số lượng lớn, nghĩa là bề mặt tiếp xúc của hai phân tử phải cực đại Điển hình là khi phân tử mang một hốc có hình dạng phù hợp với chỗ lồi trên phân tử kia như trường hợp kháng nguyên – kháng thể, enzyme - cơ chất,…

- Liên kết kỵ nước: Các phân tử không phân cực, tức là các phân tử không chứa

nhóm ion hoá lẫn liên kết phân cực, đều không hoà tan trong nước, chúng là những phân tử kỵ nước Lực thúc đẩy các phân tử hay các vùng không phân cực của các phân

tử không liên kết với nhau thay vì với các phân tử H2O được gọi là liên kết kỵ nước Các liên kết kỵ nước đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định các protein, các phức hợp protein với các phân tử khác cũng như sự phân bố các protein trong các màng sinh học

Các liên kết yếu có tác động quyết định đến cấu hình không gian của các đại phân tử sinh học, trật tự phân bố của chúng trong tế bào và tương tác giữa các đại phân

tử sinh học đặc biệt là tương tác protein-DNA

1.4.1.3 Tách chiết DNA

Để phát hiện được DNA trong mẫu phân tích bằng cảm biến sinh học, DNA phải được tách chiết ra khỏi các thành phần liên kết khác như: loại bỏ màng tế bào, loại protein, tủa axit nucleic Do DNA thường là những phân tử có kích thước lớn, dễ

bị phân huỷ hoặc bị gẫy bởi các tác nhân lý, hoá, vì thế quá trình tách triết thường được thực hiện tại các phòng thí nghiệm chuẩn thức và trong điều kiện nhiệt độ thấp

để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào gây phân hủy axit nucleic

1.4.1.4 Lai hóa chuỗi DNA

Khái niệm “nhiệt độ biến tính” của DNA: Khi một phân tử DNA mạch đôi được đun lên một nhiệt độ vượt quá “nhiệt độ biến tính” (Tm) thì hai mạch đơn sẽ tách rời nhau do sự phá vỡ các liên kết hydro nối liền hai mạch Sự chuyển từ dạng mạch đôi sang dạng mạch đơn xảy ra đột ngột khi nhiệt độ dao động rất ít xung quanh Tm do tính cộng hưởng của phản ứng

Công thức tính Tm ở điều kiện chuẩn:

Tm = 69,3 + 0,41(G +C) (1.6)

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự lai hoá chuỗi DNA bao gồm: nồng độ DNA trong môi trường, nhiệt độ và thời gian phản ứng, kích thước các trình tự lai, lực ion của môi trường

Cấu hình của chuỗi xoắn kép của phân tử DNA là một cấu trúc ổn định vì hai lý do: (1) nếu hai mạch đơn tách rời nhau, các bazơ purine và pyrimidine kỵ nước sẽ phải tiếp xúc với nước, điều này dễ làm cho chuỗi DNA đơn không ổn định., (2) mỗi phân

tử DNA mang một số lượng liên kết hydro rất lớn nên dù chuyển động nhiệt có phá vỡ các liên kết nằm hai đầu phân tử, hai mạch đơn vẫn gắn với nhau ở vùng giữa Chỉ trong điều kiện rất khắc nghiệt (nhiệt độ cao hơn Tm) mới có thể phá vỡ đồng thời nhiều liên kết hydro khiến phân tử không còn giữ được cấu hình ban đầu, phân tử bị biến tính

1.4.2 Một số khái niệm về vi rút học

1.4.2.1 Khái niệm về vi rút

Vi rút là dạng nhỏ nhất của sự sống và không có cấu trúc tế bào, chúng phải hoàn toàn phụ thuộc vào tế bào chủ để tổng hợp các đại phân tử và nhân lên Thành phần của vi rút chỉ chứa duy nhất một trong hai loại axit nucleic là DNA hoặc RNA cuộn bên trong một lớp vỏ capsid, đôi khi còn có thêm một lớp lipid bao bên ngoài [23] Một số thuật ngữ về thành phần cấu trúc của virút đã được Caspar và cộng sự đề xuất năm 1962 như sau:

- Capsid được biểu thị là một vỏ protein bao bọc axit nucleic và được cấu thành

từ các đơn vị cấu trúc

- Đơn vị cấu trúc là đơn vị cấu tạo nhỏ nhất của lớp vỏ và có chức năng như

nhau

- Capsome là đơn vị hình thái có khả năng quan sát được trên bề mặt của vi rút

và đại diện cho tập hợp đơn vị cấu trúc

- Capsid và axit nucleic được bao bọc bên trong gọi là nucleocapsid

- Nucleocapsid có thể được ‘‘khoác’’ một lớp vỏ bao bọc mang các vật liệu có

nguồn gốc từ tế bào vật chủ hay bản thân vi rút

- Virion là hạt virút hoàn chỉnh có khả năng gây nhiễm vào tế bào chủ

Vi rút là những “vật ký sinh” nội bào bắt buộc nhưng không giống như các sinh vật ký sinh nội bào khác như Chlamyiae và Rickettsiae [1]

1.4.2.2 Bộ gen (vật liệu di truyền) của vi rút

Người ta có thể cô đặc nước nổi nuôi cấy tế bào nhiễm vi rút, làm sạch và tách chiết axit nucleic, sau đó tính trọng lượng, đo chiều dài và quan sát được cấu trúc hình thái của phân tử axit nucleic của vi rút bằng kính hiển vi điện tử [3,23]

Bộ gen của vi rút có những đặc tính sau:

- Mỗi loại vi rút chỉ chứa một loại axit nucleic hoặc là DNA hoặc là RNA: Những vi

rút chứa bộ gen DNA thì phần lớn các DNA là sợi đôi (dsDNA) nhưng cũng có một số ít vi rút chứa DNA sợi đơn (ssDNA) như phage X174 Những vi rút chứa bộ gen RNA thì phần lớn các RNA là sợi đơn (ssRNA) nhưng cũng có một số ít vi rút chứa RNA sợi đôi (dsRNA) như Reovirus

- Chiều dài và trọng lượng phân tử của axit nucleic khác nhau tùy theo từng loại vi rút: Những vi rút chứa chuỗi axit nucleic dài thường có kích thước lớn hơn Bộ gen DNA có

trọng lượng phân tử thay đổi từ 1x106 dalton (DNA sợi đơn của Phage X174) đến 160x106

dalton (Poxvirus) Bộ gen RNA có trọng lượng phân tử thay đổi từ 1x106 dalton (RNA nhỏ của phage) đến 10x106 dalton (Coronavirus) và 15x106 dalton (RNA sợi kép của Reovirus) (1 dalton = 1,661g) [3,23]

Papovavirus là mạch vòng và tồn tại ở 2 đồng phân Thể thứ nhất là một DNA xoắn vặn; ở mỗi đầu nối của hai sợi được khép lại kín bằng mạch kết hợp đồng hoá trị để trở thành vòng xoắn Thể thứ hai là mạch vòng - thẳng do sự đứt của một trong hai sợi, nó vẫn còn khả năng gây nhiễm và mạch vòng dễ dàng bị gắn với bộ gen tế bào chủ

(Orthomyxoviridae) có tám đoạn, ở trạng thái này nó dễ dàng tái tổ hợp Bộ gen RNA

chuỗi kép của họ Reoviridae có 11 đoạn

bị hấp phụ, xâm nhập vào tế bào chủ và bộ gen của vi rút nhân lên trong tế bào sau gia đoạn cởi vỏ capsid

1.4.2.3 Protein của vi rút

Một số protein được vi rút mã hoá là protein cấu trúc, chúng là một phần của virion, còn một số khác là protein không cấu trúc và có vai trò trong quá trình nhân lên của vi rút Vai trò cơ bản của protein cấu trúc là tạo thành một lớp áo bảo vệ axit nucleic của vi rút Một trong những protein bề mặt có vị trí kết hợp với thụ thể của tế bào chủ Các virion của tất cả các vi rút của động vật có vú đều chứa nhiều protein khác nhau, khoảng từ 2 protein ở những vi rút đơn giản nhất tới trên 100 protein ở những vi rút phức tạp nhất Với những vi rút đối xứng hình khối , các protein cấu trúc tạo thành capsid hình khối nhiều mặt, đôi khi nó bao bọc một lớpỉtung gian hoặc một lõi gồm những polypeptid kết hợp chặt chẽ với axit nucleic [23]

Một hoặc nhiều enzyme liên kết với hầu hết các virion đều liên quan tới sự sao chép axit nucleic Chúng gồm có nhiều kiểu enzyme phiên mã khác nhau, sao chép mRNA từ những bộ gen vi rút DNA sợi đôi hoặc sợi đơn hoặc những bộ gen vi rút với RNA sợi (-) Enzyme phiên mã ngược sao chép DNA từ RNA có trong Retrovirus (HIV) và Hepadnavirus (vi rút viêm gan B), trong khi đó những enzyme khác có trong Retrovirus lại liên quan tới sự tổng hợp của các DNA đã tích hợp vào trong DNA tế bào

Poxvirus nhân lên trong bào tương tế bào vật chủ mang một số enzyme liên quan tới quá trình tạo khuôn mẫu phiên mã RNA và sao chép DNA Một trong những glucoprotein gai của vỏ các vi rút Orthomyxovirus và Paramyxxovirus là neuraminidase có hoạt tính enzyme

1.4.2.4 Glycoprotein của vi rút

Đa số glycoprotein vi rút được biểu hiện là những gai (spike) gắn vào màng hoặc chồi ra từ vỏ của vi rút có vỏ, những glycoprotein của một số vi rút phức tạp hơn được glycosyl hóa Những chuỗi oligo sacarit (glycans) được gắn bởi cầu nối N-glycosidic hoặc O-glycosidic nhưng ít hơn Vì các glycan được tổng hợp bởi các glycosyltransferaze của tế bào nên thành phần đường của những glycan tương ứng với thành phần đường của những lycoprotein màng tế bào chủ [3,23]

1.4.2.5 Lipid của vỏ vi rút

Lipid chiếm khoảng 20-35% trọng lượng khô của các vi rút có vỏ; vỏ gồm lipid của tế bào vật chủ và các loại protein của vi rút Nên thành phần các lipid của những vi rút khác với thành phần của lipid màng tế bào vật chủ Khoảng 50-60% lipid vỏ là phospholipid còn lại hầu hết là cholesterol Đại đa số lipid trong các vi rút có vỏ là màng lipid 2 lớp có các gai (spike) glycoprotein gắn vào

1.4.3 Vi rút Herpes (Herpes Simplex Virus - HSV)

1.4.3.1 Một số đặc điểm của vi rút Herpes

HSV thuộc họ Herpesviridae, là một trong những nguyên nhân gây bệnh cho

người phổ biến nhất trên toàn cầu, chỉ sau vi rút cúm và các vi rút gây bệnh cảm cúm thông thường [6] Cấu trúc của HSV gồm có DNA sợi kép thẳng, vỏ capsid gồm 162 mặt đối xứng hình khối có vỏ bao dạng cầu hoặc đa hình, đường kính hạt vi rút hoàn chỉnh 120-200nm Capsid của vi rút Herpes có đường kính 100nm (hình 1.10a, b) Mỗi capsome có một vùng lõm sâu ở giữa Lõi của vi rút chứa bộ gen dsDNA, có độ

dài biến động khoảng 125 – 229kbp, là một cuộn các sợi DNA bị bao bọc lại Đầu của

các sợi DAN được gắn vào mặt trong của lớp áo capsid Lớp vỏ bao bọc nucleocapsid

có nguồn gốc từ lá trong màng nhân tế bào vật chủ Các glycoprotein có ở bề mặt màng ngoài hạt vi rút phân tán Hình 1.10b, mô tả glycoprotein B (gB) như các đám gai dài khoảng 10nm Giữa capsid và vỏ là một lớp màng protein không rõ ràng (lớp tegument) Khi lớp vỏ bị vỡ và xẹp xuống, các virion nhuộm âm thường có dạng như quả trứng rán (hình 1.10a)

Hình 1.10a Ảnh hiển vi điện tử truyền qua của vi rút Herpes - nhuộm âm bản

Nguồn: Trần Quang Huy –K12N

Hình 1.10b Cấu trúc vi rút Herpes

Nguồn: http://home.inje.ac.kr/ /hsv1structure.jpg

HSV có hai týp (HSV-1 và HSV-2) HSV-1 thường gây bệnh ở mặt, đặc biệt là khu vực miệng như viêm loét miệng-lợi, quá trình lây nhiễm HSV-1 có thể xảy ra khi người bình thường tiếp xúc với dịch tiết nước bọt của người mắc bệnh (hình 1.11) HSV-2 gây bệnh ở đường sinh dục của cả nam và nữ Tuy nhiên, hiện nay do hành vi tình dục thay đổi, HSV-1 cũng có thể gây bệnh ở bộ phận sinh dục hoặc ngược lại Bệnh do HSV có thể điều trị được nhưng không thể khỏi hẳn Triệu chứng bệnh xuất hiện trong thời gian ngắn rồi biến mất Bộ gen vi rút nằm tiềm ẩn trong các tế bào thần kinh nhưng có thể tái phát [6,23]

Hình 1.11 Bệnh nhân bị nhiễm vi rút HSV-1, toàn bộ khu vực xung quanh miệng và lưỡi của

bệnh nhân bị phồng rộp và lở loét

Nguồn: http://missinglink.ucsf.edu/ /Herpes_Simplex_tongue-XX.jpg

Nhiễm trùng tiên phát thường ở trẻ em Lây qua các chất tiết của mụn nước Gây nhiễm thể ẩn trong hạch thần kinh giao cảm Tái phát có thể xảy ra trong suốt cuộc đời của người nhiễm vi rút

Vi rút herpes týp 2

Thường gây nhiễm trùng ở đường sinh dục Nhiễm trùng tiên phát thường sau tuổi dậy thì, liên quan đến hoạt động tình dục

Lây truyền qua tiếp xúc với dịch tiết từ mụn nước

Gây nhiễm thể ẩn ở các hạnh giao cảm vùng thắt lưng

Herpes sơ sinh là bệnh thường mắc phải lúc sinh ở các bà mẹ bị bệnh tại đường sinh dục

1.4.3.2 Phương pháp chẩn đoán vi rút Herpes trong phòng thí nghiệm

Hiện nay trên thế giới có một số phương pháp, kỹ thuật được ứng dụng để chẩn đoán, phát hiện vi rút Đặc điểm của các phương pháp này là phải thực hiện trong các phòng thí nghiệm chuẩn thức Tùy theo mức độ nguy hiểm của từng loại vi rút mà tổ chức y tế thế giới (WHO) yêu cầu thực hiện các kỹ thuật này trong phòng thí nghiệm

an toàn bậc 1, bậc 2, bậc 3 hoặc bậc 4 Nhìn chung, các phương pháp chẩn đoán vi rút được phân thành 02 nhóm: phát hiện trực tiếp; kiểm tra gián tiếp Phát hiện trực tiếp là phương pháp nhằm tìm ra sự hiện diện của các hạt vi rút, kháng nguyên, axit nucleic của vi rút trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm bằng các kỹ thuật hiển vi điện tử (EM), kỹ thuật miễn dịch, kỹ thuật sinh học phân tử (PCR,…) Kiểm tra gián tiếp là phương pháp phân lập vi rút, mẫu bệnh phẩm đưa vào trong môi trường nuôi cấy thích hợp (tế bào nuôi, trứng, động vật, ) nhằm tạo điều kiện cho vi rút cần tìm phát triển sau đó sử dụng các kỹ thuật khác nhau theo dõi sự thay đổi của tế bào: theo dõi hiệu ứng hoại tế bào (CPE) trong quá trình nuôi cấy tế bào, quan sát ngưng kết hồng cầu, Ngoài ra, huyết thanh học là phương pháp phát hiện sự thay đổi tỷ lệ kháng thể lúc phát bệnh và thời gian hồi phục, các kỹ thuật được sử dụng như: ức chế ngưng kết hồng cầu, miễn dịch huỳnh quang, trung hoà, đánh dấu phóng xạ, miễn dịch gắn men (ELISA),

Đối với vi rút Herpes, các phương pháp chẩn đoán nhanh chủ yếu để xác định

sự có mặt kháng nguyên HSV trong các tế bào lấy ra từ tổn thương bọng nước, đường sinh dục, vết loét ở họng, giác mạc hoặc sinh thiết mô não bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang Ngoài ra, người ta cũng áp dụng kỹ thuật ELISA để xác định sự có mặt kháng nguyên HSV trong dịch não tủy hay dò tìm DNA của HSV trong dịch này bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction – phản ứng chuỗi tổng hợp polymerase)

CHƯƠNG 2 CHẾ TẠO CẢM BIẾN SINH HỌC

Trong chương 2, tác giả tập trung trình bày phương pháp chế tạo loại cảm biến sinh học DNA trên cơ sở polyme dẫn 3-aminopropyltriethoxysilance (APTS) nhằm phát hiện vi rút herpes týp 1 và 2 (HSV) thông qua việc dò tìm DNA đặc hiệu của HSV Quá trình này bao gồm việc chế tạo các vi cảm biến độ dấn, lựa chọn polyme dẫn thích hợp, chuẩn bị DNA đầu dò và cố định DNA đầu dò lên trên bề mặt vi cảm biến, quá trình xây dựng hệ đo, nguyên lý và cách thức đo đạc các thông số của vi cảm biến sinh học chế tạo được để phát hiện DNA bổ sung trong mẫu thử nghiệm và dò tìm DNA đặc hiệu của HSV trong sản phẩm PCR

2.1 Thiết bị, hoá chất 2.1.1 Thiết bị

Vi cảm biến được chế tạo trên công nghệ silicon với vật liệu ban đầu là phiến silic sạch có đường kính 76,2mm và 101,6mm, định hướng (100) Máy phún xạ ca tốt cao tần, lò oxy hóa, hệ thống quang khắc PEM 800 (SAMCO, Nhật Bản), máy quay phủ, kính hiển vi soi nổi, mắy cắt ACCU-CUT 5200, máy hàn dây 7400C (Westbond Inc., USA), bộ khuếch đại Lock-in SR830

2.1.2 Hóa chất

Các hoá chất thí nghiệm bao gồm : chất cảm quang dương OIR 907-12, dung dịch hiện hình Tetra Methyl Ammonium Hydroxide 2% (Fujifilm Electronic Materials, USA); HF, HCl, HNO3, H2SO4, KCr2O7, CH3COCH3, CH3OH, cồn tuyệt đối, KCl, NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, 3-aminopropyl–triethoxy-silance (APTS, 98%), 1–ethyl-3-(dimethyl-aminopropyl)carbodiimide (EDC), 1-methylimidazole (MIA) (Sigma-Aldrich); nước khử ion (ITIMS)

DNA đầu dò có trình tự 5’–AT CAC CGA CCC GGA GAG GGA C–3’ và DNA bổ sung (đích) có trình tự 5’-G TCC CTC TCC GGG TCG GTG AT-3’, nước có enzyme bảo vệ axit nucleic (Invitrogen); kít tách chiết QIAamp® DNA minikit (QIAGEN); Master Mix GoTaq® Green (Promega M712B); Sản phẩm PCR HSV được thực hiện và cung cấp bởi Phòng thí nghiệm các vi rút Herpes, khoa Vi rút, Viện

Vệ sinh Dịch tễ Trung ương