Nghiên cứu sự biến đổi nồng độ HBV-RNA và mối liên quan với HBeAg, HBVDNA ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate

Nghiên cứu sự biến đổi nồng độ HBVRNA và mối liên quan với HBeAg, HBVDNA ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate.Nghiên cứu sự biến đổi nồng độ HBVRNA và mối liên quan với HBeAg, HBVDNA ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate.Nghiên cứu sự biến đổi nồng độ HBVRNA và mối liên quan với HBeAg, HBVDNA ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate.Nghiên cứu sự biến đổi nồng độ HBVRNA và mối liên quan với HBeAg, HBVDNA ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate.Nghiên cứu sự biến đổi nồng độ HBVRNA và mối liên quan với HBeAg, HBVDNA ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate.Nghiên cứu sự biến đổi nồng độ HBVRNA và mối liên quan với HBeAg, HBVDNA ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate.Nghiên cứu sự biến đổi nồng độ HBVRNA và mối liên quan với HBeAg, HBVDNA ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate.Nghiên cứu sự biến đổi nồng độ HBVRNA và mối liên quan với HBeAg, HBVDNA ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate.Nghiên cứu sự biến đổi nồng độ HBVRNA và mối liên quan với HBeAg, HBVDNA ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate.Nghiên cứu sự biến đổi nồng độ HBVRNA và mối liên quan với HBeAg, HBVDNA ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate.Nghiên cứu sự biến đổi nồng độ HBVRNA và mối liên quan với HBeAg, HBVDNA ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate.Nghiên cứu sự biến đổi nồng độ HBVRNA và mối liên quan với HBeAg, HBVDNA ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate.Nghiên cứu sự biến đổi nồng độ HBVRNA và mối liên quan với HBeAg, HBVDNA ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate.Nghiên cứu sự biến đổi nồng độ HBVRNA và mối liên quan với HBeAg, HBVDNA ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate.Nghiên cứu sự biến đổi nồng độ HBVRNA và mối liên quan với HBeAg, HBVDNA ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate.Nghiên cứu sự biến đổi nồng độ HBVRNA và mối liên quan với HBeAg, HBVDNA ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate.Nghiên cứu sự biến đổi nồng độ HBVRNA và mối liên quan với HBeAg, HBVDNA ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate.Nghiên cứu sự biến đổi nồng độ HBVRNA và mối liên quan với HBeAg, HBVDNA ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate.Nghiên cứu sự biến đổi nồng độ HBVRNA và mối liên quan với HBeAg, HBVDNA ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate.Nghiên cứu sự biến đổi nồng độ HBVRNA và mối liên quan với HBeAg, HBVDNA ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate.Nghiên cứu sự biến đổi nồng độ HBVRNA và mối liên quan với HBeAg, HBVDNA ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate.Nghiên cứu sự biến đổi nồng độ HBVRNA và mối liên quan với HBeAg, HBVDNA ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate.Nghiên cứu sự biến đổi nồng độ HBVRNA và mối liên quan với HBeAg, HBVDNA ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate.Nghiên cứu sự biến đổi nồng độ HBVRNA và mối liên quan với HBeAg, HBVDNA ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate.Nghiên cứu sự biến đổi nồng độ HBVRNA và mối liên quan với HBeAg, HBVDNA ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate.Nghiên cứu sự biến đổi nồng độ HBVRNA và mối liên quan với HBeAg, HBVDNA ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate.Nghiên cứu sự biến đổi nồng độ HBVRNA và mối liên quan với HBeAg, HBVDNA ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate.Nghiên cứu sự biến đổi nồng độ HBVRNA và mối liên quan với HBeAg, HBVDNA ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate.

NGUYỄN ĐÌNH ỨNG

NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỔI NỒNG ĐỘ HBV-RNA VÀ MỐI LIÊN QUAN VỚI HBEAG, HBV-DNA Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN VIRUS B MẠN TÍNH ĐIỀU TRỊ BẰNG TENOFOVIR DISOPROXIL FUMARATE

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2023

NGUYỄN ĐÌNH ỨNG

NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỔI NỒNG ĐỘ HBV-RNA VÀ MỐI LIÊN QUAN VỚI HBEAG, HBV-DNA Ở BỆNH NHÂN VIÊM GAN VIRUS B MẠN TÍNH ĐIỀU TRỊ BẰNG TENOFOVIR DISOPROXIL FUMARATE

Ngành: Bệnh truyền nhiễm và các bệnh nhiệt đới

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu trong đề tài luận án là một phần số liệu trong

đề tài nghiên cứu cấp sở, mã số 01C-0808-2017-3, có tên: “Nghiên cứu xâydựng quy trình định lượng và đánh giá sự biến động tải lượng HBV RNAhuyết tương trong đáp ứng điều trị ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính tại HàNội” Kết quả đề tài này là thành quả nghiên cứu của tập thể mà tôi là mộtthành viên chính Tôi đã được Chủ nhiệm đề tài và toàn bộ các thành viêntrong nhóm nghiên cứu đồng ý cho phép sử dụng những số liệu này vào trongluận án Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từngđược ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

Nguyễn Đình Ứng

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ ix

DANH MỤC CÁC HÌNH xi

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan bệnh viêm gan virus B mạn tính 3

1.1.1 Tình hình nhiễm HBV trên thế giới và ở Việt Nam 3

1.1.2 Diễn biến tự nhiên của nhiễm HBV mạn tính 4

1.1.3 Giá trị của nồng độ HBV-DNA huyết tương trong bệnh viêm gan virus B mạn tính 6

1.1.4 Giá trị của HBeAg huyết tương trong theo dõi điều trị và tiên lượng bệnh viêm gan virus B mạn tính 9

1.1.5 Cập nhật chỉ định điều trị và ngừng thuốc kháng virus 10

1.1.6 Thuốc điều trị viêm gan virus B mạn tính đường uống 12

1.2 Đặc điểm sinh học của HBV 15

1.2.1 Cấu trúc của hạt virus 15

1.2.2 Cấu trúc bộ gen HBV 15

1.2.3 Các protein của HBV 16

1.2.4 Chu trình nhân lên của virus 18

1.2.5 Vai trò của HBV-RNA trong vòng đời HBV 20

1.3 Các kỹ thuật định lượng nồng độ HBV-RNA trong máu ngoại vi bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính 21

1.3.1 Kỹ thuật 3’ RACE-PCR/ Realtime PCR 22

1.3.2 Kỹ thuật RT-qPCR 23

1.3.3 Kỹ thuật Droplet digital PCR 26

1.4 Tình hình các nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam về dấu ấn HBV-RNA

huyết tương trong điều trị và tiên lượng bệnh viêm gan virus B mạn tính 28

1.4.1 Các nghiên cứu trên thế giới 28

1.4.2 Các nghiên cứu trong nước 35

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.1 Đối tượng nghiên cứu 36

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân 36

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 36

2.1.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 36

2.2 Phương pháp nghiên cứu 37

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 38

2.2.2 Cỡ mẫu nghiên cứu, thời điểm thu thập và phác đồ điều trị 38

2.2.3 Các chỉ tiêu nghiên cứu và tiêu chuẩn đánh giá 39

2.2.4 Các nguyên lý và quy trình kỹ thuật sử dụng trong đề tài 41

2.2.5 Phương pháp phân tích số liệu 51

2.2.6 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 52

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53

3.1 Đặc điểm bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính tham gia nghiên cứu 53

3.1.1 Đặc điểm về tuổi và giới tính 53

3.1.2 Đặc điểm về các chỉ tiêu cận lâm sàng 55

3.2 Kết quả xác định sự biến đổi về nồng độ HBV RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính được điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate 57

3.3 Kết quả đánh giá mối liên quan giữa nồng độ HBV-RNA huyết tương với sự thay đổi của HBV-DNA và HBeAg ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính được điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate 64 3.3.1 Mối liên quan giữa nồng độ HBV-RNA huyết tương với sự thay đổi của HBV-DNA ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính được điều trị bằng Tenofovir

3.3.2 Mối liên quan giữa nồng độ HBV-RNA huyết tương với sự thay đổi của HBeAg ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính được điều trị bằng Tenofovir

Disoproxil Fumarate 76

Chương 4 BÀN LUẬN 87

4.1 Đặc điểm của đối tượng tham gia nghiên cứu 87

4.1.1 Đặc điểm chung của đối tượng tham gia nghiên cứu 87

4.1.2 Đặc điểm về cận lâm sàng của đối tượng tham gia nghiên cứu 88

4.2 Sự biến đổi nồng độ HBV-RNA huyết tương ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate 91

4.3 Mối liên quan giữa nồng độ HBV-RNA huyết tương với sự thay đổi của HBV-DNA và HBeAg ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính được điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate 100

4.3.1 Mối liên quan giữa nồng độ HBV-RNA huyết tương với sự thay đổi của HBV- DNA ở bệnh nhân VGBMT được điều trị bằng TDF 100

4.3.2 Mối liên quan giữa nồng độ HBV-RNA huyết tương với sự thay đổi của HBeAg ở bệnh nhân VGBMT được điều trị bằng TDF 115

4.4 Một số hạn chế, tồn tại của đề tài nghiên cứu 125

KẾT LUẬN 126

KIẾN NGHỊ 128

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 129

TÀI LIỆU THAM KHẢO 130

PHỤ LỤC 143

DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT

1 APASL The Asia Pacific Association for the Study of the Liver

3 cccDNA Covalently circular close DNA

5 ddPCR Droplet digital PCR (PCR kỹ thuật số giọt)

7 EASL The European Association for the Study of the Liver

8 ER Endoplastic reticulum (Mạng lưới nội chất)

10 HBcrAg Hepatitis B core related antigen

11 HBeAg Hepatitis B e antigen (Kháng nguyên e của HBV)

12 HBsAg Hepatitis B surface antigen (Kháng nguyên bề mặt HBV)

13 HBV Hepatitis B virus (virus viêm gan B)

14 HBV-flRNA Hepatitis B virus full length Ribonucleic Acid

15 HCC Hepatocellular carcinoma (Ung thư biểu mô tế bào

gan)

17 NAs Nucleos(t)idenucleos(t)ide) analogues (thuốc đồng đẳng

19 pgRNA pregenomic RNA (RNA tiền bộ gen)

20 qPCR Quantitative PCR (PCR định lượng)

21 RACE Rapid amplification of complementary DNA-ends

23 REVEAL-HBV The Risk Evaluation of Viral Load Elevation and

Associated Liver Disease/Cancer in HBV

25 RT Reverse Trancription (Quá trình phiên mã ngược)

26 RTase Reverse transcriptase (Enzyme phiên mã ngược)

27 TDF Tenofovir disoproxil fumurat

28 ULN Upper limit of normal (Giới hạn cao của bình thường)

29 VGBMT Viêm gan virus B mạn tính

DANH MỤC CÁC BẢNG

2.1 Trình tự của các mồi và mẫu dò sử dụng trong nghiên cứu 46

2.2 Chu trình luân nhiệt của phản ứng realtime RT-PCR 47

2.3 Thành phần phản ứng realtime RT-PCR 47

3.1 Phân bố nhóm tuổi của đối tượng tham gia nghiên cứu 53

3.2 Đặc điểm về tuổi của đối tượng tham gia nghiên cứu, 53

3.3 Đặc điểm về giới tính của người tham gia nghiên cứu, phân nhóm theo tình trạng HBeAg trước điều trị 54

3.4 Đặc điểm về HBeAg và anti-HBe tại thời điểm trước điều trị 55

3.5 Đặc điểm về tình trạng thanh thải và chuyển đảo HBeAg 55

3.6 Đặc điểm hoạt độ enzyme AST và ALT tại T0 55

3.7 Đặc điểm về GGT và Bilirubin toàn phần tại T0 56

3.8 Đặc điểm nồng độ HBV-DNA và HBV-RNA huyết tương tại T0 56

3.9 Nồng độ HBV RNA tại các thời điểm nghiên cứu 57

3.10 Mức độ giảm của nồng độ HBV-RNA huyết tương 57

3.11 Nồng độ HBV-DNA huyết tương tại các thời điểm nghiên cứu 60

3.12 So sánh mức giảm nồng độ HBV-RNA và HBV-DNA huyết tương 61

3.13 Mối tương quan giữa nồng độ HBV-RNA và HBV-DNA huyết tương theo thời gian điều trị 64

3.14 Đặc điểm về tình trạng đáp ứng virus theo thời gian điều trị 66

3.15 Mối liên quan giữa nồng độ HBV-RNA huyết tương đối với tình trạng đáp ứng virus tại tháng thứ 6 sau điều trị 67

3.16 Mối liên quan giữa nồng độ HBV-RNA huyết tương trước điều trị với tình trạng đáp ứng sau 6 tháng theo đặc điểm HBeAg T0 67

3.17 Mối liên quan giữa nồng độ HBV-RNA huyết tương đối với tình trạng đáp ứng virus tại sau tháng thứ 12 68

Bảng Tên bảng Trang

3.18 Mối liên quan giữa nồng độ HBV-RNA huyết tương (T0) với tình trạng

đáp ứng virus sau 12 tháng điều trịheo đặc điểm HBeAg T0 683.19 Giá trị dự báo tình trạng đáp ứng virus sau 6 tháng điều trị của nồng độ

HBV-RNA huyết tương trước điều trị 693.20 Giá trị dự báo của nồng độ HBV-RNA huyết tương trước điều trị đối

với tình trạng đáp ứng virus sau 6 tháng, theo đặc điểm HBeAg (T0) 703.21 Mức độ liên quan giữa nồng độ HBV-RNA trước điều trị và tình trạng

đáp ứng virus sau 6 tháng ở nhóm HBeAg (T0) dương tính 703.22 Giá trị dự báo tình trạng đáp ứng virus sau 12 tháng điều trị của nồng

độ HBV-RNA huyết tương T0 713.23 Giá trị dự báo tình trạng đáp ứng virus sau 12 tháng điều trị của nồng

độ HBV-RNA huyết tương trước điều trị theo đặc điểm HBeAg T0 723.24 Mức độ liên quan giữa nồng độ HBV-RNA huyết tương trước điều trị

và đáp ứng virus sau 12 tháng ở nhóm có HBeAg T0 dương tính 723.25 Phân tích hồi quy logistic đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đối với

tình trạng đáp ứng điều trị sau 6 tháng ở nhóm HBeAg (T0) dương tính 733.26 Phân tích hồi quy logistic đánh giá ảnh hưởng các yếu tố đối với tình

trạng đáp ứng điều trị sau 6 tháng ở nhóm HBeAg (T0) âm tính 743.27 Phân tích hồi quy logistic đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đối với

tình trạng đáp ứng điều trị sau 12 tháng ở nhóm HBeAg T0 dương tính 743.28 Phân tích hồi quy logistic đánh giá ảnh hưởng đối với tình trạng đáp

ứng điều trị sau 12 tháng ở nhóm HBeAg (T0) âm tính 753.29 Liên quan giữa nồng độ HBV-DNA và HBV-RNA huyết tương (T0) và

tình trạng thanh thải HBeAg 763.30 Liên quan giữa nồng độ HBV-DNA và HBV-RNA huyết tương (T0) và

tình trạng chuyển đảo HBeAg huyết thanh 77

Bảng Tên bảng Trang

3.31 Giá trị dự báo của nồng độ HBV-RNA huyết tương (T0) với tình trạng

thanh thải HBeAg 773.32 Giá trị dự báo của nồng độ HBV-RNA huyết tương (T0) với tình trạng

chuyển đảo HBeAg 793.33 Mức độ liên quan giữa nồng độ HBV-RNA huyết tương (T0) và tình

trạng thanh thải HBeAg sau 6 tháng điều trị 803.34 Mức độ liên quan giữa nồng độ HBV-RNA huyết (T0) và tình trạng

thanh thải HBeAg sau 12 tháng điều trị 803.35 Mức độ liên quan giữa nồng độ HBV RNA ban đầu và tình trạng

chuyển đảo HBeAg sau 6 tháng điều trị 813.36 Mức độ liên quan giữa nồng độ HBV RNA huyết tương (T0) và tình

trạng chuyển đảo HBeAg sau 12 tháng điều trị 813.37 Phân tích logistic đa biến đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố quan sát đối

với tình trạng thanh thải HBeAg sau 6 tháng điều trị 823.38 Phân tích hồi quy logistic đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đối với

tình trạng thanh thải HBeAg sau 12 tháng điều trị 833.39 Phân tích hồi quy logistic đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đối với

tình trạng chuyển đảo HBeAg sau 6 và 12 tháng điều trị 833.40 Phân tích hồi quy logistic đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đối với

tình trạng chuyển đảo HBeAg sau 12 tháng điều trị 84

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

3.1 Sự khác biệt về tuổi giữa hai nhóm bệnh nhân có HBeAg âm tính và

dương tính tại T0 543.2 Mô hình giảm dạng hai pha của nồng độ HBV-RNA huyết tương theo

thời gian điều trị 583.3 Mô hình giảm nồng độ HBV-RNA huyết tương theo thời gian điều trị;

(A): bệnh nhân HBeAg dương tính; (B) bệnh nhân HBeAg âm tính 593.4 Mô hình giảm nồng độ HBV-DNA huyết tương theo thời gian điều trị

thuốc TDF 613.5 So sánh tốc độ giảm nồng độ HBV-DNA và HBV-RNA huyết tương

theo thời gian điều trị 623.6 Mô hình giảm nồng độ HBV-RNA huyết tương, phân nhóm theo mức

nồng độ HBV-RNA huyết tương trước điều trị 623.7 Sự suy giảm nồng độ HBV DNA huyết tương trong quá trình điều trị

phân theo mức nồng độ HBV RNA ban đầu 633.8 Mối tương quan giữa nồng độ HBV-DNA và HBV-RNA huyết tương

tại thời điểm trước điều trị 653.9 So sánh khả năng dự báo của nồng độ HBV-DNA và HBV-RNA huyết

tương (T0) đối với tình trạng thanh thải HBeAg 783.10 So sánh khả năng dự báo của nồng độ HBV-DNA và HBV-RNA huyết

tương (T0) đối với tình trạng chuyển đảo HBeAg 793.11 So sáng sự biến đổi nồng độ HBV-RNA và HBV-DNA giữa hai nhóm

bệnh nhân thanh thải và không thanh thải HBeAg T6 843.12 So sáng sự biến đổi nồng độ HBV-RNA và HBV-DNA huyết tương

giữa hai nhóm bệnh nhân thanh thải và không thanh thải HBeAg sau 12tháng điều trị 85

Biểu đồ Tên biểu đồ Trang

3.13 So sáng sự biến đổi nồng độ HBV-RNA và HBV-DNA huyết tương

giữa hai nhóm bệnh nhân chuyển đảo và không chuyển đảo HBeAghuyết thanh sau 6 tháng điều trị 863.14 So sáng sự biến đổi nồng độ HBV-RNA và HBV-DNA huyết tương

giữa hai nhóm bệnh nhân chuyển đảo và không chuyển đảo HBeAghuyết thanh sau 12 tháng điều trị 864.1 Sơ đồ suy giảm nồng độ HBV-RNA theo dạng hai pha 934.2 Sơ đồ biến độ nồng độ của HBV pgRNA trong quá trình điều

trị entecavir 96

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.1 Tỷ lệ lưu hành HBsAg ở các khu vực trên thế giới năm 2019 3

1.2 Các giai đoạn nhiễm HBV mạn tính 5

1.3 Liên quan giữa HBV-DNA huyết tương và HCC 7

1.4 Cấu trúc hóa học của Tenofovir Disoproxil Fumarate 13

1.5 Sơ đồ cấu trúc bộ gen của HBV 15

1.6 Chu trình nhân lên của HBV trong tế bào gan 19

1.7 Giải thuyết về HBV pgRNA trong vòng đời của HBV 20

1.8 Sơ đồ kỹ thuật realtime dựa trên nguyên lý 3’-RACE PCR 22

1.9 Vị trí thiết kế các mồi cho phản ứng RT-qPCR 24

1.10 Nguyên lý kỹ thuật ddPCR 26

1.11 Liên quan HBV RNA với chuyển đảo HBeAg 33

2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 37

2.2 Sơ đồ thời điểm thu thập mẫu nghiên cứu 38

2.3 Bộ kit QIAamp Viral RNA mini kit 42

2.4 Nguyên lý xét nghiệm one-step realtime RT-PCR định lượng HBV-RNA huyết tương 44

2.5 Sơ đồ vị trí thiết kế mồi của phản ứng định lượng HBV-RNA 45

2.6 Kết quả chạy dải nồng độ chứng chuẩn xác định ngưỡng phát hiện của quy trình 46

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nhiễm virus viêm gan B (Hepatitis B virus - HBV) là một vấn đề y tếtoàn cầu Mặc dù từ năm 1982, vaccine phòng bệnh hiệu quả cao đã được bổsung vào chương trình tiêm chủng mở rộng tại hơn 160 quốc gia, bệnh gan donhiễm mạn tính HBV vẫn là gánh nặng đối với toàn xã hội [1] HBV có thểlây nhiễm một cách âm thầm và gây ra những hậu quả nặng nề như xơ gan vàung thư biểu mô tế bào gan [1] Gần đây, một số nghiên cứu ước tính trêntoàn cầu có khoảng 4,10 % dân số, tương đương 316 triệu người nhiễm HBVmạn tính và khoảng 555.000 ca tử vong vì các bệnh có liên quan đến nhiễmHBV [2] Việt Nam là một trong những quốc gia có tỷ lệ lưu hành HBV vàoloại cao trên thế giới với ước tính khoảng 6,60 % dân số nhiễm mạn tính HBV[2] Hơn nữa, trên phạm vi toàn cầu, có tới 42,00% bệnh nhân xơ gan nhiễmHBV mạn tính; ở Việt Nam, tỉ lệ này khoảng 35,00 % [3]

Vấn đề tồn tại chủ yếu của quá trình điều trị bệnh viêm gan virus B mạntính (VGBMT) là không đạt được sự khỏi bệnh hoàn toàn bằng các phác đồhiện tại Điều này là do các thuốc kháng virus không có tác dụng trực tiếp tớinguồn cccDNA trong nhân tế bào gan, do đó hầu như không loại bỏ triệt đểđược cccDNA [4], [5] Khi ngừng điều trị thuốc kháng virus, người ta lại thấy

sự phục hồi của HBV-DNA trong huyết tương bệnh nhân [6], [7], [8] Do dó,việc theo dõi và tiên lượng đáp ứng điều trị một cách hiệu quả có ý nghĩaquan trọng trong thực hành lâm sàng Không may là, những dấu ấn sinh họccủa virus hiện đang sử dụng có một số hạn chế trong việc tiên lương sớm tìnhtrạng đáp ứng virus hoặc huyết thanh ở bệnh nhân [9], [10] Cụ thể, sự suygiảm mạnh nồng độ HBV-DNA huyết tương khi sử dụng các thuốc khángvirus thế hệ mới như entecavir hay tenofovir đã đã làm giảm vai trò của yếu tốnồng độ HBV- DNA trong dự báo đáp ứng điều trị [11], [12] Nồng độHBsAg huyết tương, vì thường được tổng hợp một cách dư thừa hàng ngànlần so với HBV-DNA, cũng ảnh hưởng lớn đến việc sử dụng dấu ấn này ởnhững giai đoạn điều trị đầu

tiên [9], [13] Mặc dù, về lâu dài nồng độ HBsAg cũng là một yếu tố tiềmnăng trong tiên lượng đáp ứng điều trị và biến chứng gặp phải ở bệnh nhânVGBMT [14], [15] Gần đây, HBcrAg nổi lên như một dấu ấn sinh học có ýnghĩa trong việc tiên lượng chuyển đảo HBeAg, đáp ứng điều trị, sự tái hoạtđộng của virus sau ngừng thuốc Tuy nhiên, HBcrAg chủ yếu thể hiện vai tròkhá tốt trong tiên lượng chuyển đảo HBeAg huyết thanh và những thông sốdương tính giả, âm tính giả của xét nghiệm còn cần tiếp tục được làm sáng tỏ[16] Do vậy, việc tìm ra xét nghiệm mới nhằm đánh giá đáp ứng điều trị vàtiên lượng bệnh hiệu quả là vấn đề hết sức cấp thiết đối với ngành Y tế.

Một số nghiên cứu trên thế giới thời gian gần đây đã xác định bản chấtsinh học của HBV-RNA lưu hành trong huyết tương của bệnh nhân VGBMT[17], [18] Các nghiên cứu trên cũng đánh giá ý nghĩa của nồng độ HBV-RNAhuyết tương trong dự báo sớm đáp ứng điều trị và chuyển đảo HBeAg, cũngnhư mối liên quan giữa nồng độ HBV-RNA với các dấu ấn sinh học khác củavirus như nồng độ HBV-DNA, HBsAg huyết tương [9], [17], [18] Tại ViệtNam, đến nay đã có một số nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng HBV-RNA huyết tương và bước đầu đánh giá biến động của dấu ấn này trong quátrình điều trị, tuy chỉ với cỡ mẫu còn khiêm tốn và thời gian chưa đủ dài [19],

[20] Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sự biến đổi nồng độ HBV-RNA và mối liên quan với HBeAg, HBV-DNA ở bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính điều trị bằng Tenofovir Disoproxil Fumarate”, với các mục

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bệnh viêm gan virus B mạn tính

1.1.1 Tình hình nhiễm HBV trên thế giới và ở Việt Nam

1.1.1.1 Tình hình nhiễm HBV trên thế giới

Năm 2019, ước tính trên toàn cầu hiện có khoảng 4,10 % dân số, tươngđương 316 (284 – 351) triệu người nhiễm HBV mạn tính và khoảng 555.000(487.000 – 630.000) ca tử vong vì các bệnh có liên quan đến nhiễm HBV mỗinăm [2] Việt Nam là một trong những quốc gia có tỷ lệ lưu hành HBsAgtrong cộng đồng ở mức cao, với khoảng 6,60 % dân số nhiễm mạn tính HBV[2] Trên bình diện toàn cầu, trong số những bệnh nhân xơ gan, có tới 42,00

% người nhiễm HBV, tỉ lệ này là khoảng 35,00 % ở Việt Nam [3]

Hình 1.1 Tỷ lệ lưu hành HBsAg ở các khu vực trên thế giới năm 2019

* Nguồn: theo Global Health Data 2019 Hepatitis B Collaborator [2]

Tỷ lệ lưu hành HBsAg ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ dưới 5 tuổi là một thông

số đại diện cho trình độ quản lý lây nhiễm HBV chu sinh từ mẹ sang con.Theo ước tính năm 2019, tỷ lệ lưu hành HBsAg ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ dưới 5tuổi trên toàn thế giới là 1,00% (0,80 - 1,20), cao nhất ở khu vực châu Phi là2,70% (2,20

- 3,20), thấp nhất ở khu vực châu Mỹ là 0,08% (0,06 - 0,11) Khu vực ĐôngNam Á có tỷ lệ lưu hành HBsAg trên đối tượng này là 0,50% (0,40 - 0,60) [2]

1.1.1.2 Tình hình nhiễm HBV ở Việt Nam

Theo các nghiên cứu quốc tế, tỷ lệ lưu hành HBsAg ở Việt Nam chỉkhoảng 6,60% (số liệu điều tra năm 2019), tuy nhiên các kết quả nghiên cứunhững năm gần đây cho thấy, tỷ lệ nhiễm HBV trên các đối tượng khác nhau ởnước ta cao hơn nhiều [2] Năm 2014, Phan Thị Ngọc Bích và cộng sự (CS)nghiên cứu ở

4.325 cán bộ viên chức tại Hà Nội cho thấy, tỷ lệ nhiễm HBV trên những đốitượng này là 8,00% [21] Nguyễn Xuân Nguyệt Ninh (2017), nghiên cứu ở 203người dân đến xét nghiệm tại Trung tâm Y tế huyện Cần Giuộc, cho thấy tỷ lệHBsAg dương tính là 11,82% [22] Nguyễn Quang Hưng và CS (2019) trongmột nghiên cứu ở nhóm 633 đối tượng nguy cơ cao tại trung tâm Giáo dục vàLao Động Xã Hội Hải Phòng cho thấy, tỷ lệ nhiễm HBV chung là 10,58% [23].Bên cạnh đó, Ngũ Quốc Vĩ và CS (2018) nghiên cứu ở nhóm 215 thaiphụ có tuổi thai từ 37 tuần trở lên cho thấy, tỷ lệ HBsAg dương tính là 8,80

%; trong đó có đến 42,10% thai phụ có HBeAg dương tính [24] Lê Thị HồngVân và CS (2022) trong một nghiên cứu trên 120 trẻ sơ sinh là con của các bà

mẹ có HBsAg dương tính cho thấy, tỷ lệ trẻ có HBsAg dương tính là 60,80%;

tỷ lệ HBeAg dương tính là 13,30% Tỷ lệ trẻ có HBsAg dương tính cao hơnrất nhiều ở những bà mẹ có HBeAg dương tính so với mẹ có HBeAg âm tính(91,90% so với 47,00%, p < 0,01) [25]

Như vậy, tỷ lệ nhiễm HBV ở nước ta thực tế cao hơn so với những báocáo quốc tế và lây truyền từ mẹ sang con vẫn là con đường lây nhiễm quantrọng đối với công tác quản lý lây nhiễm HBV trong cộng đồng ở Việt Nam

1.1.2 Diễn biến tự nhiên của nhiễm HBV mạn tính

Nhiễm HBV mạn tính là một quá trình động, phản ánh tương tác giữa sựtái bản HBV và đáp ứng miễn dịch của người chủ Diễn biến tự nhiên củanhiễm HBV mạn tính được phân chia dựa trên sự có mặt của HBeAg, tảilượng HBV DNA, hoạt độ ALT huyết tương và tình trạng tổn thương gan

Hình 1.2 Các giai đoạn nhiễm HBV mạn tính

* Nguồn: theo Lampertico (2017) [11]

Các giai đoạn nhiễm HBV mạn tính có thể được phân chia gồm [11]:

Giai đoạn 1: “Nhiễm HBV mạn tính HBeAg dương tính”: tương ứng với

giai đoạn “dung nạp miễn dịch” theo danh pháp trước đây; đặc trưng bởi sự

có mặt của HBeAg huyết thanh, HBV-DNA ở mức rất cao và ALT thườngxuyên trong phạm vi bình thường Trong gan, hầu như không có hoặc rất íttình trạng hoại tử hoặc xơ hóa

Giai đoạn 2: “VGBMT, HBeAg dương tính”: đặc trưng bởi sự có mặt

của HBeAg trong huyết thanh, tải lượng HBV-DNA huyết tương ở mức cao

và ALT tăng cao Trong gan, có dấu hiệu hoạt tử trung bình hoặc nặng và tiếntriển thành xơ gan nhanh

Giai đoạn 3: “Nhiễm HBV mạn tính HBeAg âm tính”, tên gọi trước là

“người mang virus không hoạt động”, đặc trưng bởi sự có mặt của kháng thểkháng HBeAg, tải lượng HBV-DNA huyết tương ở mức thấp (< 2000 IU/ml)hoặc không phát hiện được và ALT bình thường (ULN ≤ 40 IU/L) Một vài

bệnh nhân thuộc giai đoạn này có thể có mức HBV-DNA cao > 2000 IU/mL(thường <20.000 IU/mL), cùng với mức ALT bình thường liên tục và chỉ ghinhận hoạt động hoại tử gan tối thiểu và xơ hóa thấp.

Giai đoạn 4: “VGBMT, HBeAg âm tính” đặc trưng bởi sự thiếu khuyết

HBeAg huyết thanh nhưng thường có thể phát hiện anti-HBe, tải lượng DNA huyết tương có thể từ mức trung bình tới cao một cách liên tục hay daođộng (thường thấp hơn so với các bệnh nhân HBeAg dương tính), cũng nhưgiái trị ALT cao liên tục hoặc dao động Mô học gan cho thấy hình ảnh xơ vàhoại tử Hầu hết những người này chứa các biến thể HBV ở khu vực precorevà/hoặc BCP mà gây hư hại hoặc hủy bỏ sự biểu hiện HBeAg Giai đoạn nàyliên quan với tỉ lệ thấp thuyên giảm bệnh tự phát

HBV-Giai đoạn 5: “giai đoạn HBsAg âm tính” đặc trưng bởi HBsAg âm tính

trong huyết tương và anti-HBc dương tính, có thể phát hiện được anti-HBshoặc không Bệnh nhân trong giai đoạn này có giá trị ALT bình thường nhưngkhông luôn luôn không phát hiện được HBV-DNA huyết tương Trạng thái ứcchế miễn dịch có thể dẫn tới sự tái hoạt HBV ở những bệnh nhân này

Như vậy, diễn biến tự nhiên của quá trình nhiễm HBV mạn tính có thểđược phân chia giản lược thành 5 giai đoạn và không nhất thiết liên tục vềthời gian Nếu không được điều trị bằng thuốc kháng virus, tình tạng viêmgan sẽ tái phát lặp lại nhiều lần, cùng với sự xơ hóa gan tăng và tiến triểnthành xơ gan và/ hoặc ung thư biểu mô tế bào gan (HepatocellularCarcinoma– HCC)

1.1.3 Giá trị của nồng độ HBV-DNA huyết tương trong bệnh viêm gan virus B mạn tính

Nồng độ HBV-DNA huyết tương là yếu tố quan trọng cấu thành nên chỉđịnh điều trị thuốc kháng virus, theo dõi hiệu quả điều trị và tiên lượng đápứng của quá trình điều trị bệnh VGBMT Như đã biết, tình trạng đáp ứngvirus (không phát hiện HBV-DNA huyết tương bằng các xét nghiệm PCRnhạy cảm) là một trong các mục tiêu cần thiết của quá trình điều trị bệnhVGBMT [11]

Hơn nữa, một số nghiên cứu trên thế giới đã đánh giá vai trò của nồng độHBV-DNA huyết tương đối với khả năng tiên lượng nguy cơ tiến triển củabệnh xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan (Hepatocellular Carcinoma –HCC) Năm 2007, nghiên cứu REVEAL-HBV của nhóm tác giả Chen C.J.trên 23.820 người trong cộng đồng, theo dõi trong 11 năm, cho thấy, tỉ lệ mắc

xơ gan (trên mỗi 100.000 người/năm được quan sát) tăng theo mức nồng độHBV DNA huyết tương ban đầu [26] Năm 2018, Liu C và CS công bố kếtquả nghiên cứu trên 396 bệnh nhân VGBMT và xơ gan, cho thấy nồng độHBV-DNA có thể tiên lượng tình trạng xơ hóa mức độ nhẹ và xơ gan, rõ rệthơn ở những bệnh nhân có HBeAg dương tính so với những bệnh nhânHBeAg âm tính [27]

Hình 1.3 Liên quan giữa HBV-DNA huyết tương và HCC

* Nguồn: theo Chen C J và CS [26]

Nghiên cứu của tác giả Chen C.J (2007) cũng đồng thời cho thấy nhữngbệnh nhân VGBMT có mức nồng độ HBV-DNA ban đầu càng cao thì nguy

cơ tiến triển HCC càng cao Thêm nữa, những người có nồng độ HBV DNAhuyết tương ban đầu cao hơn mức 5 log10 copies/mL có tỉ số rủi ro tiến triểnHCC hiệu chỉnh cao hơn đáng kể theo mức nồng độ HBV DNA huyết tươngtại thời

điểm kết thúc Điều này chứng tỏ, không chỉ mức nồng độ HBV DNA huyếttương tại thời điểm xét nghiệm (> 5 log10copies/mL), mà sự suy giảm về nồng

độ HBV DNA huyết tương theo thời gian cũng là một yếu tố ảnh hưởng đốivới khả năng tiến triển thành HCC [26], [28] Ủng hộ cho luận điểm trên, năm

2020, Kim G.A và CS nghiên cứu trên 6.949 bệnh nhân VGBMT, theo dõitrong 8 năm, có 363 bệnh nhân HCC (5,2%) Kết quả cho thấy, nguy cơ nguy

cơ tiến triển thành HCC có liên quan đến mức nông độ HBV-DNA huyếttương ban đầu [29] Những kết quả nghiên cứu trên cho thấy, nồng độ HBV-DNA huyết tương là một yếu tố tiên lượng có giá trị đối với các biến chứngnặng của bệnh VGBMT như xơ gan hoặc HCC

Câu hỏi đặt ra tiếp theo, liệu rằng các bệnh nhân được điều trị bằngthuốc kháng virus đồng đẳng nulceos(t)ide (nucleos(t)ide analongues – NAs)

có giúp giảm nguy cơ tiến triển thành xơ gan va HCC trong tương lai haykhông? Để giải đáp vấn đề quan trọng trên, rất nhiều nghiên cứu trên thế giới

đã so sánh nguy cơ tiến triển xơ gan và HCC giữa những bệnh nhân được điềutrị thuốc NAs và không điều trị Các kết quả nghiên cứu cho thấy, ở nhữngbệnh nhân VGBMT được điều trị bằng ETV hoặc TDF, tỷ lệ mắc HCC hàngnăm khoảng từ 0,01% đến 1,4% (bệnh nhân không xơ gan) và từ 0,9% đến5,4% (bệnh nhân bị xơ gan) Trong các nghiên cứu ở châu Á, trị liệu NAsluôn dẫn đến tỷ lệ HCC thấp hơn đáng kể ở những bệnh nhân bị xơ gan (giảm30%) và ở những bệnh nhân không xơ gan (giảm 80%) [30]

Tác giả Hosaka T và CS (2013) nghiên cứu trên 316 bệnh nhân đượcđiều trị ETV (79 người được chẩn đoán xơ gan) và 316 người không điều trịthuốc kháng virus (85 người được chẩn đoán xơ gan) Kết quả nghiên cứu chothấy, những người được dùng ETV có tỉ lệ mắc HCC sau 5 năm thấp hơn so

với những người không sử dụng ETV (3,7% so với 13,7%, p < 0,001) Tỉ lệ

hiện mắc HCC thấp hơn rõ rệt ở nhóm bệnh nhân xơ gan được điều trị ETV

so với những bệnh nhân xơ gan không điều trị ETV (7,0% so với 38,9%, p < 0,001)

[31] Tác giả Kumada T và CS (2013) nghiên cứu nhóm 117 BN dùng ETV(48 xơ gan và 69 VGBMT) và 117 BN không dùng thuốc kháng virus có kếtluận tương tự về tỉ lệ hiện mắc HCC sau 10 năm ở nhóm điều trị ETV thấphơn đáng kể so với nhóm không điều trị thuốc kháng virus (3,3% so với

40,0%, p

= 0,0094) [32] Như vậy, bên cạnh rất nhiều yếu tố có tính chất điều kiện hay

cơ địa, việc sử dụng thuốc NAs có ý nghĩa quan trọng, nhằm giảm thiểu nguy

cơ tiến triển HCC ở bệnh nhân xơ gan và VGBMT

Tóm lại, các kết quả nghiên cứu cho đến nay đã có sự thống nhất về vaitrò của nồng độ HBV-DNA huyết tương đối với bệnh VGBMT và các biếnchứng nguy hiểm đối với bệnh nhân Ngoài ra, các nghiên cứu đều có sựthống nhất về vai trò của việc điều trị thuốc kháng virus đối với vấn đề giảmthiểu nguy cơ tiến triển xơ gan và HCC trên bệnh nhân Do đó, vấn đề tiênlượng hoặc dự báo sớm tình trạng đáp ứng virus (không phát hiện được HBV-DNA huyết tương), tình trạng chuyển đảo huyết thanh HBeAg là hết sức cầnthiết đối với mục tiêu cá nhân hóa quá trình điều trị bệnh VGBMT hiện nay

1.1.4 Giá trị của HBeAg huyết tương trong theo dõi điều trị và tiên lượng bệnh viêm gan virus B mạn tính

Trong tiến trình diễn biến tự nhiên nhiễm HBV mạn tính, tình trạngchuyển đảo HBeAg huyết thanh có vai trò đánh dấu sự chuyển đổi từ giaiđoạn hoạt động miễn dịch sang trạng thái người mang không hoạt động [11].Với những BN VGBMT được điều trị thuốc kháng virus, chuyển đảo HBeAghuyết thanh là một dấu mốc quan trọng, phản ánh hiệu quả ức chế sự nhân lêncủa HBV của thuốc kháng virus [33] Sự thuyên giảm của bệnh được thấy ởphần lớn những BN có chuyển đảo HBeAg huyết thanh (66,8%); đặc biệttrong số những BN đạt chuyển đảo huyết thanh HBeAg xảy ra trước 30 tuổi

và có nồng độ HBV-DNA huyết tương ở mức thấp [34] Hui và CS (2007) đãđánh giá các mẫu mô gan từ 128 BN HBeAg dương tính và chưa từng điều trị.Kết quả cho thấy, những BN xuất hiện chuyển đổi huyết thanh HBeAg vànồng độ HBV- DNA < 4 log10 copies/ml có sự thoái lui của tình trạng xơ hóacao hơn so với

những người còn lại (38,5% so với 19,1%; p < 0,00005) Phân tích đa biến

cho thấy tình trạng chuyển đảo huyết thanh HBeAg và HBV-DNA < 4log10copies/ml có liên quan độc lập với sự thoái lui của mức độ xơ hóa [35].Hơn nữa, các hiệp hội nghiên cứu bệnh gan trên thế giới đều khuyến cáo, sựchuyển đảo HBeAg huyết thanh là một yếu tố quan trọng, gợi ý xem xét khảnăng ngừng thuốc NAs an toàn [11], [36]

Bên cạnh đó, mối liên quan giữa tình trạng HBeAg dương tính và nguy

cơ tiến triển HCC đã được tác giả Yang HI và CS (2002) báo cáo trong mộtnghiên cứu dài hạn trên 11.893 nam giới Đài Loan không mắc HCC [37].Trong đó, tỉ lệ mắc HCC ở BN có HBeAg dương tính cao hơn so với những

BN còn lại (1.169 trường hợp trong 100.000 người-năm so với 324 trườnghợp trong

100.0 người-năm) Chen CJ và CS (2006) nghiên cứu ở 3.582 BN cóHBeAg dương tính, theo dõi trong 11 năm cho thấy, tình trạng HBeAg dươngtính có liên quan đến nguy cơ tiến triển HCC cao hơn (hazard ratio [HR] =

2.6; 95% CI = 1.6–4.2; P > 0.001) [28] Ngoài ra, Lin SM và CS (2007)

nghiên cứu trên 233 BN VGBMT cho thấy, những BN có chuyển đảo HBeAghuyết thanh có tỉ lệ mắc xơ gan tích lũy sau 15 năm thấp hơn (17,8% so với

33,7%, p =0,041) và có tỉ lệ mắc tích lũy HCC sau 15 năm thấp hơn (2,7% so với 12,5%, p = 0,011) so với những BN không chuyển đảo HBeAg [38].

Những dữ liệu trên cho thấy, tình trạng dương tính HBeAg huyết thanh

có liên quan đến sự gia tăng nguy cơ tiến triển HCC và xơ gan; sự chuyển đảoHBeAg là một mục tiêu liên quan đến tình trạng sau điều trị tốt hơn ở những

ở BN VGBMT Như vậy, sự chuyển đảo HBeAg huyết thanh là một dấu mốcquan trọng, có ý nghĩa dự báo hiệu quả điều trị tốt và tiên lượng thuận lợitrong việc đạt mục tiêu cải thiện khả năng sống sót của BN VGBMT

1.1.5 Cập nhật chỉ định điều trị và ngừng thuốc kháng virus

Theo hướng dẫn chẩn đoán và điều trị bệnh viêm gan vi rút B của Bộ Y

tế, ban hành ngày 29/7/2019, chỉ định điều trị thuốc kháng virus ở bệnhVGBMT căn cứ trên sự phối hợp của ba yếu tố cần thiết: tải lượng HBV-DNA huyết thanh, hoạt độ ALT huyết thanh và mức độ xơ hóa gan [39]

Các chỉ định điều trị cụ thể:

- Điều trị VGBMT cho người bệnh khi đáp ứng cả 2 tiêu chuẩn:

(1) Tổn thương tế bào gan

AST, ALT > 2 lần ULN và/hoặc xơ hóa gan F ≥ 2

(2) Vi rút đang tăng sinh

+ HBV-DNA ≥ 20.000 IU/mL (≥ 105 copies/mL) nếu HBeAg dương tính.+ HBV-DNA > 2.000 IU/mL (≥ 104 copies/mL) nếu HBeAg âm tính

- Đối với các trường hợp chưa đáp ứng hai tiêu chuẩn trên, chỉ định điềutrị khi có một trong các tiêu chuẩn sau:

+ Những BN trên 30 tuổi, với mức ALT cao hơn ULN kéo dài (ghi nhận ítnhất 3 lần trong khoảng 24 - 48 tuần) và HBV DNA > 20.000 IU/ml, bất kể tìnhtrạng HBeAg

+ Tiền sử gia đình có HCC hoặc xơ gan

+ Có các biểu hiện ngoài gan như viêm cầu thận, viêm đa khớp,cryoglobulin máu, viêm đa nút động mạch

+ Tái phát sau khi ngưng điều trị thuốc kháng HBV

Các gợi ý xem xét ngừng sử dụng thuốc NAs:

+ VGBMT với HBeAg dương tính: có thể ngưng điều trị sau khi đã điềutrị thêm 12 tháng kể từ khi có chuyển đổi huyết thanh HBeAg (HBeAg âmtính, anti-HBe dương tính và tải lượng HBV-DNA dưới ngưỡng) hoặc mấtHBsAg

+ VGBMT với HBeAg âm tính: có thể ngưng điều trị khi tải lượng HBVDNA dưới ngưỡng và mất HBsAg

+ Nếu không thể đo tải lượng HBV-DNA, có thể cân nhắc ngưng thuốckháng vi rút khi mất HBsAg kéo dài ít nhất 12 tháng trước khi ngưng điều trị(bất kể tình trạng HBeAg)

+ HBcrAg âm tính

+ Chú ý: chỉ ngưng điều trị khi BN có điều kiện theo dõi định kỳ để đánhgiá khả năng tái hoạt HBV sau khi ngừng thuốc Cần phải giải thích và tư vấncho BN về nguy cơ bùng phát VGBMT, bệnh gan mất bù và ung thư gan saukhi ngưng điều trị thuốc kháng virus

1.1.6 Thuốc điều trị viêm gan virus B mạn tính đường uống

Thuốc điều trị bệnh VGBMT hiện nay gồm có nhóm thuốc điều biếnmiễn dịch (IFN, Peg-IFN…) dùng đường tiêm và nhóm đồng đẳngnucleos(t)ide (NAs) dùng đương uống Các NAs dùng trong điều trị bệnhVGBMT gồm các nucleoside (lamivudine, telbivudine, emtricitabine,entecavir) và nucleotide (adefovir và tenofovir) Hiện nay, các NAs được sửdụng phổ biến do hiệu lực ức chế virus tốt, ít tác dụng phụ, cách dùng đơngiản và chi phí tiết kiệm

1.1.6.1 Cơ chế tác dụng của các thuốc NAs

Khác biệt với hiệu quả điều biến miễn dịch của interferon, các NAs có tácdụng đối với enzyme polymerase của HBV HBV polymerase là một protein đachức năng trong đó có chức năng của enzyme DNA polymerase phụ thuộc DNA

và RNA, cần thiết cho sự sao chép của virus Các thuốc NAs hoạt động bằngcách ức chế trực tiếp, thông qua sự liên kết cạnh tranh với các chất nền nội sinhhoặc thông qua việc kết hợp vào DNA của virus và hoạt động như một chất kếtthúc chuỗi nhờ cấu trúc hóa học tương tự các nucleoside hoặc nucleotide cầnthiết trong quá trình nhân lên của HBV, nhưng bị khóa khả năng kéo dài chuỗi[40] Cả 3 dòng thuốc trên đều có tác dụng trên cùng một đích là enzympolymerase nhằm ức chế sao chép của HBV với mức đặc hiệu khác nhau Dovậy khi phối hợp các thuốc này không làm tăng khả năng ức chế HBV, song cóthể phối hợp để đề phòng kháng thuốc hoặc thay thế khi đã có đề kháng vớithuốc khác

1.1.6.2 Cơ chế đề kháng các thuốc NAs

Hiệu quả của các thuốc NAs bị giới hạn bởi sự chọn lọc của chủngkháng thuốc HBV trong suốt quá trình điều trị [41] Nguyên nhân có thể doenzyme reverse transcriptase thiếu hụt cơ chế sửa lỗi một cách tự nhiên, dẫnđến tỉ lệ đột biến cao, tạo ra một lượng lớn các trình tự HBV khác nhau [42].Những chủng HBV đột biến thường được chọn lọc qua điều trị, gây ra sự tănglên một lượng ưu thế các virus kháng thuốc Các thuốc kháng virus trực tiếpkhác nhau có khuynh hướng chọn lọc kháng thuốc khác nhau, với việclamivudine được

dùng rộng rãi nhất gây ra sự chọn lọc của HBV kháng thuốc lên đến 70% sau

5 năm điều trị [43] Trái lại, đến nay không có dữ liệu nào về sự chọn lọc cácchủng HBV mã hóa đề kháng với tenofovir được công nhận, thậm chí saunhiều năm điều trị [44], [45]

1.1.6.3 Thuốc kháng virus Tenofovir disoproxil fumarate

Tenofovir disoproxil fumurat - TDF là một chất đồng đẳng vớiadenosine 5´-monophosphate, có hiệu lực ức chế HBV cao và cho đến naychưa có dữ liệu kháng thuốc đặc hiệu kiểu gen được công bố [36], [46] TDF

ức chế hoạt động của HBV DNA polymerase bằng cách cạnh tranh vớinucleotide deoxyadenosine 5´triphosphate để kết hợp vào DNA của virus,chấm dứt sự kéo dài chuỗi DNA, do đó ức chế sự sao chép DNA Tại nồng độlên đến 300

µmol/ngày, TDF cũng cho thấy không ảnh hưởng đến việc tổng hợp DNA tithể hoặc sản xuất axit lactic trong thử nghiệm trong ống nghiệm [47]

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của Tenofovir Disoproxil Fumarate

*Nguồn: theo Chihava R và CS (2020) [48]

Sinh khả dụng đường uống của TDF dao động trong khoảng 25 - 40%,với thời gian bán hủy là 17h (huyết thanh) hoặc 10-50h (tế bào) TDF đượcthải trừ phần lớn qua thận, do đó, liều lượng TDF phải được điều chỉnh trongbệnh nhân suy thận từ trung bình đến nặng Ở những bệnh nhân bị suy chứcnăng gan, không cần điều chỉnh liều lượng vì TDF không trải qua quá trìnhchuyển hóa ở gan Nồng độ TDF huyết thanh có thể tăng nếu dùng chung vớicác loại thuốc

gây độc cho thận hoặc cạnh tranh để bài tiết tích cực ở ống thận (ví dụ: thuốcchống tăng tiết), vì vậy có thể gây tăng độc tính của TDF.

Về những tác dụng không mong muốn, TDF có sự dung nạp tốt cả trênnhững bệnh nhân mắc bệnh gan mất bù [49], khoảng 1% bệnh nhân phát triểnhội chứng giảm phosphat huyết hypophosphatemia (<2 mg/dl hoặc 0.65mmol/l) nhưng hầu hết đều không cần điều chỉnh liều, dừng trị liệu hoặc cầnphải bổ sung phosphate Một nghiên cứu đa trung tâm so sánh TDF (n = 141)đơn trị liệu và phối hợp với emtricitabine (n = 139) trên những bệnh nhânVGBMT kháng LAM, có một lượng nhỏ bệnh nhân có suy giảm mật độxương cột sống (khoảng 1,4%) và xương hông (khoảng 1,8%) tại tuần thứ 96[50]

Về tác dụng kháng virus của TDF, một nghiên cứu trên 348 bệnh nhânVGBMT điều trị bằng TDF, theo dõi sau 5 năm cho thấy, 87% bệnh nhân cócải thiện mô học và 74% những bệnh nhân xơ gan có phục hồi về mức xơ hóagan [51] Những bệnh nhân có tải lượng virus cao > 9,00 log10copies mấtnhiều thời gian hơn để đạt mức HBV DNA < 2,60 log10copies/ml so vớinhững bệnh nhân có mức HBV-DNA ban đầu thấp hơn, nhưng nói chung,96,9% các bệnh nhân hoàn thành 240 tuần điều trị có thể đạt mức HBV-DNA

< 2,23 log10copies/ml [52] Không có dữ liệu kháng TDF được báo cáo lên

đến 7 năm điều trị thuốc [53] Các nghiên cứu in-vitro cho thất một số đột biến đơn độc kháng adefovir đã biết như A181T/V hoặc N236T có ảnh hưởng

suy giảm hiệu lực đối với TDF [54] Một nghiên cứu khác cho thấy, đơn trịliệu TDF và phối hợp TDF với emtricitabine có hiệu quả tương đương trongviệc ức chế HBV DNA đến mức < 400 copies/ml (~ 2,60 log10copies/ml)trong 168 tuần điều trị (82 và 84% tương ứng) ở những bệnh nhân không đápứng với adefovir

Như vậy, TDF là một thuốc kháng virus có hiệu lực ức chế virus cao vàrào cản di truyền kháng thuốc tốt trong điều trị bệnh VGBMT TDF là mộttrong các thuốc kê đơn đầu tay, được dùng phổ biến điều trị bện nhânVGBMT mới và những bệnh nhân có tình trạng kháng các thuốc NAs kháctrên lâm sàng

1.2 Đặc điểm sinh học của HBV

1.2.1 Cấu trúc của hạt virus

Dưới kính hiển vi điện tử quan sát thấy HBV tồn tại dưới 3 loại tiểu thểkhác nhau (Hình 1): tiểu thể hình cầu nhỏ (small particle) có đường kính 22

nm, tiểu thể hình ống (tubular particle) đường kính 22nm và tiểu thể hình cầulớn (large particle) có kích thước 42 - 45 nm Tiểu thể hình cầu nhỏ và hìnhống là thành phần vỏ của HBV mà trong quá trình nhân lên tổng hợp dư thừa.Các tiểu thể này chính là kháng nguyên bề mặt (HBsAg) [55]

1.2.2 Cấu trúc bộ gen HBV

Hình 1.5 Sơ đồ cấu trúc bộ gen của HBV

* Nguồn: theo Al-Sadeq D.W (2019) [56]

Bộ gen của HBV có chiều dài khoảng 3.2 kilobase (kb), được chứa trongcấu trúc nucleocapsid, ở dạng sợi đôi dạng vòng một phần (relaxed circular DNA– rcDNA) Một trong những đặc điểm độc đáo của hệ gen HBV đó chính là cấutrúc

bất đối xứng giữa hai sợi Dù sợi âm có chiều dài đầy đủ của hệ gen thì sợidương bổ sung với sợi âm lại có sự khác biệt về chiều dài, thường dài khoảng từ50% so với sợi âm trở lên [55] Hệ gen của virus có chứa các khung đọc mở(open reading frame - ORF) xếp chồng lên nhau kí hiệu là S, C, P và X, mã hóacho bốn protein khác nhau Cấu trúc xếp chồng lên nhau của các vùng mã hóakhiến cho virus có thể sử dụng hệ gen với hiệu suất cao hơn [57].

Gen S (Surface): gồm 3 vùng S; PreS1 và PreS2, có chức năng mã hóa

tổng hợp protein bề mặt của HBV hay HBsAg (Hepatitis B surface antigen) baogồm HBsAg nhỏ (S-HbsAg) , HBsAg trung bình (M-HbsAG) và HBsAg lớn(L- HbsAg) Các protein vỏ L, M và S-HBsAg có liên quan đến tính sinh miễndịch và các cơ chế bám dính, xâm nhập vào tế bào gan [58]

Gen precore/core: mã hóa đồng thời cho protein nucleocapsid (HBcAg)

và các protein không cấu trúc (HBeAg) dựa trên 2 codon khởi đầu cho quátrình đọc mã Một số trường hợp xảy ra đột biến ở vùng preCore tại vị trí

1896, cho nên sự tổng hợp của HBeAg không được thực hiện dù quá trìnhnhân lên của HBV vẫn tiếp diễn [58]

Gen P: mã hóa cho enzyme vừa có hoạt tính DNA polymerase phụ thuộc

RNA lại vừa có hoạt tính DNA polymerase phụ thuộc DNA DNApolymerase gắn với đầu 5’ tận của HBV-pgRNA, hoạt động như mồi của quátrình phiên mã ngược sử dụng khuôn RNA tiền bộ gen được dùng để tổng hợpDNA sợi âm Hơn nữa, nó đóng vai trò quan trọng trong suốt quá trình nhiễmvirus cấp tính và mạn tính [58]

Gen X: mã hóa cho protein điều hòa X, có liên quan đến vai trò chuyển hoạt

hóa (transactivation) trong quá trình nhân lên của HBV, quá trình điều hòa sựtăng trưởng của tế bào và bệnh sinh HCC [58]

1.2.3 Các protein của HBV

HBsAg - Kháng nguyên bề mặt: là dấu ấn đầu tiên của sự nhiễm HBV,

HBsAg được phát hiện lần đầu bởi Blumberg B.S và CS năm 1968 Cho đến

nay, HBsAg không chỉ là xét nghiệm chẩn đoán nhiễm HBV, mà dấu hiệuthanh thải/chuyển đảo HBsAg còn là mục tiêu quan trọng của quá trình điềutrị bệnh VGBMT [11] HBsAg có ba dạng khác nhau của hạt virus được giảiphóng từ tế bào nhiễm HBV, là kết quả của quá trình biểu hiện không đồngđều của ba kháng nguyên bề mặt này S-HBsAg là protein có mức biểu hiệncao nhất trong các kháng nguyên bề mặt của virus HBV và protein này chính

là thành phần chính cấu thành nên vỏ virus HBsAg thường được tổng hợpmột cách dư thừa (100 -100,000 lần) so với lượng virion được tiết ra Nguồntổng hợp HBsAg chính là từ các trình tự của virus được tích hợp một cáchngẫu nhiên vào bộ gen của người, có thể giúp chúng ta biết được trạng tháinhiễm của bệnh nhân một cách toàn diện hơn [58]

HBeAg - Kháng nguyên E: là sản phẩm dịch mã từ vùng precore thuộc

gen C với các chức năng vẫn còn chưa được xác định đầy đủ Có một số giảthiết cho rằng HBeAg có khả năng tạo điều kiện cho virus HBV “trốn thoát”

khỏi các cơ chế miễn dịch của cơ thể, ức chế đáp ứng miễn dịch đối vớiprotein core của HBV [58] Ngoài ra, kết quả nghiên cứu gần đây cũngcho rằng, HBeAg có vai trò quan trọng trong sự hình thành tình trạng nhiễmHBV mạn tính ở trẻ bị lây nhiễm trong thời kỳ chu sinh và sự phát sinh ung

thư gan [58]

Chuyển đảo HBeAg huyết thanh: là tình trạng biến mất của HBeAg trong

máu ngoại vi những bệnh nhân mà trước đó có HBeAg dương tính, đồng thờivới sự xuất hiện của kháng thể anti-HBe Chuyển đảo HBeAg thường là tiềntriệu cho sự thanh thải HBsAg, và có liên quan đến sự thuyên giảm tình trạngnhân lên của HBV, tỉ lệ tiến triển xơ gan và HCC và tỉ lệ sống còn cao hơn của

BN [59]

HBcAg - Protein lõi (protein core): được phiên mã từ gen C và có vai

trò định hình cho virion Ngoài ra, HBcAg còn có khả năng liên kết vớicccDNA, điều chỉnh khoảng cách của nucleosome trên cccDNA Thêm vào

đó, protein core cần thiết cho quá trình đóng gói pgRNA và đóng vai trò là tácnhân khởi động cho quá trình phiên mã ngược và trong quá trình đóng góinucleocapsid trưởng thành Có rất nhiều vai trò tiềm tàng của HBcAg trongchu trình nhân

lên của HBV đã được đề cập trong một số nghiên cứu gần đây, cùng với mô tảchi tiết về cơ chế lắp ráp của capsid [58] [60].

Polymerase/Reverse transcriptase (RTase): là protein được tạo thành từ 3

vùng chức năng và một vùng đệm thay đổi Vùng TP (terminal protein) thuộcN- terminus, có vai trò quan trọng trong việc khởi động quá trình sao chép,giúp polymerase bám vào pgRNA, đóng gói RNA, mồi hóa protein RTdomain có vai trò trong quá trình nhân lên của bộ gen virus bằng cách phiên

mã ngược pgRNA để hình thành sợi âm trong DNA của bộ gen virus và sau

đó sợi âm này được sử dụng làm khuôn cho quá trình tổng hợp sợi dương củaDNA Khu vực cuối cùng của protein P là enzyme RNase H, chịu trách nhiệmcho việc cắt bỏ mạch khuôn pgRNA trong suốt quá trình tổng hợp sợi âm của

hệ gen DNA [61]

Protein X: có chức năng điều hòa duy nhất được mã hóa bởi ORF nhỏ

nhất của HBV Đã có rất nhiều nghiên cứu cho thấy những bằng chứng xácthực về vai trò cần thiết của HBx trong suốt quá trình nhân lên của HBV nhưkhả năng liên kết với cccDNA, và quá trình phiên mã từ cccDNA [61]

1.2.4 Chu trình nhân lên của virus

HBV được coi như một para-retrovirus nên có một số điểm chung với các retrovirus khác, rõ nhất là vai trò trung tâm của quá trình phiên mã ngược Tuy nhiên, HBV và các hepadnavirus so với retrovirus có sự khác biệt ở một

số khía cạnh quan trọng như sự khởi đầu quá trình phiên mã ngược và sự lắpráp nucleocapsid Vòng đời của HBV bắt đầu bằng sự gắn kết của các hạtvirion với thụ cảm thể tế bào gan, được biết đến với tên gọi sodiumtaurocholate cotransporting polypeptide (NTCP), và sau đó nucleocapsidechứa relaxed circular DNA (rcDNA) được giải phóng vào tế bào gan rcDNAsau đó được vận chuyển đến vùng nhân của tế bào, tại đây nó được chuyểnđổi thành cccDNA, một thể bổ sung tồn tại như một tiểu nhiễm sắc thể, thôngqua một chuỗi các cơ chế còn chưa được hiểu rõ đẩy đủ [58] cccDNA phục

vụ như một khuôn mẫu để sao chép toàn bộ các bản sao của virus, gồmprecore mRNA

(pcRNA-3.5kb), pregenomic RNA (pgRNA), các mRNA bề mặt (2.4kb và2.1kb) và X mRNA (0.7kb) pgRNA là khuôn để đồng thời phiên mã ngược

và dịch mã tổng hợp các protein lõi và polymerase (pol) của virus Sau đó,protein pol gắn lên khu vực 5’-epsilon của pgRNA, và cùng với nhau, chúngđược đóng gói vào capsid của virus Bên trong capsid, pol chuyển đổi pgRNAthành rcDNA thông qua quá trình phiên mã ngược, sau đó được bao bọc bởicác protein vỏ của HBV trên mạng lưới nội chất (endoplasmic reticulum –ER) để chế tiết virion qua các thể đa túi (multivesicular bodies – MVBs), hoặctái nhập vào nhân của tế bào để bổ sung nguồn cccDNA [55]

Hình 1.6 Chu trình nhân lên của HBV trong tế bào gan

* Nguồn: theo Tsukuda S (2020) [55]

1.2.5 Vai trò của HBV-RNA trong vòng đời HBV

Về mặt logic, HBV-RNA huyết tương chắc chắn có nguồn gốc từ các tếbào gan bị nhiễm bệnh Để kiểm chứng điều này, tác giả Wang J và CS(2018) đã tiến hành giải trình tự lặp lại nhiều lần HBV-RNA huyết tương vàcác vùng tương ứng của DNA virus được tích hợp trong DNA tế bào ganngười, và nhận thấy rằng độ phức tạp và khoảng cách di truyền trung bìnhgiữa các biến thể của cả hai là tương đương nhau [62] Tuy nhiên, cơ chế chitiết của việc giải phóng HBV-RNA vào tuần hoàn từ các tế bào gan bị nhiễmbệnh hiện vẫn chưa rõ ràng Các nghiên cứu đã chứng minh rằng nuôi cấy tếbào nhiễm HBV tự nhiên tiết ra một lượng lớn capsid “trần” (nonenvelopedcapsid, naked capsid) chứa tất cả các loại bản sao trung gian của HBV-DNA,bao gồm cả pgRNA [63]

Do đó, vẫn chưa rõ liệu HBV-RNA trong huyết tương có nguồn gốc từcác capsid chưa trưởng thành được giải phóng vào dòng máu hay từ những conđường khác chưa được biết đến Nếu các virion chứa pgRNA tồn tại, điều thú

vị là liệu chúng có lây nhiễm và có thể tạo ra một đợt lây nhiễm mới haykhông? [18]

Hình 1.7 Giải thuyết về HBV pgRNA trong vòng đời của HBV

* Nguồn: theo Wang J (2016) [18]

Năm 2016, Jie Wang và CS sau khi xác nhận bản chất của pgRNA huyết tương, đã đề nghị một mô hình tạo ra các nucleocapsid chứapgRNA và

HBV-sự tái nhiễm của chúng vào nhân các tế bào gan nhằm tạo cccDNA, giải thích

sự dai dẳng của nguồn cccDNA trong gan Dù vậy, tác giả chưa có những kếtquả chứng minh tương ứng, do khó khăn về mặt kỹ thuật để tinh sạch virionchứa pgRNA và phân biệt với virion chứa HBV-DNA, nhằm kiểm tra khảnăng lây nhiễm trong nuôi cấy tế bào [18]

Năm 2018, Wang J và CS đã báo cáo rằng các virion chứa HBV-RNAđược tạo ra bởi quá trình điều trị bằng các NAs thiếu hụt khả năng lây nhiễm.Tuy nhiên, kết luận trên cần được xem xét một cách thận trọng vì các virionchứa HBV-pgRNA được xử lý bằng NAs, là những thuốc có tác dụng kết thúcchuỗi không thể đảo ngược Do đó, không loại trừ khả năng lây nhiễm củapgRNA-virion cũng bị ảnh hưởng dưới tác dụng của các NAs [64]

Các kết quả nghiên cứu cho thấy, vẫn tồn tại nhiều khoảng trống kiếnthức trong vòng đời của HBV, đặc biệt là về HBV-pgRNA Việc bổ sung cácvirion chứa HBV-pgRNA vào mô hình về vòng đời của HBV có lẽ cần đượcxem xét thận trọng, dựa trên kết quả của các nghiên cứu tương lai

1.3 Các kỹ thuật định lượng nồng độ HBV-RNA trong máu ngoại vi bệnh nhân viêm gan virus B mạn tính

Các kỹ thuật định lượng HBV-RNA được sử dụng hiện nay cơ bản đềudựa trên nền tảng kỹ thuật Polymerase Chain reaction – PCR và các kỹ thuậtcải tiến dựa trên nguyên lý phản ứng PCR, kết hợp với phản ứng phiên mãngược (Reverse Trancriptiom – RT) để tổng hợp cDNA, như RT-PCR, RT-qPCR…

Một số kỹ thuật cụ thể đã và đang được ứng dụng trên thế giới trongcác công bố về HBV RNA, gồm có:

- Kỹ thuật PCR/Realtime PCR dựa trên nguyên lý 3’ RACE

- Kỹ thuật RT-qPCR

- Kỹ thuật Droplet digital PCR

- Một số kỹ thuật khác như QuantiGene, Kỹ thuật định lượng gián tiếp…

1.3.1 Kỹ thuật 3’ RACE-PCR/ Realtime PCR

Hình 1.8 Sơ đồ kỹ thuật realtime dựa trên nguyên lý 3’-RACE PCR

* Nguồn van Bommel F (2015) [9]

Năm 1996, Kock J và CS, lần đầu tiên phát hiện ra HBV-RNA tronghuyết tương của bệnh nhân VGBMT bằng cách sử dụng phương pháp 3’Rapid amplification of complementary DNA (cDNA)-ends (3’ RACE) [65].RACE PCR là kỹ thuật khuếch đại trình tự acid nucleic từ các mRNA giữamột vị trí xác định và đầu 3’ hoặc 5’ của RNA RACE PCR còn được gọ làPCR “một phía” hoặc PCR “neo” Tác giả Kock J sử dụng chiến lược thiết kếmồi nhằm lựa chọn phát hiện trình tự poly A tại đầu cuối 3’ của các HBV-RNA Để phiên mã ngược, một mồi đặc biệt chứa chuỗi oligo-dT và một đoạnoligo được thiết kế nhân tạo Chuỗi oligo-dT sẽ bắt cặp bổ sung vào đuôi poly

A của HBV-RNA trong phản ứng phiên mã ngược để tạo trình tự DNA bổsung (complement DNA

– cDNA) Sản phẩm cDNA sau đó được khuếch đại bằng các cặp mồi đặc hiệucủa phản ứng Nested PCR Toàn bộ các mẫu đều được kiểm tra với sự có mặt

và vắng mặt của quá trình phiên mã ngược Đến năm 2015, van Bommel F vàCS

đã sử dụng kỹ thuật Realtime PCR dựa trên nguyên lý 3’ RACE PCR để tiếnhành định lượng cả hai loại HBV flRNA và HBV trRNA, hai loại mRNA này

có sự khác biệt về kích thước do được hình thành từ hai khu vực tín hiệutrưởng thành mRNA khác nhau thuộc gen X của HBV [9]

Mặc dù các kỹ thuật khuếch đại gen dựa trên nguyên lý RACE với thiết

kế mồi oligo (dT) gắn trình tự “neo”, có ưu điểm tạo được cDNA có chiều dàiđầy đủ từ mRNA, tuy nhiên kỹ thuật này vẫn có những điểm hạn chế nhấtđịnh Công bố của tác giả Shen S năm 2020 về bản chất và đặc điểm phân tửcủa HBV-RNA trong huyết tương bệnh nhân VGBMT đã chứng minh HBVpgRNA tồn tại trong huyết tương dưới dạng hỗn hợp các loại RNA ngắn hơnnhiều so với kích thước của HBV pgRNA trong nhân tế bào gan và có thểkhông có đuôi poly(A) [66] Điều này có thể gây ra kết quả âm tính giả khiđịnh lượng HBV-RNA huyết tương dựa trên kỹ thuật 3’-RACE PCR, sử dụngmồi oligo (dT) bắt cặp với trình tự gen X Bên cạnh đó, khi sử dụng các mồioligo(dT) để phiên mã ngược, việc phát hiện hay định lượng sản phẩm cDNAtạo ra sau đó hầu như không thể cải tiến để thực hiện quy trình One-step RT-PCR Ngoài ra, khi sử dụng kỹ thuật 3’ RACE, việc thiết kế gen đích thường

có vị trí gần khu vực đầu 3’ trong trình tự HBV RNA, có thể là một điểm khókhăn nếu không lựa chọn được trình tự thích hợp, đảm bảo tính đặc hiệu vớicác chủng HBV lưu hành tại Việt Nam

1.3.2 Kỹ thuật RT-qPCR

Ngoài RACE-qPCR, các phương pháp RT-qPCR thông thường với mồiđặc hiệu cho HBV nhắm mục tiêu vào vùng X, C hoặc S của bộ gen HBVcũng được phát triển để định lượng HBV-RNA trong huyết tương [18], [67].RT- qPCR là kỹ thuật PCR định lượng với khuôn ban đầu là RNA, đượcphiên mã ngược trở thành cDNA và sử dụng làm khuôn cho phản ứng qPCR.Nghiên cứu tiêu biểu sử dụng kỹ thuật RT-qPCR định lượng HBV-RNAhuyết tương là công bố của Wang J và CS năm 2016 Tác giả sử dụng cácmồi cho phản ứng

phiên mã ngược bắt cặp đặc hiệu tại vị trí nucleotide 2436-2415, kèm theomột trình tự “neo” tại đầu 5’ dùng để phát hiện loại HBV-RNA có kích thước3.5 kb Một mồi khác bắt cặp đặc hiệu tại vị trí nt 1702-1682, cũng có gắntrình tự “neo” trên, để phát hiện HBV-RNA tổng số trong dịch tách chiết Tácgiả so sánh kết quả định lương nồng độ HBV-RNA tổng số và HBV-RNAkích thước 3,5 kb để xác định loại HBV-RNA trong huyết tương Tương tựnhư vậy, các cặp mồi dùng để phân biệt HBV-pgRNA và HBV-pcRNA cũngđược sử dụng để xác định nguồn gốc chính xác của HBV-RNA huyết tương là

từ HBV- pgRNA

Hình 1.9 Vị trí thiết kế các mồi cho phản ứng RT-qPCR

* Nguồn: theo Wang J (2016) [18]

Phản ứng RT-qPCR có thể được tiến hành theo phương thức one-step

và two-step Với kỹ thuật one-step RT-qPCR, giai đoạn tổng hợp cDNA vàqPCR được tiến hành trong cùng một ống phản ứng bằng cùng một enzym.Phương thức này chỉ có thể sử dụng mồi đặc hiệu, nhưng vì vậy có thể giảmthiểu các sai số do kỹ thuật và thao tác, đồng thời giảm nguy cơ ngoại nhiễm.Tuy nhiên one-step RTqPCR không thể tối ưu riêng biệt cho hai giai đoạnphản ứng, do đó có thể kém nhạy cảm hơn two-step RT-qPCR, đồng thời pháthiện được ít gen đích hơn trong mỗi lần chạy Ngược lại, với phương thứctwo-step RT- qPCR, giai đoạn tổng hợp cDNA và qPCR được tiến hành tronghai ống phản ứng riêng biệt với enzym, đệm, thành phần và điều kiện phảnứng được tối ưu cho mỗi giai đoạn Chính vì vậy, two-step RT-qPCR chophép tối ưu riêng từng giai đoạn, có nhiều lựa chọn mồi phiên mã ngược hơn

và có độ nhạy cảm cao hơn Tuy nhiên, loại kỹ thuật này có nhiều thao tác dễgây ngoại nhiễm, tốn kém chi phí và thời gian thực hiện hơn so với one-stepRT-qPCR

Kỹ thuật RT-qPCR hiện được sử dụng phổ biến trong các công bố trênthế giới với mục đích định lượng nồng độ HBV-RNA trong máu ngoại vibệnh nhân VGBMT do hiệu quả tốt và tính linh hoạt trong thiết kế Tuynhiên, với sự phức tạp các chủng loại HBV-RNA kích thước khác nhau có thểtồn tại trong huyết thanh, việc lựa chọn vị trí thiết kế mồi đặc hiệu cho HBVpgRNA có thể là một khó khăn đáng kể Bên cạnh đó, vấn đề kỹ thuật cầnkhắc phục của kỹ thuật RT-qPCR chính là tín hiệu nhiễu từ HBV-DNA tồn

dư trong sản phẩm tách chiết RNA tổng số Hầu hết các nghiên cứu để tránhthu được tính hiệu nhiễu từ HBV-DNA trong quá trình RT-qPCR, đều phải xử

lý DNase I đối với nucleic acid chiết xuất từ huyết thanh Tuy nhiên, Dnase I

có ảnh hưởng nhất định đối với các RNA, từ đó có thể gây tác động tiêu cựcđối với kết quả định lượng HBV-RNA tiếp sau đó

1.3.3 Kỹ thuật Droplet digital PCR

Khác với kỹ thuật realtime PCR, thông tin về chu kỹ ngưỡng thu được

từ tín hiệu huỳnh quang dùng để định lượng nồng độ của gen đích trong mẫuban đầu, kỹ thuật PCR kỹ thuật số (digital PCR – dPCR) là một sự kết hợpdạng thức xét nghiệm PCR truyền thống (phân tích đầu cuối), kết hợp với phaloãng giới hạn và thống kê Poisson [68] Cách tiếp cận này tận dụng được ưuthế của công nghệ tin học trong xử lý thông tin, giúp định lượng nồng độtuyệt đối của acid nucleic, giảm thiểu được tác động của hiệu suất khuếch đạiphản ứng đối với độ chính xác của kỹ thuật như realtime PCR

Hình 1.10 Nguyên lý kỹ thuật ddPCR

* Nguồn: theo Nazir S (2023) [68]

Kỹ thuật Droplet digital PCR (ddPCR) là một phương pháp thực hiệnPCR kỹ thuật số dựa trên công nghệ giọt nhũ tương nước – dầu (Water-oilemulsion droplet technology) Nhũ tương là một hỗn hợp ổn định tạm thời củacác chất lỏng không thể trộn lẫn, như dầu và nước, đạt được bằng cách phânchia một pha thành các giọt rất nhỏ, thông thường có thể là dầu lơ lửng trongpha nước hoặc nước lơ lửng trong pha dầu Để thực hiện được việc phân chiamẫu phản ứng thành vô số hạt nhỏ trong ddPCR, cần các hóa chất chuyêndụng, các chất nhũ hóa, giúp làm ổn định sự huyền phù và ngăn các hạt dungdịch nhỏ kết hợp lại để tạo các hạt lớn hơn Mỗi giọt phản ứng đều trải quaquá trình khuếch đại PCR một cách riêng lẻ tương tự như quy trình được sửdụng công nghệ Taqman probe tiêu chuẩn [68]

Những năm sau đó, một số công bố đã báo cáo sử dụng ddPCR địnhlượng HBV-RNA trong dịch nổi tế bào nhiễm HBV hoặc huyết tương củabệnh nhân VGBMT, cho thấy độ nhạy rất tốt [69], [70], [71] Tuy ddPCR làmột ứng dụng đầy hứa hẹn không chỉ trong việc định lượng HBV RNA,nhưng vẫn phụ thuộc vào tính đặc hiệu đối với HBV pgRNA của các cặp mồi

và chất lượng mẫu RNA đầu vào Với nguồn gốc phức tạp của HBV-RNAtrong huyết thanh, chiến lược thiết kế mồi/mẫu dò nhằm khuếch đại đặc hiệupgRNA và giảm thiểu các tín hiệu nhiễu là vấn đề mấu chốt trong các nghiêncứu nhằm đánh giá, khảo sát vai trò của HBV pgRNA trong điều trị và tiênlượng biến chứng các bệnh nhiễm HBV mạn tính

1.3.4 Một số kỹ thuật khác

 Kỹ thuật định lượng nồng độ HBV RNA huyết tương gián tiếp

Một số tác giả như Hatakeyama T (2007), Tsuge M (2013) tiến hành đotổng lượng axit nucleic của HBV bằng một thử nghiệm one-step realtime RT-qPCR mà không loại bỏ HBV-DNA bằng cách phân hủy Dnase Sau đó, nồng

độ HBV-RNA huyết tương được tính toán bằng cách trừ đi số lượng bản saoHBV-DNA được xác định bởi qPCR [72], [73] Các tác giả thường sử dụng

02 mẫu tách chiết của cùng một bệnh nhân, trong đó một mẫu được thực hiệnphản ứng phiên mã ngược tạo cDNA, sau đó sử dụng sản phẩm này để chạyphản ứng realtime PCR với các cặp mồi đặc hiệu với trình tự HBV DNA Kếtquả định lượng được phiên giải là tải lượng HBV (DNA+RNA) hay tải lượngacid nucleic Mẫu tách chiết còn lại sẽ được đo tải lượng HBV-DNA theo cácquy trình thông thường [73]

Một số ưu điểm của cách tiếp cận này là (1) có thể giảm thiểu tác độngnhiễu từ tập hợp phức tạp của các loại HBV-RNA tồn tại trong máu ngoại và(2) tránh được tác động tiêu cực của Dnase I đối với sản phẩm tách chiếtRNA, khi được sử dụng để loại bỏ tín hiệu từ các HBV-DNA tồn dư Tuynhiên, việc tính toán nồng độ HBV-RNA huyết tương một cách gián tiếpthông qua hai