Các khảo sát nhằm xác định các điều kiện tối ưu ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly tinh dầu và khả năng kháng oxy hoá cũng như kháng khuẩn từ vỏ cam sành. Các yếu tố khảo sát là chọn loại dung môi (Methanol, Ethanol), tỉ lệ nguyên liệu dung môi (1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60), nồng độ dung môi (50, 60, 70, 80, 90%), thời gian trích ly (60, 90, 120, 150, 180 phút), công suất vi sóng (160, 320, 480, 640, 800W), thời gian vi sóng (30, 60, 90, 120, 150 giây). Kết quả thí nghiệm được đánh giá thông qua khả năng kháng oxy hoá và kháng khuẩn của tinh dầu trong dịch chiết thu được.
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ SÀI GÒN KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
GVHD: TS Nguyễn Minh Hải
Trang 2MỤC LỤC
1 Giới thiệu 1
2 Nguyên liệu và phương pháp 2
2.1 Nguyên liệu 2
2.2 Phương pháp 3
2.2.1 Phương pháp nghiên cứu 3
2.2.2 Phương pháp phân tích 6
2.2.3 Xử lý thống kê 8
3 Kết quả và biện luận 8
3.1 Phương trình đường chuẩn Vitamin C 8
3.2 Ảnh hưởng của loại dung môi đến khả năng trích ly và khả năng kháng oxy hoá từ dịch chiết vỏ cam 9
3.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đến khả năng trích ly và khả năng kháng oxy hoá từ dịch chiết vỏ cam 10
3.4 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến khả năng trích ly và khả năng kháng oxy hoá từ dịch chiết vỏ cam 11
3.5 Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến khả năng trích ly và khả năng kháng oxy hoá từ dịch chiết vỏ cam 13
3.6 Ảnh hưởng của công suất vi sóng đến khả năng trích ly và khả năng kháng oxy hoá từ dịch chiết vỏ cam 14
3.7 Ảnh hưởng của thời gian xử lý vi sóng đến khả năng trích ly và khả năng kháng oxy hoá từ dịch chiết vỏ cam 15
3.8 Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết vỏ cam trước và sau khi xử lý vi sóng 17
4 Kết luận 18
Tài liệu tham khảo 19
Trang 3KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TRÍCH LY TINH DẦU TỪ VỎ CAM SÀNH TRƯỚC VÀ SAU KHI XỬ LÝ VI SÓNG
Hồ Ngọc Minh Thơ, Phạm Thị Mỹ Trinh, Nguyễn Hải Đăng Đoàn Thị Cẩm Hương, Nguyễn Thanh Thảo, Nguyễn Tấn Khang
Phòng thí nghiệm vi sinh, khoa Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Công Nghệ Sài Gòn
Tóm tắt
Các khảo sát nhằm xác định các điều kiện tối ưu ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly tinh dầu
và khả năng kháng oxy hoá cũng như kháng khuẩn từ vỏ cam sành Các yếu tố khảo sát là chọn loại dung môi (Methanol, Ethanol), tỉ lệ nguyên liệu dung môi (1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60), nồng độ dung môi (50, 60, 70, 80, 90%), thời gian trích ly (60, 90, 120, 150, 180 phút), công suất vi sóng (160, 320, 480, 640, 800W), thời gian vi sóng (30, 60, 90, 120,
150 giây) Kết quả thí nghiệm được đánh giá thông qua khả năng kháng oxy hoá và kháng khuẩn của tinh dầu trong dịch chiết thu được Hoạt tính kháng oxy hoá của tinh dầu trong dịch chiết được xác định bằng phương pháp DPPH và khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch Kết quả khảo sát cho thấy điều kiện tối ưu để trích ly tinh dầu được thể hiện ở loại dung môi Methanol (70.10 ± 0.46b), tỉ lệ nguyên liệu và dung môi 1:30 (66.26 ± 2.64d), nồng độ dung môi 70% (72.10 ± 2.93c), thời gian trích ly 120 phút (72.06 ± 1.23b), công suất vi sóng 480W (74.54 ± 1.44c), thời gian vi sóng 90 giây (76.48
± 1.06c), và khả năng kháng khuẩn trước và sau vi sóng Các thông số đã chọn trên là dung môi Methanol 70%, tỷ lệ nguyên liệu dung môi 1:30, nồng độ dung môi 70%, thời gian trích ly 120 phút, công suất vi sóng 480W, thời gian vi sóng 90 giây Khả năng kháng oxy hoá của tinh dầu khi trích ly có sự hỗ trợ của vi sóng cho hiệu quả cao nhất Bên cạnh đó, tinh dầu từ vỏ cam cũng được ghi nhận là có hoạt tính kháng khuẩn
Từ khoá: Tinh dầu, khả năng kháng oxy hoá của tinh dầu, vỏ cam sành, dung môi, tỷ lệ,
nồng độ, thời gian, vi sóng, trích ly, kháng khuẩn
Trang 4để sản xuất nước ép trái cây và nước cam chiếm gần 85% tổng lượng tiêu thụ (USDA 2006).[3] Các phế phẩm từ quá trình chế biến nước ép trái cây như vỏ cam chiếm khoảng 45% tổng khối lượng (Yeoh, Shi, & Langrish, 2008) Trên thực tế, vỏ cam chưa được
xử lý đúng cách thường bị thải trực tiếp ra môi trường gây ra các vấn đề như ô nhiễm nguồn nước do tinh dầu trong vỏ cam tiết ra (Berna, Tàrrega, Blasco, & Subirats, 2000; Ferhat và cộng sự, 2006, 2007, 2008).[2] Tuy nhiên, các chế phẩm từ cam như là vỏ có thể mang lại giá trị cao nhờ việc chiết xuất tinh dầu
Tinh dầu (còn được gọi là dầu dễ bay hơi) là chất lỏng nhờn, có mùi thơm nồng đặc trưng và được sản xuất bởi các nguyên liệu thực vật khác nhau (hoa, chồi, lá, vỏ cây, quả,…) dưới dạng chất chuyển hoá thứ cấp Các thành phần phenolic chịu trách nhiệm chính về đặc tính kháng oxy hoá cũng như kháng khuẩn của tinh dầu Các chất chống oxy hoá trong tinh dầu có tác dụng bảo vệ tế bào khỏi tác hại của các gốc tự do.[4] Trong
tự nhiên, tinh dầu đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ thực vật nhờ đặc tính kháng khuẩn bởi các thành phần chính: geranyl acetate, eugenyl acetate, menthol, carvacrol, thymol, geraniol, eugenol, p-cymene, limonene, 𝛾-terpinene, carvone.[5] Đặc biệt limonene chiếm khoảng 92.3 – 95.5% của tổng số thành phần tinh dầu có trong cam
Do đó tinh dầu cam thường được sử dụng để thêm hương cam vào các sản phẩm đồ uống, bánh kẹo, mỹ phẩm, dược liệu (Braun & Cohen, 2007).[2]
Trích ly tinh dầu có những phương pháp thông thường như ép lạnh, dung môi, chưng cất hoặc trích ly bằng khí CO2 siêu tới hạn.[6] Bên cạnh đó, trích ly có sự hỗ trợ của vi sóng đã được công nhận là một kỹ thuật có nhiều ưu điểm so với các phương pháp trích
ly khác, chẳng hạn như giảm chi phí, thời gian, tiêu thụ năng lượng Nhiều nghiên cứu
đã cho thấy hiệu quả của sự hỗ trợ vi sóng trong việc trích ly các hợp chất như tinh dầu, chất màu, chất chống oxy hoá và các hợp chất hữu cơ khác Những nghiên cứu ban đầu
về ứng dụng vi sóng đã được thực hiện vào những năm 1980 (Letellier & Budzinski,
Trang 51999) Năm 1989, Craverio và cộng sự đã so sánh 2 quá trình sử dụng vi sóng và sử dụng hơi nước để trích ly dầu từ lá Lippia sidoides Kết quả cho thấy rằng chất lượng tinh dầu không đổi nhưng lại có sự khác biệt về số lượng.[7]
Mục đích nghiên cứu: Khảo sát ảnh hưởng của 4 yếu tố là loại dung môi trích ly, tỉ lệ
nguyên liệu/dung môi, nồng độ dung môi và thời gian trích ly đến hoạt tính kháng oxy hoá và kháng khuẩn của tinh dầu vỏ cam Từ đó tìm ra được dung môi, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi, nồng độ dung môi và thời gian tối ưu
Hàm mục tiêu: Khả năng kháng oxy hoá, khả năng kháng khuẩn
2 Nguyên liệu và phương pháp
2.1 Nguyên liệu
Cam sành được mua tại chợ Rạch Đỉa, huyện Nhà Bè Nguyên liệu được xử lý
để lấy phần vỏ và cắt nhỏ thành hạt có kích thước dưới 2mm.[8] Sau đó, được đem trữ đông để bảo quản và chuẩn bị cho kế hoạch thực nghiệm
Dung môi Methanol (Thương hiệu: Xilong, Trung Quốc)
Dung môi Ethanol, DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), Acid Ascorbic
(Vitamin C), chủng vi khuẩn E.coli, môi trường LB, môi trường NA và dụng cụ
được cung cấp bởi phòng vi sinh Trường đại học Công Nghệ Sài Gòn
Nhân giống vi khuẩn E.coli: Vi khuẩn lấy từ ống gốc được đem đi hoạt hoá lại
trên môi trường NA, nuôi cấy trong 24 giờ ở 37oC Sau đó, ta tiếp tục đem khuẩn lạc cấy vào môi trường LB lỏng và nuôi trên máy lắc trong 24 giờ ở nhiệt độ
Trang 6phòng Khi đó dịch vi khuẩn đã đạt độ đục chuẩn, ta tiến hành thử khả năng kháng khuẩn của dịch chiết
2.2 Phương pháp
2.2.1 Phương pháp nghiên cứu
a Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly bằng phương pháp thông thường
❖ Thí nghiệm 1: Lựa chọn loại dung môi (Ethanol, Methanol) [9]
Thông số khảo sát: Dung môi Ethanol 70%, Methanol 70%
Thông số cố định:
- Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/25 (w/v)
- Nhiệt độ trích ly: 50oC
- Thời gian trích ly: 60 phút
Cách thực hiện: Vỏ cam được cắt nhỏ vào bình tam giác và cân 1g, đem
đi hoà chung với dung môi thay đổi lần lượt là Ethanol 70% và Methanol 70% theo tỉ lệ 1/25 (w/v) Sau đó, đem đi cân khối lượng và cho vào bể
ổn nhiệt ủ trong 60 phút ở nhiệt độ 50oC Sau 60 phút, lấy hỗn hợp chiết
ra khỏi bể ổn nhiệt, để nguội ở nhiệt độ phòng và cân lại khối lượng, bổ sung thêm dung môi Hỗn hợp được lọc qua giấy lọc để thu được dịch chiết trong
❖ Thí nghiệm 2: Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/dung môi Thông số khảo sát: Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi thay đổi lần lượt là 1/20,
1/30, 1/40, 1/50, 1/60 (w/v).[9]
Thông số cố định:
- Loại dung môi: được chọn từ kết quả thí nghiệm 1
- Nhiệt độ trích ly: 50oC
- Thời gian trích ly: 60 phút
Cách thực hiện: Vỏ cam được cắt nhỏ vào bình tam giác và cân 1g, đem
đi hoà chung với dung môi đã chọn từ thí nghiệm 1 theo các tỉ lệ (1/20, 1/30, 1/40, 1/50, 1/60) Sau đó, đem đi cân khối lượng và cho vào bể ổn nhiệt ủ trong 60 phút ở nhiệt độ 50oC Sau 60 phút, lấy hỗn hợp chiết ra
Trang 7khỏi bể ổn nhiệt, để nguội ở nhiệt độ phòng và cân lại khối lượng, bổ sung thêm dung môi Hỗn hợp được lọc qua giấy lọc để thu được dịch chiết trong
❖ Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ dung môi Thông số khảo sát: Nồng độ dung môi thay đổi lần lượt là 50, 60, 70,
80, 90%.[10]
Thông số cố định:
- Loại dung môi: được chọn từ kết quả thí nghiệm 1
- Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi: được chọn từ kết quả thí nghiệm 2
- Nhiệt độ trích ly: 50oC
- Thời gian trích ly: 60 phút
Cách thực hiện: Vỏ cam được cắt nhỏ vào bình tam giác và cân 1g, đem
đi hoà chung với dung môi đã chọn với nồng độ dung môi thay đổi lần lượt (50, 60, 70, 80, 90%) theo tỉ lệ tối ưu được chọn từ thí nghiệm 2 Sau
đó, đem đi cân khối lượng và cho vào bể ổn nhiệt ủ trong 60 phút ở nhiệt
độ 50oC Sau 60 phút, lấy hỗn hợp chiết ra khỏi bể ổn nhiệt, để nguội ở nhiệt độ phòng và cân lại khối lượng, bổ sung thêm dung môi Hỗn hợp được lọc qua giấy lọc để thu được dịch chiết trong
❖ Thí nghiệm 4: Khảo sát thời gian trích ly Thông số khảo sát: Thời gian trích ly thay đổi lần lượt 60, 90, 120, 150,
Cách thực hiện: Vỏ cam được cắt nhỏ vào bình tam giác và cân 1g, đem
đi hoà chung với dung môi theo tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đã chọn Sau
đó, đem đi cân khối lượng và cho vào bể ổn nhiệt ủ ở nhiệt độ 50oC và thời gian trích ly thay đổi lần lượt (60, 90, 120, 150, 180 phút) Sau mỗi
Trang 8thời gian khảo sát, lấy hỗn hợp chiết ra khỏi bể ổn nhiệt, để nguội ở nhiệt
độ phòng và cân lại khối lượng, bổ sung thêm dung môi Hỗn hợp được lọc qua giấy lọc để thu được dịch chiết trong
b Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly với sự hỗ trợ của
vi sóng Cách thực hiện: Vỏ cam được cắt nhỏ vào bình tam giác và cân 1g Bình
chứa mẫu được hoà chung với dung môi, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi tối ưu được chọn từ thí nghiệm 1, 2 và 3; đem đi cân khối lượng bình chứa mẫu Sau đó, bình chứa mẫu được đem đi khảo sát xử lý vi sóng với công suất và thời gian thay đổi Sau khi xử lý vi sóng, bình chứa mẫu được để nguội ở nhiệt độ phòng và đem đi cân lại khối lượng, bổ sung thêm dung môi Sau
đó các mẫu được tiến hành khảo sát trích ly bằng những thông số được xác định ở thí nghiệm 4
❖ Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của công suất vi sóng Thông số khảo sát: Công suất vi sóng thay đổi lần lượt là 160, 320, 480,
640, 800W.[12]
Thông số cố định:
- Thời gian xử lý vi sóng: 60 giây[12]
- Loại dung môi và nồng độ dung môi: được chọn từ kết quả thí nghiệm 1 và 3
- Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi: được chọn từ kết quả thí nghiệm 2
- Thời gian trích ly: được chọn từ kết quả thí nghiệm 4
Trang 9- Loại dung môi và nồng độ dung môi: được chọn từ kết quả thí nghiệm 1 và 3
- Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi: được chọn từ kết quả thí nghiệm 2
- Thời gian trích ly: được chọn từ kết quả thí nghiệm 4
- Nhiệt độ trích ly: 50oC
2.2.2 Phương pháp phân tích
a Xác định hoạt tính chống oxy hoá bằng phương pháp DPPH
❖ Nguyên tắc:Phương pháp này xác định hoạt độ của các chất chống oxy hóa của các loại thực phẩm bằng phản ứng với DPPH gốc bền Các gốc DPPH tự do có độ hấp thụ cực đại mạnh tại bước sóng 517 nm và có màu
đỏ tía Quá trình chuyển màu đỏ tía sang vàng tương ứng với độ hấp thụ mol phân tử gốc DPPH tại bước sóng 517 nm giảm từ 9660 µM-1 cm-
1 xuống 1640 µM-1 cm-1 khi electron tự do của gốc DPPH bắt cặp với một electron từ chất chống oxy hóa và một nguyên tử hydro (tương đương hydrua) để tạo thành DPPH-H khử Kết quả sự khử màu tỷ lệ đối với
lượng hydrua tương đương được giữ lại (Theo TCVN 11939:2017)
❖ Dựng đường chuẩn [15]
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn acid Ascorbic 60ppm (100%): hòa tan 0.006g acid L-ascorbic trong nước cất và định mức tới 100ml Pha dung dịch acid Ascorbic với các nồng độ khác nhau: 20, 40, 60, 80, 100% từ dung dịch acid Ascorbic (Vitamin C) tiêu chuẩn (100%) Sau
đó thêm 1ml dung dịch vào 5 ống nghiệm khác nhau và thêm 4ml dung môi Ethanol và 2ml dung dịch DPPH Ủ trong bóng tối ở nhiệt
độ phòng trong khoảng 60 phút
- Mẫu control chứa 4ml dung môi Ethanol và 2ml dung dịch DPPH
- Mẫu blank là Vitamin C đối với mẫu dựng đường chuẩn hoặc Ethanol đối với mẫu dịch chiết
- Đo độ hấp thu ở bước sóng 517nm
- Dựng đường chuẩn của phần trăm bất hoạt (%I) theo nồng độ chuẩn
Trang 10❖ Tiến hành phân tích: Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm thay cho dung
dịch chuẩn Vitamin C, các bước tiếp theo thực hiện tương tự như trên Sau đó đo độ hấp thu ở bước sóng 517nm
❖ Công thức tính [16]
Phần trăm bất hoạt DPPH (%I)
%I = (Acontrol − Asample)
Trong đó: Acontrol là độ hấp thu của mẫu chuẩn
Từ đồ thị đường chuẩn, ta xác định được hoạt tính chống oxy hóa của mẫu Từ kết quả tính được, xây dựng phương trình đường thẳng tuyến tính giữa nồng độ mẫu và hoạt tính chống oxy hóa để tính IC50 Tính giá trị IC50(μg/ml) dựa vào phương trình đường chuẩn y= ax + b với y = 50%
để tìm x (x là IC50 cần tìm)
b Xác định khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch
❖ Tiến hành phân tích: [17]
Lắc đều ống nghiệm chứa chủng vi sinh E.coli, hút 100µL dịch vi khuẩn
vào giữa đĩa thạch chứa môi trường LB, dùng que cấy tam giác trải đều cho đến khi bề mặt thạch khô Sau đó tiến hành đục lỗ (giếng) trên môi trường thạch với đường kính 7mm, đục 4 giếng, mỗi giếng cách nhau 1 –
2 cm Ở mỗi giếng thạch nhỏ 20µL dịch chiết, sử dụng mẫu đối chứng là Methanol Tiếp tục nuôi cấy trong tủ ấm ở 37oC sau 24 - 48 giờ mang ra
đo kích thước vòng kháng khuẩn
❖ Công thức tính
Hoạt tính vòng kháng khuẩn được xác định bằng cách đo kích thước vùng kháng khuẩn (BK)
Trang 11Sử dụng phần mềm Excel và STATGRAPHIC Centurion XVI.I để tính toán, thống kê số liệu và vẽ biểu đồ
3 Kết quả và biện luận
3.1 Phương trình đường chuẩn Vitamin C
Khả năng kháng oxy hoá trong dịch chiết thu được sẽ được tính theo phương trình đường chuẩn Viatmin C minh hoạ trong hình 1
Phương trình đường chuẩn:
y = 0.9045x + 4.0343 (R2 = 0.9882)
Hình 1: Đồ thị đường chuẩn Vitamin C
y = 0.9045x + 4.0343 R² = 0.9882
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Trang 123.2 Ảnh hưởng của loại dung môi đến khả năng trích ly và khả năng kháng oxy
hoá từ dịch chiết vỏ cam
Dung môi Hàm lượng kháng oxy hoá
(μg/ml) Ethanol 70% 28.61 ± 1.98a
Methanol 70% 70.10 ± 0.46b
Bảng 1: Kết quả thí nghiệm khảo sát loại dung môi dùng để trích ly đến khả
năng kháng oxy hoá
* Chú thích: Trong cùng một cột, các số trung bình theo sau bởi một hoặc những chữ cái giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa P ≤ 0.05
Hình 2: Ảnh hưởng của loại dung môi đến khả năng kháng oxy hoá của dịch
chiết vỏ cam
Nhận xét: Dựa trên kết quả thu được ở (hình 2) hai dung môi Ethanol 70%
(28.61 ± 1.98a) và Methanol 70% (70.10±0.46b) Cho thấy Methanol thu được hàm lượng tinh dầu cao hơn Ethanol Kết quả xử lí cho thấy dung môi methanol
có khả năng thu nhận các hợp chất có tính oxy hóa
Giải thích: Methanol là một hợp chất có tính phân cực mạnh nên khi trích ly
tinh dầu thu được hàm lượng cao hơn Ethanol.[18] Dựa trên kết quả đó chọn dung môi Methanol để trích ly tinh dầu
28.61 ± 1.98a
70.10 ± 0.46b
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00
