Phân lập và đánh giá khả năng lên men của một số chủng nấm men có hoạt lực cao trong sản xuất cồn từ cây men lá tỉnh lào cai 1

Các tế bào trong cơ thể sống tham gia quá trìnhbiến đổi hóa học mà qua đó năng lượng trong thức ăn hoặc ánh sáng Mặttrời được chuyển hóa thành những dạng năng lượng có thể duy trì sự sốn

PHẦN I

MỞ ĐẦU

Nhiên liệu là vật chất được sử dụng để giải phóng năng lượng khi cấutrúc vật lý hoặc hóa học bị thay đổi Năng lượng có thể được giải phóng khicần thiết và sự giải phóng năng lượng được kiểm soát để phục vụ mục đíchcủa con người Mọi dạng sự sống trên Trái đất, từ những cấu trúc vi sinhvật cho đến động vật và con người, đều phụ thuộc và sử dụng nhiên liệu lànguồn cung cấp năng lượng Các tế bào trong cơ thể sống tham gia quá trìnhbiến đổi hóa học mà qua đó năng lượng trong thức ăn hoặc ánh sáng Mặttrời được chuyển hóa thành những dạng năng lượng có thể duy trì sự sống.Con người sử dụng nhiều cách thức nhằm biến đổi năng lượng ở nhiều hìnhthức thành những dạng phù hợp mới mục đích sử dụng phục vụ cuộc sống vàcác quá trình xã hội Ứng dụng giải phóng năng lượng từ nhiên liệu rất đadạng trong cuộc sống như đốt cháy khí tự nhiên để đun nấu, kích nổ xăngdầu để chạy động cơ, biến năng lượng hạt nhân thành điện năng,… Các dạngnhiên liệu phổ biến được dùng là dầu hỏa, xăng dầu, than đá, chất phóng xạ,

… Hiện tại, trên hầu hết các quốc gia trên thế giới, than đá vẫn là nguồnnguyên liệu chính cung cấp điện năng cho nhu cầu trong nước Một vấn đềđang được quan tâm là nguồn năng lượng hóa thạch này ngày nay đang dầnkhan hiếm và khó có thể tái tạo được

Những năm gần đây, dư luận nói đến nhiều về nguồn năng lượng mới,gọi là năng lượng lựa chọn, năng lượng thay thế hay năng lượng xanh Ưuđiểm của nguồn năng lượng này là sạch, có sẵn trong thiên nhiên, không gây

ô nhiễm, không bị cạn kiệt và là giải pháp tốt nhất nhằm tiết kiệm năng lượnghóa thạch cho tương lai Đẩy mạnh sử dụng cồn nhiên liệu là một trong nhữnglựa chọn chiến lược bảo vệ an toàn tài nguyên quốc gia và phát triển nguồnnăng lượng tái sinh sạch Việc này không chỉ có thể ứng phó với sự thiếu hụtnăng lượng dầu mỏ của thế giới trong tương lai, mà còn có thể bảo vệ, duy trìnguồn năng lượng quốc gia và bảo vệ môi trường Để đối phó với những cuộckhủng hoảng dầu mỏ của thế giới những năm 70 và giảm bớt sự phụ thuộcvào việc nhập khẩu xăng dầu, Braxin bắt đầu phát triển nhiên liệu cồn để tậndụng triệt để nguồn tài nguyên nông nghiệp quốc gia, đặc biệt là ưu thế của

chuyên đề thực tập tổng hợp

cây mía, họ đã coi cây mía là nguồn nguyên liệu chính của kế hoạch phát triểncồn nhiên liệu.

Việt Nam có nhiều tiềm năng về năng lượng sinh học có thể làm nhiênliệu thay thế cho xăng dầu có nguồn gốc dầu mỏ Nhiều loại cây như sắn, ngô,mía, có thể sản xuất cồn sinh học mà ở Việt Nam lại có nhiều vùng đất rấtthích hợp với các loại cây trồng này Sản lượng sắn cả nước năm 2007 là hơn

7 triệu tấn, mía đường hơn 14 triệu tấn và ngô gần 4 triệu tấn Với sản lượngnày có thể đáp ứng được cho nhu cầu sản xuất cồn sinh học ở quy mô vừa vànhỏ Ước tính Việt Nam có thể sản xuất 5 triệu lít cồn sinh học mỗi năm nếunhư có sự điều chỉnh về sản lượng và diện tích cây trồng Điều kiện đất đai vàkhí hậu Việt Nam cho phép hình thành những vùng nguyên liệu tập trung để

phát triển nguồn nhiên liệu sạch này Vì vậy, chúng tôi đã thực hiện nghiên

cứu đề tài “Phân lập và đánh giá khả năng lên men của một số chủng nấm

men có hoạt lực cao trong sản xuất cồn từ cây men lá tỉnh Lào Cai”.

1.2.Mục tiêu và yêu cầu nghiên cứu

1.2.1Mục tiêu nghiên cứu

Từ các mẫu thu thập được trên địa bàn tỉnh Cao Bằng Lào Cai , tiếnhành phân lập, tuyển chọn chủng nấm men có hoạt lực cao trong quá trìnhlên men rượu Khảo sát những điều kiện môi trường thích hợp nhất chochủng nấm men phát triển nhằm cung cấp giống cho quá trình sản xuấtrượu đặc sản trên quy mô lớn

1.2.2 Yêu cầu nghiên cứu

 Phân lập được các chủng nấm men trên các mẫu men lá đã được thu thập

 Tuyển chọn ra chủng có năng lực lên men cao nhất từ các chủng phânlập được

 Khảo sát môi trường thích hợp nhất cho chủng nấm men phân lập được

1.3 Ý nghĩa của đề tài

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

 Sơ bộ đánh giá được trong mẫu men lá có những loại vi sinh vật nào,

ý nghĩa của chúng trong bánh men truyền thống, làm cơ sở cho các nghiêncứu liên quan tiếp theo

chuyên đề thực tập tổng hợp

 Biết được trong mẫu men lá có những chủng nấm men nào và chủngnào có năng lực lên men tốt nhất.

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1 Nhiên liệu sinh học

2.1.1 Cồn sinh họcơ [17]

Cồn sinh học (Bioethanol) là một loại nhiên liệu lỏng, trong đó có sửdụng ethanol như là một loại phụ gia nhiên liệu pha trộn vào xăng thay phụgia chì Ethanol được chế biến thông qua quá trình lên men các sản phẩm hữu

cơ như tinh bột, cellulose, lignocellulose Ethanol được pha chế với tỷ lệ thíchhợp với xăng tạo thành Bioethanol có thể thay thế hoàn toàn cho loại xăng sửdụng phụ gia chì truyền thống.

2.1.1 Lịch sử hình thành cồn sinh học

2.1.1.1 Lịch sử

Ethanol đã được con người sử dụng từ thời tiền sử như là một thànhphần gây cảm giác say trong đồ uống chứa cồn Các cặn bã khô trong cácbình gốm 9000 năm tuổi tìm thấy ở miền bắc Trung Quốc đã gián tiếp chothấy việc sử dụng các đồ uống chứa cồn trong số những người sống ở thời

kỳ đồ đá mới Việc chiết nó ra dưới dạng tương đối nguyên chất đã được thựchiện lần đầu tiên bởi các nhà giả kim thuật Hồi giáo và họ là những người đãphát triển ra nghệ thuậtchưng cất rượu trong thời kỳ của chế độ khalip (vuachúa Hồi giáo) thời kỳ Abbasid Các ghi chép của Jabir Ibn Hayyan (Geber)(721-815) đã đề cập tới hơi dễ cháy của rượu được đun sôi Al-Kindī (801-873) cũng đã miêu tả rõ ràng quá trình chưng cất rượu Việc chưng cất êtanol

ra khỏi nước có thể tạo ra các sản phẩm chứa tới 96% êtanol Êtanol nguyênchất lần đầu tiên đã thu được vào năm 1796 bởi Johann Tobias Lowitz, bằngcách lọc êtanol chưng cất qua than củi

Antoine Lavoisier đã mô tả êthanol ethanol như là một hợp chất của

cacbLCon, hiđrô và ôxy, và năm 1808,Nicolas-Théodore de Saussure đã xácđịnh được công thức hóa học của nó Năm 1858,Archibald Scott Couper đãcông bố công thức cấu trúc của eêtanol: điều này làm cho êethanol trở thànhmột trong các hợp chất hóa học đầu tiên có sự xác định cấu trúc hóa học

chuyên đề thực tập tổng hợp

Etanol lần đầu tiên được tổng hợp nhân tạo vào năm 1826, thông quacác cố gắng độc lập của Henry Hennel ở Anh và S.G Sérullas ở Pháp Michael Faraday đã điều chế eêtanol bằng phản ứng hyđrat hóa êetylen vớixúc tác axít năm 1828, theo một công nghệ tương tự như công nghệ tổng hợp

êetanol công nghiệp ngày nay

2.1.1.2 Sản xuất công nghiệp

Ethanol được sử dụng như là nguyên liệu công nghiệp và thông thường

nó được sản xuất từ các nguyên liệu, chủ yếu là thông qua phương pháphyđrat hóa êetylen bằng xúc tác axít, được trình bày theo phản ứng hóa

học sau Cho etilen hợp nước ở 300 độ C, áp suất 70-80 atm với chất xúc tác

là acid wolframic hoặc acid phosphoric:

Chất xúc tác thông thường là axít phốtphoric, được hút bám trong các chất có độ xốp cao chẳng hạn như điatomit (đất chứa tảo cát) hay than

củi; chất xúc tác này đã lần đầu tiên được công ty dầu mỏ Shell sử dụng để

sản xuất Etanol ở mức độ công nghiệp năm 1947 Các chất xúc tác rắn, chủyếu là các loại ôxít kim loại khác nhau, cũng được đề cập tới trong các sách

vở hóa học

Trong công nghệ cũ, lần đầu tiên được tiến hành ở mức độ công nghiệpvào năm 1930 bởi Union Carbide, nhưng ngày nay gần như đã bị loại bỏ thì

Etylen đầu tiên được hyđrat hóa gián tiếp bằng phản ứng của nó với axít

sulfuric đậm đặc để tạo ra Ethyl sulfat, sau đó chất này đượcthủy phân để tạo

thành Etanol và tái tạo axít sulfuric:

Etanol để sử dụng công nghiệp thông thường là không phù hợp vớimục đích làm đồ uống cho con người ("biến tính") do nó có chứa một

lượng nhỏ các chất có thể là độc hại (chẳng hạnmêthanol) hay khó chịu (chẳng hạn denatonium- C21H29N2O•C7H5O2-là một chất rất đắng, gây tê)

Ethanol biến tính có số UN là UN 1987 và Ethanol biến tính độc hại có số

là UN 1986

2.1.1.3 Sản xuất trong sinh học

Ethanol để sử dụng trong đồ uống chứa cồn cũng như phần lớn êtanol

sử dụng làm nhiên liệu, được sản xuất bằng cách lên men: khi một số loài

chuyên đề thực tập tổng hợp

men rượu nhất định (quan trọng nhất là Saccharomyces cerevisiae) chuyểnhóa

đường trong điều kiện không có ôxy (gọi là yếm khí), chúng sản xuất raêtanol và cacbLCon điôxít CO2 Phản ứng hóa học tổng quát có thể viết nhưsau:

C 6 H 12 O 6 → 2 CH 3 CH 2 OH + 2 CO 2

Quá trình nuôi cấy men rượu theo các điều kiện để sản xuất rượu đượcgọi là ủ rượu Men rượu có thể phát triển trong sự hiện diện của khoảng 20%rượu, nhưng nồng độ của rượu trong các sản phẩm cuối cùng có thể tăng lênnhờ chưng cất

Để sản xuất Etanol từ các nguyên liệu chứa tinh bột như hạt ngũ cốc thìtinh bột đầu tiên phải được chuyển hóa thành đường Trong việc ủ men bia,theo truyền thống nó được tạo ra bằng cách cho hạt nảy mầm hay ủ mạch nha.Trong quá trình nảy mầm, hạt tạo ra các enzym có chức năng phá vỡ tinh bột

để tạo ra đường Để sản xuất êtanol làm nhiên liệu, quá trình thủy phân nàycủa tinh bột thành glucoza được thực hiện nhanh chóng hơn bằng cách xử lýhạt với axít sulfuric loãng, enzym nấm amylas, hay là tổ hợp của cả haiphương pháp

Về tiềm năng, glucoza để lên men thành êtanol có thể thu được

từ xenluloza Việc thực hiện công nghệ này có thể giúp chuyển hóa một loạicác phế thải và phụ phẩm nông nghiệp chứa nhiều xenluloza, chẳng hạn lõingô, rơm rạ hay mùn cưa thành các nguồn năng lượng tái sinh Cho đến gầnđây thì giá thành của các enzym cellulas có thể thủy phân xenluloza là rất cao.Hãng Iogen ở Canada đã đưa vào vận hành xí nghiệp sản xuất Etanol trên cơ

sở xenluloza đầu tiên vào năm 2004

Phản ứng thủy phân cellulose gồm các bước

Bước 1, thủy phân xenluloza thành mantoza dưới tác dụng củamen amylaza

Bước 2, thủy phân tiếp mantoza thành glucoza hoặc fructoza dưới tácdụng của men mantaza

Bước 3, phản ứng lên men rượu có xúc tác là men zima

chuyên đề thực tập tổng hợp

Với giá dầu mỏ tương tự như các mức giá của những năm thập niên

1990 thì công nghệ hyđrat hóa êtylen là kinh tế một cách đáng kể hơn so vớicông nghệ lên men để sản xuất êtanol tinh khiết Sự tăng cao của giá dầu mỏtrong thời gian gần đây, cùng với sự không ổn định trong giá cả nông phẩmtheo từng năm đã làm cho việc dự báo giá thành sản xuất tương đối của côngnghệ lên men và công nghệ hóa dầu là rất khó

2.2.1 Tình hình sử dụng nhiên liệu sinh học trên thế giới.[19]

Theo thông tin của EU tháng1/2007 tiêu thụ năng lượng toàn cầu đãtăng lên gấp đôi từ 10 tỷ tấn qui ra dầu/năm tăng lên 22 tỷ tấn qui dầu/nămvào năm 2050

Giáo sư Nghê Duy Đấu, Viện sĩ công trình Đại học Thanh Hoa (BắcKinh) cho biết theo Bộ Năng lượng Mỹ và Uỷ ban năng lượng thế giới dự báonguồn năng lượng hoá thạch không còn nhiều: dầu mỏ còn 39 năm, khí thiênnhiên 60 năm, than đá111 năm Theo Bộ Năng lượng Mỹ nhu cầu dầu mỏ thếgiới ngày càng tăng

Theo Trung tâm năng lượng ASEAN nhu cầu tiêu thụ năng lượng củakhu vực này năm 2002 là 280 triệu tấn và tăng lên 583 triệu tấn vào năm 2020 Indonesia là nước có nguồn năng lương hoá thạch lớn nhất trong các nướcASEAN, tuy nhiên hiện nay dầu mỏ dự trữ của họ chỉ còn trong 25 năm, khíđốt 60 năm và than đá 150 năm

Trong những tháng gần đây giá dầu thế giới đạt ngưỡng 70 USD/thùng

và với nhu cầu tiêu thụ khỏang 82,5triệu thùng/ngày trong lúc đó số lượngdầu thừa chỉ 1-2 triệu thùng/ngày, vì vậy theo Uỷ ban quốc gia các chính sáchnăng lượng của Mỹ nếu chỉ 4% năng lượng thế giới bị ngừng trệ bởi thiên taithì giá dầu thô có thể lên đến 160USD/thùng

Mặt khác, theo dự báo của các chuyên gia thì sắp tới ô tô sẽ là phươngtiện giao thông được ưa chuộng hơn cả mà nhiên liệu cho ô tô là xăng và dầudiesel Ở Mỹ đã quảng cáo bán trả góp ô tô không phải trả lãi năm đầu Hiệnnay tỷ lệ sử dụng ô tô trên thế giới là 8/1000 người và dự báo là sẽ tăng lênđáng kể trong 2 thập kỷ tới, điều đó đòi hỏi một khối lượng nhiên liệu xăngdầu lớn

chuyên đề thực tập tổng hợp

Ngày nay do thế giới phụ thuộc quá nhiều vào dầu mỏ và giá dầu biếnđộng liên tục theo chiều tăng và sự cạn kiệt dần nguồn năng lượng hoá thạch

và khí đốt nên việc tìm kiếm các nguồn năng lượng thay thế là việc làm cótính sống còn trong những thập kỷ tới, trong đó có năng lượng sinh học

Năng lượng sinh học bao gồm các nguồn năng lượng được sản xuất từnhiều loại sản phẩm nông nghiệp khác nhau như thân, cành, vỏ, quả cây, cácsản phẩm dư thừa khi chế biến nông, lâm sản, gỗ củi, phân gia súc, nước thải

và bã phế thải hửu cơ công nghiệp, rác thải….Vì vậy, năng lượng sinh học lànguồn năng lượng thay thế có thể tồn tại, tái sinh và điều chỉnh theo ý muốncủa con người

Hiện có 2 dạng năng lượng sinh học chủ yếu là ethanol sinh học vàdiesel sinh học Với nguyên liệu là tinh bột và đường, nhờ quá trình phân giảicủa vi sinh vật có thể sản xuất ra ethanol, sau đó tách nước bổ sung các chấtphụ gia thành ethanol biến tính, gọi là ethanol nhiên liệu biến tính hay cồnnhiên liệu Diesel sinh học nói riêng hay nhiên liệu sinh học nói chung là mộtloại năng lượng tái tạo

Mới đây tại Hội nghị năng lượng sinh học Trường đại học Georgia(Mỹ), giáo sư vật lý đã nghỉ hưu 70 tuổi - hiện là lão lão nông – Zimmy Grine

đã giới thiệu một loại ethanol nhiên liệu được chưng cất từ lúa mì và lạc.Theo tính toán về nhiệt lượng thì 1,5 lít ethanol có thể thay thế 1 lít xăng Nếupha ethanol với xăng thì tuỳ theo độ tinh khiết của chúng có thể giảm lượngxăng từ 10 đến 15% mà công suất và hiệu suất mài mòn động cơ không đổi

Ấn Độ dự kiến số ô tô của quốc gia này vào năm 2007 là 10 triệu chiếc vàhàng năm nhu cầu nhập dầu mỏ của họ tăng khoảng 10% Năm 2004 trong tổng

số 114 triệu tấn dầu của quốc gia này có đến 75 % là nhập từ nước ngoài với sốtiền là 26 tỷ USD Trong báo cáo năm 2003 của Uỷ ban phát triển nhiên liệu sinhhọc của Ấn Độ cho rằng khả năng sản xuất 29 triệu lít cồn ethanol của họ đủ tạo

ra hỗn hợp nhiên liệu 5% cồn cho đến kế hoạch lần thứ 12

Braxin sản xuất 14 tỷ lít cồn (tương đương 20 vạn thùng) từ cây mía.Luật pháp nước này qui định tất cả các loại xe phải sử dụng xăng pha với22% cồn ethanol và nước này đã có 20% số lượng xe chỉ dùmg cồn ethanol.Chương trình sản xuất cồn này của họ tạo việc làm cho 1 triệu người và tiết

chuyên đề thực tập tổng hợp

kiệm được 60 tỷ USD tiền nhập dầu trong 3 thập kỷ qua Số tiền này lớn gấp

10 lần chi cho chương trình trên và gấp 50 lần số tiền trợ cấp ban đầu.Từ sau

1985 sản lượng ethanol nhiên liệu đạt bình quân 10 triệu tấn/năm, thay thế luỹ

kế 200 tấn dầu mỏ Hiện nay toàn bộ xăng chạy ô tô của Braxin đều pha 25% ethanol sinh học và đã có loại ô tô chạy hoàn toàn bằng ethanol sinh học.Năm 2005 có 70% số ôtô đã sử dụng nhiên liệu sinh học Lượng tiêu thụethnol sinh học ở quốc gia này đạt 12 triệu tấn năm 2005, thay thế 45% lượngtiêu thụ xăng và chiểm 1/3 tổng lượng tiêu thụ nhiên liệu cho các loại xe, tạocông ăn việc làm cho 700.000 người Braxin có thể sản xuất được lượngethanol thay thế 10% nhu cầu xăng dầu của thế giới trong vòng 20 năm tớivới lượng xuất khẩu khoảng 200 tỷ lít, so với mức 3 tỷ lít hiện nay.

20-Ở Trung Quốc các tỉnh Hà Nam, An Huy, Cát Lâm, Hắc Long Giang…

đã sản xuất ethanol từ lương thực tồn kho với sản lượng hàng năm đạt 1,02triệu tấn Hắc Long Giang đã sản xuất thử ethanol đạt khối lượng 5000tấn/năm Nước này đang nghiên cứu công nghệ sản xuất ethanol từ xenlulose

và hiện đã có cơ sở đạt 600 tấn/năm Theo kế hoach đến 2010 sản lượng nhiênliệu sinh học của Trung Quốc khoảng 6 triệu tấn Đến năm 2020 là 19 triệutấn, trong đó ethanol 10 triệu tấn và diesel 9 triệu tấn

Malaysia hiện có 3 nhà máy sản xuất nhiên liệu sinh học với công suất276.000 tấn /năm Chính phủ nước này đặt chỉ tiêu sản xuất 1 triệu tấn dầudiesel sinh học xuất khẩu vào năm 2007-2008 Hiện nay Malaysia đã trồngđược 10 ngàn cây Jatropha

Thái Lan đã xây dựng chương trình phát triển năng lượng thay thế cácnguồn nhiên liệu hoá thạch

Năm 2001, Nhật đã dùng tế bào Rhizopus oryzae cố định để sản suất

diesel sinh học với tỷ lệ chuyển hoá đạt 80% Với công nghệ nêu trên tỷ lệchuyển hoá có thể đạt trên 95%, cao hơn phương pháp hoá học, giá thànhgiảm từ 15-20%

2.2.2 Sản xuất nhiên liệu sinh học ở Việt Nam

Gây trồng cây cung cấp nguyên liệu, sản xuất và sử dụng nhiên liệusinh học là một vấn đề mới đối với Việt Nam Vừa qua Bộ Công nghiệp đã

chuyên đề thực tập tổng hợp

xây dựng đề án Phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015, tầm nhìn 2020,với mục tiêu sản xuất xăng E10 và dầu sinh học nhằm thay thế một phầnnhiên liệu truyền thống hiện nay Theo đề án, trong giai đoạn 2006-2010, ViệtNam sẽ tiếp cận công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học, xây dựng mạnglưới thí điểm phân phối nhiên liệu sinh học tại một số tỉnh, thành, quy hoạchvùng trồng cây nguyên liệu cho năng suất cao, đào tạo cán bộ chuyên sâu vê

kỹ thuật

Giai đoạn 2011-2015, sẽ phát triển mạnh sản xuất và sử dụng nhiênliệu sinh học thay thế một phần nhiên liệu truyền thống, mở rộng quy môsản xuất và mạng lưới phân phối phục vụ cho giao thông và các ngành sảnxuất công nghiệp khác, đa dạng hóa nguồn nguyên liệu Đến năm 2020,công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học ở Việt Nam sẽ đạt trình độ tiên tiếntrên thế giới, với sản lượng đạt khoảng 5 tỷ lít xăng E10 và 500 triệu lít dầudiesel sinh học B10/năm.Theo các chuyên gia, xăng E10 là xăng pha cồnvới hàm lượng cồn tối đa là 10%, đáp ứng hoàn toàn mọi hoạt động binhthường của ô tô, xe máy

Bộ Công nghiệp đang triển khai công nghệ sản xuất các loại hoá chất,phụ gia cần thiết để pha chế nhiên liệu sinh học với xăng Các đơn vị thuộc

Bộ sẽ ứng dụng và làm chủ công nghệ sản xuất các chất phụ gia, chất xúc tác

để pha chế xăng với ethanol và diesel sinh học và diesel khoáng, triển khaisản xuất các hoá chất, phụ gia cung cấp cho các cơ sở pha chế Dự kiến năm

2007 làm chủ công nghệ này và sản xuất với qui mô nhỏ Năm 2011-2015 mởrộng cơ sở sản xuất phụ gia và bảo đảm cho nhu cầu trộn xăng E5/E10, dầuB5/B10

2.2.3 Các loài cây nông, lâm nghiệp cung cấp nguyên liệu sản xuất nhiên liệu sinh học

Các loài cây sau đây đang được sử dụng để cung cấp nguyên liệusản xuất nhiên liệu sinh học

Với ưu thế về diện tích canh tác, Mỹ sử dụng ngô để sảnxuất ethanol

chuyên đề thực tập tổng hợp

Từ năm 1975 Braxin đã có kế hoạch dùng mía làm nguyên liệu sảnxuất cồn thay thế xăng và khuyến khích sử dụng nhiên liệu sinh học bằngcác biện pháp như: sử dụng xăng để chạy xe phải pha một tỷ lệ ethanolnhiên liệu, đầu tư trồng và cải tạo giống mía để sản xuất nhiên liệu sinhhọc, cải tiến công nghệ sản xuất ethanol, nghiên cứu sản xuất ô tô chạybằng ethanol, miễn giảm thuế sản xuất và tiêu thụ ethanol.

Các nước EU sử dụng đậu tương, hạt cải dầu (Brassica napus) và dầu

mỡ phế thải từ động, thực vật để sản xuất nhiên liệu sinh học

Thụy Điển dự kiến sau 2020 ethanol sinh học từ xenlulose sẽ thaythế toàn bộ nhiên liệu hoá thạch nhằm chấm dứt phụ thuộc vào dầu mỏ

Tại Indonesia, người ta trồng cây Jatropha để làm nguyên liệu sản

xuất nhiên liệu sinh học Uỷ ban Quốc gia về nghiên cứu phát triển nhiênliệu sinh học của nước này đã trình Chính phủ dành 5 triệu ha đồi trọc đểtrồng Jatropha, mía và sắn để sản xuất nhiên liệu sinh học Hiện nay nướcnày đã trồng được 20 ngàn ha cây Jatropha

Trung Quốc đang triển khai sản xuất dầu ethanol sinh học từ câyJatropha, Hòang liên mộc (Pistaciachinensis Bunge), Văn quan

(Xanthoceras sorbifolia Bunge) Hiện nay quốc gia này đã có 9 tỉnh có trạm

xăng ethanol và đã trồng được 40 ngàn ha cây Jatropha

Bộ Nông nghiệp và hợp tác Thái đã có chính sách khuyến khích nôngdân trồng sắn để sản xuất năng lượng mới Dự án trồng sắn để sản xuấtethanol đã được ký giữa 3 tập đoàn kinh tế lớn với nông dân Dự kiến quý1/2008 có khoảng 2 triệu tấn sắn nguyên liệu phục vụ các nhà máy

Như vậy, hiện nay trên thế giới cũng như trong khu vực các loài câymía, sắn thường được dùng để sản xuất ethanol sinh học

nảy chồi, tế bào con không rời khỏi tế bào mẹ và lại tiếp tục mọc chồi Bởivậy nó có hình thái giống như cây xương rồng khi quan sát dưới kính hiển vi.

Hình 1 Nấm Saccharomyces Cerevisiea

2.3.1.1 Cấu tạo tế bào

Khác với vi khuẩn và xạ khuẩn, nấm men có cấu tạo tế bào khá phứctạp, gần giống như tế bào thực vật Có đầy đủ các cấu tạo thành tế bào, màng

tế bào chất, tế bào chất, ty thể, riboxom, nhân, không bào và các hạt dự trữ

- Thành tế bào

Thành tế bào nấm men được cấu tạo bởi hai lớp phân tử bao gồm 90%

là hợp chất glucan và mannan, phần còn lại là protein, lipit và glucozamin.Glucan là hợp chất cao phân tử của D - Glucoza, mannan là hợp chất caophân tử của D - Manoza

Trên thành tế bào có nhiều lỗ, qua đó các chất dinh dưỡng được hấp thu

và các sản phẩm của quá trình trao đổi chất được thải ra

- Màng nguyên sinh chất

Màng nguyên sinh chất của tế bào nấm men dày khoảng 8 nm cócấu tạo tương tự như màng nguyên sinh chất của vi khuẩn

chuyên đề thực tập tổng hợp

Tế bào chất của nấm men cũng tương tự như tế bào chất của vi khuẩn,

độ nhớt của tế bào chất cao hơn của nước 800 lần

Nhân tế bào nấm men là nhân điển hình, có màng nhân, bên trong làchất dịch nhân có chứa hạch nhân Cũng như nhân tế bào của vi sinh vật bậccao, nhân tế bào nấm men ngoài AND còn có protein và nhiều loại men Hạchnhân của tế bào nấm men không phải chỉ gồm một phân tử AND như ở vikhuẩn mà đã có cấu tạo nhiễm sắc thể điển hình và có quá trình phânbào nguyên nhiễm còn gọi là gián phân Quá trình gián phân gồm 4 giaiđoạn như ở vi sinh vật bậc cao Số lượng nhiễm sắc thể trong tế bào nấmmen khác nhau tuỳ loại nấm men ỞSaccharomyces serevisiae là nhóm nấmmen phân bố rộng rãi nhất, thể đơn bội của nó có n = 17 nhiễm sắc thể, thểlưỡng bội có 2n = 34 Ngoài nhiễm sắc thể ra, trong nhân tế bào S.serevisiae còn có từ 50 đến 100 plasmic có cấu tạo là 1 phân tử AND hìnhvòng kín có kích thước 2 mm, có khả năng sao chép độc lập, mang thông tin

di truyền

- Ty thể:

Khác với vi khuẩn, nấm men đã có ty thể giống như ở tế bào bậc cao,

đó là cơ quan sinh năng lượng của tế bào Ty thể nấm men có hình bầu dục,được bao bọc bởi hai lớp màng, màng trong gấp khúc thành nhiều tấm rănglược hợc nhiều ống nhỏ làm cho diện tích bề mặt của màng trong tăng lên.Cấu trúc của hai lớp màng ty thể giống cấu trúc của màng nguyên sinh chất.Trên bề mặt của màng trong có dính vô số các hạt nhỏ hình cầu Các hạt này

có chức năng sinh năng lượng và giải phóng năng lượng của ty thể Trong tythể còn có một phân tử AND có cấu trúc hình vòng, có khả năng tự sao chép.Những đột biến tạo ra tế bào nấm men không có AND ty thể làm cho tế bàonấm men phát triển rất yếu, khuẩn lạc nhỏ bé Trong ty thể còn có cả cácthành phần cần cho quá trình tổng hợp protein như riboxom, các loại ARN vàcác loại enzym cần thiết cho sự tổng hợp protein Các thành phẩn nàykhông giống với các thành phần tương tự của tế bào nấm men nhưng lại rấtgiống của vi khuẩn AND của ty thể rất nhỏ nên chỉ có thể mang mật mã tổnghợp cho một số protein của ty thể, số còn lại do tế bào tổng hợp rồi đưa vào ty

chuyên đề thực tập tổng hợp

thể Người ta đã chứng minh được quá trình tự tổng hợp protein của ty thể.Quá trình này bị kìm hãm bởi cloramfenicol giống như ở vi khuẩn, trong khi

đó chất kháng sinh này không kìm hãm được quá trình tổng hợp protein ở tếbào nấm men

- Riboxom của tế bào nấm men có hai loại : loại 80S gồm 2 tiểu thể60S và 40S nằm trong tế bào chất, một số khác gắn với màng tế bào chất Một

số nghiên cứu đã chứng minh rằng: các riboxom gắn với màng tế bào chất cóhoạt tính tổng hợp protein cao hơn loại 70S là loại riboxom có trong ti thể

Ngoài các cơ quan trên, nấm men còn có không bào và các hạt dự trữnhư hạt Volutin, hạt này không những mang vai trò chất dự trữ mà còn dùnglàm nguồn năng lượng cho nhiều quá trình sinh hoá học của tế bào Ngoài hạtVolutin trong tế bào còn có các hạt dự trữ khác như glycogen và lipit Một sốnấm men có khả năng hình thành một lượng lớn lipit

- Bào tử: Nhiều nấm men có khả năng hình thành bào tử, đó là mộthình thức sinh sản của nấm men Có 2 loại bào tử: bào tử bắn và bào

tử túi Bào tử túi là những bào tử được hình thành trong một túi nhỏcòn gọi là nang Trong nang thường chứa từ 1-8 bào tử, đôi khi đến 12 bào

tử Phương thức hình thành túi phụ thuộc vào hình thức sinh sản của nấmmen Bào tử bắn là những bào tử úau khi hình thành nhờ năng lượng của tếbào bắn mạnh về phía đối diện Đó là một hình thức phát tán bào tử Có thểquan sát bào tử bắn bằng cách nuôi cấy nấm men trên đĩa petri, vài ngày sauthấy xuất hiện trên nắp hộp phía đối diện thành một lớp mờ mờ Đem nắp hộpsoi dưới kính hiển vi sẽ thấy rõ các bào tử

2.3.1.2 Sinh sản

Ở 3 nấm men có 3 hình thức sinh sản

- Sinh sản sinh dưỡng : là hình thức sinh sản đơn giản nhất của nấmmen Có 2 hình thức sinh sản sinh dưỡng: nảy chồi và hình thức ngangphân đôi tế bào như vi khuẩn Ở hình thức nảy chồi, từ một cực của tế bào

mẹ nảy chồi thành một tế bào con, sau đó hình thành vách ngăn ngang giữahai tế bào Tế bào còn có thể tách khỏi tế bào mẹ hoặc có thể dính với tế

chuyên đề thực tập tổng hợp

bào mẹ và lại tiếp tục nảy chồi làm cho nấm men giống như hình dạng câyxương rồng tai nhỏ.

- Sinh sản đơn tính: bằng hai hình thức bào tử túi và bào tử bắn như đãnói ở phần bào tử

- Sinh sản hữu tính: do hai tế bào nấm men kết hợp với nhau hình thànhhợp tử Hợp tử phân chia thành các bào tử nằm trong nang, nang chín bào tửđược phát tán ra ngoài Nếu 2 tế bào nấm men có hình thái kích thước giốngnhau tiếp hợp với nhau thì được gọi là tiếp hợp đẳng giao Nếu 2 tế bào nấmmen khác nhau thì gọi là tiếp hợp dị giao

Trong chu trình sống của nhiều loài nấm men, có sự kết hợp các hìnhthức sinh sản khác nhau Sau đây là quá trình sinh sản của S serevisiae - mộtloài nấm men phân bố rộng rãi trong thiên nhiên Chu trình sống của nấmmen này có 2 giai đoạn đơn bội và lưỡng bội Đầu tiên tế bào sinh dưỡng đonbội (n) sinh sôi nảy nở theo lối nảy chồi Sau đó 2 tế bào đơn bội kết hợp vớinhau, có sự trao đổi của tế bào chất và nhân hình thành tế bào lưỡng bội (2n)

Tế bào lưỡng bội lại nảy chồi (sinh sản sinh dưỡng) thành nhiều tế bào lưỡngbội khác, cuối cùng hình thành hợp tử Nhân của hợp tử phân chia giảmnhiễm thành 4 nhân đơn bội Mỗi nhân đơn bội được bao bọc nguyên sinhchất, hình thành màng, tạo thành 4 bào tử nằm trong một túi gọi là bào tử túi.Khi túi vỡ, bào tử ra ngoài phát triển thành tế bào dinh dưỡng và lại phân chiatheo lối này rồi tiếp tục chu trình sống

Ngoài hình thức sinh sản như ở S serevisiae, một số loài nấm menkhác có những hình thức sinh sản về cơ bản cũng giống như trên nhưng cómột số sai khác

Ví dụ như là Schizosaccharomyces octosporus hợp tử lưỡng bội phânchia 3 lần, lầnđầu giảm nhiễm sinh ra 8 bào tử nằm trong nang

Yêu cầu đối với nấm men dùng trong sản xuất rượu là phải có khả nănglên men đường nhanh và càng triệt để càng tốt Các chủng nấm men đượcphát triển trong men rượu có ảnh hưởng quyết định đến hiệu suất lên men,thường gặp là các nấm men Saccharomyces Với môi trường và điều kiện làmmen thì đây là loài nấm men phổ biến và phát triển khá mạnh do có điều kiện

chuyên đề thực tập tổng hợp

thuận lợi Trong sản xuất bánh men theo phương pháp truyền thống thì hệnấm men và nấm mốc là không ổn định, phụ thuộc khá nhiều vào môi trườnglàm men nên ngoài chủng nêu trên còn nhiều chủng khác có năng lực lên menkhác nhau, tạo ra những sản phẩm phụ với lượng khác nhau nên có nhiều loạimen khác nhau.

Sử dụng loài nấm men Saccharomyces cerevisiae Đây là loài nấm menlên men nổi, kỵ khí không bắt buộc, sinh sản theo kiểu nảy chồi, phân đôi bào

tử, có khả năng lên men nhiều loại đường khác nhau như glucoza, saccaroza,fructoza, galactoza,… Nhiệt độ phát triển tối ưu của loài nấm men này là 25 –

300C, nhiệt độ tối thiểu là 2 – 30C, ở 400C thì ngừng phát triển và men bị chết.

Sử dụng nấm mốc Aspergillus niger Đây là một trong những loài nấmmốc phổ biến nhất của Aspergillus Khi mới phát triển sợi nấm màu trắng, sau

đó sẫm lại nhưng không hoàn toàn đen Bào tử của chúng có màu đen tuyền

chuyên đề thực tập tổng hợp

Từ một sợi đầu tiên, chúng phân nhánh tạo ra 2-4 nhánh sợi nhỏ Từ cácnhánh này sẽ phát triển thành những đỉnh bào tử và từ đó sẽ phát triển thànhnhững bào tử màu đen Aspergillus niger là chủng nấm mốc có khả năng pháttriển ở nhiệt độ tối ưu là 28 – 320C, có khả năng đường hóa tốt Loại nấm này

có khả năng sinh enzyme rất mạnh, trong đó chủ yếu là các loại enzymeamylase, protease, maltase,…

Các loại lá cây này được người dân bản địa lấy về và ủ trực tiếp hoặcsản xuất thành bánh men để ủ với gạo, ngô, khoai hoặc sắn để trưng cất rượu.

2.3.2.1.1.1 Một số mẫu lá

 Cây kinh giới núi

Cây men, Lá men, Kinh giới núi - Mosla dianthera (Buch: - Ham.)Maxim, thuộc họ Hoa môi - Lamiaceae

Mô tả: Cây thảo cao 25-50cm, mọc đứng, mảnh, phân nhánh, có lông

mịn hay dạng bột Lá mọc đối, hình trứng nhọn hay xoan, dài 1,5-3cm, rộng1-1,5cm, có răng cưa nhỏ, có điểm tuyến ở mặt dưới; cuống lá ngắn Hoa nhỏ,trắng hay hồng, họp thành bông ở ngọn hay ở nách lá, dài 5-10cm, mangnhững vòng 2 hoa, cách quãng nhau, mỗi hoa có 2 nhị sinh sản Quả bế màunâu đen, có mạng, dài 1,7mm

Mùa hoa quả tháng 5-11

Hình 4 Cây kinh giới núi

Bộ phận dùng: Toàn cây - Herba Moslae Diantherae

chuyên đề thực tập tổng hợp

Nơi sống và thu hái: Cây mọc hoang ở nhiều nơi từ Cao BằngLào Cai ,Lạng Sơn, Lào Cai, Ninh Bình tới Thừa Thiên-Huế và được trồng làm cây gia

vị và làm thuốc Trồng bằng hạt vào mùa xuân Thu hái toàn cây vào lúc đang

có hoa, rửa sạch phơi khô trong râm

 Cây cam thảo:

Mô tả

Cam thảo lâu năm cao từ 0,5-1m, nhẵn, mọc đứng khỏe, có gốc hóa mộc, cóthân bò kéo dài, lá kép lông chim gồm 4-8 đôi lá chét hình bầu dục hoặcthuôn, nguyên hơi dính ở mặt dưới, lá kèm rất nhỏ Hoa màu xanh lơ hoặctím, hơi nhỏ, nhiều, thành chùm dạng bông hình trụ, trên những cuống ở náchchỉ bằng nửa của lá Đài có lông tuyến, hình ống, gù lên ở gốc, có hai môichia 5 răng hơi không đều, hình mũi mác dài hơn ống, cánh cờ dựng lên,thuôn, dài hơn các cánh bên Nhị hai bó (9+1) Bầu không cuống, 2 đến nhiềunoãn, đầu nhụy nghiêng Quả cong rất dẹt, mặt quả có nhiều lông Hạt 2-4,hình lăng kính

Hình 5 Cây cam thảo đất

một loại cây xanh quanh năm có nguồn gốc ở Trung Quốc và đông bắc ViệtNam Các quả hình sao được thu hoạch ngay trước khi chín Nó được sử dụngrộng rãi trong ẩm thực Trung Hoa và ở mức độ ít hơn ở vùng Đông Nam

Á và Indonesia Đại hồi là một thành phần của ngũ vị hương truyền thốngtrong cách nấu ăn của người Trung Quốc Nó cũng là một thành phần được sửdụng trong nấu nước dùng cho món phở của người Việt Nam

Đại hồi chứa anethol (C10H12O), cùng thành phần tương tự để tạo ra mùi

vị như cây tiểu hồi vốn không có quan hệ họ hàng gì Gần đây, đại hồi đượcngười phương Tây sử dụng như là chất thay thế rẻ tiền hơn cho tiểu hồi trongviệc nướng bánh cũng như trong sản xuất rượu mùi

Đại hồi cũng được sử dụng trong trà như là liệu pháp chữa đaubụng và thấp khớp, và các hạt của nó đôi khi cũng được nhai sau bữa ăn đểgiúp tiêu hóa

Hình 6 Cây hồi

chuyên đề thực tập tổng hợp

chuyên đề thực tập tổng hợp

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Nấm men có trong cây men lá ở tỉnh Lào Cai

Môi trường phân lập chủng nấm men có nồng độ chất khô là 6.5 Bx và

pH = 5,6 - 6,0 Môi trường sử dụng trong quá trình này là môi trường Hansen

Bảng 1 Môi trường phân lập và giữ giống nấm men < hansen >

chuyên đề thực tập tổng hợp

Bảng 2: Môi trường giữ giống nấm men: Môi trường này có nồng

Môi trường thử khả năng lên men của nấm men

Sử dụng dung dịch đường 10% được hấp thanh trùng ở 1210 C trong

 tủ lạnh sâu (Sanyo ultra low, Nhật Bản)

 Thiết bị nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào: Kính hiển viquang học

 OLYMPUS, modelCHS, Nhật Bản

 Các thiết bị khác: Cân điện tử SARORIUS (Nhật); máy đo pH (320

pH meter),

 METTLER TOLEDO, Thụy Sĩ; pipetman; máy đo quang Model 80

 Anh; máy khuấy từ; lò vi sóng; máy ly tâm, máy sấy chân không,…

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp phân lập nấm men và thuần khiết

Dùng cối chày sứ nghiền nhỏ các mẫu lá, cân lấy 1g cho vào bình tamgiác đựng 100ml nước cất (được dung dịch 1%) Sau đó pha loãng đến 10-4,

10-5, 10-6… Từ các độ pha loãng này dùng pipet vô trùng lấy chính xác 0,1 mldịch nhỏ vào đĩa peptri có chứa môi trường phân lập đã điều chỉnh ph= 5,6 đểhạn chế sự phát triển của vi khuẩn Dùng que gạt thuỷ tinh cô trùng gạt đềudịch chứa vi sinh vật trên khắp mặt đĩa, mỗi độ pha loãng cấy từ 3 đến 4 đĩa.Đặt ngược các đĩa thạch đã cấy vào tủ ấm 30oC Sau 48h khi các khuẩn lạc đãxuất hiện, nhận dạng sơ bộ và đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch sau đó dùng quecấy tách những khuẩn lạc khác nhau về hình dạng cấy ra từng môi trường cấyriêng biệt và đặt kí hiệu cho từng chủng

chuyên đề thực tập tổng hợp

Thu nhập lá cây men lá

Lấy 1g mẫu nghiền nhỏ

Hòa 1g mẫu vào 9ml nước

Cấy sang môi trường đặc <hansen>

Cấy sang môi trường thạch nghiêng nuôi 24h ở 30o C

Kiểm tra độ thuần khiết

chuyên đề thực tập tổng hợp

3.2.2 Bảo quản và giữ giống

3.2.2.1 Bảo quản trên thạch đứng

Các khuẩn lạc sau khi được phân lập và xác định là vi khuẩn laticnấmmen, được chuyển sang các ống môi trường Hansen thạch đứng, nuôi 24htrong tủ ấm 370C và giữ trong tủ lạnh 40C cho các nghiên cứu tiếp theo

3.2.2.2 Bảo quản trong dung dịch 30% glixerin

Những chủng lactic đã thuần khiết được nuôi trong môi trường Hansendịch thể ở 370C Sau 18 giờ nuôi cấy hút lấy 500 µl dịch hòa đều trong 500µldung dịch 30% glixerin vô trùng và giữ ở -200C trong các ống giống vô trùng

Phương pháp này cho phép bảo quản chủng giống trong khoảng thờigian từ 1 đến 3 năm

Pha môi trường hansen đặc

Rót 10ml môi trường vào ống nghiệm

Để môi trường nằm nghiêng đến khi đông

đặc

Nuôi ở 300C̣̣̣ trong 24-48h

Pha môi trường hansen đặc

Bảo quản ở 40C trong tủ lạnh

Thanh trùng ở 1200C trong 15 phút

Tiến hành cấy theo đường ziczac

chuyên đề thực tập tổng hợp

3.3.1 Phương pháp xác định hình thái

Quan sát chủng giống qua khuẩn lạc:

Lấy chủng đã thuần khiết nuôi ở trong môi trường Hansen thạch đứngpha loãng đến 10-4,10-5,10-6 Từ các độ pha loãng này dùng pipet vô trùng lấychính xác 0,1 ml dịch nhỏ vào đĩa peptri có chứa môi trường phân lập Dùngque gạt thuỷ tinh cô trùng gạt đều dịch chứa vi sinh vật trên khắp mặt đĩa, mỗi

độ pha loãng cấy từ 3 đến 4 đĩa Đặt ngược các đĩa thạch đã cấy vào tủ ấm

30oC Sau 48 h nuôi cấy quan sát hình thái khuẩn lạc và miêu tả chúng

Quan sát chủng giống qua kính hiển vi:

Làm tiêu bản sống: Dùng que cấy vô trùng lấy tế bào vi sinh vật từ ốnggiống dàn đều trong một giọt nước cất vô trùng đã nhỏ sẵn trên một phiếnkính Đặt một mép lá kính sát với mép của giọt canh trường, sau đó nghiêng

lá kính một góc 600 và từ từ hạ xuống sao cho giọt canh trường bị ép giữa lákính và phiến kính Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi quang học có độphóng đại 400 lần

3.3.2 Đếm số lượng tế bào nấm men trong dịch nuôi cấy dùng buồng đếm hồng cầu

Dùng que cấy vô trùng lấy tế bào vi sinh vật từ ống giống dàn đềutrong một giọt nước cất vô trùng đã nhỏ sẵn trên buồng đếm Đặt một mép lákính sát với mép của giọt canh trường, sau đó nghiêng lá kính một góc 600 và

từ từ hạ xuống sao cho giọt canh trường bị ép giữa lá kính và buồng đếm.Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 400 lần

3.3.3 Xác định năng lực lên men của các chủng giống nấm men trên ống dunham

Cơ cở của phương pháp:

Trong quá trình lên men dịch đường, nấm men sinh ra CO2 Đây là chỉtiêu quan trọng để đánh giá khả năng lên men của nấm men Chủng nấm men

có năng lực lên men mạnh hơn thì có khả năng sinh ra năng lượng CO2 lớnhơn trong thời gian ngắn

Tiến hành:

Cho 20 ml dịch đường đã thanh trùng vào ống thủy tinh có sẵn ốngDurham Tiếp thanh trùng dịch đường ở 121oC trong 15 phút Sau đó cấy nấmmen vào môi trường và quan sát khả năng lên men Tính thời gian lên mencủa chủng nấm men tạo khí CO2 trong ống Dunham cao 5cm

Hinh 3.1 Thử khả năng lên men đường các chủng nấm men

chuyên đề thực tập tổng hợp

3.3.4 Xác định khả năng phát triển của nấm men

Xác định khả năng phát triển của các chủng nấm men trong quá trìnhlên men chính bằng cách đếm mật độ tế bào lơ lửng trên buồng đếm hồng cầu

3.3.5 Xác định khả năng sống của nấm men

Xác định tỷ lệ phần trăm tế bào sống của các chủng nấm men vào cuốiquá trình lên men bằng phương pháp nhuộm xanh metylen trên buồng đếmhồng cầu

3.3.6 Xác định hàm lượng cồn bằng dụng cụ cất cồn.

Tiến hành:

Lấy 100ml dịch lọc giấm chín có nhiệt độ xấp xỉ 200C cho vào bìnhđịnh mức 100ml, rót dịch giấm vào bình cất rồi tráng bình bằng 100ml nướccất rồi cũng đổ vào bình có dung tích khoảng 300ml Tiến hành chưng cất chotới khi dịch trong bình còn khoảng 1/3 thì ngừng sau đó định mức lên 250 ml

và làm lạnh tới 200C Tiếp theo thực hiện xác định độ rượu bằng bình tỷ trọngdựa vào bảng tra độ rượu theo tỷ trọng của dịch ethanol ở 200C

Tính toán: d20= (m3 – m1)/(m2 - m1)

Trong đó: m1: khối lượng bình không (g)

m2: khối lượng nước ở 200C và bình (g)

m3: khối lượng dung dịch ethanol ở 200C (g)

Xác định sinh khối nấm men bằng phương pháp đo OD

Nguyên lý: Tế bào nấm men phát triển sẽ làm đục dịch nuôi cấy và làmcho dịch nuôi cấy chuyển sang dạng huyền phù Độ đục của dịch nuôi cấy tỷ

lệ thuận với mật độ của tế bào nấm men

Dựa vào khả năng hấp phụ ánh sáng ở bước sóng 550 – 620 nm củadịch nấm men, khả năng hấp phụ ánh sáng càng cao thì mật độ tế bào nấmmen trong dịch nuôi cấy càng nhiều và cho giá trị OD càng lớn

Tiến hành:

Bật máy so màu sau đó chờ cho máy khởi động xong, chuyển sangbước sóng 620 nm

chuyên đề thực tập tổng hợp

Hút vào curvet 1 -2 ml mẫu đối chứng sau đó đưa vào giếng đo chờ chomáy hiển thị kết quả, chọn setting blank, đổ mẫu đối chứng vào 1 ốngefpendof, rửa sạch curvet bằng nước cất vô trùng, lau khô.

Cho 1 – 2ml mẫu cần đo vào curvet đưa vào giếng đo đậy nắp chờ chomáy hiện kết quả

Ghi lại giá trị OD hiển thị trên máy

3.3.7 Quan sát khuẩn ty giả.

Có một số nấm men khi phát triển trong những môi trường nuôi cấy lâuhay trong những điều kiện thiếu oxy có thể tạo thành những tế bào dài, xếpnối tiếp nhau, được gọi là khuẩn ty Người ta phân biệt hai loại khuẩn ty:khuẩn ty giả và khuẩn ty thật Khuẩn ty thật là các tế bào dạng sợi có váchngăn, khuẩn ty giả là các tế bào dạng sợi không có vách ngăn Việc tạo thànhkhuẩn ty là một đặc điểm quan trọng trong phân loại nấm men

Tiến hành: Đổ môi trường vào đĩa Petri Dùng que cấy, cấy nấm menthành 3 cặp đường song song ngắn, ở 3 chỗ Dùng panh lấy lá kính mỏng(ngâm trong còn 70%) đốt nhẹ cho bay hết cồn, để nguội một chút rồi cẩnthận đặt nhẹ nhàng lên vết cấy Sao cho hai đường cấy song song ở mỗi chỗ

có chiều ngang nằm gọn giữa lamen, hai đầu dài hơn lamen một chút để saunày dễ quan sát Khi đậy lamen, phải tránh bọt khí, đậy xong phải tránh dichuyển làm xô lệch lamen Sau khi đặt lamen một cách nhẹ nhàng và cẩn thận

ta đậy đĩa Petri lại và nuôi cấy ở 25-300C trong 4-5 ngày Lấy ra và quan sátcác vết cấy dưới kính hiển vi

3.3.8 Quan sát bào tử bắn, túi.

Tiến hành: Cấy nấm men trên môi trường khoai tây - glucoza theo haiđường vuông góc ở giữa sau đó úp ngược lên một đĩa Petri khác chứa cùngmôi trường nhưng không cấy nấm men Trong đĩa Petri này chứa 1 lamen vôtrùng, để ở 200C sau 3 tuần bào tử bắn sẽ tạo thành các khuẩn lạc trên đĩaPetri chứa môi trường ở phía dưới và lấy phần lamelle mang các bào tử bắn

để đưa đi quan sát dưới kính hiển vi

chuyên đề thực tập tổng hợp

3.3.9 Xác định nồng độ cồn theo phương pháp chưng cất.

3.3.9.1 Xác định nồng độ chất khô bằng Chiết quang kế [9].

Mục đích: Xác định khoảng thời gian thực hiện xong quá trình lên men.Khi quá trình lên men còn tiếp diễn thì giá trị chiết quang đo được sẽ thay đổi

do có sự chuyển hóa từ đường thành rượu Khi giá trị chiết quang không thayđổi chứng tỏ quá trình lên men đã xong

Nguyên tắc: Dựa vào chiết suất để suy ra nồng độ dung dịch, khi nồng

độ dung dịch tăng thì chiết suất tăng

Tiến hành:

Hiệu chỉnh chiết quang kế về giá trị 0: Nhỏ một giọt nước cất ở 200Clên mặt kính đo Chú ý không làm tạo bọt và đóng mặt kính lại Điều chỉnhbằng vít vặn sao cho giải phân cách giữa 2 vùng sáng tối rõ nét và trùng vàođiểm 0

Đo nồng độ chất khô: Đo nhiệt độ của dịch cần đo, nhỏ 1 giọt dịchđường lên mặt kính đo, đọc chỉ số tương ứng trên dải phân cách nếu nhiệt độkhác 200C thì cần hiệu chỉnh kết quả theo bảng phu lục (Bảng hiệu chỉnhnồng độ chất khô đo được về nhiệt độ 200C)

3.3.9.2 Đo hàm lượng đường sót trong giấm chín (phương pháp Graxianop).

Mục đích: Xác định hàm lượng đường còn lại sau quá trình lên men

Từ đó đánh giá năng lực lên men của chủng nấm men (chủng nấm men cónăng lực lên men càng cao thì hàm lượng đường sót càng nhỏ và ngược lại

Nguyên tắc: Đường khử khi đun nóng với dung dịch kiềm, cùng vớiferixyanua sẽ khử ferixyanua thành feroxyanua và đường khử chuyển thànhacid đường Dùng xanh methylen làm chất chỉ thị sẽ mất màu xanh khi phảnứng kết thúc Phản ứng chính như sau:

2K3Fe(CN)6 + 2KOH + CH2OH(CHOH)4CHO → 2K4Fe(CN)6 + 2H2O +COOH(CHOH)4COOH

Tiến hành: Dùng pipet hút 20ml dung dịch K3Fe(CN)6 1% cho vào bìnhtam giác (loại 250 ml) thêm vào đó 5ml KOH 2,5N và 3 – 4 giọt xanhmethylen 0,5% Lắc nhẹ và đun trên bếp điện sao cho 1 – 2 phút thì sôi, chuẩn

chuyên đề thực tập tổng hợp

tới khi xanh methylen mất màu từ xanh sang phớt hồng và cuối cùng là vàng

da cam

Tính toán: Hàm lượng đường trong dịch đường tính theo công thức:

D = (a/x)100 g/100ml

Trong đó: a là hàm lượng đường chuẩn hết 20ml dung dịch ferixyanua

x là thể tích dung dịch đường chưa biết nồng độ

Muốn xác định chỉ số a của 20ml K3Fe(CN)6 ta cần chuẩn bị glucosetinh khiết cân 0,5g glucose tinh khiết đã sấy đến khối lượng không đổi hòa tantrong nước cất rồi cho vào bình định mức 100ml tráng sạch bằng nước cất rồichuẩn đến 100ml ta có dung dịch glucose chuẩn 5g/l Dùng dung dịch nàylàm dung dịch chuẩn ta sẽ xá định được chỉ số a

Ví dụ: 20ml K3Fe(CN)6 + 5ml KOH 2,5N + 3 – 4 giọt xanh methylen0,5% chuẩn hết 10ml dung dịch glucose chuẩn 5g/l Như vậy, 20ml

K3Fe(CN)6 + 5ml KOH 2,5N + 3 – 4 giọt xanh methylen 0,5% tương đương0,05g đường

20ml K3Fe(CN)6 + 5ml KOH 2,5N + 3 – 4 giọt xanh methylen 0,5%chuẩn hết 20ml dung dịch giấm chín, như vậy, hàm lượng đường sót trongdịch dấm chín là: 0,05/20 = 0,0025 = 0,25%

chuyên đề thực tập tổng hợp

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN4.1 Kết quả phân lập

Từ mẫu men lá thu thập được trên địa bàn tỉnh Cao bằngLào Cai , tôi

đã phân lập được 10 chủng nấm men trên môi trường Hansen Đặc điểm hìnhthái của khuẩn lạc được chúng tôi trình bày trong bảng 4.1

Bảng 4.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc sau 3 ngày nuôi cấy

1 LC 1 A Tròn, lồi, bề mặt bóng, màu trắng ngà, có tâm 2.5

2 LC 1 B Hơi tròn, lồi, bề mặt bóng, màu trắng sữa, không

3 LC 2 Tròn, lồi, bề mặt bóng, màu trắng sữa, có tâm 3.0

4 LC 3 Tròn , lồi, bề mặt bóng, màu trắng ngà, có tâm 2.5

5 LC 4 A Hơi tròn, bẹt, bề mặt bóng, màu trắng ngà, có

6 LC 4 B Tròn , lồi, bề mặt bóng , màu trắng ngà, có tâm 3.5

7 LC 5 Tròn, lồi, bề mặt bóng màu trắng ngà, không tâm 2.0

8 LC 6 Tròn, lồi, bề mặt bóng, màu trắng ngà, có tâm 2.5

9 LC 7 A Tròn, lồi bề mặt nhăn, màu trắng ngà, không có

10 LC 7 B Tròn, lồi, bề mặt nhẵn, màu trắng sữa, có tâm 3.5

chuyên đề thực tập tổng hợp

Hình 4.1 Khuẩn lạc trên đĩa peptri

Từ mẫu men lá tôi tiến hành phân lập theo phương pháp pha loãng vàcấy trang trên đĩa petri Các khuẩn lạc mọc lên rất khác nhau bao gồm cả nấmmốc, nấm men…

Chọn những khuẩn lạc nghi ngờ là nấm men đem đi pha loãng và cấytrang trên môi trường Hansen qua nhiều lần tôi đã phân lập được 10 chủngnấm men từ 9 mẫu men lá

4.2 Định danh sơ bộ

Các khuẩn lạc ở mỗi chủng có đặc điểm về hình thái và màu sắc đồngnhất Tuy nhiên chưa thể biết được chúng có phải là nấm men hay không vàcũng chưa biết chúng thuộc loài nào

Trên cơ sở các đặc điểm về hình thái, sinh lý, sinh hóa của nấm men đãbiết, tôi tiến hành các thí nghiệm trợ giúp quá trình tuyển chọn và định danh

sơ bộ các chủng nấm men phân lập được

Trước khi thực hiện các thí nghiệm tiếp theo, các mẫu được giữ giốngtheo 2 phương pháp đó là giữ giống tạm thời trên môi trường thạch nghiêng

và giữ giống lâu dài bằng glixerin

CBLC

7 B

chuyên đề thực tập tổng hợp

Tạm gọi 10 loại khuẩn lạc phân lập được là 10 chủng nấm men.

4.2.1 Quan sát khuẩn ty

Pha môi trường pepton – glucose – agar, hấp vô trùng ở 1210C trong

15 phút, đổ ra đĩa petri để nguội Cấy mẫu nấm nem vào, sau 4 đến 5 ngàyđem ra quan sát

Bảng 4.2 Kết quả quan sát khuẩn ty giả

42.2 Quan sát bào tử bắn, túi.

Hình 4.2 Nấm men và bào tử

chuyên đề thực tập tổng hợp

4.2.3 Quan sát hình thái tế bào nấm men

Lấy các chủng nấm men đem tăng sinh lỏng trên môi trường cao nấmmen – pepton – glucose trong khoảng 24 giờ Lấy dịch canh trường ra làmtiêu bản soi dưới kính hiển vi

4.3 Thử khả năng lên men các loại đường

Dựa vào bản chất của quá trình lên men là chuyển hóa các loại đường

có trong dịch đường bởi nấm men thành rượu etylic, CO2 và các sản phẩm bậc

2 Chủng nấm men nào có khả năng lên men mạnh thì thời gian tạo thành CO2

ngắn hơn

Các chủng nấm men có khả năng lên men 1 số loại đường khác nhau.Trong đó, Glucose là loại đường mà nấm men sử dụng tốt nhất Song do điềukiện phòng thí nghiệm không có đủ hóa chất tôi tiến hành thử khả năng sửdụng đường glucose và sacharose

Tiến hành: Cho 20 ml dịch (gồm môi trường cơ sở và 1 – 2% đườngđịnh thử khả năng lên men) vào ống thủy tinh có sẵn ống Durham Thanhtrùng dịch đường ở 121oC trong 15 phút Sau đó để nguội, cấy 100 ml nấmmen ( đã tăng sinh trên môi trường Hansen lỏng) vào môi trường và quan sátkhả năng lên men Tính thời gian lên men của chủng nấm men tạo khí CO2

đẩy ống Durham cao 5cm Tính thời gian chủng nấm men tạo ra khí CO2 đẩyống durham nổi cao 5cm

Hình 4.3 Ống dunham cao 5cm

chuyên đề thực tập tổng hợp

Bảng 4.3 Kết quả thử khả năng lên men Glucose

Bảng 4.4 Kết quả thử khả năng lên men đường saccarozơ

4.4Thử khả năng lên men trong dịch chiết malt

Tiến hành: Cho 20 ml dịch chiết malt vào ống thủy tinh có sẵn ống Durham.Thanh trùng dịch chiết ở 121o C trong 15 phút Sau đó để nguội, cấy 100 mlnấm men ( đã tăng sinh trên môi trường Hansen lỏng) vào môi trường chiếtmalt và quan sát khả năng lên men Tính thời gian lên men của chủng nấmmen tạo khí CO2 đẩy ống Durham cao 5cm

Bảng 4.7 Kết quả thử khả năng lên men dịch chiết Malt

Chủng LC1A LC1B LC2 LC3 LC4A LC4B LC5

Thời gian 48* giờ 48* giờ 23 giờ 21 giờ 48* giờ 18 giờ 22 giờChủng LC6 LC7 A LC7B LC8 A LC8 B LC9 A LC9 BThời gian 32 giờ 22 giờ 18giờ 16 giờ 48* giờ 18 giờ 27giờ

(48* giờ: Trong thời gian 48 giờ chiều cao của ống Durham là 4,0 cm)

Bảng 4.8: Kết quả thử nghiệm một số loại đường

chuyên đề thực tập tổng hợp

STT Chủng Glucose Scharose Maltoza Raffinoza Lactose Mannitol

vi sinh vật kỵ khí tùy tiện không

Tiến hành: Nuôi cấy nấm men trên đĩa petri thạch Hansen trong 48 giờ, sau đó nhỏ một giọt H2O2 3% trực tiếp lên bề mặt khuẩn lạc quan sát thấykhông có hiện tượng sủi bọt khí

Từ kết quả trên ta thấy rằng, hầu hết các chủng đều có khả năng lênmen tốt hai loại đường khảo sát Tuy nhên có 3 chủng thể hiện năng lực lênmen cao hơn cả Đó là các chủng LC5, LC6, LC7A

Trên cơ sở những kết quả nghiên cứu được tôi thấy 3 chủng LC7 A,

LC5, LC6 có khả năng lên men tốt, có các đặc tính nuôi cấy đặc điểm về hìnhthái tế bào, đặc điểm khuẩn lạc của chủng Saccharomyces cerevisiae Do vậy,tạm thời định tên sơ bộ cho 3 chủng LC5, LC6, LC7A là Saccharomycescerevisiae LC5, Saccharomyces cerevisiae LC6, và Saccharomyces cerevisiae

LC7.

4.64 Xác định nồng độ cồn và tuyển chọn

Với mục đích lựa chọn chủng có khả năng lên men rượu với hiệu xuấtcao chúng tôi đã thực hiện nghiên cứu khả năng tạo ethylic của các chủngnấm men từ dịch tinh bột sắn thủy phân

Kết quả thu được thể hiện qua bảng 4.5

chuyên đề thực tập tổng hợp

Bảng 4.5 Kết quả xác định hàm lượng cồn trong dịch giấm chín.

4.74.1.Tối ưu điều kiện sinh trưởng và phát triển chủng Saccharomyces cerevisiae LC 7

4.74.1.1Khả năng sử dụng nguồn carbon (đường glucose)

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường tới sự sinh trưởng

và phát triển của chủng nấm men được thể hiện qua bảng 4.6 và hình 4.5

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của nồng độ đường tới sự phát triển của nấm men

Hình 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ đường tới sự phát triển của nấm men

Kết luận: Nồng độ đường tối thích cho chủng Saccharomyces cerevisiae

LC 7 phát triển là 3%.

chuyên đề thực tập tổng hợp