Bài phúc trình học phần thực tập vi sinh môi trường bài 1 an toàn phòng thí nghiệm vi sinh và nguyên tắc vận hành các thiết bị

Không được ăn uống trong phòng thí nghiệm, không được để lên miệng các vật dụng như viết chì trong quá trình nuôi cấy nhằm hạn chế nguy cơ nhiễm vi sinh vật từ phòng thí nghiệm 3.. Cần p

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

La Thương B2202205

Lớp: MT2257A1

Nhóm: 5 Lớp/Nghành: KTMT GVHD: Kim Lavane Học kì 1 năm 2023-2024

1

Bài 1: An toàn phòng thí nghiệm vi sinh và nguyên tắc vận hành các thiết bị 1 Bài 2: Chuẩn bị môi trường phân lập và nuôi cấy VSV 12 Bài 3: Phân lập VSV 16 Bài 4: Định lượng tổng E.coli và Coliform bằng phương pháp

MPN 18 Bài 5+6+7: Định lượng vi khuẩn hiếu khí, Enterococi và E.coli và coliform trong nước bằng phương pháp màng lọc 23 Bài 8: Sử dụng kính hiển vi quan sát vi sinh vật trong bùn hoạt tính 28 Tài liệu tham khảo 30

2

BÀI 1: AN TOÀN PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH

VÀ NGUYÊN TẮC VẬN HÀNH CÁC THIẾT BỊ

• Các nguyên tắc an toàn:

Một số hướng dẫn an toàn phòng thí nghiệm sinh kỹ thuật môi trường

1 Chuẩn bị và đọc trước các thí nghiệm để giảm tối đa các rủi ro trong quá trình thí nghiệm

2 Không được ăn uống trong phòng thí nghiệm, không được để lên miệng các vật dụng như viết chì trong quá trình nuôi cấy nhằm hạn chế nguy cơ nhiễm

vi sinh vật từ phòng thí nghiệm

3 Bắt buộc mặc áo blouse và đeo khẩu tra trong suốt quá trình làm thí nghiệm

4 Chỉ mang theo các vật dụng cần thiết dùng cho thí nghiệm, vở ghi chép và bút ghi chú Các vật dụng khác tập trung một chỗ riêng biệt

5 Trước khi bắt đầu hay sau khi kết thúc thí nghiệm cần phải khử trùng bằng cồn 700C

6 Phải có các nhãn ghi chú trên các chai, lọ chứa đựng hóa chất, môi trường và

có ghi đầy đủ ngày tháng pha Việc có các nhãn mác giúp tránh nhầm lẫn hóa chất, môi trường với nhau và biết được thời gian có thể sử dụng

7 Cần tuân thủ các chỉ dẫn ghi trên các chai lọ hóa chất để đảm bảo an toàn khi

11 Cần phải khử trùng các dụng cụ đã sử dụng để thực hiện thí nghiệm với vi sinh vật trước khi cất hoặc thải bỏ Không đổ môi trường có chứa vi sinh vật vào bồn rửa Trường hợp này, môi trường phải được khử trùng trước khi đổ

bỏ Đối với môi trường thạch (agar), khử trùng môi trường trước khi thải bỏ

3

cũng phải thực hiện Cần lưu ý rằng khi khử trùng thạch cần có túi nylong chuyên dụng để tránh thạch lỏng đổ ra thiết bị khử trùng Riêng các mẫu môitrường thu thập từ đất, nước tự nhiên thì không cần phải khử trước trước khi thải bỏ trong trường hợp không sử dụng hết

12 Sau khi kết thúc buổi thực hành cần phải dọn dẹp ngăn nắp và lau các bề mặtbằng cồn 70oC

Ngoài ra cần phải vệ sinh tay cẩn thận trước khi rời khỏi phòng thí nghiệm

13 Nếu trong quá trình thao tác thí nghiệm có bị vết cắt hay có sự cố khác thì cần báo ngay cho người hướng dẫn trong phòng thí nghiệm để có thể xử lý kịp thời và phù hợp

• Nguyên tắc vận hành các thiết bị:

1/ Tủ ủ vi sinh MODEL BE600

Tủ ấm vi sinh là thiết bị sinh học bên

trong có điện trở gia nhiệt, có tác dụng truyền

nhiệt cho không khí bên trong buồng tủ Điện

trở gia nhiệt giúp chuyển hóa điện năng thành

nhiệt năng, cùng hệ thống quạt giúp điều chỉnh

độ ẩm tạo nên những luồng không khí có nhiệt

độ và độ ẩm thích hợp Tủ ấm thường có lớp

cách nhiệt nhằm duy trì nhiệt độ ổn định bên

trong tủ

Tủ ấm vi sinh được sử dụng với mục đích

chính là tạo ra và duy trì mức nhiệt độ và độ ẩm

thích hợp cho môi trường theo yêu cầu của

người nghiên cứu Tủ ấm được sử dụng với 2

mục đích chính:

Tạo môi trường nuôi cấy vi sinh vật: Mỗi loại vi sinh vật cần những điều kiện khác nhau để tồn tại và có thể sinh sản, vì vậy cần sử dụng tủ ấm vi sinh để tạo nhiệt độ, độ ẩm, độ pH, thích hợp

Tạo môi trường ủ ấm vi sinh vật, hỗ trợ vi sinh vật sinh trưởng và phát triển: Mỗi loại vi sinh vật lại đòi hỏi một nhiệt độ để có thể sinh trưởng và phát

4

triển khác nhau Để có thể nuôi cấy vi sinh vật thành công và đạt hiệu quả cao thì cần phải cung cấp nhiệt độ thích hợp

Nhờ khả năng điều chỉnh nhiệt độ, tủ ấm vi sinh được sử dụng trong rất nhiều bệnh viện, phòng thí nghiệm, các hoạt động nghiên cứu và sản xuất với nhiều ứng dụng khác nhau:

• Được ứng dụng các quá trình sản xuất các loại thực phẩm cần lên men nhờ hoạt động của vi sinh vật như sữa chua, pho-mai, nước tương, giấm, rượu,

• Ứng dụng trong việc xử lý rác thải bằng cách nuôi cấy và phát triển các loại vi sinh vật có khả năng phân hủy chất hữu cơ

• Ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản thông qua việc nuôi cấy và phát triển

ví inh vật có khả năng thanh lọc nước thải, tái sử dụng nước thải

• Ứng dụng trong công nghệ sản xuất phân vi sinh, chế phẩm hóa học, thuốc kích thích tăng trưởng,

• Sử dụng nhiệt độ để khử trùng: dùng tủ ấm vi sinh tạo nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối đa của vi sinh vật làm biến tính cấu trúc, chức năng của

chúng

• Kiểm tra khả năng chịu nhiệt của vi sinh vật

• Nghiên cứu sự kết tinh

• Lưu trữ hóa chất ở nhiệt độ thích hợp

• Kiểm tra độ ổn định của dược phẩm trước những thay đổi của nhiệt độ

Tủ ấm nuôi cấy vi sinh ngày nay được sử dụng rộng rãi nhằm phục vụ cáchoạt động nghiên cứu, sản xuất Chúng ta chỉ cần bỏ ra một khoản chi phí đầu tư ban đầu là có thể thực hiện rất nhiều hoạt động liên quan đến nghiên cứu, ứng dụng về vi sinh vật Trên thị trường hiện nay cũng có rất nhiều dòng sản phẩm tủ nuôi cấy vi sinh có xuất xứ từ nhiều nước khác nhau nên chất lượng cũng khác nhau Vì vậy khi lựa chọn mua tủ ấm vi sinh bạn nên tìm những địa chỉ uy tín

- Hướng dẫn sử dụng:

B1: Cắm dây nguồn vào ổ điện

B2: Bật công tắc nguồn (vặn nút POWER ở vị trí I), đèn nguồn sáng

xanh, nhiệt dộ trong tủ hiện lên trên bảng

5

B3: Nhấn nút SET và xoay nút điều chỉnh nhiệt dộ đến mức thích

hợp Nhiệt độ trong tủ sẽ tăng lên từ từ Khi nhiệt độ đạt đến mức thiết lập thì tự

động không tăng và được duy trì ổn định trong suốt thời gian vận hành

B4: Nếu xoay nút nhanh thì nhiệt độ thay đổi lớn Khi xoay nút chậm thì nhiệt độ thay đổi chậm theo từng mức nhỏ

B5: Khi kết thúc vận hành, trị số nhiệt độ vẫn giữ nguyên như lúc SET ban đầu Lưu ý điều chỉnh nhiệt độ trong lần tiếp theo nếu có thay đổi nhiệt độ

B6: Sau khi sử dụng, vặn nút POWER về vị trí 0 đèn power tắt Rút dây

nguồn ra khỏi ổ điện

2/ Tủ sấy MODEL UNE 600

- Hướng dẫn sử dụng:

B1: Cắm phích điện vào nguồn điện

B2: Nhấn nút ON/OFF, đèn bật sáng,

nhiệt độ trong tủ, nhiệt độ tối đa của tủ sẻ

hiện lên trên bảng theo dõi nhiệt độ

B3: nhấn nút SET và xoay nút để điều

chỉnh đến nhiệt độ thích hợp, nhiệt độ trong

tủ sẽ tăng lên từ từ, khi đạt đến nhiệt độ cần

thiết thì ngừng tăng và duy trì nhiệt độ bên

trong suốt thời gian vận hành

B4: Nếu xoay nút nhanh thì điểm nhiệt

độ thay đổi lớn, khi xaoy chậm thì điểm nhiệt

độ thay đổi từng số một

B5: Khi máy kết thúc vận hành, giá trị

nhiệt độ khi SET vẫn còn giữ trong máy ngay cả khi tắt công tắc máy Lưu ý để

điều chỉnh nhiệt độ cho lần sử dụng kế tiếp

B6: Sau khi sử dụng xong, nhấn nút ON/OFF, đèn POWER tắt

3/ Thiết bị khử trùng HIRAYAMA HVE-50

- Hướng dẫn sử dụng:

B1: Cắm phích điện vào nguồn điện Nhấn nút POWER ON/OFF để bật

thiết bị

6

B2: Mở nắp: Đẩy thanh gạt về phía

UNCLOCK, nắp tự động bật lên

B3: Cho nước cất 1 lần vào buồng khử

trùng cho đến khi nhìn thấy mục nước

B7: Cài đặt nhiệt độ và thời gian khử trùng: Nhấn nút SET/ENT Để điều

chỉnh nhiệt độ thì nhấn nút () để tăng nhiệt độ và nút () để giảm và sau đó

nhấn SET Tiếp theo, để thay đổi thời gian thì nhấn nút NEXT Sau đó dùng nút lên-xuống để điều chỉnh thời gian và cuối cùng nhấn nút SET

B8: Nhấn nút START/STOP để bắt đầu khử trùng

B9: Sau khi khử trùng xong, Nhấn nút START/STOP để kết thúc vận

hành

B10: Kéo thanh gạt về phía UNCLOCK và lấy các dụng cụ đã khử trùng

ra ngoài khi sử dụng, tắt công tắc nguồn và rút điện LƯU Ý: PHẢI SỬ

DỤNG BAO TAY VẢI ĐỂ MANG RỌ CHỨA DỤNG CỤ, MÔI

TRƯỜNG RA NGOÀI

B11: Tắt nguồn: Nhấn nút ON/OFF Rút phích cắm khỏi nguồn điện

7

4/ Máy trộn mẫu ( Vibra Mix R)

có con dấu hoàn chỉnh mà không cần sử dụng

con dấu quay phức tạp

Máy khuấy từ là một máy phổ biến vì nó

hiệu quả và quitter hơn

Thiếu di chuyển phần bên ngoài cũng

ngăn chặn mọi thiệt hại trên các phần khác của thiết bị.

8

6/ Tủ ủ vi sinh MODEL BE 500 - Hướng dẫn sử dụng:

B1: Cắm phích điện vào nguồn điện

B2: Bật nút POWER về vị trí 1, đèn

xanh bật sáng, nhiệt độ trong tủ sẽ hiện lên

trên bảng theo dõi nhiệt độ

B3: nhấn nút SET và xoay nút để điều

chỉnh đến nhiệt độ thích hợp, nhiệt độ trong tủ

sẽ tăng lên từ từ, khi đạt đến nhiệt độ cần thiết

thì ngừng tăng và duy trì nhiệt độ bên trong

suốt thời gian vận hành

B4: Nếu xoay nút nhanh thì điểm nhiệt

độ thay đổi lớn, khi xaoy chậm thì điểm nhiệt

độ thay đổi từng số một

B5: Khi máy kết thúc vận hành, giá trị

nhiệt độ khi SET vẫn còn giữ trong máy ngay

cả khi tắt công tắc máy Lưu ý để điều chỉnh

nhiệt độ cho lần sử dụng kế tiếp

B6: Sau khi sử dụng xong, vặn nút POWER về vị trí 0, đèn POWER tắt.

7/ Tủ cấy vi sinh

Tủ cấy vi sinh (tủ an toàn sinh học

hay tủ nuôi cấy mô ) là tên gọi của một hệ

thống làm việc được thiết kế để ngăn ngừa

các tác nhân ô nhiễm đối với các thao tác

trên mẫu sinh học, vật liệu nhạy cảm với

các hạt bụi Không khí được hút thông qua

một bộ lọc HEPA và được đưa vào trong

B1: Cắm phích điện vào nguồn điện

B2: Bật công tắc nguồn, đèn nguồn sáng đỏ, nhiệt độ trong tủ bắt đầu tăng

B3: Lẫn tay nắm lên và kéo cửa mở Kéo nhẹ cánh trong và chuyển mẫu vào

B4: Đẩy nhẹ cánh trong khép kín Kéo cánh cửa bên ngoài và lẫy tay nắm khóa lại

B5: Sử dụng dấu mũi tên  để điều chỉnh nhiệt độ trong tủ ủ

B6: Sau khi sử dụng, tắt công tắc nguồn và rút điện

9/ Máy bơm chân không

• Máy bơm nước chân không là gì?

Máy bơm chân không là một

loại máy có thể bơm được cả nước

và không khí Cụ thể, đây dòng

máy bơm dân dụng cỡ nhỏ có khả

năng bơm hút chân không ở một

Máy bơm chân không vòng nước hoạt động trên nguyên tắc Piston có

nghĩa là quay trong chất lỏng, trục và cánh bơm chính là bộ phận chuyển

động Khi cánh bơm quay chất lỏng liên tục, lực văng ly tâm sẽ hướng ra

ngoài và tạo nên một vòng chất lỏng quay đồng tâm với vỏ bơm

Chất lỏng được tạo ra bởi lực ly tâm khi cánh bơm quay và ở cổng hút

sẽ làm nhiệm vụ hút không khí Sau khi bộ phận cổng hút được thông, chất

lỏng sẽ quay trở lại vào không gian giữa cánh bơm và lưỡi, đẩy không khí ra bên ngoài qua cổng xả Cho đến khi nào không gian giữa các lưỡi cánh chạm với cổng xả thì vòng chất lỏng sẽ đưa không khí bị nén vào cổng xả

10

10/ Kính hiển vi

Sử dụng kính hiển vi 2 thị kính quan sát VSV trong bùn hoạt tính

Kính hiển vi là dụng cụ rất quan trọng trong nghiên cứu VSV Kính hiển

vi giúp ta quan sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, đo & đếm tế bào VSV

1 Cấu tạo :

a Bộ phận cơ học :

- Chân kính hiển vi

- Bàn kính : hình vuông hoặc tròn, nơi đặt kính mang vật để xem

- Thân kính : gắn liền với đế kính

- Ống kính : có thể di chuyển lên xuống nhờ các ốc điều chỉnh Đầu trênống kính có đặt thị kính, đầu dưới là bàn quay có gắn các vật kính

được gắn lồng vào trong ống kính, nơi

đặt mắt xem ảnh của mẫu vật

- Vật kính : là hệ thống gồm nhiều thấu kính

ghép lại Mỗi kính hiển vi thường gồm 3 đến 4 vật

kính X4, X10, X40, X100

- Hệ thống tụ quang : đặt dưới bàn kính, dùng

tập trung ánh sáng vào mẫu vật Hệ thống nầy gồm

nhiều thấu kính gộp lại hoặc chỉ là một gương lõm

- Bộ phận chắn sáng : nằm bên dưới bàn kính để chỉnh chùm tia sáng chiếu vào mẫu vật

11

2 Cách sử dụng :

- Mở bao đậy kính hiển vi

- Mở đèn ở hệ thống tụ quang hay chỉnh gương lõm để lấy ánh sáng

- Xoay vật kính X4 vào ngay quang trục

- Quay gương lõm hướng về đèn, điều chỉnh để thị trường được chiếu sáng tối đa, theo dõi bằng cách đặt mắt vào thị kính Sau đó tuyệt đối không xê dịch kính hiển vi nữa Muốn chiếu sáng vừa, hạ hệ thống tụ quang, khép bớt chắn sáng Muốn chiếu sáng mạnh, nâng hệ thống tụ quang lên, mở chắn sáng Đối với vật kính X100 thì nâng hệ thống tụ quang lên vị trí cao nhất, mở hết chắn sáng

- Vặn ốc thứ cấp, hạ từ từ ống kính xuống đến khi không vặn được thì thôi

- Đặt mẫu vật lên bàn kính, xê dịch cho mẫu vật được chiếu sáng rồi kẹp mẫu vật với 2 kẹp

- Đặt mắt vào thị kính rồi vặn ốc thứ cấp để nâng ống kính lên từ từ, đếnkhi ảnh hiện ra thì ngưng Điều chỉnh bằng

ốc vi cấp để thấy ảnh rỏ hơn Sau đó xoay

qua vật kính dài X10, X40, X100 lúc đó chỉ

dùng ốc vi cấp để rỏ ảnh

* Quan sát với vật kính nhúngdầu X100 : Sau khi điều chỉnh ảnh rỏ

ở vật kính X40, xoay vật kính X40 ra

khỏi quang trục và nhõ 1 giọt dầu lên

mẫu vật, rồi xoay vật kính X100 vào

BÀI 2: CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG PHÂN LẬP VÀ

Nhìn chung, môi trường nuôi cấy vi sinh vật chứa đựng các chất gồm chấthữu cơ (glucose, protein) và các khoáng chất cần thiết như N, P, và các khoáng

vi lượng

2 Một số môi trường nuôi cấy:

a) Potato Dextrose Agar (PDA): là một môi trường cho vi sinh phát triển chứa tinh bột khoai tây và đường dextrose Chúng được sử dụng phổ biến

để nuối cấy vi nấm, vi khuẩn PDA có thể bổ sung thêm các hợp chất khácnhư axít hoặc chất kháng sinh để ức chế sự phát triển các vi sinh vật không mong muốn hoặc các vi khuẩn ảnh hưởng đến nấm men, nấm mốc.PDA được khuyến khích sử dụng để phân lập và xã định mật số của nấm men, nấm mốc trong thực phẩm, mỹ phẩm hay môi trường PDA là môi trường giàu dưỡng chất từ khoai tây nhằm kích thích sự phát triển bào tử nấm Trong khi đó, đường dextrose hỗ trợ cho sự phát triển chung của cácVSV khác Thành phần chính của PDA gồm 20 g dextrose, 4g khoai tây trích ly, 15g agar

b) Môi trường lactose broth (LSB: Lauryl Sulfate Broth) sử dụng để phát hiện vi khuẩn coliform trong nước và trong các sản phẩm thực phẩm như: bánh kẹo, thức ăn chăn nuôi, thực phẩm… LSB thúc đẩy sự Sinh trường

và giải phóng khí vi sinh vật coliform Vi khuẩn gây hiếu khí đã được ức chế hoàn toàn

13

II VẬT LIỆU, DỤNG CỤ VÀ QUÁ TRÌNH THỰC HIỆN: :

- Chai duran 200mL có nắp đậy

- Cân phân tích, giấy cân

B4 Đỗ đĩa thạch vào các đĩa petri đã khử trùng trước đó

Lưu ý: Khi đổ Agar vào đĩa petri cần đổ từ dưới lên và đặt trong tủ cấy vi sinh Sau khi đổ xong thì cần lật úp đĩa petri

B5: Khi thạch đã đông đặc và đĩa petri đã nguội, cất đĩa môi trường vào bọc kín

và bảo quản

• Môi trường tổng số Coliform, E.coli (LSB):

14

❖ Môi trường tổng số Coliform:

B1 Cân 14,25g LSB sau đó hoà tan vào 400mL nước cất,

B2 Sử dụng máy khuấy từ khuấy cho đến khi tan hoàn toàn và đều môi trường B3 Phân phối vào ống nghiệm mỗi ống 10ml Các ống nghiệm cần đặt ống Durham lật ngược trước đó

B4 Khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 10 phút

B5 Bảo quản các ống nghiệm ở điều kiện lạnh

❖ Môi trường tổng số E.coli:

B1 Pha loãng 14,6g môi trường trong 400 ml nước cất

B2 Sử dụng máy khuấy từ khuấy cho đến khi tan hoàn toàn và đều môi trường B3 Phân phối vào ống nghiệm mỗi ống 10mL

B4 Khử trùng nhiệt ướt trong thời gian 10 phút ở nhiệt độ 1210C

B5 Trữ lại ở điều lạnh trước khi sử dụng

15

BÀI 3: PHÂN LẬP VI SINH VẬT

- Trong môi trường thiên nhiên VSV gồm nhiều chủng loài, muốn tìm hiểu từng chủng loài riêng biệt cần phải biết kỹ thuật gieo cấy và phân

lập chúng Bài này giúp sinh viên nắm vững được các thao tác trên

2 Khái niệm :

16

- Phân lập vi sinh vật là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu và đưa về dạng thuần khiết Đây là một khâu có ý nghĩa rấtquan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng VSV

- Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật đươc tạo ra từ 1 tế bào ban đầu Trong thiên nhiên hoặc trong các vật phẩm nghiên cứu, visinh vật thường tồn tại ở dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau Muốn nghiên cứu về hình thái, sinh lý, lý hoá hoặc sử dụng vào thực tiễn một loài nào đó thì cần phải đưa chúng về dạng thuần khiết

3 Nguyên tắc:

- Tách rời các tế bào vi sinh vật; Nuôi cấy các tế bào trên trong môi

trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau

II.

VẬT LIỆU, DỤNG CỤ, QUÁ TRÌNH THỰC HIỆN VÀ ĐÁNH

GIÁ KẾT :

1 Vật liệu:

- Môi trường PDA

- Mẫu đất: Khối lượng 0,9936g đất

- Địa điểm: Tòa phức hợp (RLC)

2 Dụng cụ:

- Ống nghiệm, Pipet thủy tinh

- Chai Duran có nắp đậy - Que cấy Drigalski

B1 Chuẩn bị môi trường PDA

B2 Pha loãng mẫu

- Chuẩn bị 5 ống nghiệm chứa 9ml nước cất khử trùng (dd pha loãng)

- Cân 0.9936g đất đã chuẩn bị đem đi hòa tan vào 9ml dd pha loãng

17