Nghiên cứu tạo tế bào e coli biểu hiện kháng thể bán phần chuỗi đơn cb6 kháng virus sars cov 2

Như vậy,từ những kết quả trên cho thấy nghiên cứu đãtạo dòng và biểu hiện thànhcông protein CB6 và là tiền đề để sản xuất kháng thể bán phần chuỗi đơn CB6trong điều trị COVID - 19... Hai

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHÓ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN VĂN ĐOÁN

Công trình đượchoàn thành tại Trường Đại học Công nghiệp TP HồChí Minh.Người hướng dẫn khoahọc: TS Đoàn Chính Chung và PGS TS Trịnh Ngọc Nam

Luận văn thạc sĩ được bảovệtại Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn thạc sĩ Trường Đại

học Công nghiệpthành phố Hồ Chí Minh ngày 06 tháng 10 năm 2023

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 TS Nguyễn Thị Kim Anh- Chủ tịch Hội đồng

2 TS Lao Đức Thuận - Phản biện 1

3 TS Phạm Tấn Việt - Phản biện 2

4 TS Nguyễn MinhNam - ủy viên

5 TS Trần Thị Huyền - Thư ký

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THựC PHẨM

BỘ CÔNG THƯƠNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

THÀNH PHÓ HỒ CHÍ MINH

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC sĩ

Họ tên học viên: Nguyễn Văn Đoán

Ngày, tháng, năm sinh: 14/04/1997

NGHIÊN CỨU TẠO TẾ BÀO E coli BIỂU HIỆN KHÁNG THỂ BÁN PHẦN

CHUỖI ĐƠN CB6 KHÁNG VIRUS SARS-CoV-2

- Tạo dòng vector biểu hiện gen mãhóa kháng thể chuỗiđơn CB6 kháng protein

SARS-CoV-2

Biến nạp và biểu hiện hiện kháng thể chuỗi đơn CB6 kháng protein

SARS-CoV-2 trên vi khuẩn E.colỉ.

— Nghiên cứu điều kiện phù hợp nuôi cấy vi khuẩn E. coỉi sản xuất kháng thể

chuỗi đơn CB6 kháng protein SARS-CoV-2

- Kiểm tra và đánh giá sơ bộ chấtlượng kháng thể chuỗi đơn CB6 kháng protein

SARS-CoV-2

II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 30/11/2022

IV NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Đoàn Chính Chung và PGS TS

Trịnh Ngọc Nam

Tp Hồ Chí Minh, ngày 28 tháng 10 năm 2023

VIỆN TRƯỞNG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THựC PHẨM

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến tất cả các Thầy, Cô trong Viện Công

nghệ Sinh học và Thực phẩm - Trường Đại Học Công NghiệpTP Hồ Chí Minh đãtận tình giảng dạy, truyền đạt những kiến thức quý báu giúp em hoàn thành chươngtrình đào tạo và báo cáo tốt nghiệp

Trong quá trình làm báo cáo cónhiều khókhăn đã giúp emcó những trải nghiệm quýgiá và nhiều bài bài học kinh nghiệm

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới thầy Đoàn Chính Chung - Phó phòngNghiên cứu và Phát triển thuộc công ty CP CNSH Dược Nanogen và thầy Trịnh Ngọc

Nam - Trưởng phòng Quan hệ và Hợp tác Quốc tế trường ại học Công nghiệp Tp

HCM Các Thầy đã giúp đỡ hướng dẫn em tận tình để em hoàn thành báo cáo đúng

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC sĩ

Đại dịch Covid - 19 được xác địnhnguyên nhân làvirus SARS-CoV-2, gây hậu quả

hơn 6.376.503 người tử vong Hiệnnay, trên thế giới cónhiều cách tiếp cận đểnghiên

cứu điều chế vaccine phòngngừa cũng như thuốc điều trị, trong đó có phương pháptạodòng gen mãhóakhángthể đểsảnxuất protein cóthểức ché hoạt động của SARS-CoV-2 Nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục đích tạo dòng chủngvi khuẩn E coli mang gen mã hóa kháng thể bán phần chuỗi đơn CB6 có khả năng sản xuất

protein CB6, hướng đến áp dụng trong sản xuất thuốc ức chế SARS-CoV-2

Gen CB6 được gắn vào vector pNANOGEN và được biến nạpvào chủng vi khuẩnE coli BL21(DE3) bằng phương pháp hóa biến nạp Sau đó, chủng vi khuẩn manggen

mã hóa kháng thể bán phần chuỗi đơn CB6 sẽ được nuôi cấy trên môi trường LBKan

và được cảm ứngbằng ITPG Dưới sự kích hoạt của ITPG protein CB6 đã biểu hiện,

được tách chiết và tinh sạch thành công Kết quả kiểm tra, phân tích bằng SDS - PAGE và Western Blot đã xác nhận sự biểu hiện của protein CB6 với kích thước và đặctính mong muốn Khi thực hiện phản ứngtrung hòa hòa SARS-CoV-2 của mấu

khángthể CB6 được xác định bằng bộ kittrung hòa SARS-CoV-2 đã đạt hiệu quả

ức chế là 46,5% Như vậy,từ những kết quả trên cho thấy nghiên cứu đãtạo dòng và biểu hiện thànhcông protein CB6 và là tiền đề để sản xuất kháng thể bán phần chuỗi

đơn CB6trong điều trị COVID - 19

The COVID-19 pandemic is primarily caused by SARS-CoV-2, resulting in over6,376,503 deathsworldwide Currently, there are various approaches being pursued

globally to study the developmentofpreventive vaccines and therapeutic drugs One

of these methods involves generating a genetically engineered antibody-producing

cell line to produce proteins that can inhibit the activity of SARS-CoV-2 This studyaims to create a bacterial strain ofE COỈỈ carrying a gene encoding a partial single­chain antibody CB6 to produce CB6 protein for potential application in inhibitingSARS-CoV-2

The CB6 gene is inserted into the pNANOGEN vector and transformed into E coli

BL21(DE3) bacterial strain using a transformation method Subsequently, the

bacterial strain carrying the gene encoding the partial single-chain antibody CB6 iscultured on LBKan medium and induced with ITPG Under the activation of ITPG,

the CB6 protein is expressed, extracted, and successfully purified The results of

SDS-PAGE and Western Blot analyses confirm the expression of the CB6 protein

with the desired size and characteristics The neutralizing activity of the CB6

antibody against SARS-CoV-2 is determinedusing a SARS-CoV-2 neutralization kit,

which shows an inhibitory efficiency of 46,5% Therefore, these results demonstrate

the successful generation and expression of the CB6 protein, providing a foundationforthe production ofthe partial single-chain antibody CB6for COVID-19 treatment

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứucủa bản thân tôi Các kết quả nghiên

cứu và các kết luận trong luận văn làtrungthực, không sao chép từ bất kỳ một nguồn

nàovàdưới bấtkỳ hình thứcnào Việc tham khảo các nguồn tài liệu (nếu có) đãđượcthực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định

Học viên

MỤC LỤC

LÒI CẢM ƠN i

TÓM TẮT LUẬN VĂNTHẠC sĩ ii

ABSTRACT iii

LỜI CAM ĐOAN iv

MỤC LỤC V DANH MỤC HÌNH ẢNH ix

DANH MỤC BẢNG BIỂU xii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xiii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặtvấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nộidung nghiên cứu 3

4 Đối tượng, phạm vi và địa điểm nghiên cứu 3

5 Cáchtiếpcận và phương pháp nghiên cứu 4

6 Ý nghĩathực tiễn của đề tài 5

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN LĨNH vựcNGHIÊN cứu 6

1.1 Tổng quan về virus SARS-CoV-2 6

1.1.1 Đại dịch COVID-19 và virus SARS -CoV-2 6

1.1.2 Glycoprotein s và vùng bắt đặc hiệu với thụ thể (Receptor Binding Domain -RBD) 8

1.2 Tổng quan về khángthể đơn dòng (monoclonal antibody -mAb) 10

1.2.1 Kháng thể dạng khảm 11

1.2.2 Kháng thể nhân hóa 12

1.2.3 Kháng thể người 12

1.2.4 Kháng thể bán phần cấu trúc Fab 13

1.2.5 Kháng thể bán phần chuỗi đơn 14

1.3 Biểu hiện protein tái tổ hợp dạng thể vùi trong tế bào vi khuẩnE coỉi 15

1.3.1 Ưu điểm biểu hiện protein tái tổ hợp trongvi khuẩnE coli 15

1.3.2 Sự hình thành thể vùi trong tế bào chất E coli 17

1.3.3 ChủngE coỉi, hệthống vector và co chế kiểm soátđượcdùng trongbiểu hiện protein CB6 17

1.3.4 Tách chiết và tinh sạch plasmid 18

1.3.5 Biến nạp vàchọn lọc tế bào biểu hiện gen mục tiêu 19

1.3.6 Tạo tế bào khả nạp và biến nạp plasmidvào vi khuẩn E coỉi 19

1.3.7 Chọn lọc tế bào biến nạp 20

1.3.8 Nuôi cấyvi khuẩn E coỉi 20

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚƯ 22

2.1 Vật liệu nghiên cứu 22

2.1.1 Chủng vi sinh vật 22

2.1.2 VectorpNANOGEN 22

2.1.3 Gen kháng thể bán phần chuỗi đon CB6 sử dụng làm khuôn 22

2.1.4 Cácmồi dùng tronggiải trình tự 23

2.2 Hoáchất nghiên cứu 23

2.2.1 Hóachất dùng trong nuôi cấy vi khuẩn 23

2.2.2 Hóachất dùng trongxác định kích thước protein vàbán định lượng -SDS-PAGE 24

2.2.3 Hóachất dùng trong định tính khángthể bán phần chuỗi đon CB6 - Western Blot 25

2.2.4 Hóachất dùng trong kiểm trahoạt tính trung hòa SARS-CoV-2 25

2.2.5 Hóachất dùng trongxác định protein tổng số Bradford 26

2.2.6 Hóachất dùng trong định tính khángthể bán phần chuỗi đon CB6 -Immunodot 26

2.3 Dụng cụ và thiết bị 27

2,4 Phưong pháp nghiên cứu 28

2.4.1 Sơ đồnghiên cứu tổng quát 28

2.4.2 Phương pháp tạp tế bàoE.colikhả nạp 30

2.4.3 Phương pháp hoá biến nạp 31

2.4.4 Thu nhận genmã hoá kháng thể bán phần chuỗi đơn CB6 31

2.4.5 Gắn đoạn gen mã hóa kháng thể bán phần chuỗi đơn CB6 vào plasmid

pNANOGEN 32

2.4.6 Sàng lọc thể biến nạpE.coli Top 10F’ chứa plasmid pNANOGEN-CB6 33 2.4.7 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn E.coỉi TOP 10F’ 34

2.4.8 Phương pháp tạo tế bào khảnạp và biến nạp plasmid pNANOGEN vào tế bàoE.cỡ//BL21 (DE3) 34

2.4.9 Phương pháp kiểm traE.cơ/? BL21 (DE3) biểu hiện gen CB6 34

2.4.10 Khảo sát chấtcảm ứng thích hợp 37

2.4.11 Khảo sát tốc độ lắc: 38

2.4.12 Khảo sát nhiệt độ cảm ứng: 38

2.4.13 Nuôi cấy tế bào vi khuẩn E coli mangvector tái tổ hợp sản xuất protein CB6 ở quy mô phòng thí nghiệm ở các điều kiện đã khảo sát thích hợp 38

2.4.14 Thu nhận proteinCB6 từ tébàoE coỉi 39

2.4.15 Tinh sạch protein CB6 39

2.4.16 Kiểm tra và đánh giásơ bộ chất lượng khángthểbán phần chuỗi đơn CB6 kháng SARS-CoV-2 RBD 41

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊNcứu 46

3.1 Kết quả 1: Tạo dòng E.coỉi mang vector pNANOGEN-CB6 biểu hiện protein CB6 46

3.1.1 Thu nhận gen mã hóa kháng thể bán phần chuỗi đơn CB6 46

3.1.2 TạodòngK coliTOP10F’ mang vector tái tổ hợp pNANOGEN-CB6 47

3.1.3 Sàng lọc thể biến nạpE.ớớ/í Top 10F’ chứa plasmid pNANOGEN-CB6 48 3.2 Kết quả biến nạp và biểu hiện hiện kháng thểkháng protein SARS-CoV-2 RBD dạng bán phần chuỗi đơn trên tể bàoE coli 51

3.2.1 Kết quả tách chiết, tinh sạch plasmidpNANOGEN-CB6 51

3.2.2 Kết quảchọn lọc dòng tếbàoE coli BL21 mangplasmid pNANOGEN-CB6 52

3.2.3 Kết quả kiểmtra biểu hiện gen mục tiêu CB6 55

3.3 Ket quả 2: Xây dựng đường cong tăng trưởng chủng E coli BL21(DE3)/pNANOGEN-CB6trên môi trường LB 56

3.4 Kêt quả 3: Kêt quả khảo sát điêu kiện lên men từ chủngE coỉỉ tái tô hợp mang

vectorchứagen mã hoá kháng thể bán phần chuỗi đơn CB6 58

3.4.1 Kết quả khảo sát chấtcảm ứng thích hợp cho chủngE coliBL21 (DE3) Star/pNANOGEN-CB6 58

3.4.2 Kết quả khảo sát tốc độ lắc lắc ảnhhưởng đến sự pháttriển củaE” colỉ BL21 (DE3)-pNANOGEN-CB6 59

3.4.3 Kết quả khảo sát nhiệt độ nuôi cấy trong quá trình cảm ứng 61

3.5 Kết quả 4: Nuôi cấy thu nhận protein CB6 từ chủng E coỉi BL21(DE3) /pNANOGEN-CB6 ởquy mô 5 lít 64

3.6 Kêt quả 5: Kiêm travàđánhgiá sơ bộ châtlượng kháng thêbán phân chuôi đơn CB6 kháng SARS-CoV-2 RBD 65

3.6.1 Tiêu chuẩn nguyên liệu kháng thể kháng SARS-COV-2 65

3.6.2 Kết quả phân tích mẫu kháng thểtrung hòa SARS-COV-2 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 73

LÝLỊCHTRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN 81

DANH MỤC HỈNH ẢNH

Hình 1.1 Cấu trúc cơ bản của SARS-CoV-2 gây hội chứng hô cấp cấptính nghiêm

trọng COVID-19 [18, 19] 7

Hình 1.2 Cấu trúc bộ genecủa SARS-CoV-2 [22] 7

Hình 1.3 Cấu trúc các vùng chức năng của glycoprotein s với vị trícắtbởi TMPRSS2 tạo ra2 tiểu phần s 1 và S2 [23] 9

Hình 1.4 So sánhtrìnhtự aminoacid của vùng bám đặc hiệu thụ thểcủa SARS-CoV-1/2 và MERS-CoV [19] 9

Hình 1.5 Kết quả ức chế in vitro quá trình xâm nhiễm của các chủng coronavirus (pseudovirus) lần lượt bằng: a SARS-CoV-2 RBD tái tổ hợp; b SARS-CoV-1 RBD tái tổ hợp; c MERS-CoVRBD tái tổhợp 10

Hình 1.6 Cấu trúc của các dạng kháng thể 11

Hình 1.7 Cấu trúc kháng thể bán phần [41,42] 15

Hình 1.8 Cấu trúc vector pNANOGEN 18

Hình 1.9 Quá trình gắn và hấp thu DNA bởi vi khuẩn khả nạp 20

Hình 3.1 Kết quả phân tích sản phẩm cắt của plasmid pUC57-CB6 Giếng 1: thang DNA Ikb plus Giếng 2: plasmid PƯC57-CB6 cắt bằng Ndel và Hỉndllỉ 46

Hình 3.2 Kết quả tinh sạch gen mã hóakháng thể CB6 Giếng 1: gen mã hóa kháng thể CB6 Giếng 2: thang DNA Ikb plus 47

Hình 3.3 Kết quả biến nạp hỗn hợp sản phẩm nối pNANOGEN vàđoạn DNA mang gen CB6 vào tế bào E.coli Top 10F’ (Đĩa 1 - đối chứng, tế bào E.coỉi ToplOF’ không đượcbiến nạp phản ứng nối; dĩa 2 - tế bàoA.ớỡ/í ToplOF’ được biến nạp phản ứng nối) 48

Hình 3.4 Kết quả phân tích sản phẩm PCR của plasmid pNANOGEN-CB6 Giếng 1, 2,3,4, 5: plasmid pNANOGEN-CB6 Giếng 6: thang DNA Ikb plus Giếng 7: plasmid pNANOGEN khôngmang gen CB6 49

Hình 3.5 Kết quả giải trình tự plasmid pNANOGEN-CB6 và so sánh mức độ tương đồngvới trình tự lýthuyết 50

Hình 3.6 Kết quả chạy điện di agarose 1% plasmid pNANOGEN-CB6 sau khi tinh

sạch Giếng 1: Thang DNA Giếng 2: Plasmid pNANOGEN-CB6 sau khi tinh sạch 51

Hình 3.7 Kết quả chạy điện di agarose 1% plasmid pNANOGEN-CB6 Giếng 1:

ThangDNA Giếng 2: Plasmid pNANOGEN-CB6 đã được cắtmởvòng vớienzyme Ndel 52

Hình 3.8 Kết quả biến nạp hỗn hợp sản phẩm nối pNANOGEN vàđoạn DNA mang

gen CB6 vào tế bào E coll BL21 Đĩa 1 - đối chứng, tế bào E coli BL21

không được biến nạp phản ứng nối; đĩa 2 - tế bào E coli BL21 được biếnnạp phản ứng nối 53

Hình 3.9 Kết quả chạy điện di agarose 1%sản phẩm colony-PCR của 4 colony E. coli

BL21 sau biến nạp Giếng 1: ThangDNA Giếng 2: Sản phẩmcolony-PCR của colony 1 E coli BL21 Giếng 3: Sản phẩmcolony-PCR của colony 2E coli BL21 Giếng 4: Sản phẩm colony-PCR của colony 3 E coli BL21.Giếng 5: Sản phẩm colony-PCR của colony 4E coliBL21 54

Hình 3.10 Kết quả chạy điện di agarose Sản phẩm cắtgiới hạn plasmid sau tinh sạch

với enzymeHindlII và Ndel 55

Hình 3.11 Kết quả điện di SDS-PAGE protein CB6 Giếng EThang Protein/Ladder

Giếng 2-.E coli BL21 (DE3) Giếng 3:E coỉi BL21 (DE3)-pNANOGEN-

CB6 sau 6 giờ lên men 56

Hình 3.12 Đường cong tăngtrưởng của chủngE. coli BL21(DE3)

Star/pNANOGEN-CB6 theo thời gian 57

Hình 3.13 Két quả điệndi SDS-PAGEkiểmtrasự biểu hiệnkháng thể CB6củachủng

E.coỉi khi cảm ứng bằngITPG và lactose Giếng 1: Thang protein Giếng 2:

E coli BL21 (DE3)-pNANOGEN-CB6 cảm ứng bằng ITPG Giếng 3.E

colỉ BL21 (DE3)-pNANOGEN-CB6 cảm ứng bằng lactose 58

Hình 3.14 Kết quả Western Blot định tính kháng thể CB6 của chủng E.coỉikhi cảm

ứng bằng ITPG và lactose Giếng 1: Thang protein Giếng 2: E coli BL21 (DE3)-pNANOGEN-CB6 cảm ứng bằng ITPG Giếng 3:E colỉ BL21 (DE3)-pNANOGEN-CB6 cảm ứng bằng lactose 59

Hình 3.15 Mật độcủa tếbàoE coli ở các tốc độ lắc 150, 200 và 250 rpm 60Hình3.16 Kétquảđiệndi SDS-PAGEkiểmtrasự biểu hiệnkháng thể CB6 của chủng

E.colỉ ở các tốc độ lắc 150, 200 và 250 rpm Giếng 1:200 rpm Giếng 2:150 rpm Giếng 3: 250 rpm Giếng4: Thang chuẩn 61

Hình 3.17 Kết quảWestern Blot định tính kháng thể CB6 của chủngE.coỉi ở các tốc

độ lắc 150, 200 và 250 rpm Giếng 1:200 rpm Giếng 2:150 rpm Giếng3:250 rpm Giếng 4: Thang chuẩn 61

Hình 3.18 Mật độ của tếbào E coli ở các nhiệt độ nuôi cấy30°C, 37°c và 40°C 62Hình 3.19 Kết quả điện di SDS-PAGE kiểmtra sự biểu hiện CB6 của chủng E.coli ở

các nhiệt độ nuôi cấy30°C, 37°c và 40°C Giếng 1: Thang chuẩn Giếng2:

37° c Giếng 3: 40° c Giếng 4: 30° c 63

Hình 3.20 Kết quả Western Blot định tính khángthểCB6 của chủng E.coli ởcác nhiệt

độ nuôi cấy 30 °C, 37 °C và 40 °C Giếng 1 Thang chuẩn Giếng2 37° c

Giếng 3 40°c Giếng 4 30° c 63Hình 3.21 Kết quả điện di SDS-PAGE kiểm tra sựbiểu hiện protein CB6 của chủng

E.coỉi trên quy mô 5 lít Giếng 1: Thang chuẩn Giếng 2: Mau CB6 64Hình 3.22 Kết quả Western Blot định tính protein CB6của chủngE.coli trên quy mô

5 lít Giếng 1: Thangchuẩn Giếng2: Mau CB6 64Hình 3.23 Kết quả SDS-PAGE mẫu kháng thể trung hòa SARS-COV-2 Giếng 1:

Thang chuẩn Giếng 2: Mau kháng thể CB6 Giếng 3: Mau Filgrastim.Giếng 4: Mau trộn giữa kháng thể CB6 và Filgrastim 66

Hình 3.24 Kết quả Western Blot mẫu kháng thể trung hòa SARS-CoV-2 Giếng 1:

Thang chuẩn Giếng 2: Mau kháng thể CB6 Giếng 3: Mau Filgrastim.Giếng 4: Mau trộn giữa kháng thể CB6 và Filgrastim 67

Hình 3.25 Kết quả phân tích mẫu kháng thể trung hòa SARS-COV-2 68Hình 3.26 Đường chuẩn xác định tưong quan giữa nồng độ pha loãng và giá trị

OD450 của protein tếbào chủ 69Hình 3.27 Dư lượng DNA têbào chủ kiêm trabăng phưong pháp Real-time PCR70

DANH MỤC BẢNG BIÊU

Bảng 2.1 Các mồi dùng trong giải trình tự gen 23

Bảng 2.2 Hoá chất dùng trong nuôi cấy vi khuẩn 23

Bảng 2.3 Hoáchất dùng trong xác định kích thước ptotein và bán định lượng - SDS - PAGE 24

Bảng 2.4 Hoáchất dùng định tính kháng thể bán phần chuỗi đon CB6 - Western Blot 25

Bảng 2.5 Hóachất dùng trong kiểmtrahoạt tínhtrung hòa SARS-CoV-2 25

Bảng 2.6 Hóachất dùng trong xác định proteintổng số - Bradford 26

Bảng 2.7 Hóa chất dùng trong định tính kháng thể bán phần chuỗi đon CB6 -Immunodot 26

Bảng 2.8 Dụng cụ và thiết bị 27

Bảng 2.9 Khảo sát chấtcảm ứng thích hợp 37

Bảng 2.10 Thứ tự vànồng độ các mẫu khi thực hiện định tính bang SDS -PAGE41 Bảng 2.11 Thứ tự vànồng độ các mẫu khi thực hiện địnhtính bangWestern Blot.42 Bảng 2.12 Thứ tự vàthành phần các mẫu khi thực hiện 43

Bảng 3.1 Kết quả định đođộ hấpthụ ở OD260, OD280 và OD230 nm 51

Bảng 3.2 Bảng tiêu chuẩn nguyên liệu để đánh giá kháng thể bán phần chuỗi đon CB6 trung hòa SARS-CoV-2 65

Bảng 3.3 Giá trị OD450 của mẫu protein CB6 69

Bảng3.4 Nồng độ proteintổng số của mẫu protein CB6 70

Bảng 3.5 Kết quả thửnghiệm hoạt tính trung hòa của mẫu CB6 71

DANH MỤC Từ VIẾT TẲT

cDNA Complementary DNA

DNA Deoxyribonucleicacid

Fab antigen-bindingfragmentsantibody

mRNA Messenger ribonucleuc acid

ORF Open reading frame

RBD Receptor bindingdomain

sc singlechain

SARS-CoV-2 Severe acute respiratory syndrome corona virus 2

tRNA Transferribonucleic acid

UCOE UbiquitousChromatin opening Elements

UTR Untranslated region

WHO World Health Organization

MỞ ĐẦU

Sự bùngphátliên tục của bệnh do coronavirus 2019 (COVID-19) bắt nguồntừ Trung

Quốc vào tháng 12 năm 2019 [1] và trở thành đại dịch toàn cầu vào tháng 3 năm

2020 COVID-19 do một loại coronavirus mới gây ra, hội chứng hô hấp cấp tính

nghiêm trọng- coronavirus 2 (SARS- CoV-2) [2] Hai loại coronavirus khác đã gây

ra các đợt bùngphát trên toàn thế giới trong hai thập kỷ qua, đó là SARS-CoV2003) và coronavirus hội chứng hô hấp Trung Đông (MERS-CoV) (từ 2012 -nay).Trong cấu trúc củavirus này protein s đóngvai tròtrung gian gắn vào thụ thể của tế

(2002-bào người (ACE2) qua vùng bámthụ thể (RDB) thuộc tiểu phần s 1 và dung hợpvirus

và màng tế bào chủ thông qua tiểu phần S2, đây là kháng nguyên chính củacoronavirus [3, 4, 5] Các protein s của SARS-CoV-2 và SARS-CoV, có liên quanchặt chẽ về mặt phát sinh loài, có mức nhận dạng trình tự axit amin là ~ 77% [6].Mức độ giống nhau về trình tự cao như vậy làm tăng khả năng tồn tại các biểu môphản ứngchéo [7]

Do sự tưong đồng giữa protein đột biến của SARS-CoV và SARS-CoV-2, khả năng

bảo vệ của kháng thể do một khángthể tạo ra được phân tích để xác định hiệu quả của các kháng thể trung hòa [8] Vào tháng 2 năm 2020, nhóm của Ying ở Đại học

Fudan đãbáo cáo rằng trongsố một số kháng thể được tìm thấyvào năm 2006 từ một bệnh nhân SARS đang hồi phục, mộtkháng thể được đặt tên là CR3022 có thể liên

kết hiệu quả với tăng đột biến SARS-CoV-2 và là mộttácnhân điều trị tiềm năngchoCOVID-19 [9] Sau đó, các nhà khoa học từ công ty Côngnghệ sinh học Vir ỏThụy

Sĩ đã báo cáo một số mAbs được xác định từcác tế bào B bộ nhớ của một người sốngsót sau SARS năm 2003, trong đó mAb S309 vô hiệu hóa mạnh mẽ SARS-CoV-2 với giátrị IC50 =79 ng/ml Tưong tự như CR3022, S309 nhận ra một epitope chứa

glycan được dự trữ cao trong RBDnhưng không cạnh tranh vói sự gắn vào thụ thể

ACE2 ởngười, có thể được sử dụng thêm kéthợp vớicác kháng thể khác đểdự phòng

và điều trị nhiễm SARS-CoV-2 [10]

Đe có đượccác kháng thể điềutrị tiềm năng, nhiều nỗ lực đãđượcthực hiện để phân lập các kháng thể đơn dòng từ các nhóm tế bào B của những người sống sót sau

COVID- 19, và sau đó xác nhận tác dụng ức chế của chúng Vào cuối tháng 4, cácnhàkhoa họctừ Trùng Khánh, Trung Quốc đã báo cáo 2 mAbsở người từ bệnh nhân SARS-CoV-2 đã hồi phục, hai kháng thể nàyngăn chặn hiệu quả sự liên kết của RBD

với ACE2 ở người vàức chếmạnh sự lây nhiễm pseudovirus với IC50 là 0,03-0,04 Ịig/ml [11] Đáng chú ý, họ phát hiện ra rằng tất cả 26 bệnh nhân được hồi phục đãtạo ra kháng thể chống RBD, tuy nhiên, chỉ có 3 trong số 26 bệnh nhân cho thấy sự

ức chếhiệu quả sự liên kết SARS-CoV-2 RBD với hACE2 Sau đó, một nghiên cứuchung ởTrung Quốc đã sử dụng RBD tái tổ hợp của các protein SARS-CoV-2 s làm mồi nhử để phân loại các tế bào B nhớ từ các tế bào đơn nhân trong máu ngoại vi (PBMC)của một bệnh nhânCOVID-19 đã hồi phục và xác định được hai kháng thể trung hòamạnh CAI vàCB6 (0,036±0,007 pg/ml đối với nhiễm virus thực sựtrong

tế bào VERO) CB6 cũng được chứng minh là có khả năng ức chế sự lây nhiễm

SARS-CoV-2 đíchthực trên mô hình khỉ rhesus Nghiên cứu sâu hơn về cấutrúc cho

thấy CB6 cạnh tranhvới ACE2 để gắn kết epitope trên RBD, và cho thấy ái lựcliên

kết cao hơn 100 lần so với ACE2 [12, 13] Với mong muốn nghiên cứu một loại kháng thể có khả năng trung hoà SARS-CoV-2 và nhận thấy những hiệu vượt trội của kháng thể CB6, tôi quyết định thực hiện đề tài: “NGHIÊN cứu TẠOTẾ BÀO

E coỉi BIỂU HIỆNKHÁNG THỂ BÁN PHẦN CHUỖI ĐƠNCB6 KHÁNG VIRUSSARS-CoV-2”

- Tạodòng và biểu hiện thành công gene mãhóa kháng thể bán phần chuỗi đơn

CB6 khángvirus SARS-CoV-2trên tế vàoE coli.

2.2 Mục tiêu cụ thễ

- Tạo té bào vikhuẩn E coỉi biểu hiệnkháng thể bán phần chuỗi đonCB6 kháng

SARS-CoV-2

- Đánh giá sơ bộ chấtlượng sản phẩmkháng thể chuỗi đơn CB6 biểu hiện từ tế

bàoE coỉi tái tổhợp

3 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung nghiên cứu 1: Tạo dòng vector biểu hiện gen mãhóa kháng thểchuỗi

đơn CB6 kháng protein SARS-CoV-2

- Nội dung nghiên cứu 2: Biến nạp và biểu hiện hiện kháng thể chuỗi đơn CB6

kháng protein SARS-CoV-2 trên vi khuẩn E.colỉ.

- Nội dungnghiên cứu 3: Nghiên cứu điều kiện phù hợp nuôi cấy vi khuẩn E

coli sản xuất kháng thể chuỗi đơn CB6 kháng protein SARS-CoV-2

- Nội dung nghiên cứu 4: Kiểm tra và đánhgiá sơ bộ chấtlượng kháng thể chuỗi

đơn CB6 kháng protein SARS-CoV-2

4 Đối tượng, phạm vi và địa diễm nghiên cứu

- Quá trình tạo dòng và biểu hiện gen mã hóakhángthể bán phần chuỗi đơn CB6

kháng SARS-CoV-2 trên vi khuẩnE coli.

4.2 Phạm vi nghiên cứu

- Quy mô phòng thí nghiệm

4.3 Địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu đượcthực hiện tại tại Phòng R&D, Xưởng nguyên liệu của Công ty cổphần CNSH Dược Nanogen (Thành phố Hồ Chí Minh),

4.4 Thời gian thực hiện: thời gian thực hiện đề tàitừ 06/2022 -06/2023

5 Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu này tập trung phát triển kháng thể đơn dòng tái tổ hợp kháng protein SARS-CoV-2 RBD dạng bán phần chuỗi đơn Kháng thểbán phần chuỗi đơn là đơn

vịnhỏ nhấtcủaphân tử globulin miễn dịch với chức năng bám kháng nguyên Kháng

thể bán phần chuỗi đơn (single chain) lần đầu được phát hiện vào năm 1988 bởi Bird

và cộng sự [14], chuỗi bao gồm vùng biến động của chuỗi nhẹ (VL) và chuỗi nặng

(VH) của kháng thể, hai chuỗi được nối với nhau bằng cầu nối peptide (vùng giàu

glycine và serine) tạothànhmột chuỗi proteincó áilực mạnhvới kháng nguyên tương

tự với cấu trúc khángthể hoàn chỉnh Trình tự và độ dài của đoạn cầu nối tạo ra sự

khácbiệt giữa các chuỗi đơn Sự khác biệt này ảnh hưởng đến độ bền và ái lực của

các chuỗi đơn với kháng nguyên Chuỗi đơn có nhiều ưu điểm hơn so với cấu trúc kháng thể hoàn chỉnh Thứ nhất, với kích thước nhỏ khoảng ~27kDa, sc được sản

xuất với quy mô lớn bằng hệ thốngtế bào vi sinh như E coli đạtnăng suất cao hơn

và với chi phí thấp hơn so với kháng thể hoản chỉnh, thường được biểu hiện trên hệthống tế bào động vật có vú như CHO Thứ hai, trong liệu pháp miễn dịch dựa trên

kháng thể, chuỗi đơn với kích thước nhỏ dễ dàng xâm nhập vào cấu trúc khối u và

tương tác với các epitope mục tiêu, giúp tăng hiệu quả tiêu diệt tế bào khối u Tuy nhiên, việc khiếm khuyết vùng Fctrong cấu trúc, chuỗi đơn không thể kích hoạtcác

tế bào miễn dịch thông qua các hoạt tính như gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể

(ADCC), hoặc độc tế bào phụ thuộc kháng thể (CDC) Đây là một trong các nhữnggiới hạn của chuỗi đơn sử dụng trong trị liệu Ngoài ra, với cấu trúc không hoàn

chỉnh, chuỗi đơn thường kém bền và có thời gian bán hủy (T-half life) ngắn hơn so với cấu trúc kháng thể hoàn chỉnh Do vậy, để đảm bảo hiệu quả điều trị, chuỗi đơn

thường được sử dụng liên tục với liều cao

5.2 Phưong pháp nghiên cứu

Một số phương pháp được sử dụng trong đề tài như sau:

- Phương pháptạotébào vi khuẩn E coll (Top 10F’, BL21 (DE3) Sart) khả nạp

- Phương pháptách chiết plasmidtừ vi khuẩn E coỉỉ.

- Phương phápbiến nạp plasmid vào vi khuẩn bằng phương pháp hoá biến nạp.

- Phương phápthu nhận gen từ vi khuẩn

- Phương pháp PCR khuẩn lạc

- Phương pháp nuôi cấy tế bào E coli.

- Phương pháp kiểm tra biểu hiện gen khángthể chuỗi đơn CB6 trên E coỉi.

6 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN LĨNH vực NGHIÊN cứu

1.1 Tổng quan về virus SARS-CoV-2

1.1.1 Đại dịch COVID-19 và virus SARS -CoV-2

Theo cơ sở dữ liệu toàn cầu theo thời gian thực của WHO (https://covidl9.who.int/),

số lượng người mắc hội chứng viêm đường hô hap cap COVID-19 (coronavirus

disease 2019) tính đến 2:14pm CEST ngày 26/07/2022 là 566.977.818 người với6.376.503người chết Theo trang thông tin chính thức của Bộ Y tế Việt Nam

(https://ncov.moh.gov.vn/), số ca dương tính tính đến 18:00 ngày 26/07/2022 là 10.767.948, với43.092 ca tử vong Hội chứng viêm đường hô hấp cấp COVID-19 do SARS-CoV-2 gây ra, là loại virus RNA sợi đơn dương (+ssRNA), có vỏ

về mặt phân loại, virus SARS-CoV-2 thuộc họ Sarbecovirus, phân họ ortho corona

virinae vốn phân bố rộng rãi trên người vàđộng vật [15] Hạtvirus SARS-CoV-2 có

kích thước dao động từ 65-125nm chứa một chuỗi đơn RNA và có nhiều gai nhọngiốngvươngmiện (corona) SARS-CoV-2 được xácđịnh là một chủngp-coronavirushoàn toàn mới, màtrước đó được xác định là coronavirus gâyhội chứng hô hấp cấp

nghiêm trọng (severe acute respiratory syndrome coronavirus - SARS-CoV hoặcSARS-CoV-1) hoặc hội chứng hô hấp cấp Trung Đôngdocoronavirus (Middle Eastrespiratory syndrome-related coronavirus- MERS-CoV)từnggây ra các ổ dịch lớn

ở Quảng Đông, Trung Quốc và Ảrab Saudi Các nghiên cứu xác định dơi là một ổ

virus tiềmnăng khi cho bộ gene của SARS-CoV-2 giống đến 96,2% với bộ gene củachủng coronavirus trên dơi, RaTG13 [15, 16]

Cấu trúc cơ bản của SARS-CoV-2 bao gồm vỏ và vật liệu di truyền RNA đượcthể hiện như ở Hình 1.1 Bon protein chính cấu tạo nên vỏ của SARS-CoV-2 bao gồm

protein gai (spike)- glycoprotein s, protein màng nhỏ (envelope)- glycoprotein E,

protein màng - M glycoprotein, và protein tương tác với vật liệu di truyền

-nucleocapsid protein N; ngoài ra còn một so protein cấu trúckhác [17] Protein M là

protein cấu trúc chính của màng virus khiến hạt virus có hình cầu Protein E (8 -12 kDa) nằm trên vỏ virus và có vai trò chính trong việc lắp ráp và giải phóng virus

Protein N ton tại trong nucleocapsid, liên kếtvới RNAvà có vai trò liên kềt bộ gen

virus thành cấu trúc kiểu chuỗi hạt đểđóng góibộ gen thành các hạt virus hoàn chỉnh.Protein s hay glycoprotein s là một protein xuyên màng vói khối lượng phân tử

khoảng 150 kDa

Hình 1.1 Cấu trúc cơ bản của SARS-CoV-2 gâyhội chứng hô cấp cấp tính nghiêm trọng COVID-19 [18, 19]

Bộ gen của SARS-CoV-2 có độ dài khoảng 25-32 kb, có kích thước lớn nhất trong

số cácvirus RNA Các chủng SARS-CoV-2 được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm từ

chợhải sản VũHán có kích thước 29,9kb [20] Bộ gen bao gồm vùng 5’UTR, khung

đọc mở, vùng 3’ƯTR và đuôi poly-A Sau khi đượcgiải phóng vào tế bào chất của

vật chủ, vật liệu di truyền của virus (+ssRNA) sẵn sàng đế được dịch mã cấu trúc

vùng đọc mở của SARS-CoV-2 có tẳng cộng 14 vùng,mỗi vùng mã hóa cho một số

protein cả cấu trúc lẫn phi cấu trúc và đóngvai trò trong việc tồn tại và độc lực của virus [21]

Hình 1.2 Cấu trúc bộ gene của SARS-CoV-2[22]

1.1.2 Glycoprotein s và vùng bắt đặc hiệu vói thụ thể (Receptor Binding

Domain - RBD)

1.Ỉ.2.Ỉ Glycoproteins

Protein s (—150 kDa) gồm hai tiểu phần SI hình cầu ở đầu và S2 là phần đuôi, tạo

nên cấu trúc gai đặc biệttrên bề mặt của virus và có vai trò trung gian gắn vào thụthể angiotensin-converting enzyme 2 (ACE-2) trên màng tế bào vật chủ về chức

năng, protein s có hai vùng chức năng (domain) chính: (l)-tương tác và bám vào

màng tế bào chủ, (2)-xâm nhập của virus vào tế bào chủ cấu trúc gai trên bề mặt SARS-CoV-2 là dạng homotrimer của protein s gồm 3 tiểu phần protein s giống nhau; có chức năng gắn vào thụ thể ACE-2 biểu hiệntrên bềmặt của các tếbàothuộc

đường hô hấp dưới (lower respiratory tract cells) và giúp dung hợp màng virus-tế

bào Cácnghiên cứu cấu trúc củaprotein s trên SARS-CoV-2 cho thấy sự hiện diện của một vị trí cắt của protease giống furin (furin-like protease) - PRRARSỊV -trong

khi vị trí cắtnày không tồn tại trên một coronaviruskhác, RaTG13, cũng gây ra hội chứng hô hấp cấp tính được phân lập từ dơi như đã đề cập [23] SARS-CoV và MERS-CoV có các thụ thể nhận diện khác nhau Cả protein s của SARS-CoV-1 và SARS-CoV-2 sử dụng ACE2 làm thụ thểcủa chúng;protein s trên MERS-CoV dùngpeptidase 4 (DPP4) để làm thụ thể xâm nhập vào tếbào [24]

Tương tác giữa protein s và ACE-2 kích hoạt chuỗi dẫn đến sự dung hợp màng tế

bào vàmàng virus Bản thân protein s củacác chủng coronavirus có thể được li giảibởi nhiều protease như cathepsin B/L trong các bóng nội bào [25] hoặc TMPRSS2 (Transmembrane protease, serine 2 - serine proteinase xuyên màng type II) trên be

mặtmàng té bào ức ché in vitro các proteinasenày có thể ngăn cản quá trình xâmnhập của virus vào tế bào [26] Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu trên coronavirus cho

thấy TMPRSS2 có vai trò tối quan trọng trong quá trình xâm nhập của virus vào tế

bào [27, 28, 29] Protein s bị cắt tại vị trí vị trí cắt của proteasegiống furin Protein

s được cắt thành hai tiểu phần nhỏ là SI và S2: tiểu phần SI chịu trách nhiệm cho

tínhđặc hiệu loài (host) và đặc hiệu cơ quan (cellular tropism) trong khi tiểu phần S2tham giavào quá trình dung hợp của hạt virus vàotếbào chủ(Hình 1.3) [30]

S1/S2 furin cleavage site 681-PRRSR/SVA-688

Hình 1.3 cấu trúc các vùng chức năng của glycoprotein s với vị trí cắt bởi

TMPRSS2 tạo ra2 tiểu phần SI và S2 [23]

ỉ 1.2.2 Vùng bám đặc hiệu thụ thê (Receptor Binding Domain - RBD)

Tiểu phần SI chứamộtvùng chức năng (domain) cho việctư ong tác đặc hiệu với thụthể ACE-2 trên màng tế bào phổi type II của người, RBD (receptor binding domain) Bằng cách so sánh với vùng RBD của SARS-CoV-1, Wanbo T và cộng sự dựa xác

định vùng RBD trên protein s của SARS-CoV-2 nằm từ vị trí acid amine thứ 331 đến

Hình 1.4 So sánh trình tự amino acidcủa vùng bám đặc hiệu thụ thể của

SARS-CoV-1/2 và MERS-CoV [19]

Nghiên cứu gần đây cho thấy protein táitổ hợpRBD của SARS-CoV-2 liên kết mạnh

hon đáng kể vói thụ thể ACE2 của người (hACE2) và doi (bACE2) so với RBD củaSARS-CoV-1 Hằng số phân li củaphức hợp SARS-CoV-2 RBD - hACE2 có hằng

số phân li (KD) là 4,7nM, hằng số này ở phức hệ SARS-CoV-1 RBD - hACE2 là

3 InM [31] Thêm vào đó, protein tái tổ hợp RBD cóthể ngăn chặn sự xâm nhập củaSARS-CoV-2 và SARS-CoV vào các tế bào biểu hiện hACE2, cho thấy proteintáitổ

hợp có tiềm năng ức chế SARS-CoV-2 và SARS-CoV (Hình 1.5) Hơn nữa, các

khángthể đadòng đặc hiệu cho vùng RBD của SARS-CoV-1 có thể phản ứng chéo

với protein RBD của SARS-CoV-2 và trung hòa sự xâm nhập của các chủng CoV-2 [9] Kết quả này cho thấy kháng thể đặc hiệu cho vùng RBD của SARS-CoV-

SARS-2 cóthể sử dụng trong điều trị bệnh do sự xâm nhiễm virus SARS-CoV-2 ĐồngthờiRBD của cả SARS-CoV và SARS-CoV-2 là ứng cử viên tiềm năng để phát triểnvaccine phòng ngừa SARS-CoV-2

RBDtái tổ hợp; c MERS-CoV RBDtái tổ hợp

1.2 Tổng quan về kháng thề đon dòng (monoclonal antibody - mAh)

Khángthể đơn dòng (monoclonal antibody) là kháng thể được sản xuất bởi một dòng

đơn tế bào B duy nhất, đáp ứng lại với chỉ một vị trí epitope duy nhất trên kháng

nguyên Dựa vào nền tảng kỹ thuật di truyền, các thế hệ kháng thể đơn dòng tái tổ hợp (Recombinant monoclonal AntibodiesjrmAb) ra đời nhằm giảm tính sinh miễn

dịch của kháng thể dùng trong điều trị trên người Kháng thể đơn dòng tái tổ hợp

được tổng hợp in vitro thông qua quá trình lập ngân hàng gen kháng thể từ tế bào B người, khuếch đại vàtạo dòngcác gen này trên các vector phage và cuối cùng là biểu hiện các vector trển tế bào động vật hữu nhũ để thu nhận mAb [32] Các kháng thể

đơn dòng tái tổ hợp sử dụng trong liệu pháp điều trị hướng đến giảm tối đa thành

phần proteinchuột trong phân tử kháng thể [33], Hiện tại, một số thế hệ kháng thể

đơn dòng đang ứng dụng trong điều tiị bao gồm: kháng thể dơn dòng dạng khảm (chimeric), kháng thể đơn dòng nhân hóa (humanized) và kháng thể đơn dòng người

(fully human), kháng thể bán phần (Fab), kháng thể bán phần chuỗi đơn [32]

Hình 1.6Cấu trúc của các dạng kháng thể

ỉ 2.1 Kháng thể dạng khảm

Kháng thể dạng khảm là dạng đơn giản nhất của kháng thể đơn dòng nhân hóa, có cấu trúc vùng hằng định CH và CL làcủa người, trong khi đó vùng biến đổi VH và

VL là của loài khác được gây đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên mục tiêu Các

domainchuyên biệt được mãhóa bởi các exon khác nhau ở mức độ gen, sự chuyênbiệt các kháng thể nằm trong sự kết họp của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ trong các domain ởvùngbiến đổi, trong khi chức năng kích thích hệ miễn dịch được quy định

bởi cácdomain ở vùng hằng định Với khángthể khảm, các exon chuột mãhóa vùng

biến đổi và exon người mã hóavùng hằng định và sau đó tái kết hợp các phân đoạn

để tạo thànhmột gen khảm mới, tương đồng từ 75-80%so với kháng thể người Một trong những lợi thếcủacác kháng thể khảm lànó giữ nguyên tác động trên các kháng

nguyên do vủng biến đổi không bị thay thế, có thể gắn với kháng nguyên mục tiêu

Hơnthế nữa, các kháng thể khảm có tính chuyên biệt với một hapten là4-hydroxy-3

nitrophenacetyl (NP)- gắn trên bề mặttếbào, cung cấp đích tác động củakháng thể

để nghiên cứu khảnăng gây độc chotế bào [34].Tuy nhiên, dù khả năng kích thích

hệ miễn dịch của kháng thể khảm thấp hon kháng thể chuộtnhưng khi truyền vào

bệnh nhân vẫn xảy ra hiện tượng kháng thể kháng chimeric ở người (Human

anti-chimericantibodiesJHACA) [35]

1.2.2 Kháng thể nhân hóa

Kháng thể nhân hóa có cấu trúc vùng hằng định CH vàCL và vùng biến đổi VH và

VL là của người, trong vùng biến đổi có vùng xác định bổ sung CDR

(complamentarity determining fragments) là của loài khác được gây đáp ứng miễn

dịch với kháng nguyên mục tiêu Vùng biến đổi gồm có bốn vùng khungngăn cáchbỏi ba vùng CDR, vị trí gắn kháng nguyên bao gồm 6 vùng CDR (3 vùng trên chuỗi

nặng, 3 vùng trên chuỗi nhẹ) Như vậy, kháng thể nhân hoá được tạo ra bằng cách ghép vùng CDR từ các chuỗi nặng vùng V của kháng thể chuột (trực tiếp kháng

haptenNP-CAP) vào chuỗi nặng vùng V của người Do đó, cấu trúc kháng thể nhân

hóa chứa từ 90 - 95% proteintừ người Kháng thể nhân hoáưu việtso với kháng thể khảm vì protein từ chuột (có tính sinh miễn dịch) đượcgiảm xuống mức tối thiểu, từ

đó giảm đáng kể các trường hợp tạo ra kháng thể kháng thuốc ở bệnh nhân so với

kháng thể dạng khảm [35] Tuy nhiên, cấu trúc khung xung quanh CDRskhác so vói

ban đầu cóthể làm giảm khảnăng tư ongtác của kháng thểnhân hóa vớikháng nguyênmục tiêu Kháng thể nhân hoá đã được sử dụng thành công để chữatrị các bệnh nhân

u lympho và ghi nhận rất ít trường hợp phản ứng miễn dịch ở nhữngbệnh nhân này [36]

1.2.3 Kh áng th ế người

Kháng thể người là thế hệ mói nhất của kháng thể đon dòng liệu pháp vói trình tựproteinhoàn toàn của người và tính sinh miễn dịchthấp nhất.Kháng thể người có thể

được tạorabằng hai con đường khác nhau Con đường thứ nhất dựa trên kỹ thuật gọi

là “phage display” để xác định CDRs tối ưu cho việc nhận diện kháng nguyên mục tiêu Thư viện gen của CDRs từ người được chèn vào các loại phage xâm nhiễm vi khuẩn để biểu hiện CDRs Sau đó, CDRs này được sàng lọc khảnăng tưong tác với

kháng nguyên mục tiêu và lựa chọn CDRs gắn kháng nguyên tốt nhất CDRs đã chọn

được ghép lên khung protein người đểtạo kháng thể hoàn toàn từ người Đối với con

đường thứ hai, kháng thể người tạo ra dựa vào chuột chuyển gen Phương pháp này

tương tự quá trình tạo tế bào lai bất tử trong sản xuất kháng thể chuột Tuy nhiên,

chuột sử dụng để sản xuất kháng thể người được biến đổi di truyền để mang gen

kháng thể của người Quá trình tạo ra chủng chuột sản xuất kháng thể với trình tự

protein hoàn toàn từ ngườitrải qua hai bước chính là bất hoạtgen IgG chuột và chèn

các locus IgG người (bao gồm các gen mã hóa cho chuỗi nặng và chuỗi nhẹ kappa)

vào bộ gen chuột gồm 2 vùng V chưa được sắp xếp, 4 vùng D và 6 vùng J liên kết

với gen mã hóa chuỗi Ị1 của người.Do chuyển một đoạn lớn các locus, sự tái sắp xếp của các gen V, D và J tạo nên sự đa dạng của kháng thể Ngoài ra,các locus này cũngchứa các yếu tố điều hòa để kiểm soát sự biểu hiện, quá trình chuyển lớp và trưởng

thành ái lực của kháng thể Tebào Btừ dòng chuột này tiết ra kháng thể chứachuỗi

p.Chuột mang toàn bộ locus Ig của người tạo ra để tối đa hóa số lượng có sẵn sự kếthợp V-D-J vàV-J của các gen chuỗi nặng và nhẹ tươngứng Cách tiếp cận này chorằng tế bào B của chuột có khả năng điều hoà sự biểu hiện gen ỉg người Sự đồng

biểu hiện của gen ỉg ngoại sinh của người và nội sinh của chuột cũng là một vấn đề, nhưng những các vị trí này có thể bị bất hoạtbởi sự đột biến trên các mục tiêu định

sẵn gây chết qua tái tổ hợptương đồng

1.2.4 Kháng thể bản phần cấu trúc Fab

Kháng thểbán phần Fab chỉ gồm phần bám kháng nguyên (Fab) của kháng thể, gồm

một chuỗi nhẹ kháng thể (vùng VL và CL) nối chuỗi nặng kháng thể (vùng VH và

CHI)thông qua đầu nối disulfide Kháng thể bán phần Fab thường là dạngđơn phân (monovalent) có ái lực mạnh với kháng nguyên, tương đương so với kháng thể hoàn chỉnh Kháng thể bán phần Fab có nhiều điểm tương đồng với kháng thể bán phần chuỗi đơn So với cấu trúc kháng thể hoàn chỉnh, kháng thể bán phần Fab có kíchthướcnhỏ (khoảng ~50kDa), thuận lợi cho việc xâm nhậpvào cấu trúc mô Ngoài ra, cấu trúc kháng thể bán phần Fab không chứa vùng Fc, sẽ hạn chế sự kích hoạt hệthống miễn dịch tế bào, đồng thời làm giảm tính sinh miễn dịch Tuy nhiên, kháng

thể bán phần Fab có độ bền và thời gian bán thải thấp hơn so với kháng thể hoàn

chỉnh, nhưngcao hơn so với khángthể bán phần chuỗi đơn Ngoài ra, kháng thể bán

phần F(ab’)2 gồm 2 mảnh Fabliên kết với nhau, có khối lượngphân tử khoảng ~110

kDa kháng thể bán phần F(ab’)2 có cấu trúc tương đồng với kháng thể hơn so với

kháng thể bán phần Fab Tuy nhiên, kháng thể bán phần F(ab’)2 có kích thước lớn

làm giảm khảnăng xâm nhập vào cấu trúc mô so với kháng thể bán phần (Fab) [36,37,38]

1.2.5 Kháng thế bán phần chuôi đơn

Kháng thểbán phần chuỗi đơn (single chain là đơn vị nhỏnhất của phân tử globulinmiễn dịch với chức năng bám kháng nguyên Kháng thể bán phần chuỗi đơn lần đầu được phát hiện vào năm 1988 bởi Bird và cộng sự, chuỗi bao gồm vùng biến động

của chuỗi nhẹ (VL) và chuỗi nặng (VH) củakháng thể, hai chuỗi được nối với nhau

bằng cầu nối peptide (vùng giàu glycine và serine) tạo thành một chuỗi protein có ái lực mạnh với kháng nguyên tương tự với cấu trúc khángthể hoàn chỉnh [37] Trình

tự và độdài của đoạn cầu nối tạo rasự khác biệt giữa các chuỗiđơn Sự khác biệt nàyảnh hưởng đến độ bền của sc và ái lựccủa sc với kháng nguyên [36, 39] Chuỗi đơn

có nhiều ưu điểm hơn so với cấu trúc kháng thểhoàn chỉnh Thứ nhất, với kích thướcnhỏ khoảng~27kDa, chuỗi đơn được sản xuất với quy mô lớn bằng hệ thống tế bào

vi sinh nhưE coỉi. đạt năng suất cao hơn và với chi phí thấp hơn so với kháng thể

hoản chỉnh, thường được biểu hiện trên hệ thống tế bào động vật có vú như CHO

Thứ ba, trong liệu pháp miễn dịch dựa trêm kháng thể, sc với kích thướcnhỏdễdàng

xâm nhập vào cấu trúc khối u và tương tác với các epitope mục tiêu, giúp tăng hiệu

quả tiêu diệt tế bào khối u Tuy nhiên, việc khiếm khuyết vùng Fc trong cấu trúc,

chuỗi đơn không thể kích hoạt các té bào miễn dịch thông qua các hoạt tínhnhưgây

độctế bào phụ thuộc kháng thể(ADCC), hoặc độctếbàophụ thuộc kháng thể (CDC)

[40] Đây là một trong các nhữnggiớihạn của chuỗi đơn sử dụng trongtrị liệu Ngoài

ra,vớicấu trúc không hoàn chỉnh, chuỗi đơnthường kém bền và có thời gian bán hủy (T-halflife) ngắn hơn so với cấu trúc kháng thể hoàn chỉnh Do vậy, để đảm bảohiệu

quả điều trị, chuỗi đơnthường được sử dụng liên tục với liều cao Đểcải thiện độ bền

cũng nhưthời gian bãn ra, albumin hoặc polyethylen glycol (PEG) được sử dụng đểtạo phức hợp với chuỗi đơn Tuy nhiên, phương pháp này có thể làm gia tăng kíchthước và chi phí sản xuất chuỗi đơn sovới ban đầu Một số phân tử chuỗi đơn trong

giaiđoạn thử nghiệmlâm sàng,bao gồm các thuốcgancotamab (Merrimack Pharma),pexelizumab (Alexion)và brolucizumab (Novartis) [37, 38]

Hình 1.7 Cấu trúc kháng thể bán phần [41, 42]

1.3 Biểu hiện protein tái tỗ hợp dạng thể vùi trong tế bào vi khuẩn E colì 1.3.1 ưu điểm biểu hiện protein tái tể hợp trong vì khuẩn E coli

Từ những ngày đầu tiên phát triển của kỹ thuật DNA tái tổ hợp, các hệ thống biểu

hiện protein tái tổ hợp ở vi khuẩn đặc biệt làE coỉi đã đóng một vai trò hétsức quan

trọngvới những lý do sau:

- Bộ gen của E coli có kích thước tương đối nhỏ được mã hóa hoàn toàn và các

thông tin di truyền được nắm rõ

- Nhiều hệ thống vector biểu hiện đã được thiết kế phù hợp cho E coỉi biểu hiệnprotein ngoại lai trong tế bào chất haytiết rangoài môi trường

- E coỉi có thểnuôi cấy dễ dàng và đạt mật độ cao nhanh chóng trên cơ chất rẻ tiền, thường sử dụng nguồn cacbon làglucose

- E coỉi có thể tạo racác protein ngoại lai với sản lượng cao, từ 10-30%tổng số

protein của tế bào

Các hợpchấtsinhdược đầu tiên bao gồm insulin người tái tổ hợp,hormontăng trưởng người tái tổ hợp có mặt trên thị trường vào những năm đầu thậpniên 80 đã mang lại

mộtsự cải tiến vượtbậc về khảnăng sử dụng, chất lượng và an toàn so với các sản phẳmđược ly tríchtừ mô trước đây Cho đến ngày nay đãcó rấtnhiều hợpchấtđượcsản xuấtbằng các hệ thống khác nhau nhằm mục tiêu sản xuất lượng lón protein tái

tổ hợp dùng trong điều trị bệnh, trong đó nhiều hệ thống cải tiến vẫn đang được

nghiên cứu và pháttriển [43, 44]

1.3.2 Nhược điếm của tế bào E coli trong công nghệ sản xuất protein tái to hợp

- Tự động sản xuất protein quá mức: tếbàoE coli có khảnăng sản xuấtranhiều

loại protein khác nhau, bao gồm nội độc tố (LPS) và protein chaperone như DnaK và GroEL Điều này có thể dẫn tới protein mục tiêu bị nhiễm tạp từ đó

làm tăng mức độ phức tạp trong quátrình tinh chế

- Khả năng gấp cuộn không chính xác: E coli thường không thể đảm bảo khả

năng gấp cuộn chính xác của một so protein phức tạp hoặc những protein yêu

cầu môi trường oxy hóa cao thích hợp để gấp cuộn Điều này đặc biệt quan trọngvới các phức hợp proteintừ sinh vật nhân chuẩn hoặc những protein cần sửađổisau dịch mã

- Nguy cơ sản xuất quá mức các protein không cần thiết: tế bào E. coỉi đôi khi cóthểtạo ra quá nhiều protein khôngcần thiết hoặc sản xuất quá mức protein mục tiêu, dẫn đến lãng phí năng lượng,thời gian và tài nguyên

- Tối ưu hóa phức tạp: tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy E coỉiđể sảnxuất protein

cóthểtốnnhiều thời gian và công sức Nó có thểyêu cầu nhiềubước thử nghiệm

và cải tiến để đạt được hiệu suất và chất lượng sản phẩm tốt nhất

Bấtchấp nhữngnhược điểm này,E coll vẫn được sử dụng rộng rãi trong sản xuất

protein tái tổ hợp do hiệu quả sản xuất cao vàchi phí thấp Tuy nhiên, tùy thuộc vào

mục tiêu sản xuất và protein cụ thể, các hệthống khác như nấm men, tếbào động vật

có vú hoặc tếbàothực vậtcó thể cần được xem xét để khắc phục những hạn chế này

[45, 38],

1.3.3 Sự hình thành thể vùi trong tế bào chất E coli

Trong vi khuẩn E coỉi, protein tái tổ hợp thường biểu hiện dạng thể vùi (inclusionbody) không tan trong tế bàochất Thể vùiđược hình thành do tốcđộtổnghợp protein cao, cácphân tử protein mói được tạo ra không kịp tự gấp cuộn màkếttụ lại vói nhau quatưong tác kị nước thành mộtthựcthểkhôngtan trong tế bàochất Việc hình thành

thể vùi thường xảy ra khi một protein được biểu hiện vượt mức (over-expression) trong tế bào Do đó việc kiểm soát hợp lý tốc độ tăng trưởng, nhiệt độ nuôi cấy, hay

tốc độ trao đổi chất của tế bào chủ có ảnh hưởng phần nào đến đặc tính của protein tái tổ hợp trong tế bào chất, có thể dẫn đến sự hình thành thể vùi hay không Ngoài

ra việc đồng biểu hiện (co-expression) protein tái tổ hợp với các chaperone phân tử

cũng giúp giới hạn việchìnhthành thể vùi [45, 46, 47]

1.3.4 Chủng E coli, hệ thong vector và cơ chế kiểm soát được dùng trong biểu

hiện protein CB6

1.3.4.1 Chủng vi khuân E coli BL21 (DE3)

Hệ thống biểu hiện E coỉi là hệ thống đầu tiên và đượcsử dụng phổ biến nhấttrong

công nghiệp sản xuất protein tái tổ hợp với nhiều ưu điểm vượt trội như điều kiện

nuôi cấy dễ dàng, thời gian phát triển nhanh chóng, thu hồi protein tái tổ hợp đongiản Ngoài ra, về mặt thưong mại E coỉi đã đượccông nhận là an toàn và là một phưongtiện khả thi về mặt kinh tế để sản xuất protein tái tổ hợp Trong đó, E coli

BL21 được xem là chủng té bào lý tưởng để biểu hiện protein ởquy mô sản xuất E coỉi BL21 (DE3) là biển chủngcuaE colivói2 đột biển khuyếtgen mãhóaprotease

Lon và OmpT nhằm tăng tính ổn định của protein ngoại lai được đưavàoE1 coỉi [48].Ngoài ra, trên bộ gen của chủng nàyđược chèn đoạn gen mãhóa T7 polymerase giúp biểu hiện một cách đơn giản và hiệu quả các gen được kiểm soátbởi promoter T7

BL21 (DE3) có một ưu điểm khác là có khảnăng biểu hiện gen mục tiêu mà không

cần bổ sungcác chấtcảm ứng(leakyexpression) [16, 49]

Hình 1.8 Cấu trúc vector pNANOGEN

1.3.5 Tách chiết và tinh sạch plasmid

Hiệu quả chuyển gen vàcác thao tác tạo dòngtrên gen bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu

tố trong đó bao gồm cả chất lượng plasmid sau khi tách chiết và tinh sạch Hầu hết

các phưong pháp tách chiết DNA plasmid truyền thống dựa trên cấu trúc dạng vòng

tự nhiên của plasmid và khả năng chịu được các điều kiện gây biến tính DNA CácDNA bị biến tính sẽ gắn lên cellulose nitrate, trongkhi các DNA mạch đôi vẫn nằm

lại trong dung dịch Đặc tính này được sử dụng để tách plasmid DNA sau khi biến

tính dịch lygiải tế bàobằngnhiệt hoặc alkali.Ly tâm dịch lygiải tếbàochứa plasmid trong điều kiện alkaline sucrose theo gradient được sử dụng để tinh sạch DNA plasmid [50] Tuynhiên,hầu hết các phưong pháp nàysẽ mất nhiều thời gian và nguy

cơ nhiễm các hóachất sử dụng trong quá trình tách chiết Do đó, nhiềunhà sản xuất

đã phát triển các bộ kit tách chiết với mục đích thu được lượng lớn DNA plasmid

trong thời gian ngắn và plasmid có độ tinh sạch caohon

ỉ 3.6 Biến nạp và chọn lọc tế bào biếu hiện gen mục tiêu

Hầu hét vi khuẩn có khả năng hấp thụ DNAtừmôitrường trong quá trìnhsinh trưởng

Thôngthườngphân tử DNA được hấpthu bằng con đường này sẽ bị giảm chấtlượng,

nhưngnó vẫn có khảnăng tồn tại và nhân đôi trong tế bào chủ nếu phân tử DNA là

một plasmid với vùng khởi động sao chép (ori) được nhận diện bởi tế bào chủ

Hầu hếtchủng vi khuẩn, bao gồm E COỈL chỉ có thể hấp thụ một số lượng DNA giói

hạn dưới điều kiện bình thường Đe giúp tăng hiệu quả biến nạp, vi khuẩn phải trải qua một vài dạng tác động vật lý hay hóa học giúp chúng tăng cường khả năng hấpthu DNA Tebào đã trải quaquá trình đó đượcgọi là “khả nạp” [50]

1.3.7 Tạo tế bào khả nạp và biến nạp plasmid vào vi khuấn E coli

Với nhiều đột phá trongcông nghệ tái tổ hợp DNA, để có những bước pháttriển lớn

trong biến nạp nhưhiện nayxảy ra vào đầu thập niên 70, khi các tế bàoE coỉi đượcquan sát sau khi ngâm trong dung dịch muối và đông lạnh sẽ có khả năng hấp thụDNA cao hơn so với tế bào không ngâm Nồng độ 50mM CaCỈ2 theo truyền thống

được sử dụng, mặc dù các muối khác, đặc biệt là rubidium clorua, cũng có hiệu quả

CaCỈ2 có thể là nguyên nhân khiến cho DNA bám lên phíangoài của tếbào, hoặc cóthể là muối đóng vai trò là một thứ giúpthay đổi màng tếbàotăng khảnăng bám củaDNA Trong bất kì trường hợp nào, ngâm trong CaCỈ2 chỉ ảnh hưởng đến việc bámDNA, chứ không ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng hấp thụ của tế bào Khi DNA được thêm vào tếbào, DNA vẫn còn ngâm bên ngoài tếbào, vàkhông được chuyểnvàotếbàochất (Hình 1.9) Thời điểm nâng cao nhiệtđộ lên 42°ccũng chhính làthời

điểm di chuyển của DNA vàotế bào khảnạp [50]

Vi khuẩn binh thường

Hình 1.9 Quá trinh,gắnvà hấp thu DNA bởivi khuẩn khả nạp

1.3.8 Chọn lọc tế bào biến nạp

Quá trình biến nạp của tế bào khả nạp là một quá trình không hiệu quả, mặc cho tế

bào được chuẩn bị cẩn thận như thế nào Mặc dù 1 ng plasmidvectorpUC8 có thểcónăng suất 1000- 10.000 thể biếnnạp, điều nàythể hiệnkhả nănghấpthu DNA chỉ là 0,01% trong số tất cả plasmid Xa hon nữa, 10.000 thể biến nạp chỉ là một tỉ lệ rất nhỏ của tổng số tế bào hiện diện trong môi trường khảnạp Với thực tếnhư vậy, cần

phải cómột cách nào đó để phân biệttế bào đã hấp thụ plasmidtừ nhiều ngàn tếbào không được biến nạp

Sự hấpthu và duy trìổn định của một plasmid thường đượcpháthiện bằng cách quan

sát sựbiểu hiệncủa các gen được mang bởi plasmid Ví dụ, các tế bào E coỉi thường

nhạy cảm vớitác dụng ức chế tăng trưởng của kháng sinhAmpicillinvà Tetracycline.Sau một thí nghiệm biến đổi vói pBR322, chỉ những vi khuẩn E. coỉi đã hấp thụplasmid là ampR/tetR và có thể tạo thành khuẩnlạc trên môi trường thạch có chứa

ampicillin hoặctetracycline các chất không biến đổi,vẫn là ampS tets, không tạora

cáckhuẩn lạctrên môi trường chọn lọc Do đó, chấtbiến đổivà chấtkhông biến đổi

dễ dàng được phânbiệt [51, 52, 53],

1.3.9 Nuôi cấy vi khuẩn E coli

Thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy đóng vai trò quan trọng trong việc biểu

hiện protein mục tiêu một cách hiệu quả Môi trường nuôi cay là các cơ chất dinhdưỡng được pha chế nhântạo nhamđáp ứng cho yêu cầu sinh trưởng, phát triển, sản

sinh các sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật vàphù hợp với phương pháp lên men

vàsản phẩmmục tiêu Môi trườngdinh dưỡng làyếu tố quantrọng trong công nghiệp lên men, công nghiệp sinh tổng hợp nhờ vi sinh vật Việc nghiên cứu hoàn thiện tạo

ramôi trường nuôi cấy phù hợp với nuôi cấy dòng E coỉimang gen biểu hiện chuỗi

đơn CB6 đóng vai trò quan trọngtrong quá trình biểu hiện gen mục tiêu

Môi trường LB (Luria broth) là môi trườngdễpha chế và được sử dụng phổ biếnnhất trong nuôi cấy E coli. Trong môi trường LB, caonấm men là nguồn nito thiết yếu cho vi khuẩn bên cạnh peptides và acid amin Ngoài ra, cao nấm men còn chứa các

loại base nitơ purine, pyrimidine, carbohydrate, các vitamin tan trong nước thuộcnhóm B Glucose được xem như là nguồn carbon chủ yếu Muối natri clorua giúp cânbằng áp suất thẩm thấu của tébào Hầu hét các môi trường cho nuôi cấy biểu hiện E coỉi đều chứa các thànhphần nàynhưng được thay đổi tỉ lệcủa chúng để tối ưu cho

sự tăng trưởng tế bào và năng suất sản xuất protein Có nhiều loại môi trường khácnhau đã đượcnghiên cứu tối ưu hóa nhằm tăng tốc độ tăng trưởng và hiệu quả sản

xuất protein như LB, TB và M9 Môi trường LB bao gồm bactotryptone cung cấp

peptide, peptone,acid amin thiếtyếu; caonấm men cung cap vitamin, các yếu tố vi

lượng; natri clorua Môi trường TB được xây dựng làm tăng khả năng tan và năng suất của protein Môi trường M9 hay môitrường tối thiểu chứa các nguồn dinhdưỡng

thiết yếu cho tếbào vi khuẩn sinh trưởng [54, 38, 55]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1 Vật liệu nghiên cứu

21.1 Chủng vi sinh vật

- Chủng chủ E coỉi TOP10F’ [{laclq TnlO (TetR)} mcrA A(mrr-hsdRMS-

mcrBC) <D801acZAM15 AlacX74 recAl araD139 A(ara-leu)7697 gaiu galK rpsL endAl nupG] được dùng để dòng hóa các gen và tạo vector tái tổ hợp

(Invitrogen, Hoa Kỳ)

- Chủng chủ E coỉi BL21(DE3) Star [F-ompT hsdSB(rB-, mB-) gal dcm mel31

(DE3)] dùng để biểu hiện gen trong vector pNANOGEN

27.2 Vector pNANOGEN

Vector pNANOGEN đượcthiết kế tại Công ty cổ phần Công nghệ Sinh học Dược

Nanogen và gửi đi tổng hợp tại Genscript (Hoa Kỳ), sử dụng làm vector dòng hoá và biểu hiện protein, có kích thước5360 bp bao gồm trình tự sao chép ori, fl (+) origin,

genkháng kanamycine,trìnhtự promoter T7 lac được cảm ứng bằng IPTG, gen laclq,

vùng MCS

2.1.3 Gen kháng thể bán phần chuỗi đơn CB6 sử dụng làm khuôn

Trình tự acid amin củaprotein mãhoá kháng thể bán phần chuỗi đon CB6tham khảo

từ ngân hàng gen NCBI (ACCESSION QJU69681 REGION: l ỉỉ4aa và ACCESSION 7C0Ỉ-CREGION: Ỉ 119aa\ được công ty CP CNSH Dược Nanogen thiết ké phù hợp vói việc biểu hiện trong vi khuẩn E.coỉi và gửi đi tổng hợp tại Genscript Biotechvới cácđặc điểm sau: thiết kếmộtgen tổnghợp được dùng đểbiểu

hiện protein củaEukaryote mangcác codon “ưa thích” ởprokaryote; có trình tựnhận biết bởi enzymeNdeL HindlII lần lượt ở vị trí trước codon methionin và sau codon

kếtthúcdịch mã để dòng hóa gen vào các vector biểu hiện Gen mãhóaprotein CB6

tổng hợp được lưu trữ trong plasmid pƯC57 và đặttên là PƯC57-CB6 Plasmid này được cung cấp bởi công ty GenscriptBiotech và được sử dụng như khuôn để thu nhận

gen và phục vụ cho nghiên cứu protein CB6

2.1.4 Các mồi dùng trong giải trình tự

Trong luận văn này sử dụngcặp mồiT7 provà T7 ter(Novagen) để giải trình tự.Bảng 2.1 Các mồi dùng trong giải trình tự gen

Tên mồi Trình tự các nucleotide theo chiều 5 ’ —> 3’

Mồi xuôi T7 pro TAATACGACTCACTATAGGG

2.2 Hoá chất nghiên cứu

2.2.1 Hóa chất dùng trong nuôi cấy vi khuẩn

Bảng 2.2 Hoá chất dùng trong nuôi cấy vi khuẩn

Yeast extract Himedia (Ân Độ)

2.2.2 Hóa chất dùng trong xác định kích thước protein và bán định lượng -

Thang spectramulticolorbroadrange MBI Fermentas (Hoa Kỳ)

Tris(hydroxymethyl)amonimethane Merck(Đức)