Nghiên cứu quy trình đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của peptide phe pro 5thp leu(oh) có nguồn gốc từ loài ếch litoria rubella bằng thực nghiệm bắt gốc tự do hydroxyl, abts và frap

TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu quy trình đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của peptide Phe - Pro - 5htp - Leu - OH có nguồn gốc từ loài ếch litoria rubella bằng thựcnghiệm bắt gốc tự do Hydroxyl,

BỘ CÔNG THƯƠNG

NGHIÊN cứư QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHÔNG OXI HÓA CỦA PEPTIDE PHE - PRO - 5HTP - LEU(OH) CÓ NGUỒN GÔC TỪ LOÀI ÉCH LITORIA RUBELLA BẰNG THựC NGHIỆM BẮT GÔC Tự DO HYDROXYL, ABTS

Công trình được hoàn thành tại phòng D14 phân tíchthí nghiệm trường Đại Học Công Nghiệp thành phố Hồ Chí Minh.

Người hướng dẫn khoa học: TS TrầnThị Thanh Nhã

Luận văn thạc sĩđược bảovệ tại Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn thạc sĩ Trường Đại

học Công nghiệp thành phố HồChí Minhngày 07 tháng 10 năm 2023

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1 GS.TS Lê Văn Tán -Chủ tịch Hội đồng

2 PGS.TS Trần Quang Hiếu - Phản biện 1

3 PGS.TS Trần Văn Mẩn - Phản biện 2

4 TS Nguyễn Quốc Thắng - ủy viên

5 TS Bùi Thị Thu Thủy - Thư ký

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)

CHỦ TỊCH HỘI ĐÒNG TRƯỞNG KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

BỘ CÔNG THƯƠNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

THÀNH PHỔ HỒ CHÍ MINH

Họ tên học viên: Nguyễn Bảo Hưng MSHV: 20000381

Ngày, tháng, năm sinh: 01/03/1989 Nơi sinh: ĐồngNai

Ngành: Hoáphân tích Mã ngành: 8440118

I TÊN ĐỀ TÀI:

Nghiên cứu quy trình đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của peptide Phe - Pro - 5htp

- Leu - OH có nguồn gốc từ loài ếch litoria rubella bằng thựcnghiệm bắt gốc tự do

Hydroxyl, ABTS và FRAP

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

(1) Khảo sát quy trình bắt gốc tự do Hydroxyl, ABTSvà khử sat (FRAP) của peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH bằng phương pháp quang phổ UV-Vis, đápứng đầy đủ cácthông số thẩm định theo TCVN ISO 17025:2017

(2) Nghiên cứu quy trình đánh giá khả năng chống oxy hóa bằng thực nghiệm cho

thấy khả năng bắt gốc tự do Hydroxyl, khả năng tương tác gốc tự do ABTS và khử sắt tronghuyết tương Frapcủa peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH Những khảo sát nàybước đầu cho việc nghiên cứu các peptidecó khả năng chống oxy hoá để bảo quảnthực phẩm và pháttriển y học

II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ:

III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:

IV NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TrầnThị Thanh Nhã

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 20 23

NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM Bộ MÔN ĐÀO TẠO

TRƯỞNG KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

(Họ tên và chữ ký)

LỜI CẢM ƠN

Luận văn Thạc sĩ ngành Hóa phân tích với đề tài “Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của peptide Phe - Pro - 5htp - Leu - OH bằngthựcnghiệm bắt gốc tự do Hydroxyl, ABTS và khử sat FRAP” là một quá trình cố gắng, nỗlực không ngừng của bản thân

cộng vói sự giúp đỡ, khích lệ củacác quý Thầy Cô, bạn bè vàngười thân trong gia

đình trong suốtquá trình nghiên cứu và học tập tại trường

Tôi xin chân thành cảm ơn đối với TS Trần Thị ThanhNhã đã trực tiếp hướngdẫn

tôi thực hiện đề tài và đã hướng dẫn tôi tận tình trong suốtquá trình

Tôi chân thành cảm ơn ban giám hiệu nhà trường cùng toàn thể quý thầy cô khoa Công Nghệ Hóacủa trường Đại Học CôngNghiệp Tp Hồ Chí Minh đãtạo điều kiệnthuận lợi cho tôi học tập vàthựcnghiệm tại trường

Tôi xin được gửi lời cảm ơn các thầycô viện đào tạo quốc tế và Sau Đại Học đãhỗtrợ, hướng dẫn tôi rấtnhiều khi học tại trường

LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên là: Nguyễn Bảo Hưng, học viên cao học chuyên ngành Hóa Phân tích, lớp

CHHOPTIOA, Trường Đại học Công nghiệpThành phố Hồ Chí Minh

Tôi cam đoan những kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là công trình của tôi với sự hướng dẫn của giảng viên hướng dẫn của TS Trần Thị Thanh Nhã,

Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh

Những kết quả nghiên cứu của các tác giả khác được sử dụng trong luận văn đều cótrích dẫn đầy đủ

Học viên (Chữ ký)

Nguyễn Bảo Hung

TÓM TẮT

Êch cây đỏ Litoria rubella từ úc đã đượcnghiên cứu trong vài thập kỷ chothấy cáctuyến trên da lưng của chúng tiết ra một so peptide nhỏ chứatrình tự Pro-Trp, được

gọi làpeptide tryptophyỉỉin L. Peptide Phe - Pro- Trp - Leu(NH2) được nghiên cứu

và chothấy khả năng là một phần của chất chống oxy hóa trên da giúp ếch đối phó với sự thay đổi mạnh mẽ về mức độ tiếp xúc với oxy và độ ẩm, khi chúng sống trênmộtkhu vực rộng lớn củaúc với sự thay đổi khí hậu rộng rãi Mặc dù các peptidetừnhiều chi ếch ức đã được báo cáo là có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau, nhưng

các hoạt tính sinh học của họ peptide này vẫn chưa được khám phá Trong nghiên

cứu này, peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH một peptide khác có nguồn gốc từ loài ếch

trên có một đặc điểm đặc biệt là sự thay thế tryptophan bởi 5-hydroxytryptophan(5HTP) 5-hydroxytryptophanlà một amino acid chuyển hóa của tryptophan đãđược

nghiên cứu và cho thấy khảnăng chốngoxi hóa cao khi đứng riêng rẽ Vì vậy, để xác

định khảnăng chống oxy hóa toàn diện của peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH, peptide

này đã được tổng hợp và đánh giá khả năng bắt gốc tự do OH', ABTS + và khử sắt

(FRAP) Các thử nghiệm chỉ rarangpeptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH có khảnăng bắt gốc tự do Hydroxyl và cũng thể hiện khảnăng chống oxi hóa qua hai thử nghiệm đó

là bat gốc ABTS + và khử sat FRAP Điều này góp phần cho việc khám phá cácpeptide mới ứngdụng cho pháttriển y học và bảo quản thực phẩm

The red tree frog Litoriarubella from Australiahas been studied for several decades

showing that their dorsal skin glands secrete a numberof small peptides containinga Pro-Trp sequence, known as tryptophylỉin L peptides, Phe - Pro - Trp - Leu(NH2)

peptide was studied and shown tobe part of a skin antioxidant that helps frogs cope

with drastic changes in oxygen and moisture exposure, as they live over a large area

of Australia with extensive climate variability Although peptides from several Australian frog genera have been reported to have a wide range of biologicalactivities, the bioactivities of this peptide family have yet to be uncovered Phe-Pro-

5HTP-Leu-OH peptide, another peptide produced from the aforementioned frog

species, is distinguished in this study by the substitution of tryptophan by 5-

hydroxytryptophan (5HTP) 5-hydroxytryptophan is a tryptophan amino acidmetabolite that has been examined and demonstrated to have a strong antioxidant

capability on its own To establish the overall antioxidant capability ofthe Phe-Pro-

5HTP-Leu-OH peptide, it was produced and tested for OH, ABTS+ free radical

scavenging, and iron reduction (FRAP) ABTS+radical scavenging and FRAP iron

reduction tests reveal that the Phe-Pro-5HTP-Leu-OH peptide can scavengeHydroxyl free radicals and exhibitsantioxidantactivity Thisaids in the discoveryofnovel peptides for medical applications

MỤC LỤC

ABSTRACT iv

MỤC LỤC V DANH MỤC HÌNH ẢNH ix

DANH MỤC BẢNG BIỂU xi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xii

MỞ ĐẤU 1

1 Đặtvấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Đốitượng và nhiệm vụ nghiên cứu 2

4 Ýnghĩa của đề tài 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ LĨNHvực NGHIÊN CƯU 5

1.1 Peptide 5

1.1.1 Phân loại peptide: 6

1.1.2 Danh pháp peptide: 7

1.1.3 ứngdụng của peptide cóhoạt tínhchống oxihóa 7

1.2 Gốctự dovà chấtchống oxy hóa 8

1.2.1 Gốc tự do 8

1.2.2 Ảnh hưởng của gốc tự do đối với co thể sinh vật 9

1.2.3 Cơ chế hoạt độngcủa chấtchống oxy hóa 10

1.2.4 Peptidechống oxy hóa nội sinh (GSH) và khảnăngchống oxy hóatương đương Trolox(TEAC) 11

1.3 Tổng quan về peptide Phe - Pro- 5HTP- Leu - OH 13

1.3.1 Giới thiệu về ếch Litoria rubella 13

1.3.2 Tổng quan về peptide tryptophyllin L tổng hợptừ da của ếch Litoriarubella 16 1.3.3 Tổng quan về peptide Phe - Pro - 5HTP- Leu - OH 18

1.4 Các phương pháp đánh giá hoạttính chống oxy hóa 19

1.4.1 Phương pháp khử sắt FRAP 20

1.4.2 Phương pháp bắt gốc ABTS+ 20

1.4.3 Phương pháp bat gốc Hydroxyl 20

1.5 Phương pháp phân tích ƯV-Vis 21

1.5.1 Nguyên tắc và cơ sở định lượng 21

1.5.2 Trangbị và sơ đồ khối của một máy UV-VIS 22

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 23

2.1 Nội dung nghiên cứu 23

2.1.1 Phương pháp khử sắt trong huyết tươngFRAPcủa peptide 23

2.1.2 Phương pháp bắt gốc tự doABTS của peptide 25

2.1.3 Phương pháp bắt gốc tự do Hydroxyl của peptide 27

2.1.4 Đánh giáphương pháp phân tích 29

2.2 Khảo sát các thông số tối ưu của phương pháp FRAP 30

2.2.1 Khảo sát phổ hấpthu tối ưu của phương pháp FRAP 30

2.2.2 Khảo sátthể tích hỗn hợp thuốc thử FRAPtrong phương pháp FRAP 31

2.2.3 Xây dựng đường chuẩn của phương pháp FRAP 31

2.3 Nghiên cứu khảnăng khử sắt của peptide theo phương pháp FRAP 32

2.3.1 Khảo sát khảnăng khử sắtcủapeptidetheonồng độtrongphương pháp FRAP 32 2.3.2 Khảo sát điểm kếtthúc của phản ứng trong phương pháp FRAP 33

2.3.3 Phân tích mẫu trong phương pháp FRAP 33

2.4 Khảo sát các thông số tối ưu của phương phápABTS 34

2.4.1 Khảo sát phổ hấpthu tối ưu của phương pháp ABTS 34

2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của thể tích hỗn hợp thuốc thử ABTS 35

2.4.3 Xây dựng đường chuẩn trolox trong phương pháp ABTS 36

2.5 Nghiêncứu khả năng bắt gốc tự doABTS củaPeptidetheophươngpháp ABTS ? .36 2.5.1 Khảo sát khả năng bắt gốc tự do của peptide theo nồng độ trong phương pháp ABTS 36

2.5.2 Khảo sát điểm kếtthúc của phản ứng trong phương pháp ABTS.37 2.5.3 Phân tích mẫu của phương phápABTS 38 2.6 Khảo sát các thông số bắt gốc tự do HYDROXYL 39

2.6.1 Khảo sát phổ hấpthu tối ưu của phương pháp HYDROXYL 39

2.6.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Deoxyrebose trong phương pháp HYDROXYL 39

2.6.3 Khảo sátảnh hưởng của pHtrong phương pháp HYDROXYL 40

2.6.4 Khảo sát tỷ lệ hỗn hợp phản ứng sinh ra gốc tự do HYDROXYL trong phương pháp HYDROXYL 41

2.6.5 Khảosátthời gian ủ củahỗn hợp phản ứng sinh ragốctự do HYDROXYLtrong phương pháp HYDROXYL 41

2.6.6 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ của quá trình phản ứng sinh ra gốc tự do HYDROXYL trong phương pháp HYDROXYL ? 42

2.6.7 Khảo sát thời gian bền màu của phương pháp HYDROXYL 43

2.6.8 Nghiên cứu khảnăng bắt gốc tự do của Peptidetheo phương phápHYDROXYL ? 44

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

3.1 Kết quả khảo sát các thông số tối ưu của phương pháp FRAP 45

3.1.1 Két quả khảo sát phổ hấp thu tối ưu củaphương pháp FRAP 45

3.1.2 Ket quả khảo sát tỉ lệ hỗn hợp thuốc thửFRAP trong phương pháp FRAP 45

3.1.3 Kết quả xâydựng đường chuẩn của phương pháp FRAP 46

3.2 Ket quả nghiên cứu khả năng khử sắt của peptide đã được tối ưu của phương pháp FRAP 47

3.2.1 Kết quả khảo sát khảnăng khử sắtcủa peptide theo nồng độ của phương pháp FRAP 47

3.2.2 Kết quả khảo sát điểm kétthúc củaphản ứng của phương pháp FRAP 48

3.2.3 Ket quả phân tích mẫu của phươngpháp FRAP 49

3.3 Ket quả khảo sát các thông số tối ưu của phương pháp ABTS 50

3.3.1 Kết quả khảo sát phổhấp thu tối ưu củaphương pháp ABTS 50

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng củatỉ lệ hỗn hợp thuốc thử ABTS trong phương pháp ABTS 51

3.3.3 Xây dựng đường chuẩn troloxcủa phương phápABTS 52

3.4 Nghiên cứu khảnăng bắt gốctựdo ABTScủa Peptide theophương pháp ABTS .7 .52

3.4.1 Khảo sát khả năng bắt gốc tự do của peptide theo nồng độ của phương pháp

ABTS 52

3.4.2 Khảo sát điểm kếtthúc của phản ứng củaphương pháp ABTS 54

3.4.3 Phân tích mẫu của phưong pháp ABTS 55

3.5 Kết quả khảo sát các thông số tối ưu bắt gốc tự do HYDROXYLtrong phưong pháo HYDROXYL 57

3.5.1 Kết quả khảo sát phổhấp thu tối ưu củaphương pháp HYDROXYL 57

3.5.2 Ket quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Deoxyrebose cuả phương pháp HYDROXYL 57

3.5.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH của phương pháp HYDROXYL 58

3.5.4 Ket quả khảo sát tỷ lệhỗn hợp phản ứng sinh ra gốc tự do HYDROXYL trong phương pháp HYDROXYL 59

3.5.5 Ket quả khảo sát nhiệt độ ủ của hỗn hợp phản ứng sinh ra gốc tự do HYDROXYL trong phương pháp HYDROXYL ? 60

3.5.6 Ket quả khảo sát thời gian ủ của hỗn hợp phản ứng sinh ra gốc tự do HYDROXYL trong phương pháp HYDROXYL 61

3.5.7 Ket quả khảo sát thời gian bền màu phương pháp của phương pháp HYDROXYL ? 62

3.5.8 Ket quả nghiên cứu khả năng bắt gốc tự do của Peptide theo phương pháp Hydroxyl 63

KẾTLUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66

1 Kếtluận 66

2 Kiến nghị 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

PHỤ LỤC 1

LÝLỊCH TRÍCHNGANG CỦA HỌC VIÊN 6

DANH MỤC HỈNH ẢNH

Hình 1.1 Liên kết amide/peptide trong các phân tử peptide và protein 5

Hình 1.2 Peptide chống oxi hóa Glutathione 11

Hình 1.3 Ếch Litoria rubella 16

Hình 1.4 Cấu trúc peptide Phe - Pro - 5HTP-Leu - OH 19

Hình 1.5 So đồcủa máy uv-VIS 22

Hình 2.1 Các bước tiến hành Phương pháp FRAP 24

Hình 2.2 Phản ứngkhử sắt trong huyết tương FRAP 25

Hình 2.3 Các bước tiến hành phương pháp ABTS 26

Hình 2.4 Phản ứng bắt gốc tự do ABTS 27

Hình 2.5 Quy trình bắt gốc tự do hydroxyl 28

Hình 2.6 Quy trình bắt gốc tự do 29

Hình 3.1 Khảo sát phổ hấp thu cực đại của thực nghiệm FRAP 45

Hình 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ hỗn hợp thuốc thử FRAP 46

Hình 3.3 Kết quả xây dựng đường chuẩn Fe2+ của phương pháp FRAP 46

Hình 3.4 Khảo sát khảnăng khử sắt của peptidetheonồng độcủa phương pháp FRAP 47

Hình 3.5 Khảo sátđiểm kếtthúc phản ứng củapeptide dùngphương pháp FRAP 48

Hình 3.6 Khảnăng khử sắt của peptide tại các nồng độ của phương phápFRAP 49

Hình 3.7 Khảo sát phổ hấp thu cực đại của thực nghiệm ABTS 50

Hình 3.8 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thuốc thửABTS 51

Hình 3.9 Xây dựng đường chuẩn troloxcủa phương phápABTS 52

Hình 3.10 Khảo sát khảnăngbắtgốc tự docủa peptidetheonồng độ của phương pháp ABTS 53

Hình 3.11 Khảo sát điểm kếtthúc phản ứng củapeptide của phương pháp ABTS 54 Hình 3.12 Khảnăng bắtgốc của peptide so với GSH của phương phápABTS 56

Hình 3.13 Khảo sát phổ hấpthu cực đại của thực nghiệm HYDROXYL 57

Hình 3.14 Kết quả ảnh hưởng của pH của thực nghiệm HYDROXYL 58

Hình 3.15 Kết quả ảnh hưởng của pH của thực nghiệm HYDROXYL 59

Hình 3.16 Kết quả ảnh hưởng khảo sát tỷ lệ hỗn hợp phản ứng sinh ra gốc tự do HYDROXYL 60

Hình 3.17 Kết quả khảo sát nhiệt độủ của hỗn hợp phản ứng sinh ra gốctự do HYDROXYL 61

Hình 3.18 Kết quả khảo sát thời gian ủ củahỗn hợp phản ứng sinh ra gốc tự do HYDROXYL ? ? 62

Hình 3.19 Kết quả khảo sát thời gian bền màu của hỗn hợp phản ứng sinh ra gốc tự do HYDROXYL 63

Hình 3.20 Khảnăng bắtgốc của peptide của phương pháp HYDROXYL 64

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Trìnhtự Tryptophyllins 17

Bảng 2.1 Dụng cụ và thiết bị của phương pháp FRAP 23

Bảng 2.2 Dụng cụ và thiết bị phương pháp HYDROXYL 27

Bảng 2.3 Quy trình khảo sát phổ hấp thu của phức 31

Bảng 2.4 Quy trình khảo sát ảnh hưởng của hỗn hợp thuốc thử FRAP 31

Bảng 2.5 Quy trình xây dựngđường chuẩn 32

Bảng 2.6 Khảnăng khử sắt của peptidetheonồng độ 32

Bảng 2.7Thời gian kết thúc phản ứng 33

Bảng 2.8 phân tích mẫu peptide 34

Bảng 2.9 Quy trình khảo sát phổ hấp thu của phức 35

Bảng 2.10 Ảnh hưởng của thuốc thử ABTS 35

Bảng 2.11 Quy trình xây dựng đường chuẩn trolox 36

Bảng 2.12 Khảo sát khảnăng bắt gốc tự do của peptidetheonồng độ 37

Bảng 2.13 Khảo sátđiểm kếtthúc của phản ứng 37

Bảng 2.14 Phân tích mẫu 38

Bảng 2.15 Khảo sátbước sóng tối ưu 39

Bảng 2.16 Khảo sát ảnhhưởng củanồngđộ Deoxyrebose trong phương pháp HYDROXYL ? 40

Bảng 2.17 Khảo sát ảnhhưởng của pHtrong phương pháp HYDROXYL 41

Bảng 2.18 Khảo sát ảnhhưởng của tỷ lệ hỗn hợp phản ứng sinh ragốc HYDROXYL 41

Bảng 2.19 Khảo sát thời gian ủ của hỗn hợp sinh ra gốc HYDROXYL 42

Bảng 2.20 Khảo sátảnh hưởng nhiệt độ của quá trình phản ứng sinh ra gốc tự do HYDROXYL 7 43

Bảng 2.21 Khảo sát thời gian bền màu của phương pháp HYDROXYL 43

Bảng 2.22 Khảo sát khảnăng bắt gốc tự do HYDROXYL theo phương pháp HYDROXYL 44

Bảng 3.1 Phân tích với mẫu của phương pháp FRAP 49

Bảng3.2 Phân tích mẫu của phương phápABTS 56

Bảng 3.3 Phân tích với mẫu của phương pháp HYDROXYL 64

DANH MỤC Từ VIẾT TẮT

ABTS 2,2'-azino-bis(3 ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid)

IƯPAC InternationalUnion of Pure and Applied Chemistry

TEAC Trolox equivalent oxidant capacity

TROLOX 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid

1 Đặt vấn đề

Như chúng ta đã biết, cơthể con người nói riêngvà cơthể sống nói chung, tất cả đều

được hình thành từ tỷ tỷ tế bào, trên mỗi tế bào chứa đựng hàng nghìn loại protein,peptide được gắn kếtvới nhau Protein và Peptide đóng nhiều vai trò sinh học khácnhau trong các cơ quan của cơ thể sống Chẳng hạn như collagen của da, keratin

móng, fibroin của lụa vàtơ nhện cũng như khoảng hơn 50 nghìn enzymes đóng vai trò xúctác trong các phản ứng sinh học xảy ratrongcơthể conngười Mặc dù vai trò

khác nhau, song peptide và protein đều có cấutrúc cơbản giống nhau gồm các amino acid liên kết với nhau tạo thành một mạch dài, hay còn gọi là các phân tử polymersinh học (biopolymer) Tuy nhiên, peptide rất dễ bị tác động từ môi trường xung quanh dẫn đến sự biến tính có lợi của peptide Vì vậy vài thập kỉ gần đây, cácnhà

khoa học đã nghiên cứu và tổng hợp các peptide từ động vật lương cư có khả năng kháng khuẩn, kháng viêm, và gần đây nhất khả năng hoạt tính chống oxy hóa của

peptide đang được giới khoa học tập trung nghiên cứu và đã có những thành côngnhất định, đặc biệt là trong ngành Y dược như tăngtrưởng, tiêu hóa và trao đổi chất

Trong thực phẩm tăng cường chất phụ gia vàbảo quản thực phẩm có nguồn gốc từ

tự nhiên có hoạt tính sinh học

Êch cây đỏLitoria rubella từ úc đã được nghiên cứu trong vài thập kỷ cho thấy cáctuyến trên da lưng của chúng tiết ra một so peptide nhỏ chứa trình tự Pro-Trp, đượcgọi làpeptitetryptophyllin L Mặc dù các peptidetừ da ếch nhiều chi tại úc đã đượcbáo cáo là có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau, nhưng các hoạt tính sinh học của

họ peptide này vẫn chưa được khám phá Gần đây nhất, việc phát hiện ra peptidechống oxy hóa (AOPs) từ các loài ếch khác nhau đã thu hút rất nhiều sự chú ý, vì

chúng có đóng vai trò vừalà bằng chứng vừa là lời giải thích cho phản ứng của các

loàiđó đối với quá trình chuyển đổi sự sống từ môi trường dưới nước lên trên cạn và

của chất tiết ở lưng của loài ếch này để thích nghi với sự thay đổi mạnh mẽ của khí

hậu từ khô cằn ởnướcúc sang điều kiện ẩm ướt của bờ biển phía đông bắcnước úc

Đe chuẩn hóa quy trình nghiên cứu đánhgiákhả năngchống oxy hóa của peptidePhe

- Pro - 5htp- Leu - OH bằng phưong pháp ức chế oxy hóa gốc tự do Hydroxyl, là

nhóm nội sinh cụ thể là gốc hydroxyl (OH ) trong co thể của sinh vật Đồng thời

nghiên cứu khảnăng chống oxy hoá với gốc tự do thưong mại bằng các thí nghiệm

khảnăng khử sắt trong huyếttưong (FRAP) và tư ong tác gốc tự do ABTS Chính vì

nhữnglý do trêntôi đã chọn và tiến hànhnghiên cứuđềtài: “ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỒNG OXI HÓA CỦA PEPTIDE PHE - PRO - 5HTP - LEU (OH) CÓ NGUỒN GỐC TỪ LOÀI ẾCH LITORIA RUBELLA BẰNG THựC NGHIỆM BẮT GỐC Tự

DO HYDROXYL, ABTS VÀ FRAP”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá khả năng chống oxy hóa của peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH dựa trên 2

nhóm phản ứng bắt gốc tự do:

Nhóm thứ 1: Nghiên cứu khảnăng chốngoxy hoá vớigốc tự do thưongmại bằng các

thí nghiệm khả năngkhử sắt trong huyết tư ong (FRAP) và tư ong tác gốc tự do ABTS

Nhóm thứ 2: Nghiên cứu khảnăng chống oxy hoábằng nhóm nội sinh cụ thể là gốcHydroxyl (OH’) trong co thể sinh vật, từ đó đánh giá khả năng bắt gốc tự do của

peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH một cách toàn diện dựa trên thực nghiệm

3 Đối tượng và nhiệm vụ nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu:

Đối tượng mẫu được chọn lựa đó là mẫu peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH được tổng hợp từ cáchợp chất có trên da của ếch litoria rubella

Peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH đã được chuẩn bị bằng cách sử dụng L-đồng phân của mỗi axit amin bằng cách tổng họp pha rắn với chiến lược íluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) Quá trình tổng hợp được thực hiện bỏi GL

Biochem Co., Ltd có độ tinh khiết xấp xỉ 95% được chứng minh dữ liệu qua sắc kýlỏng hiệu năng cao (HPLC) và khối phổ (MS).

Phạm vi nghiên cứu:

Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH bằng việc đánh giá về quá trình peptide làm ức chế các gốctự do Hydroxyl, ABTS và FRAP.Trong đó gốc tự do ABTS và FRAP là hai gốctự do thư ong mại

Thông qua các điều kiện thực nghiệm, nghiên cứu có thể pháttriển thêm và nghiêncứu sâu hon với phản ứng trong môi trường sinh học giả định hoặc thực tế để triển khai áp dụng cho bảo quản thực phẩm và y học

4 Ý nghĩa của đề tài

Y nghĩa khoa học:

Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hoá của các peptide Phe-Pro-5HTP-Leu-OH có ýnghĩa khoa học trong việc đánh giá khảnăng loại bỏ các gốc tự do nguy hại cho cơthể sống từ việc xây dựng các phương pháp thực nghiệm sử dụng nhóm nội sinh cụthể là gốc hydroxyl (OH’) trong cơthể của sinh vật đặt biệt là trong cơthể con người

cũng như lấynhóm FRAPvàABTSnhưlà các gốc tự do để khảosát điều kiệntối ưu

cho quátrình phản ứng với peptidenhằm khai thác tiềmnăng của peptidecókhả năng

chống oxy hoá chocác nghiên cứu về thực phẩm và y học Khẳng định một lần nữa nghiên cứu này quan trọng đánh giá khả năng bắt gốc tự do của peptide Phe-Pro-

5HTP-Leu-OH một cách toàn diện dựa trên thựcnghiệm

Y nghĩa thực tiên:

Nghiên cứu về peptide và pháttriển peptide nhưdược phẩm hoặcchấtbảo quản thực phẩm đang làmộtxu hướng của giới khoahọc và công nghiệp thế giới Vì vậy, tổng hợp và khảo sát hoạt tính sinh học của peptide tự nhiên là mộttrong số nghiên cứuquan trọng vì chúng sẽ góp phần mở rộng ngân hàng các peptide thuộc nhóm này, làm cơ sởcho việc dự đoán và thiết kế các peptide chống oxy hóa Ngoài ra nó góp

phần vào thúc đẩy những pháttriển xa hơn trong các lĩnh vực hóa dược và hóa thực

phẩm khi các peptide này đượcnghiên cứu sâu trên tế bào vàin vivo.

Bêncạnh đó khám phára những peptide mới có hoạt tínhchốngoxy hoátừ tự nhiên được xem như là vấn đề thiết yếu trong lĩnh vực thực phẩm khi các chất bảo quản

trong thực phẩm hiện tại gây ra những tác dụng phụ và biến đổi gen cho cơ thể Từ

đây cóthể thấy được tính an toàn và ưu việtcủachấtbảo quản từ tự nhiên

Nghiên cứu này đóng góp một phần giá trị thực tiễn cho lĩnh vực y sinh, góp phần cho sự nghiên cứu sự phát triển chất chống oxy hóa tự nhiên mà không ảnh hưởng

đến quá trình traođổi chất trong cơthể sinh vật

CHƯƠNG 1 TỐNG QUAN VỀ LĨNH vực NGHIÊN cứu

ngoại trừ peptide vòng đều cóđầu tận cùngN (nhóm amin) và đầu c(nhóm cacboxyl)

ở cuối peptide (nhưminhhọa cho tetrapeptide trong hình) [ 11 cấu trúc peptide:

Hình 1.1 Liên kết amide/peptide trong các phân tửpeptide và protein

Liênkếtpeptide:

Tronghóa họchữu cơ, liên kếtpeptide là một loại liênkết cộng hóa trị amit, hên kết

hai axit alpha-amino liên tiếptừ C1 (cacbon số một) của một axitalpha-amino vàN2

(nitơ sốhai) của một axit khác, dọc theo mộtpeptide hoặc protein chuỗi Nó cũng có thể được gọilàhênkếteupeptide để phân biệtvớiliên kết isopeptide, làmộtloại liên

kết amit khác giữahai axit amin [1-3]

Khi hai axitamin tạo thành một dipeptide thông qua một liên kết peptide đó là mộtloại phản ứng ngưng tụ Trong kiểu ngưng tụ này, hai axit amin tiếp cận nhau, với

gốc axit cacboxylic không chuỗibên (Cl) của một axitđến gần gốc axit amin không

chuỗi bên (N2) của axit kia Mộtloại mất hydro và oxy từnhóm cacboxyl (COOH)

vàloại kiamất hydro từnhóm amino(NH2) của nó Phản ứng này tạo ramột phân tửnước (H2O) và hai axit amin nối vói nhau bằng liên kết peptide (-CO-NH-) Hai

axit amin tham gia được gọi là một dipeptide [1-3]

Sự hình thànhliên kết peptide tiêu thụ năng lượng, mà ở các sinh vậtnăng lượng này được lấy từ ATP Peptide và protein là các chuỗi axit amin được liên kết với nhau

bằng liên kết peptide (và đôi khi bằng một vài liên kết isopeptide) Các sinh vật sử

dụng enzym để tạora các peptidecó hoạt tínhtốt và ribosome đểtạo ra protein thông

qua các phản ứng khác nhau về chi tiếtso với quá trình tổng hợp mấtnước [1]

Một số peptide, chẳnghạn như alpha-amanitin,được gọi làpeptideribosome vì chúng

được tạo ra bởi các ribosome, nhưng nhiều peptide không thuộc ribosome vì chúng

được tổng hợp bởi các enzyme chuyên biệt chứ không phải ribosome Ví dụ,

tripeptide glutathione được tổng họp theo hai bước từ các axit amin tự do, bởi hai enzyme: glutamate-cysteine ligase (tạo liên kết isopeptide, không phải là liên kết

peptide) và glutathione synthetase (tạo liên kết peptide) [1]

Liên kếtamit được tổng hợpkhi nhóm cacboxyl của mộtphân tử axit amin này phản

ứng với nhómamin của phân tử axit amin kia, gây rasự giải phóng mộtphân tử nước (H2O), do đó quá trình này làphản ứng tổng hợp khử nước [2]

1.1.1 Phân loại peptide:

Các peptide được phân thành hai loại Oligopeptide gồm các peptide có từ 2 đến 10

gốc a-amino acid và được gọi là dipeptide, tripeptide, tetrapeptide với so amino

acid tưong ứng Polipeptide gồm cácpeptide cótừ 11 đến 50 gốc a-amino acid [1]

Do sự thay đổi vị trí củacác amino acidthành phần trong một peptide Nếu phân tử

peptidechứa n gốc a-amino acid khác nhau thì số đồng phân loại peptide sẽ là n!

Neu trong phân tử peptide có i cặp gốc a-amino acidgiống nhau thì sốđồng phân chỉ còn n! Ví dụ, nếu peptide chỉ chứa hai amino acid là serine và alanine, có hai cách

sắp xếp hai amino acid này trong thành phần peptide, tùy vào gốcamino của serine

sẽ liên kết vói gốc carboxylic của alanine hay gốc amino của alanine sẽ liên kết vói

gốc carboxyl củaserine Ồ trườnghợp thứ nhất ta có alanylserine peptide, hường hợp

thứhaita cóserylalanine peptide[1]

1.1.2 Danh pháp peptide:

Peptide là bất kỳ polymer nào củacácaxitaminđượcliênkết bằng liên kết amit giữa

nhóm am in của một axit amin và nhóm cacboxyl của axitamin lân cận Mỗi đơn vị axit amin trong peptide được gọi là thừa (dư axit amin) [ 1-3]

Thuậtngữ“peptide” biểu thị cáchợp chất tương đốinhỏ, giống vớiproteinngoại trừ việc chúng bao gồm íthơn 50 gốc axit amin olypeptide có trên 50 gốc amin được

gọilà protein Theo quỵ ước,một peptide đượcviếtvới axit amin gốc có nhómamino

tự do (NH3+) ởbên trái và gốcaxit amin cónhóm cacboxyl tự do (CƠ2 ■) ở bênphải

[1-2]

Theo quy ước, peptide có công thức phân tửlà amino acid đầu N (còngốc NỈỈ3+ tự

do) thìnằm ở bên trái vàamino acid đầu c nằm bên phải [2]

/V-terminal end C-terminal end

„ H O H „

h 2 n - c - c - nh 0- cooh

Peptide bond

Phầncuối của peptide vớinhóm aminotựdo được gọi là đầu N hoặc đầu Nvà phần

cuối với nhóm carboxyl tự do được gọi là đầu c [2]

1.1.3 ứng dụng của peptide cỏ hoạt tính chống oxì hóa

Do có nhữngtính chấtvàvaitrò đặt biệt cókhả năng ảnhhưởng đến các chức năngsinhlýbêntrong của cơ thểsinhvật nên cácpeptide có hoạt tính chống oxy hóa được

ứng dụng trong nghành ydược và cũng được ứng dụng trongnghànhthực phẩm

Nghành ỵ dược:

Tất cả các peptide kháng sinh và aspartame vào thì peptide cũng chỉ chiếm khoảng0.0025% (khối lượng) củadược phẩm sản xuất hằng năm, nhưng peptide có vai trò

rất quan trọng trongnghiêncứu và điều trị bệnh Peptide hoạt tính sinh học được xem

là một tiềm năng rất lớn để giải quyết các vấn đề quan trọng như: tăng trưởng, tiêuhóa, trao đổi chất [4]

Có nhiều peptide được sản xuất có nhỏhon 40 amino acid bằng các phưongpháp hóa

học Phưong pháp hoáhọc cổ điển (tiến hành phản ứng trong dung dịch)phù hợpchosản xuấtnhững peptide ngắn mạch chotới trung bình, hiệu suất tối đa cóthể đạt tới

vài trăm kg cho tói vài tấn trên năm [4]

Nhu cầu sử dụng thực phẩm không chấtphụ giatổng hợp không tự nhiên, do những

ảnhhưởng có hại cho sứckhỏe của sinhvậtđặt biệt là con người, đãlàm cho cả ngành công nghiệp thực phẩm và các nhà nghiên cứu khám phá những công trình nghiên

cứu mói đểcó được chấtchống oxy hóa từtựnhiên.Những xu hướng này tăngcườngnhu cầu thu được và sử dụng các chất phụ gia thực phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên

cũng có hoạt tính sinh học [4]

1.2 Gốc tự do và chất chống oxy hóa.

1.2.1 Gốc tự do

Cácgốc tự do làcác chấthóa học sở hữu một điện tử chưa ghép đôi có thể được coi

là các mảnh phân tử và thường rất dễ phản ứng Chúng được sản xuất liên tục trong

các tébào hoặc là sản phẩm phụ của quá trình trao đổi chất Các phản ứngquantrọng

nhất trong sinh hóa gốc tự do trong tếbào hiếu khí là oxy và cácdẫn xuất gốccủa nó

(gốc superoxide và hydroxyl), hydrogen peroxide và các kim loại chuyển tiếp Các

gốc tự docó thể tích điện dương,tích điện âm hoặc trung hòa về điện [5]

Các gốctự do phản ứng hình thành trong tếbào cóthể oxy hóa các phân tử sinh học

và dẫn đến chếttế bào và tổn thưong mô Việc xác định sự tham gia của các gốc tự

do trong cơ chế bệnh sinh của một căn bệnh là vô cùng khó khăn do thời gian sống

ô nhiễm khôngkhí và hóachất công nghiệp [5]

Gốc tự do hình thành từ hai nguồn, đó là nguồn nội sinh và nguồn ngoại sinh Ởnguồn nội sinh, gốc tự do hình thành từ chuỗi chuyền điện tử trong ty thể (các phản

ứng phosphoryl oxy hóa của mitochondria): superoxide anion (Ơ2*), peroxynitrate

(ONO-), hydrogen peroxide (H2O2), goc hydroxyl (OH*) Nguồn nội sinh thứ 2 làtừhoạt động hô hấp củaleucocyte, gốc tự do hìnhthành để giết vi khuẩn Từ quá trình

tựchết củatế bào (apoptosis): bang in vitro, người ta thấy chất oxy hóanội sinh AXO

có thể ngăn trở apoptosis Ở nguồn ngoại sinh, gốc tự do hình thành từ khí ozone, bức

xạ tử ngoại,khói thuốc lá [5]

1.2.2 Ảnh hưởng của gốc tự do đoi với cơ thể sình vật.

Gốc tự do sinhranhiều sẽ vượt qua hệthống enzym bảo vệ cơthể và các gốc này sẽ

tấn công vào các chất của cơ thể Những thành phần té bào như ADN, protein,phospholipid, carbohydrat dễ bị gốctự do tấn công gây ra các bệnhnguy hiểm [5]

Gốctự do tấn công vào phospholipid màng tế bào gây ra quá trình peroxy hóa lipid Quá trình peroxy hóa lipidxảy ramãnh liệt ở cơ quan, tổchức tếbào khiến chúngbịpháhủy một cáchnghiêm trọng dẫn đến độtbiến, ung thư hoặctổn thương cácphân

tử and [5]

Sự tác động đến các yếu tố gây viêm, sự hủy hoại các phân tử polysaccharid do oxyhóacóthểlàm mấttính nhớt của acid hyalunoric (mộtchất làm tronkhớp), ảnh hưởng tói quátrình viêm có thể dẫn tói bệnh viêm khớpdạng thấp, lupus ban đỏ [5].

Gốc tự do liên quan đến các chất tiết ra từ thành mạch máu sẽ quyết định khả năng bám dính củatiểu cầu và mảng xo vữa, là nguyên nhân của các bệnh tim mạch (tai

biến mạch máu não, nhồi máu cơ tim ) [5],

Nói chung gốc tự do liên quan đến khá nhiều bệnh tật trong cơ thể vì thế nếu khả

năng chống oxy hóacủacơ thể cao thì xác suất mắc bệnhvà mứcđộ bệnh tật sẽ giảm

Vì thế người ta không ngừng nghiên cứu, tìm kiếm các chất chống oxy hóa cho cơ

thể nhằm nâng cao vàbảo vệ sức khỏe con người [5]

1.2.3 Cơ chế h oạt động củ a ch ất ch ong oxy hóa

Nghiên cứu chothấy có rất nhiều cơ chế khác nhau để các chất chống oxi hóa thực hiện hoạt động của mình, trong đó hai cơ chế phổ biến bao gồm: cơ chế chuyểnelectron vàcơ chếchoproton (H) [6]

• Cơ chế chuyển e: trong đó chất chống oxy hóa chính tặng một điện tử electron chogốc tự docó trong hệthống:

M (III) + AH=> AH‘ + M(II)

Theo cơ chếcho electron thì năng lượng ion hóalàyếu tố chính

• Cơ chế cho nguyên tử hydro: năng lượng liên kếtphân ly liên kết giữa các A-H là

yếu tố quyết định kết quả của quá trình oxy hóa

(AH: chấtchống oxy hóa; X.: gốc tự do; M: kim loại chuyểntiếp)

Hai cơ chế trong quá trình oxy hóa luôn xuất hiện xen kẻ nhau và việc nhậndạng xác

định riêng từng cơ chế làhết sứckhó khăn Khi gốc tự do nhận một nguyên tử hydro

hoặc một electron từ chât chông oxy hóa thì sẽ tạo thành gôc tự do mói hoạtđộngyêu hơn gôc tự do banđâu và khả năng gắy hậ sẽ không còn nữa.

L2.4 Peftidfe cíiéttg ozykia fíỷìsàất ịGSĩĩỊ vàkkàttấtg cfiOff* ozykóư tfitfft* đuíHíg ĩ/vtec (TEAty

Giói thiệuvê Glutathione và Trolox

Khái niệm Glutathione:

Glutathione làmột chât được sảnxuât tụ nhiến bởi gan Nó cũngxuâthiệnnhiêu trái

cây, các loại rau và thịt Đây là một chổng oxy ho á nội sinh, xuâthiện trong tât cả

các tề bào độngvậtvàđuợctổnghọp từ tê bảo bẵng 3 amino acids, bao gổm cysteine,

a-glutamic và glycine [7]

Glutathione (GSH)

Hỉnh 1.2 Peptide chông oxi hóa Glutathione

Cơ chê:

Cơ thể con người luồn sản sinh ra gổc tự do là nguyên nhân gây tổn hại cho tê bào

Vì dạng khủ của L-glutathione có nhóm hoạt động thiol (-SH) nên là chât cho điện

tử trong các phản úng oxy hóa khử vói các phân tử gôc tự do, trong quá trình này GSH chuyển hóathành dạngbị oxy hóa(GSSG) [8]

Cả L-glutathione vả glutathione đểu được sình ra trong gan và sau đó phân bo khăp

cơ the trong một chât được gọi là glutathione và sau cùnglà phá vỡ thành 2 thực the

riêng biệt

Tác dụng của glutathione:

Khi nhắc đến glutathione thì sẽngay đến công dụng làm đẹp Do đó công dụng đầu tiên của glutathione được xem như là mộtchấtchống lão hóa da hoàn hảo [9].

Các gốc tự do tác động đến co thể làm cho cơ thể trở nên lão hóa nhanh Lượng glutathuone sẽ giảm dần khi đến độ tuổi trưởng thành, dựavào mức độtác động của

môi trường màtác động nhiều hay ít Vì vậy, để làmchậm quá trình lãohóatự nhiên cũng như tác động bên ngoài nên cần duy trì lượng glutathione cho cơthể [9]

Ngoài chức năng làm đẹpglutathionegiúp đào thải các độc tố bất lợi ra khỏi cơ thể Nên có thể nói, glutathione hoạt động như một láchắn bảo vệ cơ thể và giúp cơthểđào thải độc tố [9]

Glutathione làm cho cơthể giảmcăng thẳng và tái tạonhiều nănglượng tích cực Sử dụng glutathione từ chế độ ăn uống giúp giảm bớt stress và có giấc ngủ tốt hơn vàoban đêm Bên cạnhđó cơthể bạn cóthể phục hồi từ các hoạt động mấtnhiều sức lực

nhưluyện tập chuyên nghiệp thểthao, lao động tay chân nặngnhọc [9]

Glutathione giúp tăng cường hệ miễn dịch Điều này có liên quan đến cácbệnh như

tiểu đường, tim mạch, ung thư khi sụtgiảm glutathione Cơ thể sẽ giảm được cáctác hại của virusvà vi khuẩn khi lượng glutathionecủa cơthể đượcduy trì ở mứcđộ

cao [9]

Khái niệm vềtrolox:

Trolox (axit 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic) là mộtchất tương

tự có thể hòa tan trong nước củavitamin E được bán bởi Hoffman-LaRoche Nó là dẫn xuất của vitamin E và được sử dụng trong hóa sinh đểgiảm stress hoặc thiệt hại

do oxy hóa [10]

Khả năng chống oxy hoátương đương (TEAC):

Khảnăng chống oxy hóa tương đương Trolox (TEAC) là phép đo sức mạnh chốngoxy hóa dựa trên Trolox, được đo bằng đơn vị gọi là Trolox Equivalents(TE), ví dụmicromolTE/100 g Do những khó khăn trong việc đo lường các thành phần chống

oxy hóa riêng lẻ của một hỗn hợp phức tạp (chẳng hạn như quả việt quất hoặc cà

chua), tưong đưong Trolox đượcsử dụng làm chuẩn cho khảnăngchống oxy hóacủamột hỗn hợp đó Tưong đương Trolox thường được đo bằng xét nghiệm khử màu

ABTS [10]

Xét nghiệm TEAC được sử dụng để đo khả năng chống oxy hóa củathực phẩm, đồuống và chất bổ sung Khảnăng khử sắt của huyết tương(FRAP) là một xét nghiệmkhảnăng chống oxy hóa sử dụng Trolox làm tiêu chuẩn [10]

Giátrị TEAC (khả năng chống oxy hóatương đương trolox) của các axit amin hoặc

peptide đượcbiểu thị bằng 1 umol TE /1 umol mẫu [10]

1.3 Tổng quan về peptide Phe - Pro - 5HTP - Leu - OH

1.3.1 Giới thiệu về ếch Litorỉa rubella

Trong số tấtcả các loài động vật có xương sống, lưỡng cưtrải qua quá trình tiến hóa

sâu sắc nhất khi chúng chuyển từ môi trường sống dưới nước lên cạn vào cuối thờiđại Cổ sinh Chúng đã đượctìm thấy ởtất cả các châu lục ngoại trừ Nam Cựcvà tồn

tại ở các vùng khí hậu khác nhau điều kiện từ sa mạc khô cằn đến hồ nướcngọt sâu,

vàtừ lòng đất đến tán rừng nhiệt đới Khảnăng thích ứng với nhiều loại khí hậu và địa chất của chúng được cho là nhờ nhiều sự thích nghi khác nhau về sinh lý, sinh

hóa và hành vi, với sự linh hoạttrong cấu trúc vàchức năngcủa da là yếu tố chính

tuyến phế nang chỉ được tìmthấy ở mộtnhómnhỏ ếch Các tuyến chất nhờn nhỏ và

giải phóng hỗnhợpnước gồm chấtnhầy, mucopolysacarit và muối giúp kiểm soát độ

pH củada, cân bằng độ ẩm, điều hòa nhiệt độ và ngăn ngừa tổn thương cơ học cho

da Mặt khác, các tuyến dạng hạt là nơi lưu trữcác chất độc hại do động vật tiết ra để

Việc khai thác da lưỡng cư theo nhiều cách khác nhau nhưy học dân gian, chất độc

đãđược biếtđến qua thực nghiệm và truyền miệng trongnhiều thế kỷ ở nhiều xã hội

như ỏ Châu Âu, Châu Phi, Châu Mỹ vàTrung Quốc cổ đại Tuy nhiên, nỗ lực phân lập và mô tả các thành phần hoạt tính sinh học từ da của động vật lưỡng cư chỉ bắt

đầu vào đầu những năm 1960 với công việc tiên phong của Erspamer và các đồngnghiệp Nó đã được tiết lộ rằng da động vật lưỡng cư là một kho chứarất nhiều hợp

chất hoạt động bao gồm các amin sinh học, steroid, alkaloid, peptide và protein

Ngoài ra, một so enzyme liên quan đến việc kích hoạt pro-peptide cũng đã được phân lập Những hợp chất được lưu trữ ởnồng độ cao nhất trong các tuyến da nhưngmột

sốcũng được tìm thấy trong các cơ quan nội tạng, máu vànòng nọc của một số loài

lưỡng cư [11]

Các nghiên cứu về khoảng 500 loài ếch vàcóc khác nhau đãxác định rằng chất tiết

ratừ da của động vậtlưỡng cư chứanhiều loại peptide, polypeptide và protein với số

lượng đáng kể và các loài khác nhau tiét ra phổ peptidehoạt tính sinh học khác nhau

Các peptidecó hoạt tính dược lý tương tự hoặc tương đươngcó thể được tìm thấy ở

nhiều loài lưỡng cư khác nhau và cấu trúc của chúng, mặc dù không nhất thiết phảigiốnghệt nhau, nhưng đượcbảotồn cao Các peptide được xác định đã cho thấy một loạtcác hoạt động kháng khuẩn với phát hiện hàng đầu về các peptide magainin từ

da của loàicóc cóvuốt châu Phỉ, Xenopus laevis. Tácdụng kháng nấm, khángvi-rút,

chống ung thư vàdẫn truyền thần kinh làcác chức năng sinh học bổ sung khác của

các peptide do da tiết ra Ngoài ra, hồ sơ peptide duy nhất củamỗi loài hỗ trợ phân loại, phân loại và nghiên cứu tiến hóa của động vật lưỡng cư Sự khác biệt về kích

thước, trình tự, cấu trúc 3 chiều và phổ hoạt tính sinh học của các peptide tuyến tạođiều kiện thuận lợi cho việc phân bổ các thành các loài, thậm chí cảcác loài phụ Ví

dụ, phân tích hồ sơ peptide của L caerulea từ các địa điểm khác nhau trên khắp

Australia đã tiết lộ rằng loài này đã tiến hóathành hai phân loài, một phân loài phía

đông và mộtphân loài trung tâm phíabắc [11]

Da của loài lưỡng cư được biết đến là vũ khí, nguồn phong phú hóachất tạo thành

mộtphần không thể thiếu trong hệthống phòng thủ của chúng, hỗ trợ động vật phản

ứng với nhiều kích thích từ môi trường Chúng được biết đến như là các hợp chất bảo

vệ vật chủ và đượctiết ra từ các tuyến trên lưng của động vật lưỡng cư Do sự cải

tiến của các phưong pháp mô tả cấu trúc, một số lượng lớn các peptide có chức năng mói đã được phát hiện, trong số đó có các peptide kháng khuẩn (AMPs) đã được

nghiên cứu rộngrãi Gần đây nhất, việcphát hiện racácpeptidechống oxy hóa (AOP)

từ các loài ếch khác nhau đãthu hút rấtnhiều sự chú ý vì chúng vừa là bằng chứng

vừa là lời giải thích cho phản ứng của các loài đó đối với sự sống chuyển từ môitrường dưới nước lên trên cạn và sự thay đổi nhiệt độ vànồng độoxy trong suốtquá

trình sống của chúng môi trường sống [11]

Trongthậpkỷ qua, ngày càng có nhiều phát hiện vềAOPtừ chất tiết qua da của ếch.Chúng được mô tảlà một phần không thểthiếu của hàng rào bảo vệ da giúp độngvật

đối phóvới sự thay đổi củađiều kiện sốngkhi chúng chuyển đổi từ môi trường sốngdưới nước sang trên cạn được đặc trưngbởi sự thay đổi lớn về oxy tính khả dụng của

gen và bứcxạ tia cực tím và để thích nghi với các vùng khí hậu khác nhau Nhữngthay đổi này có khảnăng dẫn đến sự giatăng sản xuất các loại oxy phảnứng nội sinh

(ROS) và gây ra nguy cơtổn thươngdo oxy hóa cao hơn AOP trong cáctuyến dado

đó được coi là một trong những hệ thống chống oxy hóa được pháttriển để giúp ếch

giảm bớt rủi ro như vậy Một số họAOP đã được báo cáo, đáng chú ý nhất là nhóm màngphổi và chất chốngoxy hóa được tiết rabởi loài Rana pleuraden [11]

Peptidetừ động vật lưỡng cư ức đã được nghiên cứu rộng rãi trong vài thập kỷ qua

Hàng trăm peptide từ tuyến da lưng của khoảng 30 loài ếch và cóc úc đãđượcphân lậpvà xác định cho thấy một loạt các hoạt tính sinh học bao gồm hoạt tính kháng vi-

rút, kháng ung thư, kháng nấm, hoóc-môn và pheromone, và phức hợp peptide với

protein điều hòa calmodulin (CaM) đểức chế sự hình thành oxit nitric Nhiều peptide trongsố này thể hiện hoạt tính nhiều mặt, trong khi hoạt tính củamột số peptide khác

vẫn chưađược khám phá [11]

1.3.2 Tong (ỊUÍỈH về peptide tryptophyỉlin L tổng hợp tie đa của ếch Lìtoria

rubeữa

Litoria rubella cònđược gọi là ếchcây đõ hay ếch cây sa mạc là một loài ếch nhỏ có chiều dài dưới 4,5 cm (Hình 1.3) và chiếm một khu vực rộng lớn ở miền trung và

miền bắc Australia Điều tra hồ sơ peptide từ dịch tiết lưng của L rubella từ 15 địa

điểm cho thấy có hai họpeptidetrong dịch tiết da của chi này vói tryptophyIlinsL làphần chính (Bảng 1 1) Các peptite tryptophyllin L là các peptidengắn có từ 4 đến7

gốc và có trình tự Pro-Trp đặc trưng Chúng khá bất thưòngso với các peptide được

phân lập từ các loài ếch úc khác vì chúng không có hoạt tính kháng khuẩn, chỉ có

hoạt tính cơtron nhỏ [12]

Hình 1.3 Ech Litoria rubella

Trong quá trình nghiên cứu về L.rubella, chúngtôi đã bị thu hút bởi sự phân bố rộngrãi của chi này cũng như sự lặp lại của cấu trúc loi Trp-Pro trong tất cả cáctryptophyllin L Câuhỏi đặt ra là vai trò cũa các đặc điểm cấu trúc này là gì? số lượng

peptide với các chức năng mới đã được phát hiện, trong đó peptide kháng khuẩn (AMPs) đã được nghiên cứurộngrãi Gần đây nhất, việc phát hiện ra peptide chốngoxy hóa (AOPs) từ các loài ếch khác nhau đã thu hútrấtnhiều sự chú ý vì chúng cóđóng vaitrò vừalà bằng chứngvừalà lời giải thích cho phản úng của các loài đó đối với quá trình chuyển đổi sự sống từ môi trường dưới nước lên trên cạn và cùa chất tiết ở lưng củaloài ếch này để thích nghivới sựthay đổi mạnh mẽcủakhí hậu từ khô

cằn ở trung tâm Australia sang điềukiện ẩm ưót của bờbiểnphía đông bắc [12]

sự thích nghi củachúng với các vùng khí hậu khác nhau Mặt khác, Pro và Trp đã

được báocáoxuất hiện thường xuyên trong AOP cónguồn gốc từ các proteintự nhiên

và được cho là có hoạt tính thu hồi gốc tự do mạnh trong các phản ứng oxy hóa do

sự hiện diệncủapyrrolidine và vòng indole với tư cách làchat cho protonquan trọng

Cácđặc điểm như vậy cho thấy rằng Tryptophyllins L có thể có khảnăng chống oxyhóa, và do đó rất đáng để sànglọc các chấtchốngoxy hóaTryptophyllin L Trong số

đó, tryptophyllin L 1.1 Phe-Pro-Trp-Leu (NH2) được quan tâm đặc biệt vì nó là

thành phần chínhtrong dịch tiết của loài ếchnày được nghiên cứu từnhiều địa điểm.Điều thú vị là các dẫn xuất tetrapeptide của nó Phe- Pro-Trp- Leu (OH), Ser-Pro-

Trp-Leu (OH) và hai dẫn xuất tripeptide Pro-Trp-Leu (NH2), Pro-Trp-Leu (OH)

ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) hoạt động thu hồi gốc tự do của hai

tripeptide Tryptophyllin L đã đề cậpở trên [12]

1.3.3 Tong quan về peptide Phe - Pro - 5HTP - Leu - OH

Giớithiệu 5-Hydroxytryptophan (5-HTP)

L-5-hydroxytryptophan (5-HTP) được sản xuất từ tryptophan bởi tryptophanhydroxylase (TPH) và quá trình khử carboxyl của nó tạo ra serotonin (5-

hydroxytryptamine, 5- HT), mộtchất dẫn truyềnthần kinhmonoamine liên quan đếnđiều hòa tâm trạng, nhận thức, học tập, trí nhớ, giấc ngủ và nhiều quá trình sinh lý

methoxytryptamine), hormone chủ yếu được tiết ra bởi tuyến tùng điều chỉnhchu kỳ ngủ-thức Do đó, quá trình sinh tổng hợp 5-HTP rất quan trọng và cần thiết để sản

xuất các phân tử quan trọng như 5-HT vàmelatonin 5-HTP cũng đóng một vai trò quan trọng trong các bệnh về thần kinh và chuyển hóa và sự tổng hợp của nó từtryptophan làbướcgiói hạn trong quá trình sinhtổnghợp 5-HT và melatonin Sựxuất

hiện của 5-HTP không giới hạn ỏ động vật hoặc con người và phân tử này được tạo

rabởi thực vậtbậcthấp và bậc cao, nấm và vi khuẩn [13]

5-HTP vừa là thuốc vừa là thành phần tự nhiên của một số chất bổ sung chế độ ănuống và sự xuất hiện trongcả tryptophan tổng hợp và 5-HTP tạp chất độchại đã gây

ra các trường hợp hội chứng đau cơtăng bạch cầu ái toan do đó, các phân tíchvà đặc

tính hóa học chính xác đã được phát triển Gần đây, kỹ thuật vi sinh vật đã cho phépsản xuất 5-HTP từ các lộ trình sinh tổng hợp thay thế, mở ra khả năng thú vị trong

việc kiểm soát tốt hơn sự hiện diện củacác chất gây ô nhiễm Vai trò sinh lý của 5- HTP được thảo luận bằng cách xem xét cả nghiên cứu trên động vậtvà thử nghiệm

lâm sàng ở người Độc tính của 5-HTP và khả năng xuất hiện các tạp chất độc hại

cũng đượcthảo luận [13]

Peptide Phe - Pro - 5HTP - Leu - OH:

Công thức cấu tạo:

Hình 1.4 Cấu trúc peptidePhe- Pro- 5HTP-Leu - OH

Công thức phântử: C31H39N5O

Khối lượngphântử: 577.68 g/mol

1.4 Các phương pháp đánh giá hoạt tính chong oxy hóa

Việc đánhgiá hoạttính chống oxy hóa được tiến hành theo các bước:

Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa hóahọc in vitro: việc sàng lọc trongcác thửnghiệm

hóa học dựa trên cơ sở cơ chếhoạt động của chất chống oxy hóa Các chất này hoạtđộng chống oxi hóa dựatrên cơchế cho/nhận electron hoặc cho nguyêntử hydro và

vì vậycó nhiều mô hình xác định hoạt tính chống oxi hóa tương ứng Mỗi mô hình

cóthểsửdụngthuốc thử (chất oxy hóa)khác nhau.Như vậy, mỗi mô hình thử nghiệmchỉ cho thấy mộtkhía cạnh về hoạt tính chống oxy hóa củachất, do đó để đánh giákhả năng chống oxy hóacần phải sửdụng nhiều hơn mộtmô hình thửnghiệm Sàng

lọc hóa học có ưu điểm là đơn giản, rẻ tiền, có thể thực hiện hàng loạt, nhưng đây chỉ

là thử nghiệm bước đầu, vì chất có hoạt tính chống oxy hóatốt trong mô hình thử nghiệm hóahọc chưa chắc đã cóhoạt tính chốngoxy hóatrong cơ thểsinh vật

Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa sinh học in vitro trên tếbào, thực hiệnthử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ tế bào đã tách ra khỏi cơ thể sinh vật thử nghiệm

(chuột, thỏ )và bị gâytốnthương bằng chất oxy hóa

Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóasinh học in vivo: thử nghiệm hoạt tính chống oxyhóa bảo vệtếbào ngay trên cơthể sinh vậtbị gây tổn thương bởi chất oxy hóa.

1.4.1 Phương pháp khử sắt FRAP.

Phương pháp FRAP (Ferric ion Reducing Antioxidant Power) được thực hiện đầu tiên bởi Benzie và Strain để đo năng lực khử hóa của các chất trong huyết tương,

nhưng đây cũng là phương pháp được sử dụng để thử nghiệm các chất chống oxyhóa

trong thực vật Phương pháp này dựa vàosự khử phứcferric 2,4,6-tripyridin-s-triazin (Fe3+ - TPTZ) thành phức chất ferrous 2,4,6-tripyridin-s-triazin (Fe2+ - TPTZ) bền

hơn bằng mộtchất khử (chấtchống oxy hóa) ởpHthấp Phức Fe2+ - TPTZ tạo thành

có màu xanh dương đậm, bền vững và có độ hấp thu cực đại tại bước sóng 593 nm

[14]

1.4.2 Phương pháp bắt gốc

ABTS+-Hoạt tính kháng oxy hóa được xác định bằng phương pháp khử màu ABTS’+ mô tảbởi Nenadis et al Cation ABTS’+ là một gốc tự do bền Đây làmột chất phát quang

màu xanh, hấp thu cực đại ở bước sóng 734 nm Khi cho chất chống oxy hóa vào

dung dịch chứa ABTS’+ các chất chống oxy hóa sẽ khử ion nàythành ABTS Đo độ giảm độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 734 nm để xác định hoạt tính của chấtchống oxy hóa trong sự so sánh với chất chuẩn Trolox Trong môi trường kali

persulfate, gốc ABTS’+cóthểbền2 ngày ởnhiệtđộ phòng trong điều kiện tránh sáng

[15]

1.4.3 Ph ương ph áp bắt goc Hydroxyl

Gốc hydroxyl, được tạo ra do phản ứng của phức sắt - EDTA với H2O2 do axit

ascorbic tấn công deoxyribose để tạo thành các sản phẩm mà khi đun nóng với axit

thiobarbituric ở pH thấp, tạo ra màu hong, chat bắt gốc hydroxyl đượcthêm vào cạnh

tranh với deoxyribose đểtạo ra phản ứng với các gốc hydroxyl và làm giảm sự hìnhthành chromogen Phản ứng của chất cạnh tranh phản ứng với gốc hydroxyl từ việc

ứcchế sự hình thành màu [16]

Các gốcOH’ tấn công deoxyribose vàtạo ramột loạt các phản ứng màcuối cùng dẫn

đến sự hình thành MDA, được đo bằng một mogen chro MDA-TBA màu hồng Vì

lượngtạo màu trong hỗn hợpphản ứng sau đó đượcgianhiệtbằng TBA tỷ lệ với thời

gian ủ trước khi thêm TBA, độ hấp thụ thu đượckhi kếtthúc thí nghiệm là thước đotốc độ tấn công củaOH vào deoxyribose

Phưongtrình phản ứng:

Fe3+ - EDTA+ ascobate—> Fe2+ _ EDTA+ oxydieascobate(1)

Fe2+_EDTA + H2O2 -» OH" +Fe3+-EDTA (2)

OH’ + deoxyrebose —> mảnh của deoxyrebose+ MDA (3)

MDA + acid thiobarbituric + acid tricloacetic + gia nhiệt khoản 20 phút + H2O —> chromogen (dung dịch màu hồng) (1)

Hỗn hợp phản ứng (1),(2), (3) (chưacó acid thiobarbituric và acid tricloacetic) +với

chất chống oxi hóa + thòi gian ủ 37 °C—> dung dịch (A)

Dung dịch (A) + acid thiobarbituric + acid tricloacetic +gianhiệt —>dung dịch (Al)

có màu hồng nhạt hơn dung dịch (1) nếu chất chống oxy hóaức chế được phản ứng

oxy hóa deoxyrebose của OH'

Ngoàinhững phương pháp đãnêu của đề tài thì còn rấtnhiều các phương pháp đánh

SUPEROXIDE, ORAC, FTC

1.5 Phương pháp phân tích UV-Vis

1.5.1 Nguyên tắc và cơ sở định lượng

Đe thực hiện được phép đo phổ này taphải:

Hòatan chấtphân tích bằngmột dung môi phù hợp hay là cho chất cần xác định, chủyếu là các ion kim loại tác dụng với 1 thuốcthử trong 1 dung môi thích hợp đểtạo ra

1 hợp chất có phổ hấp thụ ƯV- VISnhạy - Dùng chùm bức xạ cónăng lượng phù

hợp chiếuvào dung dịch mẫu chứa hợp chấtcần phân tích để cho chấtphân tích hay

sản phẩm củanó hấp thụ bức xạ để tạoraphổ hấp thụ uv - VIS của nó Do đó chất phân tích cần được đựng vào ống đo hay cuvet có bề dày nhất định - Thu, phân ly

phổ đó và chọnbước sóng Xcần đocủa chất phân tíchrồi ghi lại cường độ A của phổ

Nghĩa là đo cường độ của chùm sáng sau khi đã đi qua dung dịchmẫunghiên cứu

Từ đó suy ra hàm lượng chất cần xác định bằng các phương pháp khác nhau [ 17],

ỉ 5.2 Trang bị và sơ đồ khối căữ mộí máy UV- VỈS

Hình 1.5 Sơ đồ của máy UV-VIS

Máy quang phổ đơngiản hay hiện đại nó phải bộ phận chính sau đây: nguồn cung

cấp chùm tiasáng UV-VIS hay ƯV hay VIS, buồng cuvet và cuvet chứa mẫu để đo,

bộ đơn sắc (hệ quang học), detector (đầu dò),máy ghi nhậnkết quả [18],

CHƯƠNG 2 THựC NGHIỆM

2.1 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu khảnăng khử sắtFRAP của peptide

Nghiên cứu khảnăng bắt gốc tự do ABTS của peptide

Nghiên cứu khảnăng bắt gốc tự do hydroxyl của peptide

21.1 Phương pháp khử sắt trong huyết tương FRAP của peptide

20

Cân phân tích, độ chính xác 0.0001 g

Dung dịch HC1 40 mM

Dung dịch FeCh 20 mM

Đệm acetat

Thuốc thử TPTZ 10 mM

Tiến hành phươngpháp:

Bước 1 tao hôn hop FRAP

Bước 2 phản ứng vói mâu

ủ trong bể điều nhiệt

37 °C trong 30 phút

sóng 539 nm

Phản ứng đỏng hoc

Hình 2.1 Các bước tiến hành Phương pháp FRAP

Thực nghiệm FRAP được thực hiện theo phương pháp của Benzie & Strain (1996) được mô tả lại bởi Karamac và đồng nghiệp (2016) Thuốc thử FRAP được điềuchếbằng cách trộn dung dịch đệm acetat 0.3 M, TPTZ 10 mM ở pH 3.6 trong 40 mM

HC1, 20 mM FeC13.6H2Ơ pH 3.6 theo tỷ lệ 10:1:1 (v/v/v) Các mẫu được hòa tan

trong nước khử ion ở nồng độ 2 mg/mL Phản ứng được thực hiện trong một ống

đựng mẫu Các mẫu và thuốcthử FRAP được ủ ở 37°c trước kill thêm 40 U1L vào

200 mL của FRAP thuốc thử và độ hấp thụ được scan và đo ở bước sóng Imax

Glutathione (GSH), là kiểm soát dương, phản ứng với thuốc thử FRAP giống như

mẫu Đường cong chuẩn được tạo ra bằng phản ứng của thuốc thử TPTZ với

FeSƠ4.7H2O (0.5-100 mM Fe2+)

Fe(lll)(TPTZtíJ’ [Fe|ll)(TPTZy z‘, UaK = 593 nm

Hình 2.2 Phản ứng khử sắt trong huyết tương FRAP

2.1.2 Ph ương pháp bắt gốc tự do ABTS của peptide.

Dụng cụ và thiết bị:

Bảng 2.2Dụng cụ và thiết bị củaphươngphápABTS

STT Tên dụng cụ và thiết bị STT Tên dụng cụ và thiết bị

Hóa chất:

Thuốc thử ABTS 7mM

K2S2O82.45 mM

Đệm PBS 0.02 M