Nghiên cứu xử lý vỏ cà phê bằng vi sinh vật để sản xuất giá thể trồng rau sạch

Phạm vi nghiên cứu Đề tài tập trung vào nghiên cứu xử lý vỏ cà phê để sản xuất giá thể hữu cơ trồng rau và đánh giá hiệu quả của giá thể hữu cơ từ vỏ cà phê trên một số loại rau.. Hàng

NGUYỄN MẬU NGHĨA

NGHIÊN CỨU XỬ LÝ VỎ CÀ PHÊ BẰNG VI SINH VẬT

ĐỂ SẢN XUẤT GIÁ THỂ TRỒNG RAU SẠCH

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ NGÀNH: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS NGUYỄN NHƯ NGỌC

Gia Lai, 2023

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tư do - Hạnh phúc LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan tất cả những kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa được công bố Nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm Mọi trích dẫn trong đề tài đều đã được ghi rõ nguồn gốc

Gia Lai, ngày 28 tháng 8 năm 2023

NGƯỜI CAM ĐOAN

Nguyễn Mậu Nghĩa

Gia Lai, ngày 28 tháng 8 năm 2023

TÁC GIẢ

Nguyễn Mậu Nghĩa

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH vii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Thực trạng ngành sản xuất cà phê ở Việt Nam 3

1.2 Tình trạng vỏ cà phê và công nghệ xử lý 4

1.2.1 Trên thế giới 4

1.2.2 Ở Việt Nam 6

1.3 Nhu cầu giá thể trồng rau sạch ở đô thị Việt Nam 9

1.4 Tổng quan về giá thể hữu cơ 9

1.5 Tình hình sản xuất giá thể hữu cơ từ phế phụ phẩm 10

1.5.1 Tình hình nghiên cứu về sản xuất giá thể hữu cơ trên thế giới 10

1.5.2 Nghiên cứu và phát triển giá thể hữu cơ ở Việt Nam 12

Chương 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU13 2.1 Mục tiêu của đề tài 13

2.2 Nội dung nghiên cứu 13

2.3 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 13

2.3.1 Đối tượng nghiên cứu 13

2.3.2 Dụng cụ và hóa chất 13

2.3.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 14

2.4 Phương pháp nghiên cứu 14

2.4.1 Phương pháp xác định một số chất trong vỏ cà phê 14 2.4.2 Phương pháp phân lập và tuyển chọn vi sinh vật hữu ích từ vỏ cà phê 14

2.4.3 Phương pháp xác định đặc tính sinh hóa và định tên các chủng

tuyển chọn 16

2.4.4 Quy trình xử lý vỏ cà phê thành giá thể hữu cơ 20

2.4.5 Phương pháp đánh giá các chỉ tiêu dinh dưỡng của giá thể hữu cơ từ vỏ cà phê 22

2.4.6 Phương pháp đánh giá hiệu quả của giá thể hữu cơ từ vỏ cà phê 23 2.4.7 Phương pháp thu thập và xử lý kết quả 24

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Kết quả xác định thành phần các chất của nguyên liệu vỏ cà phê 24

3.2 Kết quả phân lập và tuyển chọn vi sinh vật hữu ích từ vỏ cà phê 25

3.2.1 Kết quả phân lập vi sinh vật từ mẫu vỏ cà phê 25

3.2.2 Kết quả tuyển chọn các chủng hữu ích 28

3.2.3 Đặc điểm sinh hóa và định tên các chủng tuyển chọn 33

3.3 Kết quả xây dựng quy trình xử lý vỏ cà phê thành giá thể 38

3.3.1 Lên men thu sinh khối chủng vi sinh vật 38

3.3.2 Kết quả phối trộn sinh khối vi sinh vật để xử lý vỏ cà phê 40

3.4 Kết quả đánh giá hiệu quả sử dụng của giá thể hữu cơ từ vỏ cà phê trên rau mầm 44

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

CMC Cacboxyl metyl cellulose

PCR Polymerase chain reaction PDA Potato Dextrose Agar VSV Vi sinh vật

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Xác định các chất trong vỏ cà phê 14

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 17

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR gen ITS 19

Bảng 2.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR mồi ITS 19

Bảng 2.5 Các công thức ủ giá thể từ vỏ cà phê 22

Bảng 2.6 Các chỉ tiêu dinh dưỡng trong giá thể hữu cơ từ vỏ cà phê 22

Bảng 2.7 Bố trí thí nghiệm trồng rau cải với giá thể hữu cơ từ vỏ cà phê 23

Bảng 3.1 Thành phần các chất trong vỏ cà phê (%) 24

Bảng 3.2 Đặc điểm của các chủng vi sinh vật được phân lập từ vỏ cà phê 25

Bảng 3.3 Đường kính vòng phân giải cơ chất của các chủng 28

Bảng 3.4 Khả năng sinh tổng hợp IAA của các chủng 30

Bảng 3.5 mật độ tế bào chủng trong môi trường Norris 32

Bảng 3.6 Hàm lượng NH4+ trong dịch nuôi cấy các chủng 32

Bảng 3.7 Đặc điểm sinh hóa của chủng tuyển chọn 33

Bảng 3.8 Mức độ tương đồng đoạn gen 16S rRNA của chủng CF2 với trình tự mẫu gen trên Ngân hàng sữ liệu gen NCBI 33

Bảng 3.9 Mức độ tương đồng đoạn gen 16S rRNA của chủng CF4 với trình tự mẫu gen trên Ngân hàng sữ liệu gen NCBI 35

Bảng 3.10 Mức độ tương đồng đoạn gen ITS1-5,8S-ITS2 của mẫu nấm CF17 với trình tự mẫu gen trên Ngân hàng sữ liệu gen NCBI 36

Bảng 3.11 Các thông số đống ủ vỏ cà phê sau khi phối trộn hỗn hợp sinh khối 41

Bảng 3.12 Kết quả phân tích chất lượng giá thể 43

Bảng 3.13 Chất lượng rau mầm trên giá thể hữu cơ từ vỏ cà phê 44

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Kim ngạch xuất khẩu cà phê của Việt Nam 2009-2022 3

Hình 2.1 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 18

Hình 2.2 Sơ đồ ủ nguyên liệu vỏ cà phê và hỗn hợp sinh khối 21

Hình 3.1 Một số hình ảnh về hoạt tính phân giải cơ chất của các chủng 30

Hình 3.2 Cây phân loại mẫu vi khuẩn CF2 34

Hình 3.3 Cây phân loại mẫu chủng vi khuẩn CF4 36

Hình 3.4 Cây phát sinh loài mẫu nấm CF17 38

Hình 3.5 Đường cong sinh trưởng của chủng vi khuẩn CF2 và CF4 39

Hình 3.6 Đường cong sinh trưởng của chủng CF17 40

Hình 3.7 Một số thí nghiệm trồng rau cải mầm trên giá thể 45

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Việt Nam là nước xuất khẩu cà phê lớn thứ hai trên thế giới Theo thống kê, diện tích cà phê hiện nay đạt trên 664.000 ha, năng suất khoảng 27 tạ/ha, sản lượng đạt xấp xỉ 1,9 triệu tấn, kim ngạch xuất khẩu khoảng 3,5 tỷ USD, chiếm 14% thị phần thế giới [1] Theo số liệu của Bộ Công thương, trong tháng 8/2022, Việt Nam xuất khẩu 112.531 tấn cà phê với kim ngạch

266 triệu USD, tăng 13% về kim ngạch so với tháng 8/2021 Với lượng cà phê nhân xuất khẩu khổng lồ như vậy, lượng vỏ cà phê được thải ra trong nước, đặc biệt là tại Tây Nguyên mỗi năm trên 1.000.000 tấn [2]

Theo tính toán của các chuyên gia, với sản lượng vỏ cà phê khô khổng

lồ như vậy được thải ra, tuy là nguyên liệu rất có giá trị cho một vài ngành sản

xuất công nghiệp, nhưng đến nay vẫn chưa được tận dụng triệt để Hiện nay, lượng lớn vỏ cà phê thường được đốt hoặc đổ thẳng ra vườn cà phê không qua

xử lý nên quá trình phân hủy tự nhiên chậm, gây ô nhiễm môi trường, gây bệnh hại cho vụ trồng sau và rất và lãng phí Do vỏ cà phê có chứa nhiều caffein và tanin là những chất có khả năng ức chế vi sinh vật, làm chậm quá trình phân hủy trong môi trường tự nhiên (chỉ sau thời gian đến hai năm mới phân hủy) Tuy nhiên, vỏ cà phê lại rất giàu lignocellulose và một số chất khoáng, đây là nguyên liệu lý tưởng để có thể làm giá thể trồng các loại rau, hoa và cây ngắn ngày [8]

Trong những năm gần đây, tốc độ đô thị hóa ở Việt Nam ngày càng nhanh Diện tích đất trồng trọt bị thu hẹp Việc tìm kiếm các khoảng không gian ở thành phố để trồng rau sạch, hoa, cây cảnh là vấn đề nan giải Việc trồng rau trong các thùng xốp không còn xa lạ với các hộ gia đình tại các đô thị của Việt Nam Chính vì vậy, việc trồng cây trên giá thể (trồng cây không cần đất) đã từng bước được phát triển ở Việt Nam Đây thực chất là một kỹ

thuật trồng cây không dùng đất mà cây được trồng trực tiếp trên các giá thể

hữu cơ hay giá thể trơ cứng có tưới dung dịch dinh dưỡng Đề tài: “Nghiên cứu xử lý vỏ cà phê bằng vi sinh vật để sản xuất giá thể trồng rau sạch” được

thực hiện nhằm tìm ra những điều kiện quy trình tốt hơn, đơn giản hơn, dễ dàng thực hiện tại nhà để phục vụ cho khu vực đô thị, chung cư, nhà cao tầng

có thể tự tạo ra những loại rau sạch với giá thành thấp góp phần phát triển kinh tế và bảo vệ môi trường

2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

về giá thể hữu cơ trồng rau sạch và trồng hoa cho người dân ở vùng đô thị không có diện tích đất canh tác

3 Phạm vi nghiên cứu

Đề tài tập trung vào nghiên cứu xử lý vỏ cà phê để sản xuất giá thể hữu

cơ trồng rau và đánh giá hiệu quả của giá thể hữu cơ từ vỏ cà phê trên một số loại rau

Đề tài nghiên cứu được thực hiện ở Phân hiệu Trường Đại học Lâm nghiệp tại tỉnh Gia Lai Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Thực trạng ngành sản xuất cà phê ở Việt Nam

Trong 30 năm qua, ngành cà phê Việt Nam đạt được kết quả tăng trưởng ngoạn mục Năm 1991, sản lượng cà phê Việt Nam mới chỉ đạt 1% thị phần thế giới, nhưng đến nay sản lượng xuất khẩu cà phê của Việt Nam bình quân đạt 1,5 - 1,8 triệu tấn năm, kim ngạch xuất khẩu luôn tăng trưởng trong những năm qua Theo tính toán của Bộ Công thương, kim ngạch xuất khẩu cà phê năm 2022 đã đạt mức kỷ lục với 4 tỷ USD và đà tăng có thể kéo dài sang năm 2023 [2, 4]

Hiện nay, cà phê Việt Nam đã có mặt tại 80 quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới, tập trung chủ yếu ở những thị trường lớn như Đức, Hoa Kỳ, Tây Ban Nha, Ý, Bỉ và Anh và các thị trường mới nổi như: Trung Quốc, Nga, Hàn Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, Philippines, Thái Lan… Ngành cà phê Việt Nam đang triển khai đề án cơ cấu lại để nâng cao giá trị và hướng tới mục tiêu xuất khẩu 6 tỷ USD vào năm 2030 [2, 4]

Hình 1.1 Kim ngạch xuất khẩu cà phê của Việt Nam 2009-2022

Ngoài xuất khẩu, thị trường nội địa cũng được xem là tiềm năng tiêu thụ các sản phẩm cà phê chế biến

Đối với vị thế là nước xuất khẩu cà phê lớn thứ hai trên thế giới với sản lượng xuất khẩu khổng lồ, số lượng các cơ sở chế biến cà phê ngày càng tăng

về số lượng và quy mô sản xuất với 97 cơ sở chế biến cà phê nhân với tổng công suất thiết kế 1,5 triệu tấn/năm [17]

1.2 Tình trạng vỏ cà phê và công nghệ xử lý

1.2.1 Trên thế giới

Vỏ cà phê là nguyên liệu sinh khối thuộc nhóm lignocellulose, chủ yếu bao gồm các nguyên tố sống thiết yếu (C, H, O và N), chủ yếu tạo thành cellulose (59,2 - 62,94wt%), hemicellulose (5 - 10wt%), và lignin (19,8 - 26,5wt%) [5, 6] Hơn nữa, loại chất thải này thường có một số nguyên tố được coi là vi chất vô cơ như canxi, magie, natri nhưng nồng độ của chúng thường nhỏ hơn 5,0% trọng lượng khô [41]

Với lượng lớn chất thải vỏ cà phê từ ngành công nghiệp chế biến cà phê đặc biệt là Vỏ cà phê là chất thải rắn chủ yếu từ quá trình xử lý và chế biến cà phê, vì cứ mỗi kg nhân cà phê được sản xuất, khoảng một kg vỏ trấu cà phê được tạo ra, đây là nguồn chất thải khổng lồ và đang gây ra trở ngại lớn đối với môi trường trên thế giới [39] Do đó, các nhà khoa học trên thế giới đã tập trung nghiên cứu các hướng tận dụng hoặc tái sử dụng đối với chất thải này Hàng loạt những công trình nghiên cứu về việc tái xử lý và tận dụng vỏ cà phê đã được thực hiện như trong nghiên cứu của tác giả Rathinavelu R và cộng sự, vỏ lụa cà phê khô được xay thành bột và trộn vào thức ăn cho các loại động vật như: Lợn, gà, cá, cừu, thỏ… Các thử nghiệm cho ăn bao gồm việc xác định mức tăng trọng cơ thể hàng ngày, chất khô hàng ngày lượng ăn vào và hiệu quả chuyển hóa thức ăn Lợn được nuôi bằng khẩu phần chứa tới 15% vỏ lụa cà phê ủ với 5% mật đường có tổng khối lượng tăng tương đương hoặc tốt hơn so với lợn ăn thức ăn tinh công nghiệp [54] Hoặc trong nghiên cứu của tác giả Didanna HL, vỏ cà phê cũng được tận dụng để sản nghiên cứu

bổ sung vào khẩu phần thức ăn chăn nuôi cho động vật nhai lại [39]

Mặc dù có cho thấy hiệu quả, xong hướng tận dụng vỏ cà phê này còn rất hạn chế về số lượng và chưa được áp dụng rộng rãi trên quy mô lớn vì vỏ

cà phê cũng chứa tới 18% lignin, silica và các hợp chất khác Do đó, để thực hiện được việc tận dụng vỏ cà phê làm thức ăn gia súc cần phải thực hiện cùng lúc với nhiều phương pháp để nâng cao hiệu quả của việc phân giải các hợp chất này [39, 54]

Trong nghiên cứu khác của tác giả Gouvea BM và cộng sự, khi đánh giá tính khả thi của việc sản xuất ethanol bằng cách lên men vỏ cà phê bởi

nấm men Saccharomyces cerevisiae Các nghiên cứu lên men đã được thực

hiện bằng cách sử dụng vỏ cà phê nguyên hạt và dịch chiết nước từ vỏ cà phê xay Tác giả thấy rằng có thể thu được sản lượng ethanol là 8,49g/100g chất khô (13,6g ethanol/l), đây là một giá trị khả quan khi so sánh lên men thu ethanol từ các chất thải khác như thân cây ngô, rơm lúa mạch và bã lúa mì thủy phân (với 5 - 11g ethanol/l) Đây là hướng đi khả quan có thể tận dụng

vỏ cà phê để sản xuất ethanol sinh học [44]

Ngoài ra, vỏ cà phê còn được nhiều tác giả khác nghiên cứu hàng loạt những hướng ứng dụng khác như: sử dụng vỏ lụa làm vật liệu hấp phụ kim loại nặng, dùng làm nguyên liệu để chiết xuất hợp chất chống ô xi hóa, chiết xuất cacbonhydrat chức năng hay tanin, chiết xuất thu hồi caffein, thu hồi các hợp chất phenol, sử dụng như tác nhân kháng vi sinh vật gây hại…[40,45,52,53,57]

Những nghiên cứu này vẫn đang rất được các nhà khoa học đi sâu nghiên cứu thêm, điều này chứng tỏ vấn đề môi trường và lãng phí gây ra từ nguồn vỏ thải cà phê là vấn đề cần được giải quyết trên thế giới Tuy nhiên cho đến nay những nghiên cứu này vẫn đang dừng lại ở mức quy mô nhỏ và chỉ giải quyết được lượng rất nhỏ chất thải này

Trong những năm gần đây, chất thải vỏ cà phê được nhiều các tác giả khác nghiên cứu theo các hướng xử lý để sản xuất phân bón hữu cơ nhằm tận dụng được lượng lớn và nâng cao hiệu quả tận dụng cũng như xử lý ô nhiễm môi trường Như trong nghiên cứu của tác giả Jiang Zeyin và cộng sự đầu

năm 2023, vỏ cà phê được nghiên cứu để bón lại cho cây trồng làm phân hữu

cơ Theo đó, vỏ cà phê tươi được sấy khô hoàn toàn, sau đó được nhiệt phân

và cacbon hóa ở 4000C; hoặc vỏ cà phê tươi được đặt trong bể lên men trong

5 tuần lên men oxy cưỡng bức cơ học, và nó có màu nâu nhạt sau khi thối hoàn toàn thì bón cho đất và theo dõi trong vòng 2 năm Kết quả cho thấy: từ giá trị trung bình của 2 năm, đã quan sát thấy sự khác biệt đáng kể về carbon hữu cơ trong đất, chất hữu cơ, tổng nitơ và tỷ lệ C/N [47]

Trong nghiên cứu của tác giả Kulandaivelu Velmourougane, vỏ thải cà phê được sử dụng làm nguyên liệu cho giun đất phân hủy và chuyển hóa thành phân trùn quế có giá trị Kết quả cho thấy, sau hơn 3 tháng thu được sản lượng phân trùn quế cao hơn các phương pháp sử dụng với nguyên liệu khác

Tỷ lệ ni tơ, phốt pho, kali, canxi và magie trong phân trùn quế tăng lên đáng

kể và kết luận vỏ cà phê là nguyên liệu rất tốt cho giun đất phân hủy để sản xuất phân hữu cơ trùn quế [49]

1.2.2 Ở Việt Nam

Trong khi các nước trên thế giới đã có những công trình xử lý vỏ cà phê để sản xuất thức ăn cho gia súc gia cầm, trồng nấm ăn, ứng dụng lên men tạo phân bón; sản xuất hương thơm tự nhiên, nghiên cứu ứng dụng nhiệt năng thì ở nước ta, rất ít công trình nghiên cứu đến việc ứng dụng của phế

phẩm này [11,50]

Tây Nguyên là vùng trồng cà phê lớn nhất của Việt Nam, bên cạnh sản phẩm thu hoạch chính là hạt cà phê dùng cho chế biến cà phê bột và xuất khẩu thì vỏ cà phê là nguồn phụ phẩm nông nghiệp sẵn có với số lượng lớn chưa được khai thác sử dụng có hiệu quả Theo tính toán, lượng vỏ cà phê tại Tây Nguyên mỗi năm trên 1.000.000 tấn hiện nay chưa được tận dụng thích

hợp mà thường được bỏ đi gây lãng phí và ô nhiễm môi trường [2]

Trước đây, sau khi xay xát lấy nhân, vỏ cà phê thường được đem đốt bỏ hoặc lấp lượng ít xuống gốc cây cà phê (phương pháp này ít có hiệu quả)

Trong vỏ cà phê chứa nhiều hợp chất dinh dưỡng và được đánh giá là nguồn nguyên liệu tiềm năng khổng lồ có thể tận dụng được theo nhiều hướng

Trong nghiên cứu của tác giả Bùi Anh Võ, vỏ cà phê được tận dụng làm nguyên liệu để thu nhận pectin Ở các thông số thích hợp, lượng pectin thu được là 16,25% so với nguyên liệu [3]

Vỏ cà phê cũng được nghiên cứu xử lý để nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của một số hợp chất chức năng như các sản phẩm nhiệt phân từ vỏ

cà phê: cellulose, lignin trong nghiên cứu của tác giả Trần Ngọc Thắng [18]

Tác giả Trần thị Thanh Thuần cũng nghiên cứu xử lý vỏ cà phê bằng

enzym được tổng hợp từ chủng Trichoderma viride và Aspegillus niger Theo

tác giả này, khi xử lý vỏ cà phê có bổ sung enzym cellulase và pectinase từ hai chủng vi sinh trên thì thời gian phân hủy vỏ cà phê diễn ra nhanh và hiệu quả hơn so với đối chứng sau thời gian ủ 14 ngày [19]

Tác giả Lâm Trịnh Diễm Ngọc nghiên cứu về chiết xuất hoạt tính chống oxi hóa có trong vỏ cà phê cũng cho thấy rằng, vỏ cà phê là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất một số hoạt chất chống oxi hóa tốt [7]

Tuy nhiên, ở trong nước cho đến hiện nay thì hướng xử lý vỏ cà phê hiệu quả với lượng vỏ thải ra khổng lồ hàng năm đang được các nhà khoa học quan tâm hơn cả đó là hướng tận dụng vỏ cà phê để tạo thành nguồn phân bón hữu cơ phục vụ tái sản xuất và làm nguyên liệu cho việc trồng nấm đang được

áp dụng phổ biến

Như trong các nghiên cứu của tác giả Trình Công Tư, vỏ cà phê được ủ

thành phân hữu cơ với các chế phẩm trên thị trường là Trichoderma spp và chế phẩm Bacillus spp Kết quả cho thấy ủ vỏ trấu cà phê với chế phẩm có tác

dụng giảm độ chua của đất, hàm lượng OC giảm từ 28,4 xuống 21,3%, C/N giảm từ 15,3 xuống 11,3, pH tăng từ 4,8 đến 5,6 [20]

Hay như trong nghiên cứu của tác giả Vũ Văn Trường đã sử dụng chế phẩm BioF để ủ hiếu khí đối với vỏ cà phê và vỏ hạt điều, quá trình diễn ra

tốt Kết quả cho thấy rằng chất lượng phân hữu cơ tốt, nhiệt độ khối ủ dao động trong khoảng 26,5°C - 56,2°C, độ âm dao động từ 44,5 - 60,4%, tỷ lệ N: P: K = 1,5%: 2,1%: 1,8%, hàm lượng cacbon dao động từ 52,1 - 29,1%, độ sụt giảm khối ủ còn lại 37,5% Tuy nhiên, trong nghiên cứu này cần phải phối trộn thêm một số chất dinh dưỡng khác cho sản phẩm phân bón thì mới đạt Tiêu chuẩn 10TCN 526 - 2002 [22]

Tuy nhiên, với công nghệ chế biến và xử lý vỏ cà phê đang còn thủ công và tự phát, chưa có quy trình công nghệ và bài bản do vỏ cà phê là nguyên liệu rất cứng và chậm phân hủy do chứa nhiều lượng chất pectin và cellulose Đa số các hộ dân trồng cà phê chỉ tận dụng vỏ để ủ phân tự nhiên hoặc có sử dụng một số chế phẩm vi sinh đã có trên thị trường nhưng không chuyên biệt (các chế phẩm này thường sử dụng cho các đối tượng là chất thải nông nghiệp thông thường) nên hiệu quả của việc tận dụng này vẫn đang còn chưa cao, đôi khi gây ra chết cây trồng vì thời gian lâu khả năng gây nhiễm nấm bệnh lớn cho cây và còn gây ô nhiễm môi trường

Gầy đây, cũng có một số nghiên cứu về phân lập các chủng vi sinh vật nhằm nâng cao hiệu quả của quá trình phân hủy vỏ cà phê thành phân bón hữu cơ Như trong nghiên cứu của tác giả Đào Thị Lan Hoa khi phân lập đã thu nhận được một số chủng vi sinh vật có năng lực phân giải tốt các hợp chất hữu cơ trong vỏ cà phê và cũng đã thử nghiệm bước đầu năng lực phân giải

vỏ cà phê khi ủ với các chủng này cho thấy tỉ lệ C/N của mẫu vỏ cà phê được

xử lý giảm 30,66% so với công thức đối chứng Tuy nhiên, các chủng vi sinh vật này chưa được định tên rõ để có hướng ứng dụng thích hợp [5]

Tuy nhiên các kết quả nghiên cứu về vấn đề tuyển chọn chủng cũng mới chỉ dừng lại ở đặc tính của chủng ở khía cạnh sinh các enzym phân giải các chất trong vỏ cà phê như: pectin, cellulose, tinh bột… nhưng chưa nghiên cứu sâu và chưa tạo được chế phẩm vi sinh chuyên biệt cho mục đích xử lý loại chất thải này

Như vậy, để có thể tạo ra các sản phẩm như phân bón hữu cơ hoặc giá thể hữu cơ từ nguồn nguyên liệu vỏ cà phê này một cách hiệu quả, cần phải có các nghiên cứu về tạo và phát triển các chế phẩm vi sinh chuyên biệt

1.3 Nhu cầu giá thể trồng rau sạch ở đô thị Việt Nam

Trong những năm gần đây, tốc độ đô thị hóa ở Việt Nam ngày càng nhanh Diện tích đất trồng trọt bị thu hẹp Việc tìm kiếm các khoảng không gian ở thành phố để trồng rau sạch, hoa, cây cảnh là vấn đề nan giải Chính vì vậy, việc trồng cây trên giá thể (trồng cây không cần đất) đã từng bước được phát triển ở Việt Nam Với cách trồng cây truyền thống, chúng ta thường trồng cây trên môi trường đất Có thể nói đất là môi trường chứa nước và các chất dinh dưỡng giúp cây hấp thụ, phát triển Ngày nay, ngoài việc dùng đất

để trồng cây người ta còn sử dụng một phương pháp khác để trồng, đó là trồng cây trên giá thể Đây thực chất là một kỹ thuật trồng cây không dùng đất

mà cây được trồng trực tiếp trên các giá thể hữu cơ hay giá thể trơ cứng có tưới dung dịch dinh dưỡng

Với xu hướng phát triển nông nghiệp bền vững, việc sử dụng giá thể hữu cơ để trồng rau đã được quan tâm nhiều tại Việt Nam Hiện nay, đã có một số biện pháp sử dụng các loại giá thể để trồng rau sạch bằng phương pháp thủy canh trên quy mô lớn như trấu, xơ dừa, hoặc phối trộn trấu với xơ dừa theo các tỉ lệ khác nhau [10] Tuy nhiên, việc nghiên cứu sử dụng vỏ cà phê

để làm giá thể hữu cơ trồng rau thì chưa có nhiều nghiên cứu ứng dụng

1.4 Tổng quan về giá thể hữu cơ

Giá thể: Là cách gọi chung cho hỗn hợp hoặc vật liệu có khả năng cung

cấp những điều kiện thuận lợi nhất cho cây trồng phát triển Giá thể có thể là một nguyên liệu đơn lẻ hoặc được trộn từ nhiều nguyên liệu thô với nhau dựa trên ưu điểm của từng loại

Thành phần giá thể: Tùy theo đặc tính mỗi loại cây mà giá thể sẽ có

những thành phần phù hợp khác nhau Tuy nhiên, theo các chuyên gia, giá thể

nền hữu cơ nên có độ pH dao động từ 5 - 6.8° Phần đất sạch hữu cơ chiếm 60%, còn lại là phân chuồng, mùn hữu cơ (ủ mục) hoặc tro trấu

Đặc điểm giá thể nền hữu cơ: Một giá thể hữu cơ lí tưởng để trồng trọt

phải đáp ứng đủ các tiêu chí sau: Có khả năng hút ẩm nhanh và dễ dàng Giữ nước và duy trì độ ẩm tốt; Tơi xốp, thoáng khí; Có độ pH trung tính và ổn định; Có thể tái sử dụng hoặc phân hủy an toàn ra môi trường; Sạch bệnh, an toàn, không có nguồn lây nhiễm; Giá trị dinh dưỡng cao, đảm bảo nhu cầu thiết yếu cho cây

Công dụng giá thể nền hữu cơ: Giá thể nền hữu cơ đều được tiệt trùng,

đảm bảo sạch bệnh, không nhiễm nấm trước khi đưa vào canh tác Do đó, giá thể vô cùng an toàn, không độc hại với cây trồng

Với đặc tính tơi xốp, giá thể hữu cơ giúp giữ ẩm và các chất dinh dưỡng hiệu quả Đối với những khu vực có điều kiện trồng trọt khó khăn như không có đất sạch canh tác, đất đai nghèo chất dinh dưỡng… thì giá thể hữu

cơ là một lựa chọn hoàn hảo lúc này Không chỉ vậy, giá thể có khả năng hỗ trợ cây trồng sinh trưởng và phát triển tốt Đảm bảo sản lượng nông sản Ngoài ra, giá thể có thể tái sử dụng hoặc phân hủy tự nhiên Góp phần bảo vệ

môi trường hiệu quả [6]

1.5 Tình hình sản xuất giá thể hữu cơ từ phế phụ phẩm

1.5.1 Tình hình nghiên cứu về sản xuất giá thể hữu cơ trên thế giới

Các nhà khoa học từ lâu đã rất chú trọng nghiên cứu về việc sử dụng và phát triển các loại giá thể để trồng các loại cây do những lợi ích to lớn và hiệu quả kinh tế, môi trường mà chúng mang lại Như trung tâm nghiên cứu phát triển rau Châu Á khi nghiên cứu về giá thể cho cây con, việc sử dụng các giá thể truyền thống như phối trộn than bùn và chất khoáng thành giá thể phù hợp đối với sinh trưởng, phát triển của cây con

Theo đánh giá của các chuyên gia nông nghiệp, sự gia tăng nhu cầu của người tiêu dùng đối với các sản phẩm cây trồng hữu cơ trong những năm gần

đây đã được rất nhiều nhà sản xuất ở Hoa Kỳ công nhận Khi mối quan tâm đến sản xuất hữu cơ tăng lên, việc quan tâm áp dụng đến các phương pháp sản xuất hữu cơ cũng được quản lý chặt chẽ trong đó có việc quản lý chất lượng của các giá thể được sử dụng trong nuôi trồng hữu cơ [56]

Công nghệ canh tác không sử dụng đất đã được công nhận trên toàn cầu

về mặt hiệu quả trong sản xuất cây trồng Việc sử dụng các vật liệu và chất nền

có tính xốp để cung cấp nước và chất dinh dưỡng cho cây trồng Tuy nhiên, cho tới thời gian gần đây các nhà khoa học khi lựa chọn các loại vật liệu thành phần trong giá thể trồng trọt chủ yếu lại dựa trên việc cân nhắc về hiệu suất và tính kinh tế kết hợp với khía cạnh bảo vệ môi trường và như vậy các nghiên cứu hiện nay tập trung nhiều vào các nguồn vật liệu tái tạo từ các dòng chất thải nông nghiệp, công nghiệp và đô thị Một số những nghiên cứu thực nghiệm đã được

tiến hành ở cấp độ thử nghiệm và một số ít được đưa lên quy mô lớn hơn [42]

Tác giả Bita Wisdom và cộng sự đã nghiên cứu phối trộn giá thể hữu

cơ từ vỏ thông với chất khoáng để đánh giá hiệu quả khi trồng rau cải củ trên khay nổi không cần đất cho thấy rằng: Với việc phối trộn vỏ thông trong giá thể chứa khoáng thúc đẩy tăng tổng độ xốp và làm giảm tỉ lệ thối củ cải [37]

Tác giả Jie Feng và cộng sự nghiên cứu sử dụng rơm ủ để thay thế cho vật liệu than bùn trong giá thể trồng rau Kết quả cho thấy rằng, trong tất cả các nghiệm thức có bổ sung rơm ủ để trồng cây đều cải thiện về tốc độ tăng trưởng và nguyên tố dinh dưỡng so với đối chứng [48]

Trong nghiên cứu gần đây, tác giả Danilo Escobar-Avello đã sử dụng chất xơ từ vỏ cây thông và vỏ cây bạch đàn để ủ giá thể hữu cơ sau khi được

xử lý bằng nước 70oC trong 70 phút để loại bỏ nước và thành phần gây độc Theo dõi sự nảy mầm và tăng trưởng của hạt giống củ cải và cải thảo trên giá thể từ vỏ bạch đàn và vỏ thông cho thấy: khi kết hợp 75% chất xơ chiết xuất

từ bạch đàn và 25% giá thể thương mại như than bùn, xơ dừa, rêu và vỏ thông

ủ cho kết quả phù hợp nhất đối với sự nảy mầm của hạt [38]

1.5.2 Nghiên cứu và phát triển giá thể hữu cơ ở Việt Nam

Đối với nước ta, sự quan tâm của người tiêu dùng hiện nay đã gia tăng đáng kể đối với các sản phẩm hữu cơ Nền nông nghiệp hữu cơ của nước ta cũng đang trên đà phát triển mạnh

Nhiều loại giá thể hữu cơ đã được đưa ra thị trường như GT05 của Viện Thổ nhưỡng Nông hóa, Đasa của Công ty Đất sạch Bến Tre, Đất trồng cây hệ Multi của Công ty Nguyên Nông - GINO Co, Ltd Các loại giá thể này chủ yếu là mụn dừa đã qua xử lý

Các nhà khoa học vẫn đang không ngừng nghiên cứu để sản xuất ra những loại giá thể chuyên biệt cung cấp cho nền nông nghiệp hữu cơ Trong nghiên cứu của tác giả Nguyễn Ngân Hà, khả năng sử dụng một số loại giá thể để sản xuất rau mầm củ cải trắng an toàn, chất lượng cao theo quy mô hộ gia đình Kết quả nghiên cứu cho thấy, rau mầm củ cải trắng trồng trên giá thể mụn xơ dừa có tỉ lệ nảy mầm lớn nhất (99%), hàm lượng chất khô 5,51%, hàm lượng nước 94,49%, cho năng suất cao nhất (242,54g/m2) Giá thể trấu hun tuy chỉ cho năng suất rau đứng thứ hai, hàm lượng vitamin C, protein thô không cao nhưng rau thu hoạch vẫn đảm bảo độ an toàn [10]

Võ Hoàng Anh Thy và cộng sự cũng đã nghiên cứu về việc phối trộn giữa rơm rạ và bã mía để ủ tạo giá thể trồng rau Kết quả cho thấy sau 8 tuần

ủ nguyên liệu với tỷ lệ rơm rạ/bã mía là 7,5/2,5 có lệ C/N đạt 34,8 và hàm lượng cellulose giảm còn 22,81 Giá thể khi trồng rau cải đỏ sau 45 ngày khối lượng trung bình là 21,4g [21]

Chương 2

MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Mục tiêu của đề tài

Mục tiêu chung: xây dựng được quy trình xử lý hiệu quả vỏ cà phê thành giá thể hữu cơ để trồng một số loại rau, hoa, cây cảnh

Đánh giá được chất lượng và hiệu quả của giá thể hữu cơ từ vỏ cà phê

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật có các thuộc tính hữu ích để xử lý vỏ cà phê tạo giá thể hữu cơ

- Nghiên cứu quy trình xử lý vỏ cà phê thành giá thể hữu cơ

- Nghiên cứu đánh giá chất lượng giá thể hữu cơ được sản xuất từ vỏ cà phê và hiệu quả của giá thể trên rau mầm

2.3 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu

2.3.1 Đối tượng nghiên cứu

Vỏ cà phê sau quá trình tách vỏ để thu nhân cà phê

Các chủng vi sinh vật có trong vỏ cà phê đang phân hủy

2.3.2 Dụng cụ và hóa chất

Dụng cụ: Các thùng xốp kích thước 60 x 40 x 30cm có nắp đạy để ủ giá thể, kích thước 30 x 20cm để trồng rau mầm Xô nhựa thể tích 20 lít pha chế phẩm; nhiệt kế; máy đo pH; máy sấy; máy cất đạm

Hóa chất: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu là các hóa chất thông dụng (do Việt Nam, Trung Quốc sản xuất), NaCl, KCl, KH2PO4, cao nấm men (Trung Quốc), Pepton (Trung Quốc), agar, tinh bột, sodium carboxymethyl cellulose (CMC) và các chất nhuộm màu: lugol, tím kết tinh, fuchsin…

Thành phần môi trường:

Môi trường NA: cao nấm men: 3g/l; pepton: 10g/l; NaCl: 10g/l

Môi trường PDA (potato dextrose agare: chiết khoai tây 200g/l; Dextrose: 20g/l và Agar: 15g/l

Môi trường NB (pepton: 5g/l; NaCl: 5g/l; cao nấm men 3g/l)

Môi trường Crapeck: sacarose: 30,0g/l; NaNO3: 2,0g/l; K2HPO4: 1,0g/l; MgSO4: 0,5g/l; KCl: 0,5g/l; FeSO4: 0,01g/l)

Môi trường lỏng Norris không chứa nguồn ni tơ (Glucose 10g/l;

K2HPO4 1,0g/l; MgSO4: 0,2g/l; CaCO3: 1,0g/l; NaCl 0,2g/l; Natri molypdat: 0,005g/l; FeSO4: 0,1g/l; pH =7,0)

2.3.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 6 năm 2022 đến tháng 6 năm 2023 Địa điểm nghiên cứu: Phân hiệu Trường Đại học Lâm nghiệp tại tỉnh Gia Lai; Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Trường Đại học Lâm nghiệp, Xuân Mai, Chương Mỹ, Hà Nội

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp xác định một số chất trong vỏ cà phê

Phế phụ phẩm là vỏ cà phê sau quá trình tách nhân cà phê được thu gom và xác định hàm lượng chất dinh dưỡng theo các phương pháp được trình bày trong bảng 2.1 như sau:

Bảng 2.1 Xác định các chất trong vỏ cà phê

Phương pháp

TCVN 9294:2012 [15]

TCVN 8557:2010 [12]

TCVN 8559:2010 [13]

TCVN 8560:2010 [14]

TCVN 9297:2012 [16]

2.4.2 Phương pháp phân lập và tuyển chọn vi sinh vật hữu ích từ vỏ cà phê

2.4.2.1 Phân lập vi sinh vật từ vỏ cà phê

Các mẫu vỏ cà phê thải đang phân hủy được ở lấy tại địa điểm dưới tán vườn cà phê tại tán vườn cà phê tại phường Chi Lăng Cân chính xác 1 gam

và nghiền nhỏ rồi pha loãng bằng nước cất vô trùng đến nồng độ 10-7 - 10-9

Lấy 50 μl dịch mẫu, trang đều lên các đĩa petri có chứa môi trường NA

đã được tiệt trùng ở 121oC trong 20 phút để phân lập, nuôi trong tủ nuôi ở nhiệt độ 35 - 37oC trong 24 - 36 giờ với vi khuẩn, 72 giờ với nấm Chọn những khuẩn lạc vi khuẩn và nấm xuất hiện riêng rẽ trên đĩa thạch để cấy ria

và làm thuần trên các đĩa môi trường tương ứng mới [9]

Để tuyển chọn các chủng vi sinh vật có năng lực chuyển hóa các chất hữu cơ trong vỏ cà phê hiệu quả, các khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa môi trường phân lập được tách và chuyển sang môi trường mới, NA (đối với vi khuẩn) hoặc PDA (đối với nấm), môi trường này được bổ sung 1% đối với các cơ chất tinh bột, CMC, pectin, cazein Sau khi cấy, các đĩa được nuôi trong tủ nuôi ở nhiệt độ 35oC trong 24 - 36 giờ với vi khuẩn, 72 giờ với nấm Sau thời gian nuôi, các đĩa môi trường được nhuộm với thuốc thử lugon hoặc công gô

đỏ để xác định khả năng phân giải cơ chất của các chủng [9]

2.4.2.2 Tuyển chọn các chủng hữu ích

a Tuyển chọn các chủng có năng lực phân giải hợp chất hữu cơ

Các chủng vi sinh vật phân lập được từ vỏ cà phê sẽ được kiểm tra các hoạt tính sinh tổng hợp enzym giải cơ chất (cellulose, protein, xylan, pectin) thông qua xác định hoạt độ enzym tương ứng trong môi trường nuôi cấy Theo đó, các chủng sơ bộ có hoạt chất phân giải cơ chất được nuôi cấy trong môi trường NB với vi khuẩn môi trường Crapeck với nấm ở điều kiện thích hợp và sau thời gian 48 giờ (vi khuẩn) và 120 giờ (nấm) Ly tâm ở 6000 vòng/phút thu dịch nuôi cấy để xác định hoạt tính enzym thô theo phương pháp xác định vòng phân giải cơ chất trên đĩa thạch [34, 35] Các chủng có năng lực phân giải tốt các cơ chất được tuyển chọn và lưu giữ để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo

b Tuyển chọn chủng có năng lực tổng hợp các hợp chất hữu ích cho cây

Xác định năng lực sinh tổng hợp IAA của các chủng tuyển chọn

Hàm lượng IAA được tạo ra trong dịch lên men vi sinh vật được xác định bằng phương pháp so màu với thuốc thử Salkowski được mô tả bởi

Shraddha Gang và cộng sự [28]

Theo đó, vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng có bổ sung 1% Triptophan, nuôi lắc 125 - 150 vòng/phút trong tủ tối ở 35oC trong 72 giờ Hàm lượng IAA thô sinh ra trong dịch nuôi cấy được xác định bằng phương pháp thực hiện phản ứng màu với thuốc thử Salkowski tạo ra sản phẩm có màu, đo cường độ màu trên máy quang phổ so màu ở bước sóng 530 nm, dựa vào đồ thị chuẩn IAA đã được xây dựng xác định được hàm lượng IAA có trong dịch nuôi cấy Đường chuẩn được dựng với các mẫu có nồng độ IAA chuẩn khác nhau, có dạng: y = Ax + b

 Xác định khả năng cố định nitơ của các chủng tuyển chọn

Các chủng tuyển chọn được nuôi trong môi trường lỏng Norris không chứa nguồn ni tơ, nhiệt độ nuôi cấy 35oC với vi khuẩn và 30oC với nấm, lắc

150 vòng/ phút Sau 48 giờ với khuẩn và 96 giờ với nấm tiến hành xác định mật độ các chủng có thể phát triển trong môi trường Norris

Các chủng phát triển tốt trên môi trường Norris được nuôi cấy sang môi trường lỏng Ashby, nuôi lắc ở 125 vòng/phút, 30oC trong 72 giờ với khuẩn và

120 giờ với nấm Ly tâm thu dịch trong và xác định nồng độ NH4+ có trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp so màu với thuốc thử Nessler, sử dụng đường chuẩn amonium [23]

2.4.3 Phương pháp xác định đặc tính sinh hóa và định tên các chủng tuyển chọn

2.4.3.1 Dựa trên đặc điểm hình thái và đặc tính sinh hóa

Theo các phương pháp trong sổ tay phân loại vi sinh vật [33], mô tả hình thái, đặc điểm tế bào và khuẩn lạc, đặc điểm Gram để định tên sơ bộ các chủng

2.4.3.2 Dựa trên sinh học phân tử

a Định tên vi khuẩn

 Tách DNA tổng số từ vi khuẩn

- Cấy chuyển khuẩn lạc đơn vào 10ml môi trường LB, lắc 200v/p, ở

30oC qua đêm

- Ly tâm dịch nuôi ở 5000v/p trong 5 phút

- Sinh khối thu được hòa vào 1ml đệm phá tế bào, lắc đều

- Hỗn dịch được ly tâm ở 5000v/p trong 5 phút

- Tế bào được hoà lại trong 0,4ml TE và bổ sung lysozym (200g/ml), trộn đều, ủ ở 37oC trong 1 giờ, sau đó bổ sung 10l proteinase K, ủ 80oC trong 1 giờ

- Tiếp tục bổ sung 600l phenol/chloroform, trộn đều

- Ly tâm hỗn dịch 13000v/p trong 5 phút để thu dịch nổi

- Thêm 600l chloroform/isoamylalcolhol (24:1 v/v) vào dịch nổi, trộn đều và ly tâm 13000v/p trong 10 phút để thu dịch nổi

- Tủa lại bằng cách bổ sung 50l Na2CO3 3M và 1ml cồn tuyệt đối, trộn đều Ủ hỗn dịch ở -20oC trong 1 giờ

- Ly tâm 13000v/p trong 10 phút thu DNA tủa, rửa lại DNA bằng 0,5

ml cồn 70%

- Ly tâm 13000v/p trong 10 phút thu lại DNA và làm khô DNA bằng máy làm khô mẫu Hoà tan DNA hệ gen trong 50l nước vô trùng

 Nhân bản đoạn gen mã hóa 16S rRNA bằng phản ứng PCR

Trình tự cặp mồi: Để nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA bằng phản ứng PCR, cặp mồi được thiết kế với trình tự như sau:

Thành phần Thể tích

(l)

Primer xuôi (5  M) 1 Primer ngược (5  M) 1 Taq polymerase 0,5

 Xác định trình tự chuỗi nucleotid và xử lý số liệu

- Trình tự nucleotide của đoạn gen mã hóa 16S rRNA được gửi đi giải trình tự tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội

- Xử lý số liệu chuỗi nucleotid bằng phần mềm BLAST để so sánh trên genbank và xây dựng cây phân loại loài của các chủng [27]

b Định tên chủng nấm

DNA tổng số được tách chiết từ các chủng vi nấm sử dụng bộ hóa chất QIAamp DNA Mini Kit (#51304, QIAGEN, Hilden, Đức) DNA sau đó được kiểm tra chất lượng bằng máy đo quang phổ Nanodrop 1000 (Thermo Scientific) cùng điện di trên gel agarose 1%

Sau đó sử dụng phương pháp PCR để khuếch đại đoạn gen vùng ITS1 - 5,8S - ITS2 của mẫu nấm nội sinh Bộ mồi được sử dụng là mồi

ITS-5’- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’

Và 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ cho sản phẩm có đội dài khoảng 600 bp Hỗn hợp dung dịch được chuẩn bị trong ống PCR 0,2 ml với thành phần và liều lượng như trong bảng 2.3

để kiểm chứng nhiễm

Sau khi các phản ứng PCR đã được chuẩn bị xong, ống mix được đặt lên máy luân nhiệt ProFlex PCR System (Thermo Fisher) với chu trình gia nhiệt như bảng 2.4

Bảng 2.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR mồi ITS

35

Kết thúc phản ứng 4 ∞

Sau khi quá trình PCR kết thúc, tiến hành điện di trên gel agarose 1% nhằm kiểm chứng phản ứng khuếch đại thành công Sử dụng thang chuẩn GeneRuler™ 1Kb DNA Ladder để ước lượng độ dài của sản phẩm PCR Sản phẩm khuếch đại đạt tiêu chuẩn sẽ tiếp tục tinh sạch theo hướng dẫn của nhà sản xuất kit GeneJET PCR Purification Kit (Thermofisher Scientific)

Sau đó, tiến hành quá trình giải trình tự sử dụng Bigdye terminator v3.1 cycle sequencing kit (Thermofisher Scientific) Sản phẩm của quá trình tổng hợp được điện di trên hệ thống mao quản ABI 3500XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Mỹ) Trình tự DNA thu được đọc và kiểm tra chất lượng bằng phần mềm MEGA X [52] và BioEdit 7.0.5.3 [18] trước khi được đưa lên so sánh với các trình tự của các chủng nấm khác có trên cơ sở dữ liệu NCBI/Genbank bằng công cụ online BLAST

Phương pháp định danh hình thái: Sử dụng phương pháp phân loại truyền thống theo khóa phân loại để đánh giá đặc điểm hình thái của chủng vi nấm thuần khiết về mặt sinh học theo Nguyễn Lân Dũng [1]

2.4.4 Quy trình xử lý vỏ cà phê thành giá thể hữu cơ

2.4.4.1 Lên men thu sinh khối các chủng vi sinh vật

Các chủng vi khuẩn được nuôi trong môi trường lỏng NB, ở 35oC, lắc

150 vòng/phút và lấy mẫu xác định OD600 trong khoảng thời gian từ 12 đến

72 giờ Từ đường cong sinh trưởng sẽ xác định được thời điểm thu sinh khối thích hợp [24]

Các chủng nấm cũng được tiến hành nuôi trong môi trường lỏng Crapeck, 30oC, lắc 125 vòng/phút và xác định lượng sinh khối ướt trong khoảng thời gian từ 12 đến 120 giờ Từ đó xác định được thời điểm thu sinh khối thích hợp [24]

2.4.4.2 Phối trộn sinh khối vi sinh vật để xử lý vỏ cà phê

Sinh khối các chủng vi sinh vật sau lên men, ly tâm ở 6000 vòng/phút,

thu sinh khối, hòa tan trong nước muối sinh lý để đạt tới mật độ tế bào 108

cfu/ml với khuẩn, với nấm mốc đạt lượng 1g/ml sinh khối ướt, đem phối trộn dịch sinh khối các chủng theo tỉ lệ thể tích 1:1:1 để tạo hỗn hợp sinh khối

Hỗn hợp sinh khối được phối trộn với nguyên liệu vỏ cà phê theo tỷ lệ v/w thay đổi (trong bảng 02), với công thức đối chứng là công thức không phối trộn hỗn hợp sinh khối Các công thức phối trộn hỗn hợp sinh khối và nguyên liệu được ủ trong thùng xốp, theo sơ đồ như hình 2.2 sau:

Hình 2.2 Sơ đồ ủ nguyên liệu vỏ cà phê và hỗn hợp sinh khối

Thuyết minh sơ đồ: Chuẩn bị vỏ cà phê, đảo đều đều và trộn thêm lượng nhỏ phân chuồng, ure, phân lân, vôi bột, để bổ sung dinh dưỡng Trải vỏ phê khô đã phối trộn thành lớp cao 20 - 25cm Sau đó pha hỗn hợp sinh khối vi sinh vật với nước thành dung dịch rồi tưới đều lên lớp nguyên liệu để đạt tới độ ẩm 65 - 70% Sau đó trải thêm 1 lớp tương tự và tiếp tục tưới dung dịch đã pha sẵn cứ như vậy cho đến hết 20kg vỏ cà phê khô Sau khi tưới dung dịch xong đậy kín thùng xốp lại cho các vi sinh vật có ích phát triển, phân huỷ lượng vỏ cà phê và đảo trộn hai ngày

Vỏ cà phê

Bổ sung dinh dưỡng

Ủ 6 - 8 tuần Hỗn hợp VSV

Kiểm tra, đảo trộn Đánh giá chất lượng giá thể

1 lần Các thông số trong quy trình ủ giá thể theo bảng sau:

Bảng 2.5 Các công thức ủ giá thể từ vỏ cà phê

TT Vỏ cà phê

(kg)

Phân chuồng (kg)

Phân lân (kg)

U rê (kg)

Vôi bột (kg)

Hỗn hợp sinh khối (ml)

Các chỉ tiêu theo dõi được thực hiện theo các phương pháp sau:

- Nhiệt độ: Dùng nhiệt kế thủy ngân để xác định nhiệt độ đống ủ

- pH: sử dụng máy đo pH và thực hiện theo phương pháp TCVN 5779:2007

- Chiều cao đống ủ: Sử dụng thước có đơn vị đo độ dài

- Độ ẩm: sử dụng máy sấy và thực hiện theo phương pháp TCVN 9297-2012

- Trạng thái: Quan sát bằng mắt thường về độ ướt, độ tơi xốp của đống ủ

2.4.5 Phương pháp đánh giá các chỉ tiêu dinh dưỡng của giá thể hữu cơ

cơ từ vỏ cà phê

Đối chứng

cơ từ vỏ cà phê

2.4.6 Phương pháp đánh giá hiệu quả của giá thể hữu cơ từ vỏ cà phê

Hạt rau cải được lựa chọn đồng đều và gieo vào các thùng xốp nhỏ kích thước 30 x 20cm với sự bổ sung giá thể hữu cơ từ vỏ cà phê theo các công thức được bố trí trong bảng 2.7: Các công thức được xử lý hạt rau (số lượng, đồng đều) và tưới ẩm như nhau

Bảng 2.7 Bố trí thí nghiệm trồng rau cải với giá thể hữu cơ từ vỏ cà phê

2.4.7 Phương pháp thu thập và xử lý kết quả

Các thí nghiệm đều được thực hiện với 3 lần lặp Các kết quả nghiên cứu là trung bình của 3 lần lặp lại

Chương 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả xác định thành phần các chất của nguyên liệu vỏ cà phê

Theo kết quả phân tích về thành phần dinh dưỡng của một số nguyên liệu của Viện Quy hoạch và thiết kế nông nghiệp, vỏ cà phê khô có chứa các thành phần dinh dưỡng khá cao: chất hữu cơ tổng số chiếm 41,1%, đạm tổng số chiếm 2,5%; P2O5 0,23%; K2O 3,15%; CaO 0,35%; MgO 1,49%; S 0,67% [25] Với hàm lượng các chất này hoàn toàn phù hợp làm nguồn nguyên liệu chế biến các sản phẩm hữu cơ tốt cho cây trồng như: Phân hữu cơ, giá thể hữu cơ

Từ các phương pháp phân tích, đề tài cũng đã tiến hành phân tích chất lượng vỏ cà phê khô tại Chi Lăng - Gia Lai, kết quả phân tích được trình bày trong bảng 3.1

Kết quả phân tích trong bảng 3.1 cho thấy, tổng hàm lượng các bon hữu

cơ của vỏ cà phê ở Chi Lăng - Gia Lai đạt 39,8%; đạm tổng số chiếm 3,04%;

P2O5 0,31%; K2O 2,98%; độ ẩm 34,6% So với công bố trước đó của Viện Quy hoạch và thiết kế nông nghiệp thì các chỉ tiêu phân tích được trong mẫu

vỏ cà phê dùng làm nguyên liệu không khác nhau nhiều Qua bảng phân tích

có thể thấy, vỏ cà phê hoàn toàn có thể đáp ứng làm nguồn nguyên liệu tốt để sản xuất giá thể hữu cơ

So với một số nguyên liệu phổ biến và truyền thống để sản xuất giá thể

và phân bón hữu cơ như than bùn thì vỏ cà phê được đánh giá là nguyên liệu giàu dinh dưỡng và phù hợp hơn do còn chứa các nguyên tố trung và vi lượng như Ca, Mg, S, Zn, Cu với hàm lượng tương đương so với các loại nguyên liệu hữu cơ truyền thống như phân chuồng, than bùn [25] Do vậy có thể nói,

vỏ cà phê sản xuất giá thể trồng cây, rau góp phần bổ sung sự cân đối các yếu

tố dinh dưỡng đa, trung, vi lượng cho cây trồng, trên cơ sở đó tăng năng suất

và cải thiện chất lượng nông sản [28]

3.2 Kết quả phân lập và tuyển chọn vi sinh vật hữu ích từ vỏ cà phê

3.2.1 Kết quả phân lập vi sinh vật từ mẫu vỏ cà phê

Từ 10 mẫu vỏ cà phê đang phân hủy và đất dưới tán ở vườn cà phê, đề tài đã phân lập được 17 chủng vi sinh vật riêng rẽ, trong đó có 12 chủng vi khuẩn và 05 chủng nấm riêng rẽ trên đĩa môi trường dinh dưỡng đặc Đặc điểm khuẩn lạc và ký hiệu các chủng được thể hiện trong bảng 3.2

Bảng 3.2 Đặc điểm của các chủng vi sinh vật được phân lập từ vỏ cà phê

Đặc điểm khuẩn

1 CF 1

Đất dưới tán cà phê

Khuẩn lạc tròn, bề mặt trơn lồi bóng, viền trơn, màu trắng sữa, đường kính (1,5 - 2,5mm)

-

2 CF 2

Đất vườn

cà phê

Khuẩn lạc tròn, viền trơn, bề mặt lồi, trơn, màu trắng đục, bám chắc thạch, đường kính (2 - 3mm)

-