Bài giảng xu hướng phát triển thực phẩm thiết kế cấu trúc biểu hiện gen

Yêu cầu của phương phápchuyển gen vào tế bào u Ổn định trong hệ gen vật chủ u Đoạn gen chuyển đảm bảo không bị sắp xếp lại để đảm bảo gen hoạt đông tạo sản phẩm và tính trạng mong muốn u

Thiết kế cấu trúc biểu hiện gen

u Một cấu trúc biểu hiện gen cần:

u Đầy đủ các yếu tố để đảm bảo sự biểu hiện gen đúng

u promoter phù hợp

u Chọn các trình tự tham gia điều hòa biểu hiện gen thích hợp

u Gen đích phải đúng về trình tự (tạo protein trình tự đúng)

u Để tạo được cấu trúc biểu hiện cần sử dụng các kỹ thuật: nhânDNA, cắt, ghép nối, biến nạp gen, tinh sạch….thực hiện trên cácplasmid trung gian trong vật chủ trung gian

u Cấu trúc biểu hiện thường được giữ trong các plasmid trung gianđể có thể nhân lên số lượng lớn

Thiết kế cấu trúc biểu hiện gen

u Promoter: phổ biến là: 35S (CaMV) từ virus gây bệnh

khảm súp lơ (sử dụng trong 80% cây biến đổi gen hiện

nay)

u Terminator: phổ biến là 3’nos: trình tự kết thúc từ gen

tổng hợp nopaline synthesase của Agrobacterium

Promoter Vùng mã hóa protein Terminator

Đưa lên “phương tiện” chuyển gen

u Gen chuyển vào vật chủ có thể nằm trên plasmid độc lập với hệ gen vật chủ (vật chủ là sinh vật nhân sơ), hoặc gắn lên hệ gen của vật chủ(vật chủ là sinh vật nhân chuẩn)

u Phương tiện chuyển sử dụng phụ thuộc vào phương pháp chuyển gen:

u Plasmid chuyển gen: Ti-plasmid với phương pháp dùng Agrobacterium

tumafaciens

u Hạt nano vàng/wolfram: phương pháp bắn gen

u Với phương tiện là plasmid, để đưa cấu trúc biểu hiện plasmid cần sửdụng các kỹ thuật: nhân gen, cắt và ghép nối…

Các phương pháp biến

nạp gen vào vật chủ

Yêu cầu của phương pháp

chuyển gen vào tế bào

u Ổn định trong hệ gen vật chủ

u Đoạn gen chuyển đảm bảo không bị sắp xếp lại để đảm bảo gen hoạt đông tạo sản phẩm và tính trạng mong muốn

u Đơn giản, dễ kiểm soát

u Không ảnh hưởng tới các quá trình trao đổi chất thông thườngcủa vật chủ

Ở thực vật

u Sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

u Súng bắn gen

u Dung hợp tế bào trần

Chuyển gen bằng

Agrobacterium tumafaciens

u Vi khuẩn gây khối u ở thực vật

u Có thể chuyển đoạn DNA vào tế bào thực vật, tạo khối u

để làm nơi cư trú của vi khuẩn

u tạo opine là nopalin và octopin là chất dinh dưỡng chochúng trong khối u

u Khả năng tạo khối u của vi khuẩn này là nhờ các gen trênplasmid có trong tế bào vi khuẩn, gọi là Ti plasmid –

(Tumor inducing plasmid)

u Vi khuẩn xâm nhập vào vết thương của thực vật, nhanhchóng chuyển 1 đoạn DNA chứa gene tổng hợp opine vàgen tạo u vào hệ gen thực vật, gây u và tạo opine chochúng phát triển

phải (Left border) và

bờ trái (right Border)

u Đoạn DNA gắn vào hệ

gen của tế bào thực vật

Vùng khởiđộng táibản

Phângiảinopaline

Hệ thống 2 plasmid dùng để chuyển gen vào thực vật

Đoạn gen cần chuyển

Chuyển gen bằng

Agrobacterium tumafaciens

Chuyển gen bằng

Agrobacterium tumafaciens

Đưa vào

tế bàothực vật

Điểm cắt

giới hạn

Đoạn DNA cần sửdụng

Gắn đoạnDNA vào Tiplasmid

NST thực vậtmang T-DNA

Tái sinhcây

Cây vớiđặc tínhmới

Chuyển gen bằng súng bắn gen

u DNA cần chuyển được phủ lên

So sánh 2 phương pháp chuyển gen

Bắn gen vào tế bào thực vật, gen chèn vào NST

Chọn lọc tế bào với chỉ thị chọn lọc

Cây trồng tạo

ra từ tế bào

Chuyển gen bằng dung hợp tế bào trần

u Tạo tế bào thực vật không có thành tế bào bằng phângiải pectin, cellulose

u Chuyển gen bằng 1 trong 2 cách

u Sử dụng polyethyleneglycol, các tế bào trần hoà lẫn, DNA

đi vào tế bào trần

u Xung điện chuyển DNA vào tế bào trần

u Việc tái sinh khó khăn à hạn chế sử dụng

Một số phương pháp chuyển gen vào thực vật khác

u Vi tiêm (chủ yếu cho động vật)

u Siêu âm

u Dùng tia laser

u Chuyển gen qua ống phấn

Chuyển gen vào tế bào vi sinh vật

u Tế bào vi sinh vật thường dễ hơn thực vật và động vật

u Các phương pháp chính

u Sốc điện (electroporation)

u Sốc nhiệt (heat shock)

u Dung hợp tế bào trần

u Yêu cầu tế bào phải được sử lý thành tế bào “khả biến”

(dễ dàng cho sự biến nạp, chuyển DNA vào tế bào)

Chuyển gen vào vi sinh vật

u Phương pháp sốc điện

Trước khi sốc điện Trong quá trình sốc Sau quá trình

Màng tế bào

Gen đưa vào

Điện trường tạo ratrong và ngoài màng

tế bào

Màng tế bàophục hồi

Chuyển gen vào vi sinh vật

u Phương pháp sốc nhiệt

u Tế bào vi sinh vật được

xử lý và bổ sung Ca2+,

u Khi bổ sung DNA, điện

tích âm, liên kết với

Ca2+, gắn trên màng tế

bào

u Khi sốc nhiệt (bên ngoài

nhiệt độ cao, bên trong

Chuyển gen vào tế bào động vật

u Vi tiêm: Lượng DNA nhỏ được tiêm trực tiếp

vào nhân tế bào phôi trần/hoặc tế bào

nguyên vẹn dưới kính hiển vi quang học

Chuyển gen vào tế bào động vật

u Sử dụng virus

(retrovirus): đưa DNA

của retrovirus mang

đoạn gen cần chuyển

Chuyển gen ở động vật

u Chuyển gen vào tế bào gốc:

Tế bào ở giai đoạn 16-32 tế

bào là tế bào gốc, từ đó có

thể phát triển thành các

loại tế bào nhau của cơ thể

sinh vật Các tế bào gốc này

được tách chiết và cấy gen

ngoại lai vào

Đánh giá sự hiện diện của gen chuyển trong vật chủ

Điều gì xảy ra khi DNA được

chuyển vào vật chủ

u Không chèn được vào hệ gen?

u Chèn được vào hệ gen

u Theo như dự kiến: trình tự đúng, sắp xếp P-ORF-T đúng (để đảm bảo sự biểu hiện của gen)

u Không như dự kiến: thay đổi sắp xếp trình tự, thay đổi P-ORF-T…làm mất chức năng của gen đưa vào, bị đội biến, bị cắt nhỏ

u Gen chèn được vào hệ gen có tồn tại ổn định theo các thế hệ hay

không? Hay sẽ bị loại bỏ khi sang các thế hệ con cháu sau?

u Nếu cấu trúc biểu hiện được chèn vào hệ gen ổn định, đúng à liệu sựbiểu hiện ra protein của nó như thế nào? Phân bố như thế nào trong các

bộ phận của vật chủ? (ví dụ, trong lá, rễ, củ, hạt…?)

Phương pháp phát hiện DNA

•Điện di kiểm tra sản phẩm nhân gen

• Nếu có sản phẩm PCR: đúng kích thước dự kiến à có đoạn DNA chuyển vào trên DNA hệ gen vật chủ

• Nếu không có sản phẩm à không có đoạn DNA chuyển vào hoặc

bị biến đổi dẫn tới đoạn mồi đặc hiệu không bắt cặp được

Phương pháp phát hiện DNA

u Lai Southern blot:

u sử dụng các mẫu dò (probe) là các

đoạn DNA ngắn bắt cặp được (theo

nguyên tắc bổ sung) với một vùng nào

đó trên đoạn gen đưa vào vật chủ cần

phát hiện Mẫu dò thường được gắn

thêm các đuôi để có thể phát hiện

được nó

u Phương pháp Southern blot được thiết

kế để xác định sự hiện diện, kích

thước, số lượng bản sao của đoạn DNA

đó trong hệ gen

Phương pháp phát hiện DNA

u Giải trình tự đoạn DNA khu vực mang đoạn chèn để xem có sự sai khác về trình tự hay sắp xếp lại của cấu trúc biểu hiện hay không?

u Phương pháp hoá học Maxam - Gibert

u Phương pháp enzyme Sanger

Phương pháp phát hiện RNA Northern blot

u Tương tự lai Southern blot,

nhưng áp dụng cho RNA

u Sử dụng mẫu dò lai (bắt cặp) đặc

hiệu với đoạn RNA cần phát hiện

à nếu có tín hiệu à có RNA

Phương pháp xác định protein

u Gen đưa vào sẽ tạo ra protein mới à cần xác định protein này định tính (có hay không) hoặc định lượng (hàm lượngbao nhiêu)

u Dựa trên tương tác giữa protein (coi là một kháng

nguyên) với kháng thể kháng protein đó

u Định tính: Western blot

u Định lượng: ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay): phản ứng miễn dịch hấp phụ liên kết enzyme

Phương pháp Western blot

u Ví dụ: lai cây ngô có tính kháng sâu với giống ngô phát triểntốt ở điều kiện Việt Nam (năng suất cao, dễ canh tác…)