Bài giảng phương pháp đánh giá chất lượng thực phẩm (phần 4) chương 4 hồ phú hà, vũ thu trang

• Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng và có khả năng thể hiện các đặc tính lên men đục, đổi màu, sinh khí, mùi… • Pha loãng mẫu liên tiếp theo bội số của 10 cho tới khi kết

Chương IV : Phân tích các chỉ

tiêu vi sinh vật

4.1 Chuẩn bị mẫu phân tích vi sinh

4.1.1 Phương pháp lấy mẫu

4.1.2 Vận chuyển và bảo quản mẫu

Pha loãng mẫu

• Các dung dịch pha loãng

1

Một số dung dịch pha loãng

đặc biệt

• Dung dịch Natri citrat (dùng cho phomat,

phomat chế biến, sữa sấy màng)

– Na3C6H5O7.2H2O 20 g/L

• Dung dịch dikali hidro phosphat 20g/L

– pH7,5: caseinat, phomat, phomat chế biến,

• Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng và

có khả năng thể hiện các đặc tính lên men (đục, đổi

màu, sinh khí, mùi…)

• Pha loãng mẫu liên tiếp theo bội số của 10 cho tới

khi kết quả âm tính

• Mỗi độ pha loãng cần nuôi cấy 3 ống lặp lại ở điều

Phương pháp MPN

Chuẩn bị và pha loãng mẫu

Cấy mẫu vào trong ống nghiệm chứa môi trường (mỗi độ pha loãng 3 ống)

Nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp

Đọc kết quả, xác định số đặc trưng, tra bảng Mc Grady, tính kết quả

Phương pháp MPN

7

Chọn số đặc trưng

9

Tính số tế bào

Phương pháp đếm khuẩn lạc

11

Phương pháp đếm khuẩn lạc

• Đơn vị hình thành khuẩn lạc (cfu) là gì?

13

Tính số lượng vi sinh vật

• Quan sát và đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa

(30-300).

• Tính tổng số VSV theo công thức :

• ΣC - tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa

• n1 - số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 1

• n2 - số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 2

• f1 - Hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ 1

15

Báo cáo kết quả

• Theo TCVN 6264:1997:

– Giữ lại đĩa có số khuẩn lạc từ 10-300

– Tính số khuẩn lạc theo công thức

– Nếu tất cả đều ít hơn 10 khuẩn lạc?

– Nếu tất cả đều nhiều hơn 300 khuẩn lạc?

– Đơn vị của N?

được 14 và 25 khuẩnlạc → tính số cfu

trong 1 ml mẫu ban đầu?

1 Định lượng tổng số vi sinh vật

• Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí, ưa ấm có trong SPTP

để đánh giá mức độ nhiễm tạp, tinh trạng vệ sinh, điều kiện

bảo quản và dự đoán khả năng hư hỏng của ẩn phẩm

1 Nguyên tắc:

-Nuôi cấy môi trường thạch dinh dưỡng, 301 0 C, hiếu khí,

48–72 giờ

-Đếm tất cả số khuẩn lạc mọc trên đó ➔ số lượng tế bào sống có

trong mẫu phân tích

• Tổng số VSV = VSV tồn tại và phát triển được trên môi

trường dinh dưỡng chung, ở 300C, 24 - 72giờ

Phương pháp chuẩn : kỹ thuật đếm khuẩn lạc

Quy trinh ph©n tÝch VSV tổng sốChuẩn bị và pha lo·ng mẫu

•Nuôi cấy trên / trong môi trường thạch

(30 o C, 24-72 h).

Quan s¸t vµ ®ếm khuẩn lạc

.v ).f 0,1n + (n

C

1 2 1

Khuẩn lạc vi sinh vật tổng số

hiếu khí ưa ấm

2 Định lượng tổng số nấm men-nấm mốc

-Đếm số khuẩn lạc mọc trên đó ➔ tổng số nấm men-nấm

mốc có trong mẫu phân tích

Phương pháp chuẩn : kỹ thuật đếm khuẩn lạc

1 Nguyên tắc:

Môi trường chứa chất ức chế vi khuẩn (Oxytetracyclin hoặc

Chloramphenicol, (Yeast Glucose Chloramphenicol - YGC)

-Nuôi cấy 301oC, hiếu khí, thời gian 48 - 72 giờ

21

2 Định lượng tổng số nấm men-nấm mốc

Chuẩn bị và pha lo·ng mẫu

•Nuôi cấy trên / trong môi trường thạch

(30 o C, 24-72 h).

Quan s¸t vµ ®ếm khuẩn lạc

.v ).f 0,1n + (n

C

1 2 1

1 lit

Khuẩn lạc nấm men, nấm mốc

23

3 Định lượng Coliforms và E.coli

- BGBL (Brilliant Green Bile Lactose)

- VRB (Violet Red Bile)

- EC

Môi trường xác định Coliform và E.coli

Môi trường Endo

Pepton 10 g; lactoza 10 g; K 2 HPO 4 2,5 g; sulfit natri 3,3 g;

fucshin kiềm 0,3 g; thạch 15 g; H 2 O cho đủ 1000 ml; pH

=7,5

Nguyên tắc

Natri sulfit và fucshin = phức chất fuchsin-sulfit

coliform lên men đường lactoza tạo thành aldehyt và

axit,

Aldehyt tác động đến phức chất fuchsin-sulfit và giải

phóng fuchsin,

Fuchsin tự do nhuộm khuẩn lạc thành màu hồng đến

màu đỏ cánh sen, có thể có ánh kim hoặc không

25

Quy trinh định lượng Coliform và E.coli = MPN

Chuẩn bị và pha loãng mẫu (10 0 , 10 -1 , 10 -2 , 10 -3)

Cấy mt t ăng sinh -TLS

Thử nghiệm

ống (+)

Coliforms chịunhiệt

Thử nghiệm Indol

Coliforms phõn

Phép thử khẳng định IMViC

VSV gây bệnh

E coli

I= Thử nghiệm sinh Indol (+)

M= Thử nghiệm MR (Methyl Red) (+)

V= Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer) (-)

iC= Thử nghiệm Citrat (-)

29

Quy trinh định lượngColiform vµ E.coli = đếm KL

Chuẩn bị và pha lo·ng mẫu (10 0 , 10 -1 , 10 -2 , 10 -3)

CÊy mt VRB (37 o C, 48 h, 9 èng).

Thö nghiÖm

ống (+)

Coliforms chịu nhiÖt

Thử nghiệm Indol

Coliforms phân

Quy trinh ph©n tÝch E.coli

Chuẩn bị và pha lo·ng mẫu

CÊy trªn m«i trêng th¹ch

Phép thử khẳng định IMViC

VSV gây bệnh

E coli

a Thử nghiệm sinh Indol (+)

b Thử nghiệm MR (Methyl Red) (+)

c Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer) (-)

d Thử nghiệm Citrat (-)

a Thử nghiệm sinh Indol

Thử nghiệm sinh Indol (I) (+)

b.Thử nghiệm Methyl Red

Thử nghiệm Methyl Red (MR) (+)

•- Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm có chứa 0,2

ml môi trường VP Nuôi 37oC, 24 h

Cách tiến hành :

•Môi trường VP

-Cho 2 giọt dung dịch creatin, 3 giọt 1-naphton pha trong

cồn và sau đó cho 2 giọt dung dịch KOH, lắc đều

- Phản ứng (+) khi xuất hiện mầu hồng đến mầu đỏ tươi

trong vòng 15 phút

39

SCA (Simmons Citrate Agar) / Bromth blue

CCSA (Christensens Citrate Sulfit Agar)/ phenol đỏ

-Na hoặc K xitrat

-Bromothymol blue (pH 6,9)

(-) (+)

41

Môi trường đặc trưng cho S aureus

 t¹o khuÈn l¹c mÇu vàng

Môi trường Chapman: Pepton 10 g; Cao thịt 1 g; Manitol 10;

NaCl 75 g; Thạch 15 g; pH 6,8; H2O cho đủ 1000 ml

Môi trường đặc trưng cho S.

aureus

VSV g©y bÖnh

St.aureus

- Môi trường Baird-Parker: Pepton 10 g; Cao nấm men

1 g; Caothịt 5 g; Pyruvat natri 10 g; Glycocol 12 g; dịch nhũ

lòng đỏ trứng 50 ml; Tellurit kali (K2TeO3)0,1 g; LiCl 5 g;

Sau 48 h mÇu ®en, 1-1,5 mm

Khử tellurit thành tellure 45

Quy trinh ph©n tÝch Staphylococcus aureus

(PP đếm khuẩn lạc)

Chuẩn bị và pha lo·ng mẫu

•Tinh tỷ lệ khuẩn lạc đặc trưng



=

- Chapman

- Baird-Parker Chän 5 khuÈn l¹c nghi ngê

Cấy vào TSA (37 o C, 24-48 h)

Quy trinh định lượng S aureu

(PP MPN) Chuẩn bị và pha lo·ng mẫu (10 0 , 10 -1 , 10 -2 , 10 -3)

CÊy mt t ăng sinh MSB



Tra bảng MPN và tính

Mannitol Salt Broth 47

Thử nghiệm coagulaza

•Staphylococcus có khả năng tiết enzym coagulaza làm

đông kết các thành phần huyết tương

•Phép thử khẳng định :

•- Chọn khuẩn lạc nghi ngờ ➔ ống nghiệm 0,5 ml dịch huyết

tương thỏ, lắc đều ➔ tủ ấm 370C, 2 - 24h➔đông tụ huyết

• Nuôi cấy trên các môi trường tăng sinh sơ bộ

• Nuôi cấy trên các môi trường tăng sinh chọn lọc

• Nuôi cấy trên các môi trường rắn đặc hiệu

• Khẳng định = phép thử kiểm tra đặc tính sinh hoá của các

khuẩn lạc nghi ngờ

VSV g©y bÖnh

49

- Trên môi trường thạch đỏ phenol-lục sáng :

khuẩn lạc nghi ngờ có mầu đỏ

- Môi trường XLD (Xylose Lysine Desoxycholate) :

➔khuẩn lạc nghi ngờ có mầu hồng trong suốt

-Môi trường BSA (Bismuth Sulfit Agar):

➔ mầu xám đen, môi trường xung quanh mầu nâu đen

có ánh kim

-Môi trường HEA (Hektoen-Entric Agar ):

→mầu xanh lá cây hoặc xanh da trời với tâm mầu đen

Quy trinh ph©n tÝch Salmonella

Đồng nhất (25g) và nuôi cấy tăng sinh

+ - - -

-100 91,9 99,2 99,5 91,6

99 94,6 98,5 100 98,9

53

a Phép thử khẳng định trong môi trờng TSI

(Triple Sugar Iron)

Salmonella : - lên men Glucoza, khụng LM Lactoza, Sucroza

• Lờn men glucoza ➔ trên bề mặt nghiêng mầu hồng, đỏ

• Sinh H2S : xuất hiện các vệt mầu đen, tạo khí làm nứt hoặc

• Mt kh«ng đổi mầu (mầu vàng) ➔

khôngph©n giải ure ➔ (-)

•Mt đổi mầu (mầu tím) ➔ phân giải

• Mt kh«ngđổi mầu (mầu vàng)➔ (-)

•Mt đổi mầu(mầu tím)➔ (+)

57

•Vi khuẩn lên men lactoza cần có 2 enzym : -Galactosidaza và

permease mà hoạt tính xác định nhờ

ONPG(0-nitrophenyl-D-galactopyranoside)

 Salmonella có phản øng (-)

-GalactosidazaLactose + ONPG 0-nitrophenol

(mầu vàng)

59

d.Phản ứng -Galactosidaza

+ Cỏch tiến hành thử nghiệm -Galactosidaza :

hoà một vòng que cấy từ khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm có

chứa 0,25 ml dung dịch muối 0,85 % Thêm 1 giọt toluen, lắc

đều và đặt ống nghiệm vào nồi cách thuỷ ở nhiệt độ 37oC trong

vài phút Sau đó cho 0,25 ml dung dịch thử-Galactosidaza, lắc

đều và đặt lại ống nghiệm vào nồi cách thuỷ vẫn ở nhiệt độ 37oC

trong 24 h Phản ứng dơng tính cho mầu vàng, thờng xuất hiện

Salmonella spp.

• Mẫu nghiên cứu:

– 10 mẫu nem chua ở Hà Nội

Rambach (24h) XLT4 (24h)

Các khuẩn lạc đặc trưng Thạch nghiêng Kligler (glucose, lactose, H2S, khí) Xét nghiệm hoá sinh (ure, lysine, simon citrate)

63

6 Clostridium và Cl.perfringens

•Clostridium là trực khuẩn, có thể đứng riêng rẽ hoặc

thành chuỗi, là vi khuẩn Gram dương, yếm khí bắt

buộc, bào tử hình trứng và chịu nhiệt cao tới

Môi trường xác định Clostridium và Cl.perfringens

-Môi trường lỏng Thioglycollat +Resazurin natri:

-Trypton 15 g; Cao nấm men 5 g; L-cystin 0,5 g; Dextoza 5 g;

NaCl 2,5 g; Natri thioglycollat 0,5 g ; Dung dịch Resazurin natri

mới pha (1:1000) 1 ml; Thạch 0,75 g; H2O chođủ 1000 ml

Môi trường Winson Blair:

Glucoza 20 g; pepton 5 g; Cao nấm men 2,5 g; Cao thịt 1 g;

NaCl 5 g; Thạch 20 g; H2O cho đủ 1000 ml, Na 2 SO 3 20% và

NH 4 Fe(SO 4 ) 2 5%

Môi trường thạch TSC (Trypton Sulfit Cycloserin):

Trypton 15 g; cao nấm men 5 g; Soyton 5 g; Sắt ammonium

xitrat 1 g;Natri metabisulfat l g; thạch 20 g; H2O chođủ 1000

ml Hoà tan các chất và hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C trong

15 phút, pHcuối = 7,6 ở nhiệt độ 25oC

Nu«i cÊy trong èng th¹ch

ChuÈn bÞ mÉu (10 -1 vµ 10 -2 )

25g mÉu + 225 ml dd trypton muèi

®un tan ch¶y mt Winson Blair

Cho mÉu, ®un 75 o C vµ 10-15•

Tính lượng Clostridium

Chọn KL nghi ngờ

67

•Chọn khuẩn lạc điển hình (mầu đen, tròn, lồi, bờ đều và

nhẵn) và cấy vào ống nghiệm có chứa môi trường lỏng

Thioglycollat+ Resazurin natri Nuôi cấy 37oC, 24 h, hoàn

toàn yếm khí Sau 24 h thu được canh trường thuần nhất

•lấy mẫu quan sát hình dáng tế bào và nhuộm Gram

69

Phép thử khẳng định

•Thử tớnh chất lờn men đường

Lactoza-Gelatin:

•Từ canh trường thuần nhất núi trờn, lấy

1 vũng que cấy cho vào ống nghiệm cú

chứa mụi trường Lactoza-Gelatin

• Nuụi cấy ở nhiệt độ 37oC trong 24 h

•Quan sỏt khả năng lờn men đường

lactoza, sinh khớ trong quỏ trỡnh lờn men

và khả năng hoỏ lỏng gelatin

(+) KC

71

Môi trờng chọn lọc Mannitol-Egg-Yolk-Polymyxin (MYP)

có polymyxin là chất đặc hiệu, cho khuẩn lạc mầu hồng điển

hình Tiếp tục khẳng định dựa trên các đặc tính sinh hoá

73

Quy trinh phát hiện Bacillus cereurs

Chuẩn bị và pha loãng mẫu

đếm khuẩn lạc

Quy trinh phát hiện Bacillus cereurs

Chuẩn bị và pha loãng mẫu

Trypticase Soy Polymyxin

75

Phép thử khẳng định

•Khả năng lờn men đường glucoza phenol đỏ:

•Mụi trường cú pH 7,4, mầu đỏ

•Lờn men ➔pH giảm ➔mầu vàng pH <6,8

•Cỏch tiến hành

•Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào

• Nuụi cấy ở nhiệt độ 30oC trong 24 h

•Quan sỏt sự đổi mầu của ống thử từ đỏ sang vàng

Phép thử khẳng định

Khả năng khử nitrat thành nitrit:

Nguyờn tắc : Vi khuẩn cú enzym nitrataza khử nitrat thành nitrit

và nitơ phõn tử (NO2-, NH3, N2)

Phép thử khẳng định

Cách tiến hành

•Cấy các khuẩn lạc nghi ngờ vào

môi trờng chứa nitrat,

8 Pseudomonas aeruginosa

Nguyên tắc :

Nuôi cấy mẫu trên môi trờng chọn lọc thạch Pseudomonas ở

nhiệt độ 42oC Chọn khuẩn lạc mầu xanh điển hình và tiếp

tục khẳng định dựa trên các đặc tính sinh hoá nh lên men

glucoza, không lên men lactoza và không sinh khí

Quy trinh phát hiện Pseudomonas aeruginosa

Chuẩn bị và pha loãng mẫu

Khả năng Không

81

Nguyờn tắc : Cú enzym oxydaza

9 Định lượng Vibrio

•Nguyờn tắc :

• Nuụi cấy trờn cỏc mụi trường tăng sinh

•APW (Alkalin Pepton Water) :V.cholerae,V.alginolyticus, V vulnificus

-Colisstine (Colistine Polymicine Broth) :V.parahaemolyticus

VSV gây bệnh

•Phõn lập trên mt chọn lọc: TCBSA (Thiosulphat Citrat Bile Sucrose Agar)

V.cholerae,V.alginolyticus: d=2-3mm, mầu vàng, tõm đục

V.parahaemolyticus, V vulnificus : d=3-4 mm, mầu xanh

•Khẳng định = kiểm tra đặc tính sinh hoá của các khuẩn lạc nghi ngờ

83

Quy trinh ph¸t hiÖn Vibrio

Nuôi cấy tăng sinh