(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng ức chế enzyme α glucosidase của loài địa hoàng (rehmannia glutinosa)

Do αđó, αviệc αnghiên αcứu αcác αloài αthảo αdược αđã αđược αdân αgian αsử αdụng αlàmthuốc αnhằm αtìm αkiếm αcác αhợp αchất αcó αhoạt αtính αcao αtrong αphòng αvà αchữa αbệnh là αnhiệm α

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-Họ và tên: Nguyễn Thị Dung

TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN: “NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYME αα-GLUCOSIDASEGLUCOSIDASE

CỦA LOÀI ĐỊA HOÀNG (REHMANNIA GLUTINOSA)"

LUẬN αVĂN αTHẠC αSĨ αHÓA αHỌC

Hà Nội -GLUCOSIDASE 2021

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-Họ và tên: Nguyễn Thị Dung

TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN: “NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYME αα-GLUCOSIDASEGLUCOSIDASE

CỦA LOÀI ĐỊA HOÀNG (REHMANNIA GLUTINOSA)"

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 8440114

LUẬN αVĂN αTHẠC αSĨ αHÓA αHỌC

NGƯỜI αHƯỚNG αDẪN αKHOA αHỌC: αTS αVũ αKim αThư

Hà Nội -GLUCOSIDASE 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi αlà αNguyễn αThị αDung, αHọc αviên αcao αhọc αlớp αCHE α2019B, αHọc αviện αKhoahọc αvà αCông αnghệ, αchuyên αngành αHóa αhữu αcơ, αmã αsố αhọc αviên α19803028 αxincam αđoan:

1 Đây αlà αluận αvăn αdo αbản αthân αtôi αtrực αtiếp αthực αhiện αdưới αsự αhướng αdẫn αcủa αTS αVũ αKim αThư

2 Công αtrình αnày αkhông αtrùng αlặp αvới αbất αkì αnghiên αcứu αnào αkhác αđược αcông αbố αtại αViệt αNam

3 Các αsố αliệu αvà αthông αtin αnghiên αcứu αlà αhoàn αtoàn αchính αxác, αtrung αthực

và αkhách αquan, αđã αđược αxác αnhận αvà αchấp αthuận αcủa αcơ αsở αnơi αnghiên αcứu

Tôi αxin αhoàn αtoàn αchịu αtrách αnhiệm αtrước αpháp αluật αvề αnhững αcam αkết αnày

Hà Nội, ngày… tháng… năm 2021

Người αviết αcam αđoan

Nguyễn Thị Dung

học αvà αCông αnghệ αViệt αNam αtrong αkhuôn αkhổ αđề αtài αKhoa học và Công nghệ cấp Bộ αmã αsố αB2020-GLUCOSIDASEMDA-GLUCOSIDASE09.

Lời αđầu αtiên, αem αxin αbày αtỏ αlòng αbiết αơn αsâu αsắc αtới αTS Vũ Kim Thư

người αđã αtận αtình αhướng αdẫn αvà αgiúp αđỡ αem αtrong αsuốt αquá αtrình αnghiên αcứu

và αhoàn αthành αluận αvăn

Em αxin αđược αgửi αlời αcảm αơn αchân αthành αtới αPGS.TS Phan Văn Kiệm

cùng αtoàn αthể αcán αbộ αphòng αNghiên αcứu αcấu αtrúc α- αViện αHóa αsinh αbiển, αViệnHàn αlâm αKhoa αhọc αvà αCông αnghệ αViệt αNam αđã αnhiệt αtình αchỉ αbảo, αtạo αmọi αđiềukiện αgiúp αđỡ αem αtrong αthời αgian αnghiên αcứu

Em αxin αđược αgửi αlời αcảm αơn αtới αBan αlãnh αđạo αHọc αviện αKhoa αhọc αvàCông αnghệ αcùng αtoàn αthể αcác αgiảng αviên αkhoa αHóa, αgiảng αviên αcủa αHọc αviện

đã αdạy αdỗ αvà αchỉ αbảo αem αtrong αsuốt αquá αtrình αhọc αtập αtại αHọc αviện

Em αxin αđược αgửi αlời αcảm αơn αtới αBan αlãnh αđạo αTrung αtâm αNghiên αcứu αvàchuyển αgiao αCông αnghệ α- αViện αHàn αlâm αKhoa αhọc αvà αCông αnghệ αViệt αNam αđãtạo αđiều αkiện αthuận αlợi αcho αem αcó αthời αgian αtheo αhọc αkhóa αhọc αnày

Cuối αcùng, αem αxin αđược αgửi αlời αcảm αơn αtới αgia αđình, αbạn αbè αvà αngườithân αđã αluôn αở αbên αđộng αviên, αgiúp αđỡ αem αtrong αquá αtrình αem αhọc αtập αvànghiên αcứu

Hà Nội, ngày … tháng 11 năm 2021

Học αviên

Nguyễn Thị Dung

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

13C-NMR Carbon-13 αNuclear αMagnetic Phổ αcộng αhưởng αtừ αhạt

Polarisation αTransfer

1H-NMR Proton αNuclear αMagnetic αResonance Phổ αcộng αhưởng αtừ αhạt

IC50 Inhibitory αconcentratrion αat α50% Nồng αđộ αức αchế α50%

đối αtượng αthử αnghiệmHMBC Heteronuclear αmultiple αBond Phổ αtương αtác αdị αhạt

HR-ESI- High αResolution αElectronspray Phổ αkhối αlượng αphân

tửHSQC Heteronuclear αSingle- αQuantum Phổ αtương αtác αdị αhạt

Bảng α2.1 αTrang αthiết αbị αthí αnghiệm 11

Bảng α3.1 αSố αliệu αphổ αNMR αcủa αhợp αchất αRG1 αvà αhợp αchất αso αsánh 24

Bảng α3.2 αSố αliệu αphổ αNMR αcủa αhợp αchất αRG2 αvà αhợp αchất αso αsánh 28

Bảng α3.3 αSố αliệu αphổ αNMR αcủa αhợp αchất αRG3 αvà αhợp αchất αtham αkhảo 35

Bảng α3.4 αSố αliệu αphổ αNMR αcủa αhợp αchất αRG4 αvà αchất αso αsánh 41

Bảng α3.5 αSố αliệu αphổ αNMR αcủa αhợp αchất αRG5 αvà αhợp αchất αtham αkhảo 46

Bảng α3.6 αTác αđộng αức αchế -glucosidase αcủa αmẫu αnghiên αcứu 48

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình α1.1 αMột αsố αhình αảnh αvề αloài αĐịa αhoàng 4

Hình α3.1 αCấu αtrúc αhóa αhọc αcủa αhợp αchất αRG1 αvà αcủa αhợp αchất αso αsánh 18

Hình 3.2 Phổ HR-GLUCOSIDASEESI-GLUCOSIDASEMS của hợp chất RG1 18

Hình 3.3 Phổ 1 H-GLUCOSIDASENMR của hợp chất RG1 19

Hình 3.4 Phổ 13 C-GLUCOSIDASENMR của hợp chất RG1 20

Hình 3.5 Một số tương tác HMBC chính của hợp chất RG1 20

Hình 3.6 Phổ HMBC của hợp chất RG1 21

Hình 3.7 Phổ HSQC của hợp chất RG1 21

Hình 3.8 Phổ NOESY của hợp chất RG1 23

Hình 3.9 Phổ CD của hợp chất RG1 23

Hình α3.10 αCấu αtrúc αcủa αhợp αchất αRG2 αvà αcủa αhợp αchất αso αsánh 25

Hình 3.11 Phổ HR-GLUCOSIDASEESI-GLUCOSIDASEMS của hợp chất RG2 26

Hình 3.12 Phổ 1 H-GLUCOSIDASENMR của hợp chất RG2 26

Hình 3.13 Phổ 13 C-GLUCOSIDASENMR của hợp chất RG2 27

Hình 3.14 Phổ HSQC của hợp chất RG2 28

Hình 3.15 Phổ NOESY của hợp chất RG2 30

Hình 3.16 Một số tương tác HMBC chính của hợp chất RG2 30

Hình 3.17 Phổ HMBC của hợp chất RG2 31

Hình 3.18 Phổ CD của hợp chất RG2 32

Hình 3.19 Cấu trúc hóa học của hợp chất RG3 32

Hình 3.20 Phổ 1 H-GLUCOSIDASENMR của hợp chất RG3 33

Hình 3.21 Phổ 13 C-GLUCOSIDASENMR của hợp chất RG3 33

Hình 3.22 Phổ HSQC của hợp chất RG3 34

Hình 3.23 Phổ HMBC của hợp chất RG3 35

Hình 3.24 Một số tương tác HMBC chính của hợp chất RG3 37

Hình 3.25 Cấu trúc hóa học của hợp chất RG4 37

Hình 3.26 Một số tương tác HMBC chính của hợp chất RG4 38

Hình 3.27 Phổ 1 H-GLUCOSIDASENMR của hợp chất RG4 38

Hình 3.28 Phổ 13 C-GLUCOSIDASENMR của hợp chất RG4 39

Hình 3.29 Phổ HMBC của hợp chất RG4 40

Hình 3.32 Một số tương tác HMBC chính của hợp chất RG5 43

Hình 3.33 Phổ 1 H-GLUCOSIDASENMR của hợp chất RG5 44

Hình 3.34 Phổ 13 C-GLUCOSIDASENMR của hợp chất RG5 44

Hình 3.35 Phổ HMBC của hợp chất RG5 45

Hình 3.36 Phổ HSQC của hợp chất RG5 48

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 1

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 THÔNG TIN VỀ LOÀI ĐỊA HOÀNG (REHMANNIA GLUTINOSA) αỞ αVIỆT αNAM 3

1.1.1 αĐặc αđiểm αthực αvật 3

1.1.2 αTác αdụng αchữa αbệnh αtrong αdân αgian 4

1.2 αMỘT αSỐ αCÔNG αTRÌNH αNGHIÊN αCỨU αTRONG αVÀ αNGOÀI NƯỚC 5

1.2.1 αMột αsố αnghiên αcứu αtrong αnước 5

1.2.2 αMột αsố αnghiên αcứu αtrên αthế αgiới 6

1.3 αTÁC αDỤNG αHẠ αĐƯỜNG αHUYẾT αCỦA αLOÀI αĐỊA αHOÀNG 8

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 αMẪU αNGHIÊN αCỨU 11

2.2 αNGUYÊN αVẬT αLIỆU 11

2.3 αPHƯƠNG αPHÁP αNGHIÊN αCỨU 11

2.3.1 αSắc αký αlớp αmỏng α(TLC) 11

2.3.2 αSắc αký αcột α(CC) 12

2.4 αPHƯƠNG αPHÁP αXÁC αĐỊNH αCẤU αTRÚC αCÁC αHỢP αCHẤT 12

2.4.1 αĐộ αquay αcực α([]D) 12

2.4.2 αPhổ αkhối αlượng αphân αgiải αcao αHR-ESI-MS 12

2.4.3 αPhổ αcộng αhưởng αtừ αnhân α(NMR) 12

2.5 αTHỰC αNGHIỆM 13

2.6 αTHÔNG αSỐ αVẬT αLÍ αVÀ αDỮ αKIỆN αPHỔ αCỦA αCÁC αHỢP αCHẤT α α15 2.6.1 αHợp αchất αRG1 α(hợp αchất αmới) 15

2.6.2 αHợp αchất αRG2 α(hợp αchất αmới) 15

2.6.3 Hợp chất RG3 16

2.7 αPHƯƠNG αPHÁP αĐÁNH αGIÁ αTÁC αDỤNG αỨC αCHẾ αENZYM

αα-GLUCOSIDASE 16

2.7.1 αVật αliệu 16

2.7.2 αPhương αpháp 16

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18

3.1 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT RG1 18

3.2 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT RG2 25

3.3 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT RG3 32

3.4 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT RG4 37

3.5 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT RG5 43

3.6 αTÁC αDỤNG αỨC αCHẾ αENZYME αα-GLUCOSIDASE 48

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC 56

Bài αbáo αPhytochemistry αLetters, α43, α208-211, α2021 56

KẾT αQUẢ αGIÁM αĐỊNH αTÊN αKHOA αHỌC αMẪU αTHỰC αVẬT 60

Phụ lục 1.1-GLUCOSIDASE1.22: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT RG1 61

Phụ lục 2.1-GLUCOSIDASE2.19: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT RG2 72

Phụ lục 3.1-GLUCOSIDASE3.16: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT RG3 82

Phụ lục 4.1-GLUCOSIDASE4.16: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT RG4 90

Phụ lục 5.1-GLUCOSIDASE5.18: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT RG5 98

LỜI MỞ ĐẦU

Việt αNam αlà αmột αnước αnằm αtrong αvùng αkhí αhậu αnhiệt αđới αgió αmùa αnên αcó αhệthực αvật αđa αdạng αvà αphong αphú αTheo αdự αđoán αcó αkhoảng α12.000 αloài, αtrong αđóhiện αđã αbiết αkhoảng α4.000 αloài αđược αnhân αdân αta αdùng αlàm αthảo αdược α[1], α[2]

Do αđó, αviệc αnghiên αcứu αcác αloài αthảo αdược αđã αđược αdân αgian αsử αdụng αlàmthuốc αnhằm αtìm αkiếm αcác αhợp αchất αcó αhoạt αtính αcao αtrong αphòng αvà αchữa αbệnh

là αnhiệm αvụ αđặc αbiệt αquan αtrọng αđã αvà αđang αđược αcác αnhà αkhoa αhọc αtrong αvàngoài αnước αquan αtâm αCác αhoạt αchất αcó αnguồn αgốc αthiên αnhiên αthể αhiện αưuđiểm αso αvới αcác αchất αtổng αhợp, αdo αcó αđộc αtính αthấp αvà αkhả αnăng αdung αnạp αcaotrên αcơ αthể αsinh αvật αVì αvậy αviệc αnghiên αcứu αthành αphần αhóa αhọc αvà αhoạt αtínhsinh αhọc αcác αloại αthảo αdược αcó αý αnghĩa αto αlớn αnhằm αgiải αthích αý αnghĩa αkhoahọc αvề αtác αdụng αchữa αbệnh αcủa αcác αcây αthuốc αvà αgóp αphần αtạo αcơ αsở αphát αtriểncác αloại αthuốc αchữa αbệnh αphục αvụ αchăm αsóc αsức αkhỏe αcho αcon αngười α[3], α[4]

Loài αĐịa αhoàng α(Rehmannia glutinosa) αlà αloài αcây αthảo, αsống αlâu αnăm, αcó

nguồn αgốc αtừ αvùng αôn αđới αấm αở αTrung αQuốc αĐịa αhoàng αlà αcây αthuốc αquý αcho

2 vị αthuốc: αSinh αđịa αvà αThục αđịa αCả αhai αvị αthuốc αnày αđều αlà αmột αtrong αnhữngthành αphần αđầu αcủa αvị αthuốc αBắc α[5] αĐịa αhoàng αđã αđược αsử αdụng αtrong αcác αbàithuốc αgiảm αđường αhuyết, αtác αdụng αlợi αtiểu, αcầm αmáu, αkháng αsinh… αTrong αsố αnhiềutác αdụng αcủa αĐịa αhoàng, αđáng αchú αý αnhất αlà αtiềm αnăng αtrong αviệc αchữa αbệnh αđáitháo αđường αhay αkhả αnăng αlàm αhạ αđường αhuyết αtrong αmáu

Xuất αphát αtừ αnhu αcầu αrất αlớn αvề αviệc αtìm αkiếm αcác αhoạt αchất αcó αnguồn αgốc αtừthiên αnhiên αtrong αviệc αhỗ αtrợ αvà αđiều αtrị αbệnh αtiểu αđường, αkết αhợp αvới αcác αbàithuốc αdân αgian αcó αtính αan αtoàn αvà αhiệu αquả αnên αđề αtài αđược αthực αhiện αlà:

"Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng ức chế enzyme α-GLUCOSIDASE glucosidase của loài Địa hoàng (Rehmannia glutinosa)".

- Phân αlập αmột αsố αhợp αchất αtừ αrễ αcủ αloài αĐịa αhoàng α(Rehmannia glutinosa)

- Xác αđịnh αcấu αtrúc αhóa αhọc αcác αhợp αchất αđã αphân αlập αđược

- Đánh αgiá αtác αdụng αức αchế αenzyme αα-glucosidase αcủa αcác αhợp αchất αphân αlập đƣợc αtừ αloài αĐịa αhoàng α(Rehmannia glutinosa)

Mẫu αRehmannia glutinosa αđƣợc αthu αhái αở αViệt αTrì α(Phú αThọ)

- Tổng αquan αnghiên αcứu αvề αloài αĐịa αhoàng α(Rehmannia glutinosa)

- Phân αlập αvà αxác αđịnh αcấu αtrúc αcác αhoạt αchất αtừ αloài αĐịa αhoàng α(Rehmannia

glutinosa)

- Đánh αgiá αtác αdụng αức αchế αenzyme αα-glucosidase αcủa αloài αĐịa αhoàng α (Rehmannia glutinosa)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. α THÔNG αTIN αVỀ αLOÀI αĐỊA αHOÀNG α(REHMANNIA GLUTINOSA) αỞ

Loài αĐịa αhoàng α(Rehmannia glutinosa) αlà αloài αcây αthảo, αsống αlâu αnăm, αcó

nguồn αgốc αtừ αvùng αôn αđới αấm αở αTrung αQuốc αĐịa αhoàng αlà αcây αthuốc αquý αcho

2 vị αthuốc: αSinh αđịa α(tức αlà αcủ αĐịa αhoàng αcòn αsống) αvà αThục αđịa α(tức αlà αcủ αĐịahoàng αđã αđược αnấu αchín) αCả αhai αvị αthuốc αSinh αđịa αvà αThục αđịa αđều αlà αmột αtrongnhững αthành αphần αđầu αcủa αvị αthuốc αBắc αTrước αkia αở αnước αta αchưa αcó αcây αĐịa αhoàng.Năm α1958 αta αnhập αgiống αtừ αTrung αQuốc αViện αDược αliệu αđã αnghiên αcứu αdi αthực αthuầnhóa αvà αđưa αvào αphát αtriển αtrồng αđại αtrà, αhiện αđược αtrồng αnhiều αtại αBắc αNinh, αHảiDương, αHưng αYên, αThái αBình, αNam αĐịnh, αVĩnh

Phúc αvà αThanh αHóa αMột αsố αnghiên αcứu αvề αthành αphần αhóa αhọc αcủa αrễ αcủ αloàiĐịa αhoàng αcho αbiết αsự αcó αmặt αcủa αcác αhợp αchất αkhung αiridoid, αphenethylalcohol, αglycoside, αcyclopentanoid αmonoterpene αvà αnorcarotenoid α[6]

Hình α1.1 αMột αsố αhình αảnh αvề αloài αĐịa αhoàng

1.1.2 Tác dụng chữa bệnh trong dân gian

Theo α“Từ αđiển αcây αthuốc αViệt αNam”, αtập αI αcủa αVõ αVăn αChi, αĐịa αhoàng αtươi

có αvị αngọt, αđắng, αtính αhàn, αcó αtác αdụng αthanh αnhiệt, αmát αmáu αSinh αĐịa αhoàng(củ αĐịa αhoàng αkhô) αcó αvị αngọt, αtính αhàn, αcó αtác αdụng αtư αâm αdưỡng αhuyết.Thục αĐịa αhoàng αcó αvị αngọt, αmùi αthơm, αtính αhơi αôn, αcó αtác αdụng αnuôi αthận,dưỡng αâm, αbổ αhuyết, αlàm αđen αrâu αtóc αĐịa αhoàng αđã αđược αsử αdụng αtrong αcácbài αthuốc αgiảm αđường αhuyết, αtác αdụng αcầm αmáu, αlợi αtiểu, αkháng αsinh α[2]

Theo αĐỗ αHuy αBích, αtập αI, αĐịa αhoàng αđã αđược αsử αdụng αnhư αlà αmột αloại αthảodược αtrong αcác αbài αthuốc αdân αgian αđể αchữa αđái αtháo αđường, αsuy αnhược αcơ αthể,suy αnhược αthần αkinh, αtăng αhuyết αáp, αxơ αcứng αđộng αmạch, αchữa αviêm αthanhquản, αviêm αbàng αquan αmạn αtính, αchữa αsốt αrét, αkinh αnguyệt αkhông αđều, αronghuyết, αho αkhan, αlao αphổi, αchữa αchứng αâm αhư, αtinh αhuyết αsuy αkém [1]

Theo αkết αquả αnghiên αcứu αdược αlý αhiện αđại α(nguồn α“Những αcây αthuốc αvà αvịthuốc αViệt αNam” αcủa αGS αĐỗ αTất αLợi) αthì αnước αsắc αsinh αĐịa αhoàng αcó αtác

dụng αhạ αđường αhuyết, αtác αdụng αchống αviêm αrõ αrệt αtrong αthử αnghiệm αin vivo;

ngoài αra αsinh αĐịa αhoàng αcó αtác αdụng αcường αtim, αhạ αáp, αcầm αmáu, αbảo αvệ αgan,lợi αtiểu, αchống αphóng αxạ, αchống αnấm αThực αnghiệm αđã αchứng αminh αsinh αđịa αvàthục αđịa αcó αthể αlàm αgiảm αtác αdụng αức αchế αchức αnăng αvỏ αtuyến αthượng αthận αcủacorticoid α[7]

Trong αsố αnhiều αtác αdụng αcủa αĐịa αhoàng, αđáng αchú αý αnhất αlà αtiềm αnăng αtrongviệc αchữa αbệnh αđái αtháo αđường αhay αkhả αnăng αlàm αhạ αđường αhuyết αtrong αmáu

1.2 αMỘT αSỐ αCÔNG αTRÌNH αNGHIÊN αCỨU αTRONG αVÀ αNGOÀI αNƯỚC

1.2.1 Một số nghiên cứu trong nước

Theo αtra αcứu, αở αViệt αNam αcó αnhóm αtác αgiả αĐỗ αThị αHà α(Viện αdược αliệu, αnăm2018) αcông αbố αnghiên αcứu αban αđầu αvề αthành αphần αhóa αhọc αtừ αrễ αcủ αcây αĐịa

hoàng αthông αbáo α05 αhợp αchất αtinh αkhiết αđã αđược αphân αlập αlà: αdaucosterol α(1), rehmapicrogenin α(2), αastragalin α(3), αverbascosid α(4) αvà αcatalpol α(5).

Năm α2003, αnghiên αcứu αvề αthân αvà αrễ αcủ αloài αĐịa αhoàng αđã αcông αbố αcấu αtrúc

hóa αhọc αcủa α17 αhợp αchất α2,4-Dimethoxy-2-methyl-6H-pyran-3-one α(6), αmuối calcium αcủa α rehmapicroside α(7): αnorcarotenoids: α rehmapicrogenin α (8), α5,6- dihydroxy1,1,5-trimethylcyclohexyl α(9), αrehmaionoside αA α(10); α2-formyl-5- hydroxymethylfurane α(11), αthe αiridoid αrehmaglutin αD α(12), αiridoid αglycosides (13–17) αand αphenylethyl αalcohol αglycosides α(18–22) α[8].

1.2.2 Một số nghiên cứu trên thế giới

Loài αĐịa αhoàng α(Rehmannia glutinosa) αcó αnguồn αgốc αtừ αvùng αôn αđới αấm αở

Trung αQuốc, αdo αđó αđã αcó αmột αsố αnhóm αtác αgiả αTrung αQuốc αnghiên αcứu αvềthành αphần αhóa αhọc αvà αhoạt αtính αcủa αcác αchất αphân αlập αtừ αloài αĐịa αhoàng

Mười αmột αglycoside αiridoid, αRehmaglutoside αA−K α(23−33) αđược αphân αlập αtừ

củ αkhô αcủa αloài αRehmannia glutinosa αTrong αcác αthử αnghiệm αin vitro αtại αnồng

độ α10 αµM αthì αcác αhợp αchất α25, α29 αvà α31−33 αcho αthấy αcác αhoạt αđộng αbảo αvệ αgan

vừa αphải αchống αlại αđộc αtính αdo αD-galactosamine αgây αra αtrong αtế αbào αHL-7702[9]

Năm α2014, αnghiên αcứu αcủa αnhóm αtác αgiả αWei-Sheng αFeng αthông αbáo αhai αhợp

chất αionone αglycosides, αfrehmaglutoside αG α(34) αvà αfrehmaglutoside αH α(35) αvà sáu αhợp αchất αrehmapicroside α(36), αsec-hydroxyaeginetic αacid α(37), αdihydroxy-

β-ionone α(38), αtrihydroxy-β-ionone α(39), αrehmaionoside αA α(40) αvà

rehmaionoside αC α(41) αđược αphân αlập αtừ αdịch αchiết αethanol αcủa αcủ αkhô αloài αĐịa

hoàng α[10]

Như αvậy αnhững αnghiên αcứu αvề αthành αphần αhóa αhọc αcủa αloài αĐịa αhoàng αđã αchỉ

ra α các α loại α chất α gồm α iridoid, α phenethyl α alcohol α glycoside, α norcarotenoids,ionone αglycosides αVề αhoạt αtính αhóa αhọc αcủa αcác αhợp αchất αđã αphân αlập αđượcmới αchỉ αđược αnghiên αcứu αrất αhạn αchế

1.3 TÁC DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT CỦA LOÀI ĐỊA HOÀNG

Đái αtháo αđường, αcòn αgọi αlà αbệnh αtiểu αđường, αlà αmột αnhóm αbệnh αrối αloạnchuyển αhóa αcacbohydrat, αmỡ αvà αprotein αkhi αhoóc αmôn αinsulin αcủa αtụy αbị αthiếuhay αgiảm αtác αđộng αtrong αcơ αthể, αbiểu αhiện αbằng αmức αđường αtrong αmáu αluôn

cao; αtrong αgiai αđoạn αmới αphát αthường αlàm αbệnh αnhân αđi αtiểu αnhiều, αtiểu αbanđêm αvà αdo αđó αlàm αkhát αnước αBệnh αđái αtháo αđường αdiễn αbiến αâm αthầm αnhưngkhi αnặng αlại αnhanh αchóng αgây αra αnhững αbiến αchứng αnặng αnề αnhư: αmù αlòa, αcắtcụt αchi, αsuy αthận, αtai αbiến αmạch αmáu αnão αvà αbệnh αlý αtim αmạch α[11], α[12]

Những αnăm αgần αđây, αtỉ αlệ αngười αmắc αbệnh αđái αtháo αđường αở αcác αquốc αgia αcóthu αnhập αtrung αbình αtăng αlên αrõ αrệt, αtrong αđó αcó αViệt αNam αNước αta αđược αliệtvào αnước αcó αsố αngười αmắc αbệnh αđái αtháo αđường αtăng αnhanh αnhất, αtheo αThống

kê αcủa αBộ αY αtế αnăm α2018, αViệt αNam αhiện αcó αkhoảng α3,5 αtriệu αngười αmắc αđáitháo αđường, αcon αsố αnày αdự αbáo αtăng αlên α6,1 αtriệu αvào αnăm α2040 αMặc αdù αsốngười αmắc αbệnh αđái αtháo αđường αlớn αnhư αvậy, αnhưng αdo αvẫn αcòn αrất αnhiềungười αchưa αcó αnhận αthức αđúng αvề αcăn αbệnh αđược αcoi αlà α"kẻ αgiết αngười αthầmlặng" αnày αkhiến αcăn αbệnh αnày αkhông αngừng αgia αtăng

Hiện αnay, αphương αpháp αphổ αbiến αlà αsử αdụng αTân αdược αuống αmỗi αngày αđể αgiúplàm αgiảm αlượng αđường αtrong αmáu αđể αngừa αbiến αchứng αdo αđường αhuyết αtăngcao αCác αnhóm αTân αdược αhỗ αtrợ αđiều αtrị αtiểu αđường αthường αbao αgồm αcác αloạinhư αkích αthích αtiết αhoặc αlàm αtăng αđộ αnhạy, αức αchế αhấp αthu αglucose αở αruột, αtăngsinh αglucose αở αgan, αgiảm αcảm αgiác αthèm αăn… αTân αdược αtác αdụng αnhanh,nhưng αkhi αngưng αthì αmất αtác αdụng αcũng αnhanh, αchủ αyếu αtác αdụng αtốt αtrongthời αgian αđầu αNhưng αđiều αquan αtrọng αlà, αkhi αcàng αsử αdụng, αtheo αthời αgian αsẽ

bị α“nhờn αthuốc” αVới αliều αlượng αngày αcàng αtăng, αđến αmột αlúc αnào αđó, αviệc αsửdụng αthuốc αtân αdược αbắt αđầu αtrở αnên αvô αhiệu αvà αcòn αgây αra αnhiều αtác αdụng αphụnhư αlàm αđau αdạ αdày, αlàm αthận αsuy αyếu αdẫn αđến αkhả αnăng αsuy αthận αvề αsau αKhimất αtác αdụng αhoặc αtác αdụng αgiảm αdần αthì αđường αhuyết αbắt αđầu αtrồi αsụt αlênxuống, αtuyến αtụy αsuy αyếu αdần, αđây αcũng αlà αlúc αbắt αđầu αxuất αhiện αcác αbiếnchứng αtiểu αđường αDo αđó αcơ αchế αcủa αviệc αhỗ αtrợ αđiều αtrị αcủa αTây αy αlà αtheo αcơchế α“đối αkháng”, αcòn αcơ αchế αcủa αĐông αy αtheo αcơ αchế αđiều αhòa, αbồi αbổ αgiúp αcơthể αđạt αtrạng αthái αquân αbình αTheo αĐông αy αnói αchung, αviệc αhỗ αtrợ αđiều αtrị αcácbệnh αđều αtrên αcơ αsở αtừ αnguồn αgốc αsinh αra αbệnh, αtrên αcơ αchế αbồi αbổ, αđiều αhòa αvàphục αhồi αdần αcông αnăng αcủa αcác αcơ αquan αgiúp αcơ αthể αvận αhành αtheo αcơ αchế

“thuận αtheo αtự αnhiên” αBởi αvì αthực αtế αcơ αthể αcon αngười αkhi αsinh αra αhầu αhết αai

cũng αkhỏe αmạnh, αcó αcơ αchế αtự αđề αkháng, αtự αphục αhồi, αnhưng αmột αthời αgiantheo αnhịp αsống αhiện αđại, αthói αquen αăn αuống αkhông αđiều αđộ, αsử αdụng αcác αhóaphẩm αđộc αhại, αlạm αdụng αcác αsản αphẩm αTây αy αlàm αcho αcon αngười αmất αdần αkhảnăng αtự αnhiên αvốn αcó.

Muốn αhỗ αtrợ αđiều αtrị αbệnh αtiểu αđường αhiệu αquả, αđầu αtiên αphải αđưa αđườnghuyết αvề αmức αan αtoàn, αsau αđó αcần αhỗ αtrợ αbồi αbổ αgiúp αcông αnăng αcác αtạng αđượcphục αhồi αdần αgiúp αđường αhuyết αổn αđịnh αlâu αdài αDo αđó, αcác αnhà αkhoa αhọcmong αmuốn αtìm αra αnhững αliệu αpháp αchữa αbệnh αtiểu αđường αtheo αcơ αchế α“thuậntheo αtự αnhiên”, αnghĩa αlà αnghiên αcứu, αtìm αkiếm αcác αhợp αchất αcó αnguồn αgốc αtừthiên αnhiên αcó αhoạt αtính αhạ αđường αhuyết αđể αtạo αra αcác αsản αphẩm αchữa αbệnh αantoàn αvà αhiệu αquả αlâu αdài α[13], α[14]

Đã αcó αhơn α1000 αloài αcây αđược αxác αđịnh αcó αkhả αkiểm αsoát αglucose αmáu αvà αíttác αdụng αphụ α[15], αtrong αđó αmột αsố αcây αđã αđược αnghiên αcứu αở αtrên αthế αgiới αvàViệt αNam αnhư αlá αổi, αlá αvối, αlá αsen, αbằng αlăng αnước, αtrà αxanh, αkhổ αqua, αquế,giảo αcổ αlam, αcây αdừa αcạn, [16], α[17], α[18], α[19] αMới αđây αnhất, αcó αcông αbố αvềviệc αnghiên αcứu αtìm αra α02 αhoạt αchất αmới αgiúp αhạ αđường αhuyết αtrong αdây αthìacanh αViệt αNam αđược αthực αhiện αbởi αnhóm αcác αnhà αkhoa αhọc, αgiáo αsư αcủa αĐạihọc αQuốc αgia αSeoul α(Hàn αQuốc) αvà αnhóm αcác αnhà αnghiên αcứu αcủa αcông αtyNam αdược αViệt αNam α[20] αVề αloài αĐịa αhoàng, αmặc αdù αđã αđược αsử αdụng αkếthợp αtrong αmột αsố αbài αthuốc αdân αgian αđể αchứa αmột αsố αbệnh αtuy αnhiên αtheo αtìmhiểu αthì αở αViệt αNam αmới αchỉ αcó αmột αsố αnghiên αcứu αvề αquy αtrình αtrồng αtrọt, αthuhoạch αĐịa αhoàng αvà αchế αbiến αThục αđịa α[21] αvà αmột αsố αhợp αchất α[8], α[22] αđượccông αbố αTuy αnhiên αchưa αthực αsự αcó αcông αtrình αnào αnghiên αcứu αtoàn αdiện αvềthành αphần αhóa αhọc αvà αcơ αsở αkhoa αhọc αcủa αnhững αứng αdụng αtrong αcác αbàithuốc αdân αgian αcủa αĐịa αhoàng αđặc αbiệt αlà αtác αdụng αhạ αđường αhuyết αcủa αloàinày

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU α2.1 αMẪU αNGHIÊN αCỨU

Mẫu αRehmannia glutinosa αđược αthu αhái αở αViệt αTrì α(Phú αThọ) αngày α6/03/2020.

Mẫu αđược αgiám αđịnh αbởi αTS αNguyễn αThế αCường, αViện αSinh αthái αvà αTàinguyên αsinh αvật α- αViện αHàn αlâm αKH&CN αViệt αNam αgiám αđịnh αMẫu αtiêu αbảnđược αlưu αgiữ αtại αViện αHoá αsinh αbiển α- αViện αHàn αlâm αKH&CN αViệt αNam(xem αKết αquả αgiám αđịnh αmẫu αtại αphần αPhụ αlục)

2.2 αNGUYÊN αVẬT αLIỆU

Bảng α2.1 αTrang αthiết αbị αthí αnghiệm

Tên trang thiết Thuộc phòng thí Mô tả vai trò của Tình

đối với đề tài

1 Máy αsiêu αâm Viện αHóa αsinh αbiển Chiết α αxuất, α αphân α αlập Tốt

Sắc αký αlớp αmỏng αđược αthực αhiện αtrên αbản αmỏng αtráng αsẵn αDC-Alufolien α

60 αF254 α(Merck α1,05715), αRP18 αF254s α(Merck) αPhát αhiện αchất αbằng

đèn αtử αngoại αở αhai αbước αsóng α254 αnm αvà α365 αnm αhoặc αdùng αthuốc αthử αlà αdungdịch αH2SO4 α10% αđược αphun αđều αlên αbản αmỏng, αsấy αkhô αrồi αhơ αnóng αtừ αtừ αđếnkhi αhiện αmàu.

2.3. 2 Sắc ký cột (CC)

Sắc αký αcột αđược αtiến αhành αvới αchất αhấp αphụ αlà αSilica αgel αpha αthường αvàpha αđảo αSilica αgel αpha αthường αcó αcỡ αhạt αlà α0,040-0,063 αmm α(240-430 αmesh).Silica αgel αpha αđảo αODS αhoặc αYMC α(30-50 m, αFuJisilisa αChemical αLtd.).Nhựa αtrao αđổi αion αDiaion αHP-20 α(Misubishi αChem αInd αCo., αLtd.)

2.4.2 Phổ hối lượng ph n giải cao HR-GLUCOSIDASEESI-GLUCOSIDASEMS

Phổ αkhối αphân αgiải αcao αHR-ESI-MS αđo αtrên αmáy αAgilent αAccurate αmass α6530QTOF αLC αMS αtại αViện αHóa αsinh αbiển, αViện αHàn αlâm αKhoa αhọc αvà αCông αnghệViệt αNam

2.4.3 Phổ cộng hưởng từ nh n (NMR)

Phổ αNMR αđo αtrên αcác αmáy α(chất αnội αchuẩn αlà αTMS):

+ BRUCKER αAVANCE α500 αMHz, αViện αHoá αhọc α- αViện αHàn αlâm αKH&CN αViệt αNam

Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:

 Phổ αcộng αhưởng αtừ αhạt αnhân αmột αchiều α(1D-NMR): α1H-NMR, α13NMR, αDEPT

KH α& αCN αViệt αNam.

Dung αmôi αđược αsử αdụng αlà αCD3OD αViệc αlựa αchọn αdung αmôi αđo αphụthuộc αvào αbản αchất αcủa αtừng αmẫu, αtheo αnguyên αtắc αdung αmôi αphải αhòa αtanhoàn αtoàn αmẫu αthử

2.5 αTHỰC αNGHIỆM

Để αcó αthể αthu αđược αcác αhợp αchất αtừ αcây αĐịa αhoàng, αđầu αtiên αáp αdụngphương αpháp αchiết αlỏng αrắn αSử αdụng αdung αmôi αchiết αcó αđộ αphân αcực αtrungbình αlà αmethanol αvới αmục αđích αkhảo αsát αcả αcác αhợp αchất αcó αđộ αphân αcực αít αđếntrung αbình αvà αkhá αphân αcực αTrong αquá αtrình αchiết, αsử αdụng αnhiệt αđộ αnhằm αrútngắn αthời αgian αchiết αvà αtăng αhiệu αsuất αchiết

Để αtách αthô αcác αphân αđoạn αgiúp αcho αquá αtrình αphân αlập αtrên αsắc αký αcộtthuận αlợi αchúng αtôi αsử αdụng αphương αpháp αchiết αphân αbố αlỏng αlỏng αvới αviệc αsửdụng αcác αdung αmôi αkhông αtan αvào αnhau αvà αphân αbố αchất αvào αcác αpha αkhácnhau αDung αmôi αchiết αđược αtăng αdần αđộ αphân αcực αtừ αít αphân αcực αđến αphân αcựcnhiều αQuá αtrình αlàm αgiầu αchất αđược αkiểm αtra αbằng αsắc αký αlớp αmỏng αtrước αkhitiến αhành αphân αtách αbằng αcác αloại αsắc αký αcột αvới αcác αloại αchất αhấp αphụ αkhácnhau αĐối αvới αnhững αhỗn αhợp αkhó αcó αkhả αnăng αtách αtrên αsắc αký αpha αthườngcần αthiết αsử αdụng αchất αphấp αphụ αkhác αđó αlà αsilice αgel αngược αpha α(YMC) αvớichiều αdài αmạch αchất αhấp αphụ αkhác αnhau α(RP-8 αhoặc αRP-18) αnhằm αtăng αthêmkhả αnăng αtách αTrong αquá αtrình αtách, αđiều αcần αlưu αý αlà αlàm αsao αcho αhệ αdungmôi αkiểm αtra αtrên αTLC αvà αtrên αcột αlà αgiống αnhau αvà αphải αlựa αchọn αchiều αdàicột, αđường αkính αcột αphù αhợp αvới αkhối αlượng αchất αcần αtách αcũng αnhư αRf αcủatừng αchất αtrong αhỗn αhợp

Loài αRehmannia glutinosa α phơi αkhô α(10kg) αđược αchiết αbằng αMeOH α3

lần, αmỗi αlần α20 αlít αthu αđược α2,2 αkg αcặn αchiết αMeOH αCặn αchiết αnày αđược αphân

bố α đều α trong α 5 α lít α nước α cất α và α được α chiết α phân α lớp α lần α lượt α vớidichloromethane αvà αethyl αacetate αthu αđược αcặn αCH2Cl2 α (250 αg), αcặn αEtOAc(120 αg) αvà αphần αtan αtrong αnước αPhần αtan αtrong αnước αđược αcô αquay αđể αloạibớt αdung αmôi αsau αđó αđược αchạy αqua αcột αDianion αvà αđược αgradient αbằng αhệdung αmôi αrửa αgiải αvới αđộ αphân αcực αtăng αdần α(methanol α: αnước α- α25:75 α→100:0, αv:v) αthu αđược α4 αphân αđoạn αlà αRGW1 α(80,2 αg), αRGW2 α(7,1 αg), αRGW3(10,6 αg) αvà αRGW4 α(6,3 αg)

Phân αđoạn αRGW2 α(7,1 αg) αđược αphân αtách αtrên αcột αsilica αgel αpha αđảo αvới

hệ αdung αmôi αmethanol α: αnước α– α1:2, αv:v) αthu αđược α4 αphân αđoạn αRGW2A α(1,5g), α RGW2B α (1,45 α g), α RGW2C α (1,47 α g) α và α RGW2D α (0,8 α g) α Phân α đoạnRGW2A α(1,5 αg) αđược αphân αtách αtrên αcột αsilica αgel αpha αthường αvới αhệ αdung

môi αrửa αgiải αdichloromethane α: αmethanol α– α3:1, αv:v) αthu αđược αhợp αchất αRG5

(250 αmg) αPhân αđoạn αRGW2B α(1,45 αg) αđược αphân αtách αtrên αcột αsilica αgel αphathường αvới αhệ αdung αmôi αrửa αgiải αethyl αacetate α: αmethanol α– α8:1, αv:v) αthu αđược

hợp αchất αRG3 α(18,0 αmg) αTiếp αtục αsử αdụng αsắc αký αcột αsilica αgel αpha αthường

với αhệ αdung αmôi αrửa αgiải αdichloromethane α: αacetone α– α1:1, αv:v) αvới αphân αđoạn

RGW2D α(0,8 αg) αthu αđược αhợp αchất αRG4 α(11,0 αmg).

Phân αđoạn αRGW3 α(10,6 αg) αđược αtách αtrên αcột αsilica αgel αpha αđảo αvới αhệdung αmôi αacetone α: αnước α– α1:1, αv:v) αthu αđược α4 αphân αđoạn αRGW3A α(1,2 αg),RGW3B α(1,5 αg), αRGW3C α(3,2 αg) αvà αRGW3D α(2,2 αg) αPhân αđoạn αRGW3A(1,2 αg) αđược αsử αdụng αsắc αkí αcột αsilica αgel αpha αthường αkết αhợp αvới αhỗn αhợp

dung αmôi αrửa αgiải αdichloromethane α: αmethanol α– α4:1, αv:v) αthu αđược αRG2 α(5,0

mg) αTiếp αtục αphân αtách αRGW3B α(1,5 αg) αbằng αsắc αkí αcột αsilica αgel αpha αđảo αvới

hệ αdung αmôi αacetone α: αnước α– α2:1, αv:v) αthu αđược αRG1 α(45 αmg).

Như αvậy, αsử αdụng αphối αhợp αcác αphương αpháp αsắc αký αcột αsilica αgel αphathường, αpha αđảo, αsắc αký αbản αmỏng αbằng αcác αhệ αdung αmôi αthích αhợp αđã αphânlập αđược α05 αhợp αchất αtừ αphân αđoạn αnước αcủa αcây αĐịa αhoàng

Sơ αđồ αphân αlập αloài αRehmannia glutinosa

2.6 αTHÔNG αSỐ αVẬT αLÍ αVÀ αDỮ αKIỆN αPHỔ αCỦA αCÁC αHỢP αCHẤT

HR-ESI-MS αm/z: α767.3459 α[M α+ αNa]+ α(Tính αtoán αlý αthuyết αcho α

Công αthức αphân αtử: αC29H36O15; αKhối αlượng αphân αtử: α624

2.6.4 Hợp chất RG4

Hợp αchất αRG4: αBrachynoside

Chất αbột αmàu αtrắng, αvô αđịnh αhình

Công αthức αphân αtử: αC31H40O15; αKhối αlượng αphân αtử: α652

Dữ αliệu αphổ α1H-NMR α(500 αMHz, αCD3OD, α13C-NMR: αxem αBảng α3.4 αtrang α41)

2.6.5 Hợp chất RG5

Hợp αchất αRG5: αjionoside αB1

Chất αbột αmàu αtrắng, αvô αđịnh αhình;

Công αthức αphân αtử: αC37H50O20; αKhối αlượng αphân αtử: α814

Dữ αliệu αphổ α1H-NMR α(500 αMHz, αCD3OD, α13C-NMR: αxem αBảng α3.5 αtrang α46)

2.7 αPHƯƠNG αPHÁP αĐÁNH αGIÁ αTÁC αDỤNG αỨC αCHẾ αENZYM

αα-GLUCOSIDASE

2.7.1 Vật liệu

Hóa αchất: αenzym αYeast αα-glucosidase;

glucopyranoside α(pNPG), α4-Nitrophenol α(Sigma) α[23], α[24]

p-nitrophenyl-α-D

2.7.2 Phương pháp

Hoạt αtính αức αchế αenzyme αα-glucosidase αcủa αhoạt αchất αnghiên αcứu αđược αthực αhiện α

 Chất αthử αđược αhòa αtan αtrong αDMSO αvà αpha αloãng αtrong αphosphatebuffer α10mM α(pH α6.8) αvà α50 αµl αđược αđưa αvào αcác αgiếng αcủa αkhay α96 αgiếng αđể αcónồng αđộ αphù αhợp

 20 αµl αα-glucosidase α(0,5 αU/ml) αvà α130µl αphosphate αbuffer α100mM α(pH

6.8) αđược αthêm αvào αmỗi αgiếng, αtrộn αđều αvà αủ αở α37oC αtrong α15 αphút αNhư αvậy, αnồng αđộ αmẫu αthử αđạt αđược αcuối αcùng αtrong αgiếng αlà α500-100-20-4 αµg/mL

 Cơ αchất αp-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside α(pNPG) αđược αđưa αtiếp αvào

từng αgiếng αthí αnghiệm αrồi αủ αtiếp αở α37oC αtrong α60 αphút

 Đĩa αthí αnghiệm αchỉ αcó αmẫu αthử, αphosphate αbuffer αvà αpNPG αđược αsửdụng αlàm αđối αchứng αtrắng α(blank) αGiếng αthí αnghiệm αchỉ αcó αDMSO

10%, αphosphate αbuffer, αenzyme αvà αpNPG αđược αsử αdụng αlàm αđối αchứng.Thí αnghiệm αđược αlặp αlại α3 αlần αđể αđảm αbảo αsự αchính αxác

 Dừng αthí αnghiệm αbằng αcách αthêm αvào α80 αµl αNa2CO3 α0,2M αvà αđo αOD αở αbước αsóng α405nm αbằng αmáy αđo αELISA αPlate αReader α(Biotek)

 Khả αnăng αức αchế αenzyme αα- αglucosidase αcủa αmẫu αthử αđược αxác αđịnh αtheo αcông αthức αsau:

% ức αchế α= α100% α- α(Amẫu αthử α/A αđối αchứng α*100)

Trong αđó: α αA αđối αchứng α α= αODđối αchứng α- αODblank

 Giá αtrị αIC50 α(nồng αđộ αức αchế α50%) αsẽ αđược αcác αđịnh αnhờ αphần αmềm αmáy αtính αTableCurve2Dv4

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 αXÁC αĐỊNH αCẤU αTRÚC αHÓA αHỌC αCỦA αHỢP αCHẤT αRG1

RG1: αRehmatinoside αE α(chất αmới)

Hợp αchất αRG1 αđược αphân αlập αdưới αdạng αbột αmàu αtrắng, αcông αthức αphân αtử

được αxác αđịnh αlà αC36H56O17 αbằng αpic αion αHR-ESI-MS αtại αm αz α783.3414 α[M α+Na]+ α(tính αtoán αlý αthuyết αcho α[C36H56O17Na]+, α783.3410)

Hình α3.1 αCấu αtrúc αhóa αhọc αcủa αhợp αchất αRG1 αvà αcủa αhợp αchất αso αsánh

Hình α3.2 αPhổ αHR-ESI-MS αcủa αhợp αchất αRG1

Hình α3.3 αPhổ α1H-NMR αcủa αhợp αchất αRG1

Phổ α1H-NMR α của αRG1 α (đo α trong αCD3OD) αcho αthấy αbốn αtín αhiệu αproton

singlet αcủa αbốn αnhóm αmethyl αbậc αba αcủa αtại αδH α1.06, α1.10, α1.39 αvà α2.34 α(mỗi3H, αs); αmột αtín αhiệu αdoublet αcủa αnhóm αmethyl αbậc αhai αtại αδH α1.24 α(d, αJ α= α6.5

Hz); αhai αproton αanome αở αδH α4.45 α(1H, αd, αJ α= α8.0 αHz) αvà α4.68 α(1H, αd, αJ α= α7.5

Hz) αcho αthấy αsự αhiện αdiện αcủa αhai αđơn αvị αđường

Phổ α13C-NMR αcho αthấy α36 αtín αhiệu αcarbon, αbao αgồm αmột αcarbon αcarbonyl αở αδC168.7, αsáu αcarbon αolefinic αở αδC α α104.8, α118.9, α134.1, α140.9, α141.3 αvà α154.5,bốn αcarbon αkhông αproton αở αδC α α42.3, α79.1, α82.0 αvà α83.3, αmười αbốn αcarbonmethine αở αδC α α39.3, α51.6, α71.7, α72.5, α74.8, α75.8, α77.0, α78.0, α78.2, α78.8, α79.7,93.4, α97.9 αvà α99.4, αsáu αcarbon αmethylene αở αδC α18.7, α31.2, α32.7, α48.0, α62.9 αvà72.1, αnăm αcarbon αmethyl αở αδC α14.7, α18.5, α20.5, α21.3 αvà α25.9

Hình α3.4 αPhổ α13C-NMR αcủa αhợp αchất αRG1

Phân αtích αdữ αliệu αNMR αcho αthấy αcấu αtrúc αcủa αRG1 αchứa αmột αiridoid, αmột αapo

carotenoid αsesquiterpenoid αvà αhai αphân αtử αđường αĐộ αdịch αchuyển αhóa αhọc

13C-NMR αcủa αhai αthành αphần αđường αở αδC α99.4, α74.8, α78.0, α71.7, α78.2 αvà α62.9;97.9, α75.8, α78.8, α77.0, α72.5 αvà α18.5; αvà αtín αhiệu α2 αproton αanome αở αδH α4.68 α(1H,

d, αJ α= α7.5 αHz) αvà α4.45 α(1H, αd, αJ α= α8.0 αHz) αchỉ αra αrằng α2 αphân αtử αđường αlà glucopyranosyl αvà αβ-D-quinovopyranosyl αCác αphân αtử αđường αnày αcũng αđược

αβ-D-đề αcập αtrong αcác αbài αbáo αvề αloài αR glutinosa α[26-28].

Hình α3.5 αMột αsố αtương αtác αHMBC αchính αcủa αhợp αchất αRG1

Hình α3.6 αPhổ αHMBC αcủa αhợp αchất αRG1

Hình α3.7 αPhổ αHSQC αcủa αhợp αchất αRG1

Tương αtác αHMBC αgiữa αH-1 α(δH α5.50) αvà αC-3 α(δC α140.9), αH-3 α(δH α6.23) αvà αC-1(δC α93.4) α/ αC-5 α(δC α39.3), αH-6 α(δH α4.88) αvà αC-4 α(δC α104.8) α/ αC-8 α(δC α79.1) α/ αC-9(δC α51.6) αvà αgiữa αH-10 α(δH α1.39) αvà αC-7 α(δC α48.0) α/ αC- α8 α(δC α79.1) α/ αC-9 α(δC α51.6)gợi αý αsự αhiện αdiện αcủa αliên αkết αđôi αở αC-3 α/ αC-4, αnhóm αoxy αvà αhydroxyl αở αC-6 αvàC-8 αTương αtác αNOESY αgiữa αH-10 α(δH α1.39) αvà αH-1 α(δH α5.50) α/ αH-6 α(δH α4.88)

cho αthấy αtất αcả αcác αproton αnày αđều αlà αđịnh αhướng αα αNgoài αra, αtương αtác αHMBC

giữa αH-1′ α(δH α4.68) αvà αC-1 α(δC α93.4) αchỉ αra αvị αtrí αcủa αβ-D-glucopyranosyl αtại αC-1

của αiridoid αTương αtác αHMBC αgiữa αH-13″ α(δH α1.06) αvà αC-1″ α(δC α42.3) α/ αC-2″ α(δC31.2) α/ αC-6″ α(δC α82.0) α/ αC-14″ α(δC α72.1), αH α-7" α(δH α6.87) αvà αC-1" α(δC α42.3) α/ αC-5"(δC α83.3) α/ αC-6" α(δC α82.0) αvà αgiữa αH-12" α(δH

2.34) αvà αC-8" α(δC α134.1) α/ αC-9" α(δC α154.5) α/ αC-10" α(δC α118.9) αchỉ αra αvị αtrí αcủacác αnhóm αhydroxyl αtại αC-6" αvà αC-14" αvà αliên αkết αđôi αở αC-7"/ αC-8" αvà αC-9"/ αC-10" αcủa αsesquiterpene

Tương αtác αNOESY αgiữa αH-7″ α(δH α6.87) αvà αH-12″ α(δH α2.34) α/ αH-13″ α(δH α1.06)

và α giữa α H-14″ α (δH α 3.01 α và α 3.64) α / α H-15″ α (δH α 1.10) α chỉ α ra α rằng α nhómhydroxymethylene αở αC-1″, αnhóm αmethyl αở αC-5″ αvà αnhóm αhydroxyl αở αC-6″

ở cùng αmột αphía αCấu αhình αcủa αcả αliên αkết αđôi αcủa αsesquiterpene αở αC-7"/

C-8" αvà αC-9"/ αC-10" αđược αxác αđịnh αlà αE, αdựa αtrên αhằng αsố αghép αnối αlớn αgiữa H-7" αvà αH-8", αJ α= α16,0 αHz αvà αtương αtác αNOESY αgiữa αH-8″ α(δH α6.50) αvà αH-10″ α(δH α5.86)

Các αcấu αhình αtuyệt αđối αở αC-1", αC-5" αvà αC-6" αcủa αsesquiterpene αđược αxác αđịnhbằng αphổ αCD αvới αhiệu αứng αCotton αở α226 αnm α(dương) αvà α265 αmn α(âm), αtương αtự

như αcủa αsec-hydroxyjiocarotenoside αA1 α[29] αVị αtrí αcủa αβ-D-quinovopyranosyl

tại αC-5″ αcủa αsesquiterpene αđã αđược αxác αnhận αbởi αtương αtác αHMBC αtừ αH-1"' α(δH4.45) αđến αC-5″ α(δC α83.3) αHơn αnữa, αvị αtrí αeste αhóa αtại αC-11″ αcủa αsesquiterpene

và αC-6 αcủa αajugol αđã αđược αxác αnhận αbởi αtương αtác αHMBC αtừ αH-6 α(δH α4.88) αđếnC-11″ α(δC α168.7) αDựa αtrên αcác αphân αtích αsố αliệu αphổ αNMR αtrên αvà αso αsánh αvới

số αliệu αcủa αhợp αchất αtham αkhảo αAeginetoyl αajugol α5′′-O- -D-quinovoside α[30],

cấu αtrúc αhóa αhọc αcủa αRG1 αđã αđược αxác αđịnh αlà αhợp αchất αiridoid-sesquiterpene

mới αvà αđược αđặt αtên αlà αrehmannioside αE α[31]

Hình α3.8 αPhổ αNOESY αcủa αhợp αchất αRG1

Hình α3.9 αPhổ αCD αcủa αhợp αchất αRG1

Bảng α3.1 αSố αliệu αphổ αNMR αcủa αhợp αchất αRG1 αvà αhợp αchất αso αsánh

a đo trong CD 3 OD, b 125MHz, c 500MHz, αδC # αAeginetoyl αajugol α5′′-O- -D-quinovoside α[30]

3.2 αXÁC αĐỊNH αCẤU αTRÚC αHÓA αHỌC αCỦA αHỢP αCHẤT αRG2

RG2 αRehmatinoside αF α(chất αmới)

Hình α3.10 αCấu αtrúc αcủa αhợp αchất αRG2 αvà αcủa αhợp αchất αso αsánh

Hợp αchất αRG2 α thu αđƣợc αdạng αbột αmàu αtrắng, αcông αthức αphân αtử αđƣợc αxác

định αlà αC36H56O16 αbằng αpic αion αHR-ESI-MS αtại αm αz α767.3459 α[M α+ αNa]+ α(tínhtoán αlý αthuyết αcho αion αphân αtử α[C36H56O16Na]+ αlà α767.3461)

Hình α3.11 αPhổ αHR-ESI-MS αcủa αhợp αchất αRG2

Hình α3.12 αPhổ α1H-NMR αcủa αhợp αchất αRG2

Phổ α1H-NMR αcủa αRG2 αthể αhiện αcác αtín αhiệu αđặc αtrƣng αsau: αtín αhiệu αproton α

singlet αcủa αnăm αnhóm αmethyl αbậc αba αcủa αtại αδH α0.87, α1.17, α1.20, α1.43 αvà α2.07

(mỗi α3H, αs); αmột αtín αhiệu αdoublet αcủa αnhóm αmethyl αbậc αhai αtại αδH α1.24 α(d, αJ α=

6.0 αHz); αnăm αproton αolefin αtại αδH α6.22 α(dd, αJ α= α2.0, α6.0 αHz), α4.97 α(dd, αJ α= α2.0, 6.0 αHz), α6.87 α(d, αJ α= α16.5 αHz), α7.69 α(d, αJ α= α16.5 αHz) αvà α5.71 α(s); αhai αproton

anome αở αδH α4.68 α(1H, αd, αJ α= α8.0 αHz) αvà α4.44 α(1H, αd, αJ α= α7.5 αHz) αcho αthấy αsựhiện αdiện αcủa αhai αđơn αvị αđường

Phổ α13C-NMR αbao αgồm αtín αhiệu αcủa α36 αcarbon, αtrong αđó: αmột αcarbon αcarbonyl

ở δC α168.0; αsáu αcarbon αolefin αở αδC α104.6, α117.0, α127.8, α141.1, α142.8 αvà α153.0;bốn αcarbon αkhông αproton αở αδC α39.8, α79.2, α80.6 αvà α83.6; αmười αbốn αcarbon αmethine

ở αδC α39.4, α51.5, α71.9, α72.6, α74.8, α75.8, α77.1, α78.0, α78.2, α78.8, α79.9, α93.4, α98.0 αvà99.4; αnăm αcarbon αmethylene αở αδC α 18.7, α32.9, α37.2, α48.0 αvà α63.0; αvà αsáu αcarbonmethyl αở αδC α18.4, α21.6, α22.0, α26.0, α26.2 αvà α27.8

Hình α3.13 αPhổ α13C-NMR αcủa αhợp αchất αRG2

Hình α3.14 αPhổ αHSQC αcủa αhợp αchất αRG2 Bảng α3.2 αSố αliệu αphổ αNMR αcủa αhợp αchất αRG2 αvà αhợp αchất αso αsánh