(Luận văn thạc sĩ) xác định hiệu suất, đặc trưng tính chất của dịch oligo carrageenan từ rong sụn kappaphycus alvarezii thủy phân bằng axit

Mục tiêu của luận văn Xác định hiệu suất chiết, trọng lượng phân tử và đặc trưng cấu trúc củaoligo carrageenan thu được bằng phương pháp thủy phân rong sụn trong axit vô cơ axit sulfuric

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-Nguyễn Hoàng

XÁC ĐỊNH HIỆU SUẤT, ĐẶC TRƢNG TÍNH CHẤT CỦA DỊCH OLIGO CARRAGEENAN TỪ RONG SỤN

KAPPAPHYCUS ALVAREZII THỦY PHÂN BẰNG AXIT

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Nha Trang - 2019

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-Nguyễn Hoàng

XÁC ĐỊNH HIỆU SUẤT, ĐẶC TRƢNG TÍNH CHẤT CỦA DỊCH OLIGO CARRAGEENAN TỪ RONG SỤN

KAPPAPHYCUS ALVAREZII THỦY PHÂN BẰNG AXIT

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các sốliệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bốtrong bất kỳ công trình nào khác.

Nha Trang, ngày 14 tháng 12 năm

2019

Tác giả luận văn

Nguyễn Hoàng

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng đồng nghiệp và bạn bè.

Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Phạm Trung Sản và

TS Đào Việt Hà đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành bản luận văn này.

Tôi chân thành cảm ơn đề tài mã số: TN18/C06 thuộc chương trình Nghiên cứu ứng dụng và phát triển công nghệ cấp quốc gia đã hỗ trợ kinh phí cho việc thực hiện Luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Ban Chủ nhiệm Khoa Hóa học và Phòng Đào tạo đã giảng dạy, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi thực hiện luận văn và hoàn thành mọi thủ tục cần thiết.

Tôi chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện về mọi mặt của Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang cũng như các anh chị em trong phòng Nghiên cứu ăn mòn và Công nghệ điện hóa trong quá trình thực hiện luận văn.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân

và bạn bè đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn.

Nha Trang, ngày 14 tháng 12 năm

2019

Tác giả luận văn

Nguyễn Hoàng

MỤC LỤC

Trang Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục 1

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt 6

Danh mục các bảng 7

Danh mục các hình vẽ, đồ thị 9

MỞ ĐẦU 11

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 RONG SỤN 13

1.1.1 Giới thiệu về rong sụn 13

1.1.2 Thành phần hóa học của rong sụn 13

1.2 TỔNG QUAN VỀ CARRAGEENAN VÀ OLIGO CARRAGEENAN 14 1.2.1 Giới thiệu chung về carrageenan 14

1.2.2 Phân loại 15

1.2.3 Cấu trúc 16

1.2.4 Đặc trưng hóa học của carrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii 17

1.2.5 Oligo Carrageenan và ứng dụng 18

1.2.5.1 Oligo carrageenan 18

1.2.5.2 Ứng dụng của oligo carrageenan 20

1.2.6 Các phương pháp thủy phân carrageenan thành oligo carrageenan 23

1.2.6.1 Phương pháp hóa học 23

1.2.6.2 Phương pháp vật lý 24

1.2.6.3 Phương pháp sinh học 25

1.2.6.4 Các phương pháp kết hợp 26

1.3 THỦY PHÂN CARRAGEENAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC 27

1.3.1 Ưu điểm 27

1.3.2 Nhược điểm 28

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 29

1.4.1 Phân tích thành phần hóa học rong sụn 29

1.4.1.1 Phân tích protein tổng số bằng phương pháp Kieldahl 29

1.4.1.2 Phân tích hàm lượng lipid tổng số bằng phương pháp Folch 29

1.4.1.3 Phương pháp phân tích hàm lượng tro 30

1.4.1.4 Phương pháp phân tích độ ẩm của rong biển khô 30

1.4.2 Phương pháp phân tích hàm lượng carbohydrat tổng sau thủy phân.30 1.4.3 Phương pháp phân tích trọng lượng phân tử của oligo carrageenan 30 1.4.3.1 Bằng nhớt kế 30

1.4.3.2 Sắc ký rây phân tử 31

1.4.3.3 Tán xạ ánh sáng tĩnh 32

1.4.4 Phương pháp phân tích cấu trúc oligo carrageenan 35

1.4.4.1 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) 35

1.4.4.2 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 36

1.4.4.3 Phương pháp phổ khối lượng (MS) 37

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 39

2.2 HÓA CHẤT: 39

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

2.3.1 Phương pháp phân tích thành phần hóa học rong sụn 39

2.3.1.1 Phân tích protein thô 39

2.3.1.2 Phân tích lipid thô 39

2.3.1.3 Phân tích hàm lượng tro 41

2.3.1.4 Phân tích độ ẩm 42

2.3.2 Phương pháp chiết carrageenan 42

2.3.3 Phương pháp thủy phân tạo oligo carrageenan 43

2.3.4 Phương pháp phân tích hàm lượng carbohydrat tổng 43

2.3.5 Phương pháp phân tích trọng lượng phân tử bằng phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC) 43

2.3.6 Phương pháp phân tích đặc trưng cấu trúc carrageenan bằng phổ IR 43

2.4 THỰC NGHIỆM 44

2.4.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 44

2.4.1.1 Thu và xử lý nguyên liệu 45

2.4.1.2 Chiết carrageenan 45

2.4.2 Thủy phân rong sụn bằng các axít ở các điều kiện khác nhau 47

2.4.2.1 So sánh hiệu suất thủy phân theo nồng độ axit 47

2.4.2.2 So sánh hiệu suất thủy phân các loại axit theo thời gian 48

2.4.2.3 So sánh hiệu suất thủy phân các loại axit theo nhiệt độ 49

2.4.3 Thu hồi oligo carrageenan 49

2.4.4 Phân tích hàm lượng carbohydrat tổng 49

2.4.5 Xác định hiệu suất thủy phân và trọng lượng phân tử dịch thủy phân 50

2.4.6 Đưa ra điều kiện thủy phân tối ưu cho dịch chiết sau thủy phân 50

2.4.7 Khảo sát khả năng kích thích sinh trưởng của dịch oligo carrageenan

trên cây ngô .50

2.5 XỬ LÝ SỐ LIỆU 51

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 THÀNH PHẦN HÓA HỌC RONG SỤN 52

3.2 HIỆU SUẤT THỦY PHÂN THEO CARBOHYDRAT TỔNG 53

3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ axit 53

3.2.1.1 Đánh giá hiệu suất thủy phân của hai loại axit 53

3.2.1.2 Lựa chọn nồng độ axit thích hợp 56

3.2.2 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân 57

3.2.2.1 Đánh giá hiệu suất thủy phân của hai loại axit 57

3.2.2.2 Lựa chọn thời gian thủy phân thích hợp 59

3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ 60

3.2.3.1 Đánh giá hiệu suất thủy phân 60

3.2.3.2 Lựa chọn nhiệt độ thích hợp 62

3.3 TỐI ƯU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN THỦY PHÂN RONG SỤN KAPPAPHYCUS ALVAREZII BẰNG AXÍT VÀ ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH THỦY PHÂN THÍCH HỢP 63

3.3.1 Tối ưu hóa các điều kiện thủy phân 63

3.3.2 Đề xuất quy trình thủy phân carrageenan chiết từ rong sụn Kappaphycus alvarezii bằng phương pháp hóa học sử dụng xúc tác axit 70

3.4 TRỌNG LƯỢNG PHÂN TỬ TRUNG BÌNH CỦA OLIGO CARRAGEENAN 72

3.5 ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC CỦA OLIGO CARRAGEENAN 76

3.6 KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG CỦA DỊCH OLIGO CARRAGEENAN TRÊN CÂY NGÔ 80

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1 KẾT LUẬN 85

4.2 KIẾN NGHỊ 85

TÀI LIỆU THAM KHẢO 87

PHỤ LỤC 94

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

3,6 AG 3,6-AnhydroGalactose 3,6-AnhydroGalactose

GPC Gel Permeation Chromatography Sắc ký thẩm thấu gel

HMF HydroxyMethylFurfural HydroxyMethylFurfural

NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân

PGR Plant growth regulator

trưởng thực vậtSLS Static Light Scattering Tán xạ ánh sáng tĩnh

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của rong sụn 13Bảng 3.1 Thành phần hóa học của rong Sụn – Kappaphycus alvarezii 52Bảng 3.2 Hàm lượng carbohydrat tổng (g/L) sau thủy phân của các loạiaxit theo nồng độ khác nhau, thời gian 90 phút, nhiệt độ 90 0 C, 2 %

(w/v) bột carrageenan 54Bảng 3.3 Kết quả phân tích thống kê với số liệu hiệu suất thủy phân theonồng độ axit 56Bảng 3.4 Hàm lượng carbohydrat tổng (g/L) ) sau thủy phân của các loạiaxit theo thời gian, nhiệt độ 90 0 C, 2 % (w/v) bột carrageenan, nồng

độ axit 0,2 M 58Bảng 3.5 Kết quả phân tích thống kê với số liệu hiệu suất thủy phân theothời gian thủy phân 59Bảng 3.6 Hàm lượng carbohydrat tổng (g/L) sau thủy phân của các loạiaxit theo nhiệt độ thủy phân, thời gian 90 phút, 2 % (w/v) bột rong

carrageenan trong 80 mL axit 0,2 M 61Bảng 3.7 Kết quả phân tích thống kê với số liệu hiệu suất thủy phân theonhiệt độ thủy phân 62Bảng 3.8 Giới hạn phạm vi và mức biến đổi của các yếu tố 63Bảng 3.9 Kết quả xác định hàm mục tiêu theo phần mềm qui hoạch thựcnghiệm 64Bảng 3.10 Kết quả phân tích phương sai với hàm mục tiêu là hiệu suất

thủy phân bằng axit ascorbic 65Bảng 3.11 Kết quả phân tích phương sai với hàm mục tiêu là hiệu suất

thủy phân bằng axit sulfuric 65Bảng 3.12 Kết quả phân tích thống kê sự phù hợp của các yếu tố 66

Bảng 3.13 Các điều kiện ràng buộc của yếu tố ảnh hưởng và hàm mục

tiêu 68

Bảng 3.14 Giải pháp tối ưu thuật toán đề nghị 69

Bảng 3.15 Kiểm chứng kết quả theo mô hình và thực nghiệm 69

Bảng 3.16 Kết quả tối ưu hóa điều kiện thủy phân 69

Bảng 3.17 Trọng lượng phân tử trung bình Mw (kDa) của oligocarrageenan khi thủy phân bột carageenan (Mw = 454,5 kDa) bằng axit ascorbic (C6H8O6) ở nồng độ và thời gian khác nhau, nhiệt độ 90 O C 73

Bảng 3.18 Trọng lượng phân tử trung bình Mw (kDa) của oligocarrageenan khi thủy phân bột carageenan (Mw = 454,5 kDa) bằng axit sulfuric (H2SO4) ở nồng độ và thời gian khác nhau, nhiệt độ 90 C O 75 Bảng 3.19 Một số dao động đặc trưng của nhóm nguyên tử và các liên kết trong phổ hồng ngoại của kappa carrageenan [62] 78

Bảng 3.20 Điều kiện thủy phân và tính chất của dịch oligo carrageenan 80

Bảng 3.21 Chiều cao cây (cm) sau các đợt phun dịch chiết thủy phân rong sụn Kappaphycus alvarezii từ axit ascorbic với nồng độ carbohydrat trong dịch phun lá khác nhau 80

Bảng 3.22 Chiều cao cây (cm) sau các đợt phun dịch chiết thủy phân rong sụn Kappaphycus alvarezii từ axit sulfuric với nồng độ carbohydrat trong dịch phun lá khác nhau 82

Bảng 3.23 Giá trị trung bình của chiều cao cây (cm) và năng suất hạt của bắp (tạ/ha) sau 3 đợt phun (60 ngày) với nồng độ carbohydrat trong dịch phun lá khác nhau 83

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của carrageenan 15

Hình 1.2 Cấu trúc của kappa carrageenan 16

Hình 1.3 Cấu trúc của iota carrageenan 16

Hình 1.4 Cấu trúc của lamda carrageenan 16

Hình 1.5 Quá trình chuyển nhóm cấu trúc của các loại carrageenan 18

Hình 1.6 Thuỷ phân axit: liên kết glycoside α- l, 3- bị phá vỡ tạo thành galactobiose 19

Hình 1.7 Thủy phân carrageenan bằng axit đậm đặc 19

Hình 1.8 Neocarrabiose - sản phẩm thuỷ phân carrageenan bằng enzyme, trong đó các liên kết glycoside β-1,4- bị phá vỡ 19

Hình 1.9 Hình học tán xạ và dao động cường độ tại máy dò 33

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 44

Hình 2.2 Qui trình xử lý rong biển trước khi chiết carrageenan 45

Hình 2.3 Qui trình chiết carrageenan từ bột rong sụn Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty 46

Hình 2.4 Sản phẩm bột oligo carrageenan trước và sau khi thủy phân 47

Hình 2.5 Qui trình thủy phân các loại axit theo nồng độ 47

Hình 2.6 Qui trình thủy phân các loại axit theo thời gian 48

Hình 2.7 Qui trình thủy phân các loại axit theo nhiệt độ 49

Hình 3.1 Hiệu suất thủy phân (%) theo carbohydrat tổng của các loại axit theo nồng độ khác nhau, thời gian 90 phút, nhiệt độ 90 0 C, 2 % (w/v) bột carrageenan 55

Hình 3.2 Hiệu suất thủy phân theo carbohydrat tổng của các loại axit theothời gian, nhiệt độ ở 90 O C, 2 % (w/v) bột carrgeenan, nồng độ axit 0,2M 58Hình 3.3 Hiệu suất thủy phân (%) theo carbohydrat tổng của các loại axittheo nhiệt độ, thời gian 90 phút, 2% (w/v) bột carrageenan, nồng độ

axit 0,2M 61Hình 3.4 So sánh giá trị từ thực nghiệm và từ mô hình dự đoán 67Hình 3.5 Đồ thị dạng 3D bề mặt đáp ứng và đường đồng mức cho biết ảnhhưởng của hai yếu tố nồng độ axit và thời gian thủy phân đến hiệu suấtthủy phân bằng axit ascorbic (a, c) và axit sulfuric (b, d) 68Hình 3.6 Quy trình đề xuất thủy phân carrageenan chiết từ rong sụn

Kappaphycus alvarezii bằng phương pháp hóa học sử dụng xúc tác

axit 71Hình 3.7 Phổ GPC của mẫu carrageenan 73Hình 3.8 Phổ GPC khi thủy phân 2 % (w/v) bột carrageenan bằng axit

ascorbic (0,15 M, 85 phút, 90 O C) 74Hình 3.9 Phổ GPC khi thủy phân 2 % (w/v) bột carrageenan bằng axit

sulfuric (0,15 M, 85 phút, 90 O C) 74Hình 3.10 Phổ hồng ngoại IR của mẫu carrgeenan 76Hình 3.11 Phổ hồng ngoại IR của mẫu oligo carrageenan khi thủy phân 2 %(w/v) bột carrageenan bằng axit ascorbic (0,15 M, 85 phút, 90 O C) 77Hình 3.12 Phổ hồng ngoại IR của mẫu oligo carrageenan khi thủy phân 2 %(w/v) bột carrageenan bằng axit sulfuric (0,15 M, 85 phút, 90 O C) 77

MỞ ĐẦU

Trong số các loại rong biển được nghiên cứu để phát triển thành các

dạng phân bón, rong sụn Kappaphycus alvarezii được đặc biệt quan tâm vì

thành phần dinh dưỡng vượt trội cùng mức tăng trưởng, khả năng đáp ứngtốt của cây trồng Hàng loạt các công bố trên thế giới đã khẳng định khả năngkích thích sự phát triển của cây trồng, khả năng chống chịu bệnh và năng suấttăng cao khi sử dụng phân bón từ rong sụn so với các loại rong khác và so vớiđối chứng không sử dụng phân bón rong biển

Carrageenan được chiết xuất từ rong sụn Kappaphycus alvarezii là

thành phần chủ yếu của thành tế bào rong, chiếm khoảng 40% trọng lượngkhô, chúng bao gồm galactose sulfate và trong một số trường hợp còn có cảanhydrogalactose Carrageenan đã được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệpthực phẩm với các tính chất như tạo gel, làm dày, ổn định

Carrageenan biến tính (trọng lượng phân tử thấp hay ở dạng oligo) từ

rong sụn Kappaphycus alvarezii được nghiên cứu ứng dụng trong mỹ phẩm,

dược phẩm và phân bón Oligo carrageenan với vai trò là phân bón sinh họckhông chỉ bởi tác dụng của nó như một chất kích thích sinh trưởng tự nhiên

mà còn có khả năng tăng sức đề kháng cho cây trồng chống lại sâu bệnh, sựthay đổi của thời tiết

Cũng như một số polysacchride khác, carrageenan có thể thủy phânhay cắt mạch thành oligo bằng phương pháp vật lý (chiếu xạ, dùng sóng siêuâm), phương pháp hóa học (tác nhân axit, bazơ, tác nhân oxy hóa ) hayphương pháp sinh học (enzyme) với những ưu/nhược điểm riêng

Một trong những hạn chế của phương pháp hóa học là thường tạo racác sản phẩm phụ trong quá trình thủy phân Tuy nhiên, thủy phân bằng axitlại có một số lợi thế về tốc độ phản ứng nhanh, giá thành rẻ và nguồn hóa chất

dễ có hơn Với mục tiêu xây dựng quy trình thủy phân phù hợp nhằm sử dụngrong sụn làm chất kích thích sinh trưởng trong nông nghiệp, phương phápthủy phân bằng axit được xem là phương pháp thích hợp để thủy phân rong

sụn Kappaphycus alvarezii.

Các oligosaccharide của carrageenan điều chế bằng việc thủy phân axithoặc bẽ gãy mạch bằng enzyme là các chất sinh học kích thích sinh trưởng,thụ tinh, các chất này có khả năng kích thích cho sự tích lũy dinh dưỡng và táitạo lại sức sản xuất, dẫn đến sự thụ phấn cho hoa và tạo quả tốt hơn Cácoligosaccharide sulphat đã được công nhận để kích thích cho cơ chế bảo vệcây, do đó oligocarrageenan có thể sử dụng như một chất tăng trưởng tựnhiên.

Đặc trưng chất lượng của dịch sau thủy phân phụ thuộc nhiều vào các

điều kiện thủy phân như nồng độ axit, nhiệt độ và thời gian Do đó, “Xác định hiệu suất, đặc trưng tính chất của dịch oligo carrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii thủy phân bằng axit” được chọn là đề tài luận văn

nhằm đưa ra quy trình thủy phân phù hợp cho mục đích sử dụng sản phẩm từrong sụn làm chất kích thích sinh trưởng cho cây trồng

Mục tiêu của luận văn

Xác định hiệu suất chiết, trọng lượng phân tử và đặc trưng cấu trúc củaoligo carrageenan thu được bằng phương pháp thủy phân rong sụn trong axit

vô cơ (axit sulfuric) và axit hữu cơ (axit ascorbic) ở các điều kiện khác nhau(nồng độ axit, nhiệt độ, thời gian), từ đó đưa ra quy trình thủy phân phù hợpcho mục đích làm chất kích thích sinh trưởng trong nông nghiệp

Để đạt được mục tiêu đề ra, nội dung nghiên cứu của luận văn baogồm:

- Khảo sát hiệu suất thủy phân ở các điều kiện thủy phân khác nhau

- Tối ưu hóa các điều kiện thủy phân với hiệu suất thủy phân tối ưu

- Phân tích trọng lượng phân tử trung bình và đặc trưng cấu trúc của dịch oligo carrageenan thu được sau quá trình thủy phân

- Thử nghiệm hiệu quả kích thích sinh trưởng của dịch chiết oligo carrageenan trên cây ngô

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 RONG SỤN

1.1.1 Giới thiệu về rong sụn

Rong sụn thuộc ngành Tảo hồng (Rhodophyta), phân lớp:

Kappaphycus, loài: alvarezii, trong đó loài Kappaphycus alvarezii (Doty)

tại trường đại học Hawaii bắt đầu nghiên cứu phát triển phương pháp nuôitrồng rong sụn ở Hawaii Từ đó, rong sụn được nuôi trồng và phát triển rộngrãi ở nhiều nước như Indonesia, Malaysia, Ấn Độ, Việt Nam …

Rong sụn được Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang dinhập từ Philipines về Việt Nam vào tháng 3 năm 1993, và được nhân giốngnghiên cứu các đặc tính sinh học, giải pháp kỹ thuật và mô hình trồng rongSụn ở các loại thủy vực khác nhau của nước ta

1.1.2 Thành phần hóa học của rong sụn

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của rong sụn [2]

Khi ở dạng tươi, rong sụn thường có màu xanh hoặc màu xanh đỏ nâu

do trong rong có hai loại sắc tố là phycobline (bao gồm phycocyanine có màuxanh tím, phycocythine có màu đỏ) và chlorophyll Đây là loài đơn trụ baogồm 2 phần:

Phần lõi: gồm một tế bào trung trụ chạy dọc thân từ gốc đến ngọn.Xung quanh có từ 3 ÷ 4 hàng tế bào vây trụ có kích thước lớn, hình tròn hayhình đa giác, trong suốt, vách mỏng chứa các chất dinh dưỡng (car)

Phần da: gồm nhiều tế bào nhỏ sắp xếp khít nhau, hình tròn hay hìnhbầu dục, không trong suốt, chứa đầy sắc tố Ngoài cùng là lớp vỏ keo chứacellulose, chiếm khoảng 4% trọng lượng rong khô, đóng vai trò bảo vệ cáclớp bên trong

Thành phần hóa học chính của rong sụn là carrageenan có thể chiếmđến 40% trọng lượng khô Trong đó, carrageenan tan chiếm khoảng 33%,carrageenan không tan chiếm 7%

1.2 TỔNG QUAN VỀ CARRAGEENAN VÀ OLIGO CARRAGEENAN

1.2.1 Giới thiệu chung về carrageenan

Carrageenan là một loại colloid thuộc nhóm phycocolloid cùng với agar

và alginat Carrageenan được chiết xuất từ rong biển đỏ có cấu trúc là mộtpolysaccharite Carrageenan đã được biết đến từ rất lâu đời ở các nướcphương Tây Vào những năm 1842-1862, các nhà khoa học đã phát hiện ra

carrageenan có trong một loài tảo đỏ có tên là Chondrus cripus và loài Irish

moss thuộc họ Rhodophyceae, nhưng những khám phá của họ còn thô sơ,

chưa xác định được những tính chất cũng như đặc điểm của nó Mãi đếnnhững năm khi chiến tranh thế giới thứ nhất bùng nổ, khi mà nhu cầu chiếtxuất gelatin để phục vụ quân đội trở nên cấp thiết đòi hỏi cần phải có chấtthay thế, rất nhiều các nghiên cứu đã được tiến hành và cuối cùngcarrageenan đã được tìm ra [3]

Tên Carrageenan hay Carrageenan – irish moss là tên của một thị trấnven biển Irish thuộc Carrageenan Cùng với sự tiến bộ về khoa học kỹ thuật

cũng như thiết bị hiện đại, ngày nay chúng ta đã khám phá ra những điều hữu

ích mà carrageenan đã mang lại Từ những loài tảo đỏ (Rhodophyceae) người

ta đã phát hiện ra nhiều loại carrageenan khác nhau, bao gồm: carrageenan, lamda-carrageenan, iota-carrageenan [4]

kappa-Carrageenan là một polysaccharide dị thể của galactose –galactan.Ngoài mạch polysaccharide chính còn có thể có các nhóm sulfat được gắnvào carrageenan ở những vị trí và số lượng khác nhau Vì vậy, carrageenankhông chỉ là một polysaccharide đơn lẻ, có cấu trúc nhất định mà là cácgalactan sulfat Mỗi galactan sulfat là một dạng riêng của carrageenan và có

ký hiệu riêng Ví dụ: λ – , κ –, ι –, ν – carrageenan [4]

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của carrageenan [5]

1.2.2 Phân loại

Phần lớn các carrageenan có phân tử lượng từ 500 – 1000 kDa, nhưngtrong đó chúng có thể chứa tới 25% polysaccharide với phân tử lượng nhỏdưới 100 kDa Carrageenan có cấu trúc chung là một polymer mạch thẳng vớiliên kết luân phiên của β-D-galactopyranora qua liên kết 1,3 và α-Dgalactopyranora qua liên kết 1-4 [6] Các công trình nghiên cứu bằng phươngpháp cộng hưởng từ hạt nhân cho thấy carrageenan có nhiều cấu trúc hóa họckhác nhau [7] Do đó, phân loại theo cấu trúc hóa học có các loại carrageenansau: mu, kappa, nu, iota, lamda, theta và xi Các loại này chỉ khác nhau ở mức

độ sulphat hóa, vị trí sulphat hóa, mức độ dehydrat hóa của chuỗipolysacharide Cấu trúc của chúng đều có những thành phần về số lượngsulphat của carrageenan chiếm 18 ÷ 40 % phân tử carrageenan

1.2.3 Cấu trúc

Kappa-carrageenan: là một loại polymer mạch ngắn xen kẽ giữa galactose-4- sulphat (Gal S) và 3,6 – Anhydro-D-galactose (GalA) Cấu trúcphân tử kappa carrageenan là một vòng xoắn kép bậc 3

D-Hình 1.2 Cấu trúc của kappa carrageenan

Iota-carrageenan: cũng giống nhƣ kappa-carrageenan nhƣng gốc Anhydrogalactose lại ở vị trí cacbon thứ 2 Iota –carrageenan là carrageenan

3,6-có nhóm SO42- nhiều nhất trong mạch phân tử, cấu trúc là vòng xoắn kép bậc

2 Gel iota- carrageenan có tính đàn hồi

Hình 1.3 Cấu trúc của iota carrageenan

Lamda-carrageenan: trong mạch phân tử, các đơn vị monomeric đƣợcxen kẽ với nhau: đơn vị D-galactose-2-sulphat (1,3) và D-galactose 2,6-disulphat

Hình 1.4 Cấu trúc của lamda carrageenan

Các phân đoạn này đều có tính đa phân tán nhƣng chúng khác nhau vềthành phần ester sulphat và gốc quay quang Lamda-carrageenan có khối

lượng phân tử cao và mạch dài hơn kappa-carrageenan Thành phần của phânđoạn này cũng phụ thuộc vào nhiệt độ chiết và loại nguyên liệu.

1.2.4 Đặc trưng hóa học của carrageenan từ rong sụn

Kappaphycus alvarezii

Đối với carrageenan có một quá trình lưu ý là chuyển carrageenan từnhóm cấu trúc không có cầu nối 3,6 – anhydro – D – galactose thành nhómcấu trúc có cầu nối 3,6 – anhydro – D – galactose [8] Ví dụ: µ-, ν-carrageenan được xem là tiền thân của κ- và ι- carrageenan, quá trình chuyểnnhóm cấu trúc này được thực hiện trong môi trường kiềm mạnh Sự hìnhthành liên kết cầu nối 3,6 – anhydro – D – galactose trong tự nhiên được xúctác bởi các enzyme sulphohydrolase [9]

Hình 1.5 Quá trình chuyển nhóm cấu trúc của các loại carrageenan [8] 1.2.5 Oligo Carrageenan và ứng dụng

1.2.5.1 Oligo carrageenan

Oligo carrageenan là mạch carrageenan đã bị cắt ngắn mạch khi thủyphân carrageenan của các cấu trúc kappa, lamda và iota Những oligocarrageenan này bao gồm khoảng 20 đơn vị galactose sulphat liên kết luânphiên bởi liên kết glycoside β-1,4- và α-1,3- với nhóm sulphat ở vị trí 2, 4 và

6 của vòng galactose có hoặc không có đơn vị anhydrogalactose [10]

Carrageenan rất dễ bị axit và chất oxy hóa bẻ gãy các liên kết Khi thủyphân bằng axít yếu, các liên kết glycoside α-l,3- bị phá vỡ, tạo thành cácmảnh carrabiose Mảnh carrabiose chính là galactose nên gọi là galactobiose(Hình 1.6)

Hình 1.6 Thuỷ phân axit: liên kết glycoside α- l, 3- bị phá vỡ tạo thành

galactobioseTrong trường hợp thuỷ phân bằng axít đậm đặc, lực ion lớn khôngnhững liên kết glycoside α- l,3- bị phá vỡ mà cả liên kết glycoside β-1,4- cũng

bị phá vỡ

Hình 1.7 Thủy phân carrageenan bằng axit đậm đặc [11]

Khi thuỷ phân bằng enzyme, liên kết glycoside β-1,4- bị phá vỡ, sảnphẩm được tạo thành là neocarrabiose (Hình 1.8) Khi thủy phân bằngenzyme, do có tính lựa chọn cao nên cần phải lựa chọn các enzyme cho phùhợp

Hình 1.8 Neocarrabiose - sản phẩm thuỷ phân carrageenan bằng enzyme,

trong đó các liên kết glycoside β-1,4- bị phá vỡ

1.2.5.2 Ứng dụng của oligo carrageenan

Carrageenan được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau của cuộcsống, như là tác nhân kháng ung thư, sản phẩm nhiên liệu sinh học, phụ giatẩy rửa, trong ngành công nghiệp dệt và trong nhiều lĩnh vực khác; tuy nhiênsản phẩm sau thủy phân carrageenan là oligo carrageenan có những ứng dụnggiới hạn và đang được các nhà khoa học trong và ngoài nước nghiên cứu.Một số công trình nghiên cứu về ứng dụng của oligo carrageenan đã đượcgiới thiệu và công bố, theo kết quả nghiên cứu trong luận văn thạc sĩ, Bùi HuyChích [5] sử dụng enzym Alpha-amylase Novo (hay còn gọi là Termamyl -

Te) cho quá trình thủy phân carrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii

(Doty) Doty với các điều kiện thủy phân [Te]=0,2 %; [carrageenan]=0,75 %;

pH=6,5; t0=80 0C; [Ca2+]=40 ppm; thời gian= 9 giờ Sản phẩm sau thủy phân

là oligo carrageenan có khối lượng phân tử trung bình là 51.885 Da và đượcứng dụng để sản xuất nước uống trà hòa tan Theo bảng đánh giá thị hiếu

trong kết quả nghiên cứu của luận văn cho thấy “sản phẩm được người tiêu

dùng hài lòng và ưa thích so với sản phẩm trà hòa tan Atiso Vĩnh Tiến Đà Lạt trên thị trường qua phép thử thị hiếu cho điểm”.

Một nghiên cứu về ứng dụng của oligo carrageenan là có thể dùng làmcác chất phụ gia chế biến và bảo quản thực phẩm có hiệu quả để thay thế hànthe được Vũ Ngọc Ban và cộng sự [12] công bố, điều kiện cho quá trình thủyphân carrageenan ở pH ban đầu = 1,0 – 1,5 với axit HC1 1N, nhiệt độ 60 °Cvới thời gian thủy phân là 120 phút Với việc sử dụng phương pháp đo độnhớt, khối lượng phân tử trung bình của carrageenan được xác định là 27,7kDa Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng khi sử dụng oligo carrageenan với hàmlượng 0,3 % cho kết quả tương đương với hàn the hàm lượng 0,5 %

Trong luận án tiến sĩ vào năm 2017, Bùi Huy Chích [13] đã khảo sát vànghiên cứu ứng dụng oligo carrageenan trong sản xuất surimi từ cá đổng sửdụng enzyme polysaccharase để thủy phân carrageenan thành oligocarrageenan: nồng độ carrageenan 1 %, nồng độ enzyme Termamyl 120 L 0,5

%, nhiệt độ 85 0C, pH = 6,5 và thủy phân trong 16 giờ Sản phẩm oligo

carrageenan thu được có từ 2 đến 10 monose và có khối lượng phân tử trungbình nhỏ hơn carrageenan khoảng 132 lần Kết quả nghiên cứu cho thấy khi

bổ sung oligo carrageenan 0,2 % vào surimi cá đổng có thể làm tăng chấtlượng, tăng tính ổn định, hạn chế biến đổi chất lượng của surimi trong quátrình bảo quản đông

Một nghiên cứu khác trong lĩnh vực y học của Haijn và cộng sự (2003)[14] cho thấy carrageenan oligosacarit có trọng lượng phân tử 1.726 Da, khidùng đường uống với liều 100 mg/kg ở chuột thì sự hình thành khối u bị ứcchế rõ rệt Tuy nhiên, hoạt tính chống khối u của carrageenan có sulfonatedcao ít hơn nhiều so với chế phẩm không sulfonated hoặc sulfonated nhẹ Hoạttính của các superoxide dismutase và catalase được tăng cường đáng kể, điềunày cho thấy carrageenan oligosacarit có hiệu quả trong việc thúc đẩy khảnăng chống oxy hóa và loại bỏ các gốc tự do

Rong biển chứa rất nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho cây trồng.Trong quá trình canh tác nông nghiệp trước kia rong biển thường được sửdụng dưới dạng bột nghiền, nhưng hiệu quả sử dụng không cao do vậy ítđược chú ý Khi khoa học phát triển, kỹ thuật tách chiết các chất dinh duỡngtrong rong biển phát triển, việc sử dụng rong biển làm chất dinh dưỡng chocây trồng tăng lên nhiều Tuy vậy, do các thành phần dinh dưỡng chính như

N, P và K không nhiều, đặc biệt là các vi lượng kim loại không đủ do vậy khisản xuất phân bón cho cây trồng người ta thường sử dụng thêm vi lượng kimloại và sử dụng đồng thời với các chất dinh dưỡng chiết xuất bằng phươngpháp thủy phân các chất giàu protein và khoáng chất, vitamin khác như cábiển, cám, đỗ tương Các sản phẩm phân bón sử dụng dung dịch chiết xuất từrong biển làm 1 trong các nguyên liệu chính thường được sản xuất ra dướidạng khô bao gồm dạng bột và hạt nhưng phần lớn ở dạng lỏng và dùng chính

để phun qua lá Trên thị trường phân bón thế giới đã xuất hiện phân bón lỏnghữu cơ sản xuất từ các nguyên liệu chính là rong biển, cá biển và nhiều loại đãđược cấp chứng chỉ để sử dụng làm phân bón trong nông nghiệp hữu cơ

Các oligosaccharide của carrageenan điều chế bằng việc thủy phân axithoặc bẽ gãy mạch bằng enzyme là các chất sinh học kích thích sinh trưởng,thụ tinh, các chất này có khả năng kích thích cho sự tích lũy dinh dưỡng và táitạo lại sức sản xuất, dẫn đến sự thụ phấn cho hoa và tạo quả tốt hơn Cácoligosaccharide sulphat đã được công nhận để kích thích cho cơ chế bảo vệcây, do đó oligocarrageenan có thể sử dụng như một chất tăng trưởng tựnhiên.

Trong những năm gần đây, có rất ít các báo cáo về sử dụng carrageenan

có trọng lượng phân tử thấp dùng làm phân bón cho cây trồng Theo AlbertoGonzález và cộng sự [10], oligo kappa carrageenan có trọng lượng phân tửkhoảng 10 kDa thu được bằng cách thủy phân carageenan bằng axit có khảnăng kích thích sự phát triển của cây bạch đàn, làm tăng cường chiều cao,đường kính thân cây cũng như hàm lượng α-cellulose lên 58 %, 44 % và 16

% tương ứng, với liều lượng phun một tuần một lần với tổng số là 4 lần phun.Một nghiên cứu khác của Lucille V Abad và cộng sự (2016) [15] cho thấykhi chiếu xạ κ-carrageenan ở mức 20 kGy và 30 kGy với tốc độ liều lượng 6kGy/h sử dụng Co-60 tại Viện nghiên cứu hạt nhân Philippine, oligo κ-carageenan được tạo ra có trọng lượng phân tử 1 kDa cho kết quả thử nghiệmtrên cây cải thìa khá tốt Với chu kỳ phun 2 lần một tuần, sau 45 ngày phuntrên lá thì chiều dài của chồi non đạt 308,98 mm ở 1 kDa, cao hơn so với mẫuđối chứng phun bằng nước là 252,23 mm; khi sử dụng oligo κ-carrageenanvới trọng lượng phân tử trung bình tăng lên 2 kDa và 3 kDa thì chiều dài củachồi non lại giảm đi xuống còn 289,08 mm và 278,08 mm tương ứng

Đối với kết quả nghiên cứu phân bón cho cây sả từ oligo carrageenan,Minu Singh và cộng sự (2017) [16] sử dụng oligo carrageenan thu được từphương pháp chiếu xạ để phun Với nồng độ oligo carrageenan 80 mg/L, chu

kỳ phun 2 tuần một lần, sau 90 ngày và 120 ngày phun thì lượng tinh dầu xảtăng lên 18,9 và 25,0 %, hàm lượng citral 7,33 và 8,19 % và hàm lượnggeraniol lên 9,2 và 8,9 % tương ứng

Như vậy có thể thấy, mặc dù các kết quả công bố về ảnh hưởng của oligo κycarrageenan đối với cây trồng chưa được nhiều, nhưng có thể đánh

giá sơ bộ oligo κycarrageenan có trọng lượng phân tử trung bình nhỏ hơn 10 kDa có ảnh hưởng tích cực đến sự sinh trưởng của cây trồng.

1.2.6 Các phương pháp thủy phân carrageenan thành oligo carrageenan

1.2.6.1 Phương pháp hóa học

Với quá trình thủy phân kappa carrageenan từ rong Eucheuma cottonii

sử dụng đệm axit citric và kali citrat, Myslabodski và cộng sự (1996) [17] đãnghiên cứu ảnh hưởng của quá trình thủy phân với các điều kiện thời gian,nhiệt độ và pH khác nhau đến trọng lượng phân tử trung bình củacarrageenan Kết quả cho thấy ở thời gian, nhiệt độ và pH tương ứng là 24phút, 84 0C và pH bằng 3, trọng lượng phân tử trung bình của dịch oligocarrageenan thu được là 76 kDa Kết quả cũng cho thấy nếu nhiệt độ thủyphân quá thấp hoặc pH càng cao thì quá trình cắt mạch carrageenan diễn rakhông hoàn toàn, bên cạnh đó thời gian thủy phân cũng bị kéo dài

Trong một nghiên cứu khác, Sang-Bum Lee và cộng sự (2015) [18]

nghiên cứu quá trình thủy phân rong sụn Kappaphycus alvarezii sử dụng

H2SO4 Với qui trình qui hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa các điều kiện thủyphân, kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng ở nhiệt độ thủy phân 160 0C, nồng độaxit 1,09 % và thời gian thủy phân 20 phút thì hàm lượng glucose thu được là2,15 g/L Bên cạnh đó hàm lượng galactose là 14,47 g/L khi điều kiện thủyphân cũng tương tự như trên nhưng nồng độ axit giảm còn 1,02 %

Cũng sử dụng acid để thủy phân κ-carrageenan, kết quả nghiên cứu củaJeong Ah Kim và Sun Bok Lee (2016) [11] khi khảo sát các loại acid có hằng

số phân ly pKa khác nhau (CH3COOH, HCOOH, H3PO4, CF3COOH, HNO3,

H2SO4, và HCl) với điều kiện thủy phân bao gồm 2 % (w/v) κ-carrageenan,nồng độ acid 0,2 M, nhiệt độ thủy phân 100 oC và thời gian thủy phân 1 giờ;kết quả cho thấy chỉ có 3 loại acid CF3COOH, HCl và HNO3 cho ra 3,6-anhydro-Dgalactose (D-AnG) có hàm lượng cao hơn 2 g/L Tiếp tục khảo sátcác điều kiện thủy phân tối ưu thì khi thủy phân bằng axit HCl sẽ tạo ra D-

AnG có hàm lượng cao nhất 2,81 g/L khi thủy phân ở T = 100 °C và t = 30phút với 0,2 M HCl.

Để thủy phân rong sụn K Alvarezii từ vùng biển Malaysia, với qui hoạch thực nghiệm tối ưu hóa sử dụng 8,0 g/100 mL rong khô K alvarezii

trong dung dịch thủy phân 0,2 M H2SO4 và HCl tại 110 0C trong 90 phút, kếtquả nghiên cứu của Faiqah Abd-Rahim và cộng sự (2014) [19] tạo ra hàmlượng đường khử cao nhất tương ứng với acid H2SO4 và HCl là 34,275 ±0,976 g/L và 35,872 ± 3,610 g/L, tương ứng với hiệu suất thủy phân 42,8 %

và 44,8 %

1.2.6.2 Phương pháp vật lý

Trong những năm gần đây, phương pháp chiếu xạ để biến tínhpolysaccarid đã được quan tâm nghiên cứu do khả năng cạnh tranh về mặt kỹthuật công nghệ của nó Một vài tác giả đã nghiên cứu tác dụng của bức xạtrên carrageenan để đánh giá đặc tính lưu biến Trong báo cáo kết quả nghiêncứu, L Relleve và cộng sự (2005) [20] sử dụng phương pháp chiếu xạ để biếntính κ-carrageenan, quá trình được thực hiện ở nhiệt độ thường bằng tiagamma từ nguồn Co-60 trên dung dịch κ-carrageenan 4 % Kết quả nghiêncứu cho thấy khi tăng liều bức xạ từ 10 kGy lên 30 kGy, trọng lượng phân tửtrung bình giảm từ 10,5x104 Da xuống còn 6,2x104 Da; trọng lượng phân tửđạt giá trị thấp nhất là 1,3x104 Da khi liều chiếu xạ tăng lên 200 kGy Tuynhiên, theo như kết quả nghiên cứu, cấu trúc hóa học của carrageenan có sựthay đổi, một số nhóm sulfat đã bị mất sau khi cắt mạch bằng phương phápchiếu xạ

Trong một nghiên cứu gần đây vào năm 2015, Mohammad TaghiTaghizadeh và Reza Abdollahi [21] sử dụng phương pháp siêu âm, phươngpháp xúc tác quang và phương pháp xúc tác quang siêu âm kết hợp để nghiêncứu khả năng cắt mạch của κ-carrageenan Kết quả cho thấy sau 60 phút,trọng lượng phân tử trung bình của carrageenan sau cắt mạch bằng phươngpháp siêu âm giảm từ 126,92 x 103 kDa xuống còn 107,31 x 103 kDa, trongkhi đó trọng lượng phân tử trung bình của hai phương pháp xúc tác siêu âm

và xúc tác quang siêu âm sử dụng TiO2 làm chất xúc tác, giảm còn 93,89 x

103 kDa và 88,24 x 103 kDa tương ứng Một điều đáng chú ý là sau khi cắtmạch κ-carrageenan bằng phương pháp xúc tác quang siêu âm, cấu trúc hóahọc của carrageenan vẫn không thay đổi.

1.2.6.3 Phương pháp sinh học

Trong các phương pháp thủy phân, phương pháp thủy phân bằngeznzyme có đặc điểm thuận lợi là có thể thủy phân trực tiếp từ rong biển

Trong nghiên cứu của Fangyuan Duan và cộng sự (2016) [22], rong E.

Cottonii được thủy phân bằng enzyme qua hai bước: bước 1 thủy phân bằng

enzym cellulase, bước 2 thủy phân bằng enzyme tái tổ hợp κ-carrageenan,được điều chế từ Escherichia coli BL21-HTa-cgkZ Kết quả nghiên cứu chothấy bằng cách sử dụng phương pháp GPC (sắc ký thẩm thấu gel) để xác địnhtrọng lượng phân tử của dịch sau thủy phân, sau 4 giờ thủy phân số lượngcarrageenan có trọng lượng phân tử thay đổi theo chiều hướng trọng lượngphân tử cao giảm và trọng lượng phân tử thấp tăng lên, điều này chứng tỏ quátrình thủy phân bằng enzyme đã cắt mạch polysaccarid thành cácmonosaccarid Kết quả phân tích hóa học cho thấy sản phẩm cuối cùng baogồm 79,79 % oligosaccharides và 18,89 % tro, với một lượng protein khôngđáng kể Tác giả cũng ước tính khoảng 64,8 % oligosaccharide κ-carrageenan

có trong dịch thủy phân rong E Cottonii.

Một nghiên cứu khác của Sheng-Jun Wu (2012) [23] sử dụng enzymeα-amylase để thủy phân κ-carrageenan Trong nghiên cứu này, Sheng-Jun Wu

sử dụng phương pháp đo độ nhớt bằng nhớt kế mao quản để đánh giá hiệusuất thủy phân; kết quả nghiên cứu cho thấy khi thời gian thủy phân trong 1giờ với 40 mg enzyme α-amylase, nhiệt độ 50 0C và pH = 7.5 thì độ nhớtgiảm mạnh, độ nhớt tiếp tục giảm trong 4 giờ thủy phân và hầu như giảmkhông đáng kể sau đó Liều lượng sử dụng enzyme α-amylase cũng ảnhhưởng đến độ nhớt của dịch thủy phân, khi tăng liều lượng lên hơn 40 mg thì

độ nhớt thay đổi không đáng kể Kết quả rút ra ở điều kiện tối ưu t = 4 giờ;

pH = 7.5; T= 50 0C; và enzyme α-amylase 40 mg trong dịch chiết có 5 g carrageenan, hàm lượng và hiệu suất oligosaccharide từ carrageenan thuđược sau thủy phân lần lượt tương ứng là 96,5 % và 92,6 % (w/w)

κ-Trong nghiên cứu của Bernadette M Henares và cộng sự (2010) [24],

Bernadette M Henares sử dụng Pseudoalteromonas carrageenovora để thủy phân carrageenan Pseudoalteromonas carrageenovora được nuôi cấy trong

chất rắn hoặc môi trường lỏng, chứa 2 % iota- hoặc kappa-carrageenan, hoặccác polysaccharides khác, và phát triển ở 27 °C trong hai ngày Sau 5 ngàythủy phân đối với 0,5 % iota-carageenan và 2 ngày đối với 0,5 % kappa-carrageenan ở 40 0C, kết quả nghiên cứu cho thấy khi Pseudoalteromonas

carrageenovora được nuôi cấy trong môi trường sử dụng kappa-carrageenan

sẽ cho hiệu suất thủy phân chất nền iota- và kappa-carrageenan (50 % và 99

%) cao hơn so với khi được nuôi cấy trong môi trường iota-carrageenan (hiệusuất thủy phân 10 % cho mỗi loại iota- hoặc kappa-carrageenan) Kết quảphân tích GPC cũng cho thấy sản phẩm sau thủy phân của kappa-carrageenan

Hu và cộng sự (2013) về điều chế oligosaccharides axit guluronic bằng cách

sử dụng chiếu xạ vi sóng Phương pháp này không chỉ thuận tiện, tốn ít thờigian hơn mà còn thân thiện với môi trường

Trong nghiên cứu của mình, Guangsheng Li và cộng sự [37] đã sử dụngkết hợp hai phương pháp để thủy phân κ-carrageenan, đầu tiên

carageenan được thủy phân trong môi trường acid HCl với pH bằng 3, sau đódung dịch được thủy phân dưới bức xạ vi sóng ở 100 0C trong 15 phút Kếtquả phân tích cho thấy số κ-carra-oligosaccharides lẻ với DP dao động từ 3đến 21 có thể thu được bằng phương pháp này, và cấu trúc của cácoligosaccharides phù hợp với các cấu trúc thu được bằng phương pháp thủyphân axit nhẹ truyền thống.

Với việc sử dụng phương pháp thủy phân acid và enzym kết hợp để

thủy phân rong K Alvarezii từ vùng biển Malaysia, Faiqah Abd-Rahim và

cộng sự [19] đã nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như nhiệt độthủy phân, thời gian, hàm lượng rong, nồng độ acid và thời gian thủy phânenzym lên hàm lượng đường khử được tạo thành Điều kiện thủy phân acid:hàm lượng rong 80 g/L, 0,2 M H2SO4, 110 0C trong 90 phút; sau đó tiếp tụcđược thủy phân bằng enzym sử dụng enzyme Celluclast với hoạt độ 150 FPU,

pH = 5.5, 50 0C trong 48 giờ; kết quả cho thấy hiệu suất thủy phân bằngphương pháp acid và enzyme kết hợp đạt 62,35 %, lượng đường khử tăng lên

là 15,6 g/L Kết quả nghiên cứu này cao hơn so với các nghiên cứu của Ge vàcộng sự [38] và Wan và cộng sự [39] khi điều kiện thủy phân tương đồng

nhau trên hai loại rong tương ứng là L Japonica và G Salicornia.

Trên đây là hai báo cáo điển hình của phương pháp thủy phân kết hợp trong quá trình cắt mạch carrageenan trên nguyên liệu chủ yếu là rong đỏ hoặc trên κycarrageenan Ngoài ra còn nhiều nghiên cứu khác cũng sử dụng phương pháp thủy phân kết hợp, tuy nhiên do mục đích sử dụng khác nhau (dùng để làm nhiên liệu sinh học) nên nguyên liệu thủy phân cũng khác nhau (sử dụng nguyên liệu thủy phân là phần bã sau khi chiết có chứa nhiều cellulose).

1.3 THỦY PHÂN CARRAGEENAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC

1.3.1 Ưu điểm

Với mục đích của đề tài là điều chế phân bón lá từ rong sụn với thành

phần chính là các oligo carrageenan từ rong Kappaphycus alvarezii là nguyên

liệu chính, phương pháp thủy phân được sử dụng để cắt mạch polysaccarid

thành các monosaccarid, trong đó phương pháp thủy phân hóa học đã đượcnhiều nghiên cứu đánh giá khả năng thủy phân một cách hiệu quả, tốc độ thủyphân nhanh và có chi phí thấp Axit thường được sử dụng làm chất xúc táccho quá trình thủy phân hóa học, Meinita và cộng sự (2011) [40] đã báo cáorằng hàm lượng đường khử thu được là 30,5 g/L và 25,6 g/L galactose khi

thủy phân 100 g/L rong K Alvarezii với quá trình thủy phân axit gồm 0,2 %

H2SO4 ở 130 0C trong 15 phút Axit được sử dụng trong thủy phân hóa học

có vai trò kép trong thủy phân sinh khối; thứ nhất, axit phá vỡ mạng lưới liênkết nội bộ của chuỗi liên kết hydro và cellulose Thứ hai, các axit sẽ phân giảicellulose và hemicellulose thành đường bằng cách tham gia xúc tác trong quátrình thủy phân liên kết glycosit [41]

Báo cáo của Tan và Lee, (2014) [42] cho thấy κ-carrageenan không dễdàng bị thủy phân bởi enzyme do sự liên kết của κ-carrageenan và nước tạomột liên kết khá chắc chắn chống lại sự thủy phân của enzyme; trong khi đó

H2SO4 được sử dụng như là chất xúc tác trong quá trình thủy phân hóa học

để thủy phân κ-carrageenan

1.3.2 Nhược điểm

Axit thường được sử dụng làm chất xúc tác trong quá trình thủy phânhóa học, tuy nhiên một nhược điểm của quá trình thủy phân axit trong một sốđiều kiện là thủy phân bằng axit sẽ kém hiệu quả trong việc tạo ra các nhómhexoses (là các monosaccarid có 6 nguyên tử C) Điều này chủ yếu là do quátrình phân giải các monosaccarid tạo thành các hợp chất không mong muốn.Những hợp chất này bao gồm furfural, một sản phẩm khử nước của pentoses

và hydroxymethylfurfural (HMF), một sản phẩm khử nước của hexoses.Những hợp chất này cùng với axit axetic được hình thành ở giai đoạn đầu quátrình phân hủy các hemicelluloses, được xem là kết quả thủy phân của cácnhóm acetyl liên kết với đường, là những chất ức chế sự lên men [43] Việctạo ra các chất ức chế này tăng lên khi thủy phân diễn ra ở nhiệt độ cao vànồng độ axit cao [44] Mặt khác khi thủy phân bằng phương pháp hóa học sửdụng axit làm chất xúc tác sẽ có những hạn chế như quá trình tách sản phẩmtrong dịch thủy phân sẽ khó khăn, axit gây ăn mòn hệ thống thiết bị và đòi hỏi

thêm quá trình xử lý nước thải sau thủy phân [45], điều này phụ thuộc nhiềuvào loại axit được dùng làm chất xúc tác trong quá trình thủy phân.

Với mục đích sử dụng dịch chiết thủy phân carrageenan làm phân bón

lá, việc kết hợp giữa lựa chọn các ưu điểm và hạn chế các nhược điểm của axit trong quá trình thủy phân là một hướng nghiên cứu cần thiết Vì vậy việc lựa chọn các loại axit khác nhau để khảo sát là một hướng nghiên cứu chính của luận văn này.

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

1.4.1 Phân tích thành phần hóa học rong sụn

1.4.1.1 Phân tích protein tổng số bằng phương pháp Kieldahl [46]

Nguyên tắc

Vô cơ hóa rong biển bằng H2SO4 đậm đặc có chất xúc tác đặc biệt, rồidùng kiềm đặc mạnh NaOH đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 ra thể tự do, NH3được hấp thụ bởi H2SO4 tiêu chuẩn Sau đó định lượng H2SO4 tiêu chuẩn dưbằng NaOH tiêu chuẩn

Các phản ứng xảy ra:

R-CHNH2-COOH + H2SO4  (t0 , xúc tác) CO 2 + SO 2 + H 2 O +

(NH 4 ) 2 SO 4

2NaOH + (NH4)2SO4 Na2SO4 + NH3 + 2H2O 2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 2NaOH + H2SO4

1.4.1.3 Phương pháp phân tích hàm lượng tro

1.4.2 Phương pháp phân tích hàm lượng carbohydrat tổng sau thủy phân [48]

Lấy 200 µL dung dịch cần xác định có hàm lượng carbohydrate trongkhoảng 20-100 µg/mL, thêm vào 200 µL thuốc thử phenol 5 % lắc đều đếnkhi dung dịch trở nên trong suốt, thêm tiếp 1 mL axít sulfuric đậm đặc lắc đềurồi đem đun cách thủy trong thời gian 5 phút, lấy ra để nguội, đo độ hấp thụquang ở bước sóng λ = 490 nm, sử dụng glucose làm chất chuẩn

1.4.3 Phương pháp phân tích trọng lượng phân tử của oligo

C: Nồng độ Carrageenan trong dung dịch (g/100 mL).

[η] = K.M]: Độ nhớt đặc trưng, là giới hạn của độ nhớt rút gọn (η] = K.Mr/C) khi nồng độ của dung dịch tiến tới 0 [η] = K.M] = lim (η] = K.Mr/C) C → 0

Ở đây η] = K.Mr là độ nhớt riêng, tỷ số giữa hiệu số thời gian chảy của dungdịch Carrageenan (t) và thời gian chảy của dung môi (t0) với thời gian chảycủa dung môi trong mao quản: η] = K.Mr = (t – t0)/t0

Cụ thể cần pha chế các dung dịch Carraạeenan và oligo carrageenan cónồng độ khác nhau Sau đó xác định thời gian chảy của dung môi và của cácdung dịch này trong nhớt kế Ubêlôt để xác định độ nhớt riêng η] = K.Mr

Lập đồ thị mối quan hệ giữa η] = K.Mr /C và nồng độ (C), bằng phương phápngoại suy trên đồ thị ta thu được giá trị độ nhớt đặc trưng

Với các giá trị K và α đặc trưng đã biết, ta sẽ xác định được khốilượng phân tử trung bình của Carrageenan và oligo carageenan

Phương pháp đo độ nhớt là phương pháp đơn giản về mặt thựcnghiệm, đồng thời cho phép xác định khối lượng phân tử trong khoảng lớn(M khoảng 104 đến 106 Da)

1.4.3.2 Sắc ký rây phân tử [49]

Sắc ký rây phân tử là phương pháp chia tách các phân tử trong dungdịch dựa trên kích thước của chúng Trong trường hợp pha động là một dungmôi hữu cơ, kỹ thuật được gọi là sắc ký thấm qua gel (GPC), còn trường hợppha động là nước thì kỹ thuật được gọi là sắc ký lọc trên gel (GFC)

Mẫu được đưa vào cột chứa đầy gel hoặc một loại vật liệu xốp, vàđược pha động dẫn chạy qua cột Sự chia tách theo kích thước được thựchiện nhờ sự trao đổi lặp đi lặp lại các phân tử chất tan giữa dung môi phađộng và cùng dung môi đó được pha tĩnh giữ ở trong các lỗ xốp của gel.Khoảng kích thước lỗ của vật liệu nhồi trong cột sẽ xác định khoảng kíchthước phân tử được chia tách qua quá trình sắc ký

Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để có thể đi vào trong tất cảkhoảng không gian của lỗ xốp và được rửa giải trong tổng thể tích thấm Vt

Các phân tử có kích thước lớn hơn kích thước lỗ xốp lớn nhất chỉ di chuyểnđược dọc theo cột qua các khoảng trống giữa các hạt vật liệu nhồi mà không

bị giữ lại, được rửa giải trong thể tích loại trừ Vo (thể tích trống) Sự chia táchtheo kích thước phân tử xảy ra giữa thể tích trống và tổng thể tích thấm, chiatách hiệu quả thường được thực hiện ở hai phần ba đầu tiên của khoảng này

Xây dựng một đồ thị biểu thị sự phụ thuộc giữa thể tích lưu của cácchất chuẩn dùng cho hiệu chuẩn và hàm logarit của khối lượng phân tử củachúng Đường chuẩn thường xấp xỉ với một đường thẳng nằm giữa giới hạnloại trừ và giới hạn thấm tổng thể Khối lượng phân tử của thành phần quantâm có thể được ước lượng từ đường chuẩn

Trong nghiên cứu của mình, Myslabodski và cộng sự [17] đã sử dụngphương pháp GPC kết hợp với tán xạ ánh sáng để xác định trọng lượng phân

tử trung bình của kappa carrageenan, kết quả cho thấy ở 78 0C, pH=5,8 vàthời gian 64 phút thì thu được carrageenan có Mw là 473 kDa, khi tăng nhiệt

độ lên 84 0C và giảm pH xuống còn 3,1 trong thời gian thủy phân nhanh hơn,

24 phút, thì trọng lượng phân tử giảm còn 76 kDa

1.4.3.3 Tán xạ ánh sáng tĩnh [50]

Nguyên lý:

Tán xạ ánh sáng là một kỹ thuật được thiết lập để nghiên cứu tính chấtcủa các hạt trong các dung dịch Các thông tin như kích thước, trọng lượngphân tử, độ mạnh của sự khuếch tán và cường độ tương tác sẽ thu được trongquá trình thực hiện Nguyên lý cơ bản là một chùm tia laser chiếu vào mẫu vàcường độ tán xạ được phát hiện ở một góc θ nhất định bằng máy dò

Từ các dao động cường độ theo thời gian (Hình 1.9), sẽ thu được cácthông tin về động lực học trong dung dịch Việc đánh giá các dao độngthường được đặt tên là tán xạ ánh sáng động (DLS) trong khi phân tíchcường độ trung bình tuyệt đối được gọi là tán xạ ánh sáng tĩnh (SLS) Cường

độ rất nhạy cảm với sự thay đổi kích thước của các chất hòa tan, do đó thuậnlợi cho việc nghiên cứu đặc trưng các hạt trong dung dịch

Hình 1.9 Hình học tán xạ và dao động cường độ tại máy dò

Vectơ tán xạ Q được định nghĩa là sự khác biệt giữa vectơ sóng đi vàsóng đến và cường độ của nó là:

Trong đó n là chỉ số chiết suất của dung môi, θ là góc tán xạ và λ là

bước sóng của ánh sáng tán xạ

Tán xạ ánh sáng tĩnh (SLS - Static Light Scattering)

Tán xạ ánh sáng tĩnh (SLS) là một kỹ thuật quang học đo cường độ củaánh sáng tán xạ phụ thuộc vào góc tán xạ để thu được thông tin về nguồn tánxạ

Một ứng dụng điển hình là xác định khối lượng phân tử trung bình trọnglượng Mw của một đại phân tử như polymer hoặc protein Các ứng dụng phổbiến khác là phép đo bán kính của hồi chuyển Rg hoặc yếu tố hình thức và

cấu trúc Bằng cách đo cường độ tán xạ cho một đại phân tử ở các nồng độkhác nhau, hệ số virial thứ hai A2, có thể được tính toán Các kỹ thuật phântích đặc biệt như Zimm hoặc Guinier Plot có thể được sử dụng để thu đượckết quả tối ưu từ dữ liệu đo được.

Trọng lượng phân tử tuyệt đối được xác định bằng cách sử dụng mốiquan hệ giữa cường độ ánh sáng bị phân tán bởi một phân tử, và cả trọnglượng và kích thước phân tử của nó, như được mô tả bởi lý thuyết Rayleigh

Lý thuyết Rayleigh nói rằng các phân tử lớn hơn tán xạ ánh sáng nhiều hơncác phân tử nhỏ hơn từ một nguồn sáng nhất định và cường độ của ánh sángtán xạ tỷ lệ thuận với trọng lượng phân tử của phân tử

Các đại lượng chính ảnh hưởng đến cường độ tán xạ ánh sáng tĩnh, làtrọng lượng phân tử M, nồng độ và kích thước của các hạt trong dung dịch

Do bước sóng dài, các hạt có kích thước nanomet (điển hình cho protein) cóthể được hiểu là các trung tâm tán xạ (độc lập) có cường độ can thiệp vào cấutrúc Nếu các hạt đủ lớn (> λ/20), có thể thấy góc tán xạ phụ thuộc vào sự thayđổi về cường độ Tỉ lệ tán xạ Rayleigh R α IS được giới thiệu như là sốlượng không phụ thuộc vào các thiết lập thực nghiệm Để có ước tính trực

tiếp về kết quả, cường độ tán xạ được chuẩn hóa bằng nồng độ chất tan c và

giảm đối với nồng độ nhỏ để

Trong đó A2 được gọi là hệ số virial thứ hai mô tả sự tương tác giữacác hạt, Rg là bán kính của hồi chuyển và K là hằng số quang

Nếu các hạt có kích thước lớn hoặc tương tác mạnh, các hiệu chỉnhphụ thuộc góc và nồng độ phải được xem xét, phát sinh từ yếu tố hình thái vàcấu trúc

Sử dụng phương pháp tán xạ ánh sáng (LS) để xác định trọng lượngphân tử của κ- và ι-carrageenan được bức xạ, L.V Abad và cộng sự [51] báocáo trong kết quả rằng, tại liều bức xạ 25 kGy thì κ-carrageenan có trọnglượng phân tử gấp đôi so với ι-carrageenan, tương ứng là 3,1x105 và 1,5x105

Da Như vậy phương pháp tán xạ ánh sánh là một phương pháp tuyệt đối đểxác định trọng lượng phân tử, trong khi đó với phương pháp phổ GPC thì cầnphải có một chất chuẩn đã biết

1.4.4 Phương pháp phân tích cấu trúc oligo carrageenan

1.4.4.1 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)[51]

Phương pháp phân tích theo phổ hồng ngoại là một trong những kỹthuật phân tích rất hiệu quả Một trong những ưu điểm quan trọng nhất củaphương pháp phổ hồng ngoại vượt hơn những phương pháp phân tích cấutrúc khác (nhiễu xạ tia X, cộng hưởng từ điện tử ) là phương pháp này cungcấp thông tin về cấu trúc phân tử nhanh, không đòi hỏi các phương pháp tínhtoán phức tạp

Kỹ thuật này dựa trên hiệu ứng đơn giản là các hợp chất hóa học có khảnăng hấp thụ chọn lọc bức xạ hồng ngoại Sau khi hấp thụ các bức xạ hồngngoại, các phân tử của các hợp chất hóa học dao động với nhiều vận tốc daođộng và xuất hiện dải phổ hấp thụ gọi là phổ hấp thụ bức xạ vùng hồng ngoại

Các đám phổ khác nhau có mặt trong phổ hồng ngoại tương ứng vớicác nhóm chức đặc trưng và các liên kết có trong phân tử hợp chất hóa học.Bởi vậy phổ hồng ngoại của một hợp chất hóa học được coi như “dấu vântay”, có thể căn cứ vào đó để nhận dạng chúng

Phổ hấp thu hồng ngoại là phổ dao động quay vì khi hấp thu bức xạhồng ngoại thì cả chuyển động dao động và chuyển động quay đều bị kíchthích Bức xạ hồng ngoại có độ dài sóng từ 0,8 đến 1000 µm và chia thành 3vùng:

Cận hồng ngoại: λ=0,8 – 2,5 µm

Trung hồng ngoại: λ=2,5 – 50 µm

Viễn hồng ngoại: λ = 50 – 1000 µm

1.4.4.2 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) [48]

Trong phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton, tất cả proton củacarbohydrate (bao gồm cả mono-, oligo- và polysacarit-) có độ dịch chuyểnhóa học nằm trong khoảng từ 1-6 ppm Các proton anomeric của mỗimonosacarit có độ dịch chuyển hóa học phụ thuộc vào cấu dạng α- hoặc β-củachúng Ví dụ, hầu hết các proton của α-anomeric xuất hiện trong vùng từ 5-6ppm, trong khi đó các proton β-anomeric xuất hiện ở vùng 4-5 ppm

Mặc dù phổ 13C-NMR có tín hiệu yếu hơn nhiều, nhưng lại có nhiềuthuận lợi hơn phổ 1H-NMR trong phân tích cấu trúc của polysacarit do các tínhiệu trong phổ 13C-NMR có độ dịch chuyển hóa học rộng hơn (0-220 ppm) sovới phổ 1HNMR Vì vùng giá trị  lớn nên các tín hiệu ít chồng lấp lên nhaunhư trong phổ proton NMR Các tín hiệu của C-anomeric trong phổ 13C-NMR thường xuất hiện trong vùng từ 90-100 ppm, trong khi đó các tín hiệucủa C-nonanomeric xuất hiện trong vùng từ 60-85 ppm

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều 13C và 1H của polysacarit thường

có độ phân giải thấp, các tín hiệu trùng lấp nhau khi trong phân tử của chúng cóchứa nhiều gốc đường tương tự nhau Điều này gây ra rất nhiều khó khăn trongviệc giải thích chi tiết cấu trúc của polysacarit Khi đó, phổ cộng hưởng từ hạtnhân hai chiều sẽ giúp xác định thêm những thông tin về các liên kết trong phân

tử, thông qua các tương tác giữa proton với proton và giữa proton với cacbon.Phổ 1H, 1H-COSY (Correlation spectroscopy) biểu diễn mối tương quan giữa 1H

và 1H của hạt nhân cùng loại, phổ 1H, 13C-COSY (hay cũng được gọi là phổHMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Correlation) hay HECTOR(Heteronuclear Correlated Spectroscopy)) biểu diễn mối tương quan giữa 1H và

13C của các hạt nhân khác loại Phổ hai chiều 2D-NOESY (Nuclear OverhauserEffect Spectroscopy) thể hiện sự tương tác về mặt không gian của các protonnằm trên các nguyên tử cacbon ở cách xa nhau nhưng khoảng cách không giangiữa chúng nhỏ hơn 4Å Phổ 2D-HMBC (Hecteronuclear Multiple BondCoherence) thể hiện mối tương quan của tín hiệu 1H ở một nguyên tử 13C với tínhiệu của nguyên tử 13C khác cách xa nó 2