Giáo trình sinh hoá học với cơ sở khoa học của công nghệ gen (giáo trình cao học nông nghiệp) phần 2

Chương mười một CẤU TRÚC AXIT NUCLEIC, VAI TRO LUU GIU MAT MA DI TRUYEN CUA DNA Axit nucleic là những hợp chất có phân tử lượng rất lớn, nó có trong tất cả các tế bào sống ở trạng thái

PHAN HAI

CO SO KHOA HOC

CUA CONG NGHE GEN

Chương mười một

CẤU TRÚC AXIT NUCLEIC,

VAI TRO LUU GIU MAT MA DI TRUYEN CUA DNA

Axit nucleic là những hợp chất có phân tử lượng rất lớn, nó có trong tất cả các tế bào sống ở trạng thái tự do hoặc dưới dạng liên kết với protein để tạo thành nucleoprotein Virut - có cấu trúc từ một phân tử axit nucleic rất quan trọng vì nó lưu giữ các thông tin di truyền đồng thời nó giúp thể hiện các thông tin di truyền đó

Axit nucleic được tạo ra do quá trình trùng hợp các nucleotit cho nên cũng có thể gọi axit nucleic là polinucleotit Ngoài chức năng trùng hợp để tạo thành axit nucleic, nueleotit còn đóng vai trò rất quan trọng quá trình trao đổi chất trung gian,

đó là những hợp chất chứa nhiều năng lượng ATP, NAD”, NADP”, FAD, CoA )

Nueleotit được cấu tạo từ 3 thành phần chính là :

Từ đó ta có 2 loại axit nucleic là :

1 Axit desoxiribonucleic (DNA hay là ADN) tìm thấy trong chromosom của nhân tế bào động vật và thực vật Đối với các loài procariôt như là vi khuẩn tảo xanh da trời cũng có DNA trong các chromosom

Người ta còn tìm thấy DNA trong mitochondri của tế bào động, thực vật cũng như cloroplast ở các loại thực vật quang hợp

2 Axit ribonuclic (RNA hay ARN) tìm thấy chủ yếu trong xitoplasma của

tế bào Người ta phân biệt có 5 loại RNA đó là :

RNA vận chuyển RNA Khác

RNA thông tin

Chúng tham gia vào quá trình thể hiện các thông tin đi truyền Một số virut thực vật, động vật và bacterophage chỉ bao gồm một gen là phân tử RNA

Cả hai loại đường đều thuộc dạng D và B

II GỐC NITƠ (GỐC KIỀM)

Các gốc nitơ đều xuất phát từ hai loại gốc nitơ dị vòng là purin và pirimidin

Người ta còn tìm thấy một số gốc purin khác nhất là trong phân tử RNA thông tinvận chuyển tRNA với số lượng nhỏ Cho đến ngày nay người ta biết có khoảng

50 loại gốc hiếm thuộc hai loại purin và pirimidin Đối với purin ví dụ như :

2 Gốc pirimidin

Từ gốc pirimidin có ba loại là xitosin, uraxil và thimin Trong phan tit DNA

có xitosin và thimin

220

Trong phân tử RNA có xitosin và uraxil

Người ta tìm thấy một số gốc bất bình thường trong phân tử DNA của

bacteriophage như là 5-hydroximethil xitosin thay cho vi tri xitosin -

im

H 5-hydroximethyl xitosin III NUCLEOSIT

Khi một gốc nitơ kết hợp với một phân tử đường riboza hay desoxiriboza sẽ

tạo ra một ribonucleosit hay một desoxiribonucleosit

Bang sau đây tóm tắt tên của những nucleosit :

Bảng 11.1 : Các loại nucleosit chính

IV NUCLEOTIT

Khi một nucleosit tác động với một phân tử axit phosphoric sẽ tạo thành một nucleotit Theo thành phần đường pentoza, người ta phân biệt 2 loại

nucleotit 14 ribonucleotit va desoxiribonucleotit

Khi thuỷ phán một hỗn hợp nucleotit bằng các phương pháp khác nhau có thể nhận được các kết quả như sau :

Thuỷ phân bằng

axit yếu

Gốc nitơ-pentoza-phosphat _ ——————————>Øốc nitơ + pentoza-phosphat

Nucleotit —————— Géc nito-pentoza + phosphat

Thuy phan bang =

Nucleosit Bảng 11.2: Bảng tóm tắt các nucleotit

Gốc nitơ | Ribonucleosit-5'-monophosphat Desoxiribonucleosit -5'- monophosphat

V CAU TRUC BAC MOT CUA AXIT NUCLEIC

Trong phân tử DNA và RNA, các nucleotit liên kết với nhau qua cầu

diestephosphat ở vị trí cacbon số 3 của đường pentoza và vị trí cacbon số 5 của

phân tử đường pentos tiếp theo Kết luận này dựa trên kết quả thực nghiệm sau :

- Khi trung hoà một phân tử axit nucleic nhận thấy mỗi phân tử axit

phosphoric chỉ có một chức năng axit tự do

- Khi dùng enzim thuỷ phân axit nucleic tuỳ thuộc vào loại enzim ta có thể thu được một hỗn hợp nucleosit 5'monophosphat hoặc nucleosit 3'monophosphat

Mạch polinucleotit được cấu tạo theo thứ tự một phân tử đường pentoza, tiếp

đến một axit phosphoric, tiếp theo là đường pentoza rồi axit phosphoric Cấu trúc này đặc trưng cho cả DNA và RNA Các phân tử DNA và RNA chỉ khác nhau về độ dài của mạch polinucleotit Dưới đây là một đoạn trinucleotit của phân tử RNA

Các gốc nitơ tham gia vào mạch polinucleotit cũng tương tự như thứ tự các axit amin trong mạch polipeptit, nó rất quan trọng quyết định bản chất của phân

tử DNA hay RNA

XÁC ĐỊNH THỨ TỰ CÁC NUCLEOTIT

Xác định thứ tự các gốc nitơ trong một phân tử RNA và DNA còn khó khăn

hơn việc xác định thứ tự các axit amin trong mạch protein Để nghiên cứu cấu

trúc bậc một của axit nucleic người ta phải thuỷ phân chúng

1 Thuỷ phân RNA và DNA

A Thuỷ phân bằng kiềm

Phân tử RNA có thể bị thuỷ phân bằng kiểm bởi sự cắt đứt mối liên kết giữa

nhóm phosphat và nguyên tử cacbon số 5 của phân tử đường pentoza bên cạnh

Hỗn hợp thu được sau thuỷ phân là những nucleotit 3'phosphat

OH

Phân tử DNA bền vững với việc thuỷ phân bằng kiểm

B Thuỷ phân bằng ribonucleaza tuyến tụy

Đó là một enzim endonucleaza, nó cắt mạch phosphodiester bên trong mạch

của phân tử RNA giống như thuỷ phân bằng kiểm, phân tử DNA cũng có khả

năng kháng enzim này Vị trí cắt mạch xảy ra ở nucleotit bên cạnh cacbon 3' là một gốc nitơ thuộc nhóm pirimidin

Xitosin As Uraxil Uraxil Guanin Xitosin 2)

—* Cp+ApUp+Up + GpCp + Up

C Thuy phan bang nucleaza T,

Enzim này cắt mối liên kết phosphadieste của phân tử RNA khi bên cạnh vị trí cacbon 3' là các nucleotit có gốc kiểm là guanin

224

Xitosin Adonin Guanin Uraxi Uraxil Xitosin Uraxi

NHI bebe ye mma

—» pCpApGp + UpUpCpGp

D Thuy phan bang ribonucleaza U,

N6 ciing 14 mét enzim endonucleaza phân cách mối liên kết phosphodieste của phân tử RNA ở những vị trí cacbon 3' mà nucleotit bên cạnh, có gốc nitơ là adenin hay guanin Người ta dùng enzim này để cắt tiếp các sản phẩm thu được

sau khi thuỷ phân bang ribonucleaza T,

E Thuỷ phân bằng phosphodiesteraza của noc déc ran

Khác với những enzim ở trên, nó phân cắt mối liên kết giữa axit phosphoric với cacbon 3' của đường pentoza Sản phẩm tạo ra là nucleosit 5'-monophosphat Mat khác nó là exonucleaza, nó tấn công phân tử oligo và polinucleotit từ đầu 3'

Và giải phóng ra nueleosit -5'- monophosphat

Adenin Uraxil Guanin Xitosin

Enzim này tác động lên cả DNA và RNA

E Thuỷ phân bằng phosphodiesteraza của lá lách

Đây cũng là một exonucleaza, nó tấn công RNA và DNA từ đầu 5' và giải phóng một cách tuần tự nucleosit 3' monophosphat `

G Tac dụng của phosphataza kiêm cia E.coli

Phosphataza kiểm của E.coli cũng như các phosphataza khác nó chỉ có thể

cắt phân tử axit phosphoric ra khỏi một đầu của phân tử RNA hay DNA

Guanin Uraxil Xitosin Adenin

“i P | `P Me P | P- [TP — > pGpUpCpA+Pi

H Tac dộng của desoxiribonucleaza (=DNaza)

Những DNaza đầu tiên được phát hiện thường không mang tính đặc trưng

như RNaza Người ta nghiên cứu nhiều về hai loại endonucleaza sau :

- DNaza (I) tuyến tụy phân giải DNA tao ra oligodesoxiribonucleotit 5” monophosphat

- DNaza axit (II) phan giai DNA tao ra oligodesoxiribonucleotit 3’

monophosphat

Gần đây người ta phát hiện ra các enzim "endonucleaza han chế” có trong

nhiều loại vi khuẩn làm nhiệm vụ phân giải tất cả các phân tử DNA thêm nhập

từ bên ngoài vào vi khuẩn Những enzim này phân cắt phân tử DNA mot cách rất đặc biệt Ví dụ 3 loại endonucleaza sử dụng hiện nay lấy từ vi khuẩn E.coli Eco

R1, Haemophilus aegitus (Hae III) va Haemophilus influenzae (Hind MI) va vi

2 Xác định thứ tự các nucleotit trong phân tử RNA

Có ba phương pháp để xác định cấu trúc bậc một của phân tử RNA

a) Thuỷ phân bằng enzim ribonucleaza tuyến tụy, nucleaza T¡, nucleaza U; hoặc các loại nucleaza khác Số oligonucleotit thu được sẽ tiếp tục định tính

bằng phương pháp sắc ký trên cột Phương pháp này đòi hỏi một số lượng mẫu

đủ lớn song lại cho phép định tính được các nucleotit Các tiểu phần thu được sau sắc ký cột đem soi trên máy quang phổ tử ngoại

Cũng có thể dùng phương pháp điện di 2 chiều trên giấy xelluloza - axetat,

trên gel policriamit Số lượng mẫu khi dùng phương pháp này cần ít song phân

tử RNA ở đây phải được đánh dấu bằng ””P, kỹ thuật đánh dấu rất dé dàng với vi

khuẩn, song với động vật bậc cao thì quả là một vấn để phức tạp Phân tử RNA sau khi được đánh dấu, dùng kỹ thuật thuỷ phân một phần hay toàn phần, sau đó

226

dùng dung dịch thuỷ phân để đưa vào điện di hai chiều Những mach

oligonucletit ngắn có thể định tính dựa vào vị trí của chúng trên sắc điện di đồ

b) Phương pháp dùng 32p đánh dấu ở đâu cacbon 5' để xác định thứ tự các nucleotit trong những mạch polinucleotit có độ dài vừa phải hoặc phân tử tRNA

Trước tiên đánh dấu phân tử RNA nhờ enzim polinucleotitkinaza và ATP có

3*'Py, sau đó dùng RNaza tuyến tuy, nucleaza Tạ hay U;¿ thuỷ phân, sau đó dùng

dung dịch thuỷ phân để chạy điện di trên gel poliacrilamit để định tính các

nucleotit

c) Dùng một sợi RNA tổng hợp từ virut in vitro làm mẫu, dùng 4 loại

nucleotit có đánh dấu để theo dõi thứ tự của chúng trong quá trình sinh tổng hợp

sợi bổ sung

3 Xác định thứ tự các nucleotit trong phân tử DNA

Về nguyên tắc cũ¿:g tương tự như việc xác định thứ tự các nucleotit trong

RNA Điều khác nhau ìà, với những đoạn ngắn RNA người ta dùng các enzim để

phân cắt Còn với :hững đoạn ngắn DNA người ta dùng thuỷ phân bằng hoá

chất Những đoạn ngắn này thu được do dùng enzim endonucleaza hạn chế để

cắt các phân tử DNA Những đoạn ngắn DNA được đánh dấu bằng *?P, sau đó

được tiến hành với 4 phản ứng hoá học sau :

- Xử lý với dimethilsunfat, dưới tác động của nhiệt, phân tử guanin tách

khỏi mạch polinucleotit, ta nhận được những đoạn nucleotit có điểm tận cùng của mạch là G

- Xử lý với dimethilsunfat trong mối trường axit làm các gốc purin tạo ra những đoạn nueleotit có tận cùng trong mạch là A và G So sánh với những đoạn xử lý theo phương pháp trước để biết thứ tự các nucleotit có tận cùng A tiếp đến G

- Xử lý với hydrazin trong môi trường NaCl 1M cho phép xác định những

đoạn nucleotit kết thúc bằng C

- Xử lý với hydrazin (không trong môi trường muối) cho phép cắt những

đoạn có tận cùng bằng C và T So sánh với kết quả cất theo phương pháp trên cho phép định vị cho T

Sản phẩm của 4 phản ứng trên sẽ được phân tích bằng điện di để tách các

đoạn nueleotit khác nhau tuỳ theo kích thước của chúng Những đoạn càng ngắn

càng chuyển xa hơn từ điểm xuất phát Xác định thứ tự các nucleotit trong phân

tử DNA bằng máy ôto radiographi.

VI CAU TRUC BAC HAI CUA DNA

Rất nhiều quan sát trên dung dịch DNA nhận thấy rằng, phân tử DNA sau

khi tách khỏi tế bào có cấu trúc hình như khác với cấu trúc vốn có của nó trong

nhân tế bào Sau khi xử lý nhiệt, phân tử DNA có cấu trúc một sợi đơn giản Rất

có thể phân tử DNA phải có cấu trúc bậc hai

Hình thái Ngắn và rộng | Dài hơn và | Dài và mảnh

Năm 1953 hai nhà khoa học người Mỹ là Crick và Watson đã đề xuất một

mô hình cấu trúc bậc hai của phân tử DNA có tính đến tất cả những tính chất của nó

Hai ông đã dựa vào những kết quả nghiên cứu nhiều năm trước đó của các

nhà khoa học như :

- Kết quả phân tích số lượng gốc nitơ cho thấy Trong phân tử DNA có :

Số lượng ademin = Số lượng thimin

Số lượng guanin = Số lượng xitosin

- Wilkins dùng tia X để nghiên cứu phân tử DNA đã đi đến kết luận rằng `

phân tử DNA có cấu trúc hình xoắn (helic)

228)

Hinh 11.1 So 6 cau tric DNA

- Kết quả thực nghiệm cho thấy mạch polidesoxirinucleotit được duy trì nhờ có mối liên kết

hydro

Từ những kết quả trên

Crick va Watson đã cho rằng

phân tử DNA được cấu tạo từ

hai mạch polidesoxinucleotit quấn quanh nhau tạo thành một

hình xoắn kép

Các gốc nitơ nằm trên một

mặt phẳng vuông góc với trục

của hình xoán Khoảng cách

giữa các gốc nitơ trong cùng

một mạch là 3,4A° Một bước xoắn có chiều dài là 34A”

Những gốc nita cha hai sợi liên kết với nhau bằng mối liên kết hydro Giữa A và T là hai

mối liên kết, giữa G và C là ba

mối liên kết hydro Nhờ số

lượng lớn mối liên kết như vậy làm cho phân tử DNA có cấu

trúc hình xoắn vững chắc, nhờ

các gốc nitơ đối nhau là adenin

với thimin, guanin với xitosin

Trên mô hình này có thể hiểu được tại sao ` 1

cũng đi theo chiều ngược lại

C

Vì rằng nếu phân tử Adenin có trong mạch này thì đòi hỏi phân tử

thimin ở kia, tương tự như vậy với guamin và xitosin Thứ tự các gốc nitơ

của một mạch sẽ quyết định một cách tự động thứ tự các gốc nitơ của mạch kia Hai mạch của phân tử DNA không giống nhau mà là ngược nhau, bổ sung cho nhau Hai sợi đi theo chiều ngược nhau và các mối liên kết 3', 5' Mối liên kết hydro giữa các gốc nitơ giúp duy trì trạng thái hình xoắn của phân tử DNA

3

Cấu trúc phan tit DNA bao gồm 2 sợi xoắn vào nhau theo mô hình của Crick

và Watson ngày nay tìm thấy ở thực khuẩn thể (bacteriophage), vi khuẩn, động

vật và thực vật Tuy nhiên cũng có những ngoại lệ, ví dụ, vào năm 1959

Sinsheimer tìm thấy phân tử DNA của bacteriophage _ (X174 chỉ bao gồm có

một sợi xoán Khi thâm nhập vào tế bào vi khuẩn DNA của @X174 mới tiến

hành nhân đôi (replication) thành phân tử DNA bao gồm 2 sợi xoắn

Một số virut có phân tử DNA chỉ gồm một mạch polinucleotit trong

một phần chu kỳ tồn tại của nó Năm 1959, R Sinsheimer phat hiện ra rằng phân tử DNA của bacteriophage

@XI174 chỉ bao gồm có một mạch polinucleotit Các thực nghiệm đưa đến kết

- Nhóm amin của các gốc nitơ trong phan tu DNA X174 dễ dàng tác dung

với formaldehit, trong khi đó tro¡g phân

tử DNA có cấu trúc hình xoắn kép đều

không có phản ứng formaldehit

Tuy vậy phan ti DNA 9X174 chi t6n

tại dạng một mạch trong một giai đoạn

nhất định trong chu kù tồn tại của nó Khi thâm nhập E coli, nó lại có cấu trúc hai mạch xoắn Kết quả này càng làm tăng sự

đúng đắn của mô hình Crick và Watson

Hình 11.2 Anh chụp qua kính hiển vi điện

tử phân tử DNA của phage ^ Phân tử DNA thường rất dài

Phân tử DNA thường rất dài ví dụ : chromosom của E.coli chỉ bao gồm một phân tử DNA có 4 triệu cặp gốc kiểm, phân tử lượng bằng 2,6 x 10”, chiều dài hình vòng là 14 x 10°A°, đường kính

1 Kilobaza = 1000 cap gốc nitơ của phân tử có mạch xoắn kép hoặc 1000

gốc kiểm của phân tử có một mạch polinucleotit

231

1 Kilobaza của phân tử DNA có mạch xoắn kếp có chiều dai 0,34j1m va khối lượng khoảng 660 Kdal

Quá trình xoắn, tở, thuận nghịch của phân tử DNA

Hai mạch xuắn của phân tử DNA dễ dàng tách nhau ra khi các mối liên kết

hydro giữa, các gốc nitơ bộ đứt ra Điều đó có thể thực hiện bằng cách làm Rồng

dung dịch DNA hoặc bổ sung axit hoặc kiểm để ion hoá gốc nitơ của chúng Ở

một nhiệt độ nhất định, hai mạch xoắn của phân tử DNA đột nhiên tở khỏi nhau

ra Nhiệt độ này thay đổi tuỳ thuộc vào từng loại DNA và gọi là nhiệt độ tở (Melting temperature) Tm Sự tở của phân tử DNA có thể đo được trên máy quang phổ tử ngoại ở bước sóng 260nm

Hình 7 T.3 Đường cong nhiệt độ to

của shin th ak so Hình 11.4 Chiéu dai buéc song (nm)

Nhiệt độ tở của phân tử DNA phụ thuộc rất lớn vào thành phần gốc nitơ của

chúng Những phân tử chứa nhiều GC có Tm cao hơn những phân tử chứa nhiều AT

Tm của phân tử DNA của nhiều loài khác nhau thay đổi tỷ lệ thuận với hàm

lượng GC, có thể đạt 77 đến 100°C khi lượng GC tang tir 20% dén 78% Cap

GC liên kết bằng 3 mối liên kết hydro do đó bền vững hơn cặp AT chỉ bằng 2

mối liên kết hydro

Trong cơ thể dưới tác động của một số loại protein phân tử DNA cũng bị tở ra

Hai mạch của DNA tách nhau ra khi nhiệt độ cao, khi nhiệt độ xuống thấp hơn Tm, hai mạch lại tái kết hợp với nhau

232

Một số DNA có phân tử là một vòng khép kín hay vòng xoắn cuộn

Qua kính hiển vi điện tử người ta

nhận thấy có một số DNA có hình vòng khép kín

Một số chromosom của E.coli cũng

có hình vòng khép kín gấp hàng nghìn

lần đường kính của vi khuẩn

Không phải tất cả các loại DNA đều

có cấu tạo vòng khép kín Ví dụ DNA

cuộn (dưới) của một số phantir DNA

A-DNA, 2 mạch xoắn phải của nó

có chứa l1 cặp gốc nitơ cho một chu kỳ xoắn, có độ nghiêng 20 độ so với trục thẳng đứng của phân tử DNA Nó hình thành do quá trình khử bớt nước của

dang B-DNA

B-DNA, 2 mach xoắn phải của nó mang đúng mô hình kinh điển của Crick

và Watson Một chu kỳ xoắn chứa 10 cặp gốc nitơ có mặt phẳng vuông góc với

trục của phân tử DÑA

Z-DNA Khác với hai loại trên, nó có cấu trúc hai mạch xoắn trái Mỗi chu

kỳ xoắn chứa 12 cặp gốc nitơ Mô hình này do A Rich cùng các cộng sự phát

hiện dựa trên các nghiên cứu về cấu trúc tinh thể của d (CG) 3'

VII VAI TRÒ LƯU GIỮ MẬT MÃ DI TRUYỀN CỦA PHÂN TỬDNA

Đã từ lâu người ta đã tìm hiểu về vai trò của phân tử DNA, liên quan đến

việc lưu giữ các mật mã di truyền và phát hiện ra rằng :

1 Đối với các cơ thể bậc cao, có một mối tương quan giữa số lượng DNA chứa trong tế bào với số lượng thông tin di truyền Mặt khác số lượng DNA trong nhân của tế bào cơ thể thường là nhị bội thể 2n, còn tế bào sinh dục là đơn bội In

233

2 Người ta quan sát thấy rằng thứ tự các gốc nitơ trong phân tử DNA của

thế hệ con thường khá đồng nhất với thứ tự gốc nitơ trong phân tử DNA của bố

mẹ chúng Việc này có thể chứng minh được bằng kỹ thuật lai

3 Những tác nhân vật lý, hoá học gây đột biến thường là gây sự biến đổi

phân tử DNA

4 Với vi sinh vật, người ta ghi nhận rằng phân tử DNA cho phép vận

chuyển một hoặc nhiều tính trạng di truyền

- Chuyển giao một tính trạng (Transformation) Người ta bổ sung phân tử DNA lay từ vi khuẩn kháng streptomixin vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn mẫn

cảm với kháng sinh, sau một thời gian nhất định thấy xuất hiện thế hệ vi khuẩn

kháng streptomixin Tính trạng này đã được nhận từ phân tử DNA bổ sung vào môi trường

- Chuyển giao nhiều tình trạng (Transduction) ví dụ DNA của bacteriophage

khi thâm nhập tế bào vi khuẩn sẽ chuyển giao toàn bộ những tính trạng của nó

để biến DNA của vi khuẩn thành DNA của bacteriophage và tiêu diệt vi khuẩn

- Kết giao (conjugaison) đó là sự kết giao trực tiếp giữa hai tế bào vi khuẩn,

tế bào thứ nhất có thể chuyển hoá một phần hay toàn bộ chromosom sang tế bào thứ hai Người ta ghi nhận rằng có mối tương quan giữa số lượng DNA từ tế bào cho chuyển sang tế bào nhận với số lượng các tình trạng chuyển giao

5 Thí nghiệm trên vi khuẩn pneumococci :

Vi khuẩn pneumococci đóng vai trò quan trọng trong việc xác định vai trò

lưu giữ mật mã di truyền của phân tử DNA Bình thường pneumococci có một lớp vỏ bọc cấu tạo từ polisacarit Chính lớp vỏ bọc này mang độc tính và gây ra

bệnh viêm phổi ở người và động vật có vú

Gốc glucoronat Gốc glucoza Gốc glucoronat Gốc glucoza

Người ta đã tạo được một loại pneumococci không có vỏ bọc polisacarit

bằng con đường gây đột biến Loại đột biến này không gây độc tính Loại vi

khudn pneumococci (P) binh thường có khuẩn lạc trơn nhẫn ký hiệu là § Loại P

đột biến có khuẩn lạc xù xì được ký hiệu là R Vi khuẩn P đột biến không có

enzim dehydrogenaza để chuyển hoá UDP-glucose thành UDP-glucoronate

234

Enzim này cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp lớp vỏ bọc polisacarit có cấu trúc gồm các gốc glucoza và glucoronate luân chuyển nhau

Năm 1928, Fred Griffith phát hiện ra rằng, chủng R không độc tính có thể chuyển thành chủng § mang độc tính bằng cách sau :

Ông đã tiêm chuột theo sơ đồ :

Lô II : Tiêm chủng S đã làm chết bằng nhiệt

Kết quả cho thấy chuột ở lô I chết hoàn toàn, còn chuột ở lô II và II còn

Năm 1944 O Avery và C Macleod đã tiến

hành nghiên cứu làm cho chủng R chuyển thành

chủng S Các tác giả đã đi đến những kết luận :

- Chất chiết xuất từ nhân tế bào sau khi làm sạch, xác định thành phần hoá học các

nguyên tố cấu thành nó cho thấy giống hệt như thành phần của DNA

- Các tính chất vật lý, hoá học chất chiết

xuất từ nhân tế bào chủng § giống với DNA

- Dịch chiết xuất bao gồm protein và lipit

không mang hoạt tính

- Xử lý dịnh chiết xuất từ nhân bằng trypsin chymotrypsin không làm nó mất hoạt

tính

- Xử lý bằng ribonucleaza cũng không làm

mất hoạt tính

235

- Xử lý bằng desoxiribonucleaza làm mất hoàn toàn hoạt tính

Từ đó đi đến kết luận, chất chiết xuất từ nhân tế bào chủng S có thể làm cho

được A Hershey và M chase tiến hành thực nghiệm như sau :

- Họ dùng *’P để đánh dấu DNA của phage (bacteriophage) và dùng 355 dé

đánh dấu protein trong vỏ bọc Sự đánh dấu này là rất đặc trưng vì DNA không

chứa § và protein không chứa P

- Dùng phage đã đánh dấu cho thâm nhập E.coli sau một thời gian ngắn trong tủ ấm

- Dịch nuôi cấy thu được đưa vào ly tâm với

tốc độ 10.000 vòng phút, làm cho các virut tách

khỏi tế bào E.coli đã bị nhiễm

- Tiếp tục cho ly tâm với tốc độ cao hơn

Màng tếbào đến mức toàn bộ các tế bào E coli lắng xuống

dưới đáy ống ly tâm, còn các virut ở lại trong

Hình 1] 7° dịch phía trên Đem phân tích tìm ??P và *°S két

Sơ đồ phage T; chuyển DNA của nó _ quả thu được cho thấy : vào tế bào vi khuẩn & ji

- Hầu hết DNA của phage được tìm thấy

trong vi khuẩn

- Hầu hết protein của phage tìm thấy ở dịch phía trên

Các thí nghiệm tiếp theo cho thấy dưới 1% ”ŠS được chuyển từ phage bố mẹ sang phage thế hệ con cháu Ngược lại có 30% ??P của phage bố mẹ xuất hiện trong thế hệ con cháu

Protein

336

Chương mười hai

CẤU TRÚC CỦA PHÂN TỬRNA

NH,

Xitosin B’

DNA có hai mạch xoắn Vì vậy số

lượng adenin sẽ khác với uraxil và

guanin khác với xitosin trong hầu

hết các phân tử RNA

Tuy vậy phân tit RNA cé thé tu gấp nó để tạo thành những đoạn xoắn kép Trong những đoạn xoắn

kép đó thì uraxil sẽ tạo thành cặp

với adenin và guamin tạo thành cặp với xitosin hay uraxil Tỷ lệ các đoạn có cấu trúc xoắn kép thì khác nhau trong các loại RNA khác nhau

NCZ

Một số phân tử RNA của virut có cấu trúc mach xoắn kép nhỏ là phân tử

DNA và cũng mang những gen gây bệnh

Trong tế bào có chứa năm loai RNA là :

- RNA thông tin (mRNA) - phục vụ làm khuôn mẫu để tổng hợp protein Mỗi một phân tử mRNA có chứa một gen hoặc một nhóm gen để tổng hợp một loại protein Do đó mRNA là một nhóm các chất rất khác nhau Trong tế bào

E.coli có chứa các mRNA có chiều dài trung bình khoảng 1,2 Kb

- RNA vận chuyển (tRNA) có nhiệm vụ vận chuyển axit amin đã được hoạt hoá

đến ribosom để tổng hợp lên phân tử protein theo mẫu của mRNA Có ít nhất 21 loại tRNA tương ứng với21 loại axit amin khác nhau tRNA bao gồm khoảng 25 nucleotit (25 Kdal) Chúng thuộc nhóm RNA có phân tử lượng nhỏ nhất

- RNA ribosom (rRNA) là thành phần chính của ribosom song vai trò chính

xác của chúng trong quá trình tổng hợp protein chưa hoàn toàn biết rõ Trong tế

bào E.coli có ba loại rRNA gọi là rRNA25S, rRNA16S và rRNA5S Cách phân

loại này là theo hệ số lắng đọng S

Bảng 12.1 : Các RNA trong phân tử E.coli

Loai RNA Số lượng | Hệ sốlắng | Phân tử lượng | Số lượng

16 0,55 x 10° 1700

2) RNA van chuyén (tRNA)| 15 4 2,5 x 10 75

Hệ số lắng đọng của các đại phân tử được tính theo đơn vị Svedberg 1S =

1013 giây Đơn vị này được gọi theo tên của nhà bác học Thuy Điển, người sáng

lập ra ly tâm siêu tốc

Vai trò thông tin cua MRNA

Năm 1961 lần đầu tiên F Jacob và J Monod đã phát hiện vai trò thông tin

của mRNA Hai ông nhận thấy rằng protein được tổng hợp trong xitoplasma chứ

không phải trong hạt nhân Mà phân tử DNA lại chứa trong hạt nhân, vậy những

thông tin di truyền mà nó lưu giữ làm thế nào để chuyển vào xitoplasma Hai

nhà khoa học trên đã phỏng đoán rằng phải có những tính chất sau :

1 Chất mang thông tin là một polinucleott

2 Thành phần gốc nitơ (hay gốc kiểm) của chất mang thông tin phải phản ánh được thành phần gốc kiểm của DNA mà nó đặc trưng cho

3 Chất mang thông tin phải đa dạng vì một gen hay một nhóm gen có độ

dày rất khác nhau

4 Chất mang thông tin kết hợp với ribosom ở vị trí diễn ra quá trình sinh

tổng hợp protein trong một thời gian ngắn

Š Chất mang thông tin sẽ được tổng hợp và phân giải rất nhanh

Ở thời điểm mà Jacob và Monod đề ra những tiêu chuẩn trên thì không có

một phân tử RNA đã biết đáp ứng được Ví dụ rRNA được xem là mẫu tổng hợp

protein thì có kích thước rất thuần nhất, thành phần gốc kiểm tương đối giống nhau ở những sinh vật có tỷ số gốc kiểm khác nhau trong phân tử DNA Mặt

khác rRNA vững bền và nó kết hợp véi 5’

- Ñuorouraxil với tốc độ chậm

RNA vận chuyển thường có phân tử

lượng quá nhỏ và cũng không thích ứng với những tiêu chuẩn trên `"

Khi tiến hành cho nhiễm E.coli bằng

phape Tạ, phát hiện thấy RNA mới có đời sống bán phần rất ngắn Thành phần gốc kiểm của nó giống với thành phân gốc kiểm của DNA phage

Giả thuyết đã được chứng minh bằng

thực nghiệm

Hình 12.2 Ảnh qua kính hiển vi đện tử : phage T; đang

tấn công tế bảo vi khuẩn E.coli

239

Khi nhiễm E.coli bằng phage Tạ nhận thấy rằng hầu như toàn bộ protein

tổng hợp được sau khi nhiễm đều có đặc tính di truyền thuộc về phage

Sau khi nhiễm xuất hiện một loại RNA có đời sống bán phần ngắn có thành phan nucleotit giéng nhu cua DNA phage

Rõ ràng đây chính là RNA thông tin (mRNA) vì rằng rRNA và tRNA không

tổng hợp sau khi nhiễm phage T;

Vai trd cha mRNA còn được chứng minh qua các thí nghiệm lai RNA

3? 5’ mach DNA Vào năm 1961, S.SpŸegelman phát

T ~ 2,

nucleic nhằm sáng tổ câu hỏi, liệu các

hợp sau khi nhiễm phage T; có đối

xứng (theo quy luật ghép đôi các gốc

nitơ) với thứ tạ các gốc kiểm của DNA T;ạ hay không ? Công việc bắt đầu bằng cách nâng nhiệt độ vượt quá

nhiệt độ tở của DNA để tạo thành DNA bao gồm một mạch Những mạch

đơn này lại có thể kết hợp với nhau để tạo thành mạch xoắn kép nếu ta hạ

nhiệt độ từ từ xuống Từ thực nghiệm

này, Spiegelman cho rằng nếu mRNA

có thứ tự các gốc kiểm tương ứng với

1 RNA tổng hợp được sau khi nhiễm E.coli bang phage T, (T, mRNA)

được đánh dấu bằng ?P, Tạ DNA được đán dấu bằng °H Hai loại này được

chuẩn bị trong hai thực nghiệm riêng biệt

2 Tr6n T, mRNA va T, DNA tang nhiét độ cao hơn nhiệt độ gây tở sợi xoắn của DNA, thu được dung dịch gồm những mạch đơn DNA va RNA, ha

nhiệt độ xuống khoảng 20-22°C

3 Hỗn hợp đã ]àm lạnh đem đi phân tích bằng ly tâm siêu tốc thu được 3

pic, pic thứ nhất tương ứng với mRNÀ, pic thứ 2 tương ứng với DNA và pic thứ

240

3 tương ứng với phân tử lái có cấu trúc xoắn kép song gồm 1 sợi DNA và một

sợi RNA Như vậy là Tạ mRNA tạo thành phân tử lai với Tạ DNA Tạ mRNA không tạo thành phân tử lai với bất cứ một phân tử DNA của vi khuẩn Điều này

đưa đến kết luận quan trọng là m RNA sao chép một cách chính xác những

thông tin di truyền trên phân tử DNA để tiến hành tổng hợp phân tử protein đặc trưng cho từng cơ thể

Kỹ thuật lai còn phát hiện ra rằng rRNA và tRNA cũng đều được tổng hợp

theo khuôn mẫu của DNA

Các kiểu chuyển thông tin

DNA lưu giữ tất cả các thông tin di truyền của cơ thể sinh vật ngoại trừ một

số phage và virut RNA (ví dụ như virut polimielit) ở đây không có DNA nên RNA đảm nhiệm vai trò lưu giữ các thông tin di truyền Rõ ràng là những thông tin này cần được bảo tồn trong quá trình phân chia tế bào Do đó trong quá trình phân chia tế bào sẽ xảy ra quá trình nhân đôi phân tử DNA (duplication hay replication) Một quá trình đồi hỏi các thông tin di truyền trong tế bào mẹ phải được bảo tồn đầy đủ trong các tế bào con

Những thông tin này cho phép tổng hợp các protein đặc chủng theo quy luật

một ger => một mạch polipeptit Tuy nhiên các thông tin không thể chuyển trực

tiếp sang quá trình sinh tổng hợp protein, nó phải được mRNA sac chép RNA thông tin chỉ huy việc lắp ghép các phân tử axit amin để tạo thành phân tử

protein Cho đến ngày nay người ta biết được 5 kiểu vận chuyển thông tin là :

1 Truyền thông tin từ DNA sang DNA, đó lä quá trình nhân đôi phân tử DNA nhằm đảm bảo lưu giữ toàn bộ những thông tin di truyền

2 Truyền thông tin từ DNA sang RNA - đó là quá trình sao chép

(transcription) Quá trình này cho phép truyền các thông tin từ phân tử ĐNA sang các phân tử RNA khác nhau

3 Truyền thông tin từ RNA sang protein Đây là quá trình dịch các mật mã

di truyền (tranduction) Quá trình này cho phép tổng hợp, các proiein đặc trưng theo đúng những thông tin chứa trong phân tử RNA thông tin

Trong trường hợp virut là một phân tử RNA ta có :

4 Vận chuyển thông tin tử RNA sang RNA Trong trường hợp này phân tử RNA sẽ đảm nhiệm vai trò làm khuôn mẫu để tổng hợp RNA của virut (quá trình phát triển của virut) đồng thời làm khuôn mẫu để tổng hợp phân ti RNA

thông tin Phân tử mRNA này sẽ đảm nhiệm việc tổng hợp protein đặc trưng có

thể gây bệnh

5 Truyền thông tin từ RNA sang DNA Các thông tin chứa trong phân tử RNA

của virut trước tiên phải được vận chuyển sang phân tử DNA của tế bào chủ Từ DNA của tế bào chủ các thông tin sẽ được chuyển cho các phân tử RNA để cuối

cùng có thể thực hiện được các quá trình tổng hợp protein đặc trưng gây bệnh

Ảnh kính hiển vi điện tử quá trình sao chép (transcription) của phân tử RNA

242

Chuong mudi ba SINH TONG HOP DNA

Theo mô hình của Crick va Watson, phân tử DNA gồm 2 mạch nucleotit

quấn vào nhau Vậy quá trình nhân đôi (Replication) DNA sẽ phải xảy ra như

thế nào ? Mỗi một mắt xích nucleotit của phân tử DNA mẫu phải được một

nucleotit đối xứng nhận biết trước khi nó được tham gia vào quá trình hình thành một mạch polinucieotit Với mục đích đó phân tử DNA phải được tở ra

(hay mở ra) ít nhất là một đoạn một cách tạm thời để có thể kết hợp với các

mạch polinucleotit đối xứng qua mối liên kết hydro theo sơ đồ sau :

NHÂN ĐÔI DNA THEO PHƯƠNG THỨC BÁN BẢO THỦ

(Replication semiconservative)

Watson va Crick cho rang, phan tử DNA mới tạo ra có một mạch

polinucleotit là được tổng hợp mới hoàn toàn, các mạch kia nó sẽ nhận được từ

tế bào mẹ Phương thức này gọi là quá trình nhân đôi bán bảo thủ

Cũng có thể giả thiết rằng hai sợi mạch polinucleotit của phân tử DNA mẹ

tách ra làm mẫu để tổng hợp hai mạch polinucleotit con, sau đó nó lại phối hợp

lại với nhau Trong số hai DNA con tạo ra sẽ có một DNA vẫn giữ nguyên 2 mạch polinucleotit của phân tử mẹ và một phân tử mới hoàn toàn

Meselson và Stahl đã tiến hành thực nghiệm để tìm xem DNA đã nhân đôi theo phương thức nào

Hai ông đã nuôi cấy E.coli trong nhiều thế hệ trên môi trường có !”NH„CI

như là nguồn nitơ duy nhất đạt đến mức độ toàn bộ DNA tạo ra đều có chứa '”N

Ở thời điểm đó (gọi là thời điểm O) đem toàn bộ khuẩn lạc cấy truyền trên môi

trường có chứa '“NH„CI Tiếp đó cứ cách một khoảng thời gian nhất định lấy

DNA ra cho vào ly tâm trong dung dịch clorua xeri Kỹ thuật này cho phép tách

các phân tử DNA có phân tử lượng khác nhau Phân tử càng nặng sẽ càng chuyển về vị trí gần với đáy ống nghiệm hơn Kết quả thu được cho thấy :

- Ở thời điểm O ứng với thế hệ O chỉ thu được một băng tương ứng với DNA năng (chứa 'ÝN)

- Tiếp tục lai thế hệ nuôi cấy trên môi trường chỉ có chứa l*N, thấy xu hiện một băng nằm ở giữa DNA nặng và DNA nhẹ Điều đó có nghĩa là phân tử

DNA mới tạo ra được cấu tạo từ một mạch DNA nặng và một mạch DNA nhẹ mới tạo ra

e = ` ` }

Hình 13.1

Tiếp tục đến thế hệ thứ hai trong môi trường có chứa '*N, thấy xuất hiện hai

băng có độ đậm bằng nhau, một trong hai băng tương ứng với phân tử DNA lai (DNA được cấu tạo từ một mạch nặng và một mạch nhẹ), còn phân tử DNA kia tương ứng với loại DNA nhẹ (tức là được cấu tạo từ hai mạch polinucleotit có

chứa 'ÝN)

Kết quả nghiên cứu này chứng tỏ quá trình nhân đôi của phân tử DNA xây

ra theo phương thức bán bảo thủ

244

Ly tâm siêu tốc phân tử DNA trong quá trình nhân

đôi (replication) vị trí các băng DNA phụ thuộc vào

thành phần ' N hay 'ẨN của nó Sự phân ly các băng

ua các thế hệ 5 ss

hao Meselson va Stahl) Sơ đồ quá trình nhân đôi bán bảo thủ cea erat

của phân tử DNA (theo Meselson va Stahl)

245

đó các enzim DNA polimeraza còn tìm thấy trong các dịch chiết vi khuẩn, các dịch chiết từ động vật và thực vật

Vào năm 1969 hai nhà khoa học là Delucia và Cairns đã tìm thấy DNA

polimeraza II và III Hai enzim này cùng được các phòng thí nghiệm khác phân

lập, sau khi nghiên cứu các tính chất, người ta thấy nó giống với polimeraza Ï ở

một vài tính chất :

, - Để tổng hợp phân tử DNA từ desoxiribnueleosit triphosphat cũng cần phải

có phân tử DNA làm mẫu

- Quá trình tổng hợp cũng bắt đầu từ nhóm 3'-OH tự do

- Quá trình tổng hợp cũng theo hướng Š' — 3'

- Chúng có hoạt tính 3" —> 5' exonucleaza, DNA polimeraza III còn có hoạt

Polimeraza II va III có thể hoạt động tối ưu trên hai mạch của phân tử DNA

làm mẫu Polimeraza III còn liên kết với một số protein khác khi nó thể hiện các

Những nghiên cứu về sinh hoá học và di truyền học gin đây cho thấy có

khoảng hơn 10 loại protein cần được bổ sung cho DNA polimeraza I và III, để

có thể tiến hành nhân đôi DNA trong tế bào E.coli

Để cho DNA polimeraza hoạt động nó cân một phân tử DNA làm mô hình

Cơ chất cho ‹quá trình trùng hợp nhất thiết phải là 2'-Desoxiribonucleosit - 5'- triphosphat Enzim DNA polimeraza làm nhiệm vụ xúc tác cho quá trình trùng

Người ta nhận xét rằng :

1 Mối liên kết phosphodieste tạo ra giữa nhóm 3'OH với nhóm 5'-phosphat

của nucleotit được gắn vào Mạch polinucleotit nhờ đó được kéo dài ra và được

gọi là đoạn bắt đầu

2: Mỗi một phân tử desoxiribonucleotit được gắn vào mạch mới thì hoàn

toàn phụ thuộc vào cấu trúc của mạch mẫu DNA Người ta còn gọi là mạch mẫu (tiếng Anh là "template")

Suy ra rằng enzim DNA polimeraza chỉ có thể tổng hợp phân tử DNA theo

một mẫu đã có trước

Quá trình trùng hợp xảy ra theo huéng 5’ > 3

Enzim DNA polimeraza xúc tác phản ứng sau :

+246

Enzim này có hai cơ chất : một là phân tử làm mẫu có nhóm 3'OH, cơ chất

kia nhất thiết phải là desoxiribonucleosit-5'-triphosphat — ~

Để xác định thứ tự các nucleotit được đưa vào tổng hợp, người ta tiến hành đưa vào phản ứng trùng hợp 4dTNP, một trong số đó được đánh dấu ở vị trí œ

của nhóm phosphat bằng ”?P

Kết thúc phản ứng người ta thu được phân tử DNA Đem phân tử này thuỷ

phân bằng enzim cuối cùng thu được các phân tử desoxiribonucleosit 3'-

monophosphat Người ta xác định thấy rằng ??P được gắn vào phân tử DNA ở vị

trí 5' của một nucleosit bên cạnh

Người ta tách bốn loại desoxiribonucleosit-3' monophosphat, tiến hành xác

định độ phóng xạ, người ta có thể xác định được thứ tự các gốc nitơ

Từ những phân tích này cho phép đi đến một số kết luận sau :

- Thứ tự các gốc kiểm của mạch DNA mới tạo ra thì giống hệt với mạch đối

xứng của phân tử DNA mẫu

- Độ phân cực của mạch mới tạo ra thì ngược với mạch mẫu

Các giai đoạn của quá trình nhân đôi (replication)

Quá trình nhân đôi phân tử DNA có thể chia làm ba giai đoạn :

Giai đoạn bắt đầu, giai đoạn kéo dài và giai đoạn kết thúc

1- Giai đoạn bắt đầu

Như đã trình bàyở trên enzim DNA polimeraza chỉ có thể tổng hợp DNA theo một mẫu có sắn Điểm khởi đầu của quá trình nhân đôi thường là chính xác

trong phân tử DNA mẫu Phân tử DNA làm mẫu trước tiên hai sợi xoắn của nó phải tở ra để cho giai đoạn bắt đầu có thể tiến hành

Nhóm 3'-OH có thể được cung cấp theo các phương thức khác nhau Trong phần lớn các trường hợp, một mạch DNA tự uốn cong lại Trường hợp thứ hai là

một mạch của DNA sẽ cung cấp 3'-OH để tổng hợp mạch kia

Như trên đã nêu hai mạch của phân tử DNA có độ phân cựu ngược nhau Quá trình kéo dài được tiến hành theo hướng 5' — 3' Điều đó có nghĩa là quá trình trùng hợp để tạo thành phân tử DNA theo hướng 5' —> 3" là liên tục nhưng theo một thứ tự đối kháng với mạch DNA làm mẫu

Để chứng minh cho giả thuyết trên nhóm khoa học do ông Okazaki đã tiến

hành thí nghiệm bổ sung desoxitimidin dưới dạng một hợp chất có độ phóng xạ

248

cao để đánh dấu phân tử DNA mới tổng hợp Bằng phương pháp này đã phát

hiện ra rằng phân tử DNA mới tổng hợp dưới dạng mạch nucleotit có số lượng từ

1000 đến 2000 gốc (người ta còn gọi là đoạn Okazaki) Những đoạn này ai liên kết với nhau tạo thành một mạch dài theo hướng 5' —> 3' Đối với những tế bào ơcariot chiều dài của đoạn Okazaki thường rất ngắn, từ 100 đến 200 nucleotit

Quá trình sinh tổng hợp phân tử DNA được tiến hành theo phương thức như

đã nói ở phần trên Trước tiên hai mạch DNA tở ra tạo thành một cái chạc ba

(tiếng Anh gọi là replication fork) Hai mạch của phân tử DNA mẹ được dùng

để tổng hợp phân tử DNA mới

3’ mach trước

một cách liên tục Mạch được tổng hợp từ các đoạn Okazaki được gọi là mạch

chậm (tiếng Anh gọi là lagging strand) Còn mạch kia được tổng hợp liên tục và

được gọi là mạch trước (tiếng Anh gọi là leading strand) Cả hai mạch Okazaki

va mạch dẫn đầu đều được tổng hợp theo hướng 5' -› 3'

Quá trình sinh tổng hợp DNA được bắt đầu từ RNA Như đã biết DNA polimeraza đồi hỏi phải có nhóm 3'-OH tự do để có thể bắt đầu tổng hợp DNA

Vậy thì điểm bất đầu để tổng hợp mạch dẫn đầu và những đoạn polinucleotit Người ta đã quan sát thấy rằng quá trình tổng hợp RNA cần thiết cho việc bất

đầu tổng hợp DNA Phát hiện này giả thiết rằng chính phân tử RNA mới có thể

khởi đâu cho quá trình tổng hợp DNA, vì rằng RNA polimeraza có thể bắt đầu

môt mạch mới Tiếp theo người ta phát hiện ra rằng phân tử DNA mới tạo ra có thể liên kết đồng hoá trị với một đoạn ngắn đã được kéo dài của RNA, chính

đoạn này được dùng làm điểm khởi đầu cho quá trình tổng hợp DNA

Như vậy là chính RNA đã khởi đầu cho quá trình tổng hợp DNA

Trong tế bào E coli, quá trình nhân đôi DNA xảy ra như sau :

1 Một enzim đặc trưng RNA polimeraza (gọi là primaza) tổng hợp một

đoạn ngắn kéo dài của RNA (khoảng 10 nucleotit), đoạn này tổng hợp theo mạch DNA làm mẫu Khác với DNA polimeraza, primaza không đòi hỏi điểm

khởi đầu để tiến hành tổng hợp mạch polinucleotit

2 Nhóm 3'-OH ở đầu mạch ribonucleotit của mạch RNA sẽ làm nhiệm vụ là

điểm khởi đầu cho quá trình tổng hợp cho mạch DNA mới với sự xúc tác của

DNA polimeraza III

3 Đoạn RNA có trong thành phần phân tử lai RNA-DNA sẽ được thuỷ phân bởi enzim DNA polimeraza I

4 Đoạn RNA có trong phân tử DNA sẽ được loại trừ Phần thiếu hụt tạo ra

sẽ được DNA polimeraza I hoàn tất Quá trình này diễn ra một cách rất dễ dàng

A Primaza tổng hợp một đoạn ngắn RNA

B Đoạn RNA làm nhiệm vụ khởi đầu téng hop DNA

€ Đoạn RNA bị loại bỏ và trên chỗ của nó lại tổng hợp tiếp DNA

250

"3 - Giai đoạn kết thức

Các nghiên cứu về quá trình tổng hợp DNA trước tiên tập trung vào giai đoạn kéo đài phân tử DNA và gân đây nhất là giai đoạn khởi động, chính giai đoạn này đã cho phép điều chỉnh các quá trình trong tế bào Người ta còn biết

rất ít về sự kết thúc của quá trình nhân đôi phân tử DNA

Hai vấn đề quan trọng được đặt ra là :

- Quá trình nhân đôi được kết thúc như thế nào ? Tại sao quá trình nhân đôi không tiếp tục ? Tại sao phân tử DNA mới được tổng hợp không được dùng làm

mô hình để tổng hợp phân tử DNA mới ?

- Nếu như phân tử DNA là một gen thắng hoặc là một gen hình vòng thì

việc kết thúc có thể hiểu được một cách dễ dàng là khi phân tử DNA con đã sao

chép đầy đủ các thông tin của DNA mẹ

Tính trung thực của quá trình nhân đôi phân tử DNA

Phân tử DNA lưu giữ tất cả các thông tin di truyền Những thông tin di truyền này phải được lưu trữ và chuyển giao cho thế hệ con Có nghĩa là

phan ti DNA mới tổng hợp phải sao chép một cách chính xác các thông tin

di truyền của phân tử DNA mẹ Nói một cách khác, quá trình nhân đôi phân

tử DNA phải rất trung thực và không được phạm một sai sót nào Một khi có

sự sai sót xảy ra thì nó phải được phát hiện bởi những hệ thống sửa chữa Song một điều khó ở đây là sự phân biệt giữa mạch nguồn thông tin chính

xác với mạch nguồn thông tin sai Vì vậy ở thời điểm tổng hợp phân tử DNA

cần có hoạt tính sửa chữa

1 Hoạt tính sửa chữa của DNA polimeraza

Như ta đã biết bộ gen của E coli bao gồm 4 x 10° cặp gốc kiểm, tỷ lê sai sót chấp nhận được cho mỗi một lần nhân đôi là một gốc kiểm trên 10° hoặc 107,

Cơ chế sửa chữa đã được nghiên cứu khá kỹ càng đối với E.coli Cơ sở của nó là các enzim DNA polimeraza cần đồng thời một lúc phân tử DNA

làm mẫu cũng như là điểm khởi đầu Ví dụ một gốc dưới dạng enol được gắn vào mạch polinucleotit, một gốc tiếp theo lại dưới dạng sêtô làm cho DNA polimeraza không thể xúc tác cho quá trình tạo lập liên kết phosphodieste

với một nucleotit tiếp theo Nghĩa là quá trình tổng hợp sẽ bị dừng lại Đối

với những sinh vật ơcariot sự trưởng thành trong quá trình nhân đôi càng đòi

hỏi ở mức độ cao Vì rằng một gen của động vật có vú bao gồm khoảng 3 x 10? cặp gốc kiểm Do đó tính trung thực trong quá trình nhân đôi phải bằng hoặc lớn hơn 10”

theo hướng 3'~>5' xảy ra liên tue, con Hình 13.6 RNA giống như là primer

theo hướng '5~> 3" thi không liên tục để tổng hợp DNA

252

Nhân đôi ở tế bào procariôt Nhân đôi ở tế bào Ởcariôt

Hình 13.7 Sơ đô quá trình nhân đôi DNA ở tế bào procariôt và øcariôt

- Điểm phình ra giữa hai mạch ở phân tử DNA gọi là ori Từ những ori quá

- Đối với tế bào procariôt chỉ có một ori

- Đối với tế bào ơcariôt quá trình nhân đôi DNA diễn ra ở nhiều ori trên suốt chiều dài của phân tử DNA

Chương mười bốn

QUÁ TRÌNH SAO CHÉP THÔNG TIN

(TRANSCRIPTION)

`

Cấu trúc của phân tử DNA do Watson và Crick đề xuất năm 1953, cho phép

hiểu được quá trình nhân đôi của nó Song còn những thông tin di truyền được lưu giữ trong phân tử DNA và việc chuyển những thông tin đó cho thế hệ sau được thực hiện như thế nào ? Các cơ thể sống làm thế nào để biết được những thông tin lưu giữ trong bộ gen của chúng ? Câu hỏi trên được giải quyết trong suốt nhiều năm vừa qua

Vào năm 1940, G Beadle và E Tatum nghiên cứu về nấm mốc trên bánh mì Neurospora crassa, đã để nghị gọi một đơn vị di truyền là gen, mỗi một gen, theo

hai ông thì tương ứng với việc sản xuất một enzim Mãi đến 1956 mới có thể chứng minh một cách đây đủ mối quan hệ giữa các gen và các protein khi mà V Ingram công bố các nghiên cứu của ông về cấu trúc hemoglobin của những hồng cầu dị dạng Tác giả này cho biết bệnh nhân có hồng cầu di dạng di truyền cho thế hệ sau

Trong phân tử hemoglobin của những bệnh nhân này chỉ có một axit amin khác với

phân tử hemoglobin bình thường Kết quả nghiên cứu này chứng tỏ rằng sự biến đổi

về di truyền thể hiện dưới dạng sự thay đổi cấu trúc bậc I của protein, có nghĩa là

những thông tin di truyền cố định trên các bộ gen quyết định cấu trúc bậc I của mỗi

protein trong cơ thể

Bộ gen của phần lớn các cơ thể procariôt chứa khoảng 2000 gen tương ứng với

2000 loại protein cũng như các hợp chất đại phân tử như là DNA và RNA Những gen này được đặt tên là gen duy rrì, bởi vì sản phẩm của nó giúp cho các hoạt động thông thường của tất cả các tế bào

Nấm men, một loại tế bào ơcariot đơn giản cũng có một bộ gen duy trì Tổng

số gen có trong các sinh vật ơcariôt khác thì chưa được rõ Song ước tính các loại côn trùng có chừng 7000 gen, các loại động vật có vú có khoảng 50.000 gen Ngoài những gen duy trì, các sinh vật ơcariôt còn có những gen điều khiển sự phát triển

những gen này chỉ thể hiện trong một số thời kỳ phát triển của bào thai

Quá trình thể hiện các thông tin di truyền cố định trong các phân tử DNA qua các protein được tóm tắt như sau :

Nhân đôi

PNA: DNA Hình 14.1 Vấn đề cốt lõi của sinh vật

học phân tử : Phân tử DNA tự

tế bào được chuyển từ DNA sang

Dịch mật mã RNA, réi từ RNA sang protein Protein

Trong chương này sẽ đi sâu vào quá trình làm thế nào các thông tin di truyền

cố định trên phân tử DNA có thể chuyển sang các phân tử RNA, quá trình này được

gọi là sự "sao chép thông tin”

1 Vận chuyển thông tin di truyền từ DNA sang RNA

Để vận chuyển thông tin di truyền từ DNA đến protein, tế bào cần phải bắt đầu

từ việc tổng hợp RNA, nói một cách khác các thông tin di truyền phải được chuyển

từ DNA sang RNA, quá trình này gọi là sự sao chép thông tin di truyền Mỗi một đoạn của phân tử DNA lưu giữ các thông tin để tổng hợp một loại phân tử protein

gọi là một gen Quá trình này có sự tham gia của nhiều loại RNA Ví dụ : RNA vận

chuyển tRNA làm nhiệm vụ vận chuyển các axit đến các ribosom để lắp ráp thành

phân tử protein

rRNA (RNA ribosom) chiếm một phần lớn thành phần của ribosom

Ribosom của tế bào procariôt chứa ba loại rRNA khác nhau : 16S, 5S và 23§

Ribosom của tế bào ơcariot có chứa bốn loại : 18S, 5S, 5,85 va 28S

Một bộ gen có chứa rất nhiều gen, những gen này sản sinh ra rất nhiều tRNA

và rRNA làm nhiệm vụ tổng hợp protein đối với tế bào E coli

Nhóm RNA quan trọng thứ ba là RNA thông tin (mRNA) mRNA sao chép từ các gen và lưu giữ các thông tin đặc trưng thứ tự các axit amin trong phân tử protein

Phân tử mRNA ở tất cả các cơ thể sinh vật đều kém bền vững so với các phân

tử rRNA và tRNA rRNA thì chiếm một phần lớn số lượng RNA trong tế bào còn mRNA chỉ chiếm một phần nhỏ (xem bảng 14.1)

Khi ta so sánh tốc độ tổng hợp các RNA của tế bào, nhận thấy một phần ba khả

năng tổng hợp nó thuộc về mRNA Khi vi khuẩn sinh trưởng chậm, các tRNA được

tự đổi mới thì tỷ lệ mRNA tổng hợp mới có thể đạt tới 60% Ở đây có sự sai khác

giữa tốc độ tổng hợp tương đối khác nhau của các RNA khác nhau Điều này chứng

tổ độ bền vững của các loại RNA trong quá trình trao đổi chất là khác nhau Cụ thể

là rRNA và tRNA là khá bền vững, trong khi đó thì mRNA chỉ sau một thời gian rất

ngắn làm nhiệm vụ dịch mật ¡nã đã bị phân giải Trong tế bào vi khuẩn, một nửa số

phân tử mRNA bị phân giải bởi nucleaza chỉ trong vòng 3 phút sau khi nố được tổng hợp Đối với sinh vật ơcariôt, chu kỳ sống bán phần của mRNA khoảng 10 giờ

Bảng 14.1: Thành phần RNA trong một tế bào

Ghi chi: Theo H Bremer va P.P Dennis (1987)

(1U RNA khởi động được dùng trong quá trình nhân đôi DNA, nó không phải là sản

phẩm của RNA polimeraza

(2) Trong số những RNA khác, người ta tìm thấy nhiều RNA enzim như là thành phần của RN-aza

(3) Tính theo phần trăm của tổng số RNA tổng hợp được

2 Tổng hợp RNA nhờ sự xúc tác RNA polimeraza

Stevens và Sweiss đã phát minh ra enzim có khả năng tổng hợp RNA nếu có đủ các chất ATP, UTP, GTP, CTP cùng với phân tử DNA làm mẫu Enzim mới này chính là RNA polimeraza, nó đảm nhận quá trình tổng hợp RNA theo mẫu của một

phân tử DNA, đó chính là quá trình sao chép

Phân tử RNA polimeraza trước tiên là nó nhận biết được địa điểm đặc biệt trên

phân tử DNA mẫu để gắn vào, nó tháo giãn phân tử DNA và tổng hợp ngay ở vị trí

đó một đoạn RNA khởi động, đoạn này sẵn sàng được kéo dài ra Enzim này sau đó

làm nhiệm vụ xúc tác để kéo dài mạch RNA theo kiểu đối kháng RNA polimeraza

có cấu trúc bậc 4 giống như DNA polimeraza, đó là một holoenzim Holoenzim

RNA polimeraza liên kết với những protein phụ trợ tạo thành một phức hợp sao

chép hay còn gọi là một bộ máy sao chép, bộ máy này dùng để tổng hợp RNA

Thành phần của phức sao chép thay đổi rất lớn tuỳ theo từng loài sinh vật, nhưng chúng xúc tác các phản ứng gần như cùng một kiểu

RNA polimeraza tách từ E.coli là một cấu trúc gồm 6 thành phần (hecxamere)

bao gồm 5 loại đơn vị cơ bản (xem bảng14.2)

Thành phần của nó bao gồm các loại đơn vị cơ bản sau :

- Hai đơn vị cơ bản œ, một đơn vị cơ bản 8”, một đơn vị cơ bản B, một đơn vị cơ bản ø và một đơn vị cơ bản œ Holoenzim bao gồm tất cả các đơn vị cơ bản tiến hành

các phản ứng sao chép Đơn vị cơ bản " chịu trách nhiệm cố định trên phân tử DNA,

256