Giáo trình sinh hoá học với cơ sở khoa học của công nghệ gen (giáo trình cao học nông nghiệp) phần 1

Lời giới thiệu Chương mười sáu Chương mười bảy : Cấu trúc và trao đổi của gluxit : Cấu trúc và trao đổi 1ipit : Hoá sinh của quang hợp : Năng lượng sinh học Bioenergetics : Màng sinh h

JIÊN KHOA HỌC KỲ THUẬT NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

a ~ HOANG VAN TIEN - LÊ KHẮC THẬN - Lf DOAN DIEN

CONG NGHE GEN

(GIAO TRINH CAO HOC NONG NGHIEP)

NHÀ XUAT BAN NONG NGHIEP

VIỆN KHOA HỌC KỸ THUẬT NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

HOÀNG VĂN TIẾN - LE KHAC THẬN - LÊ DOÃN DIÊN

Chi: bién : HOANG VĂN TIẾN

SINH HOA HOC

VOLCO SO KHOA HOC CUA CONG NGHE GEN

(Giáo trình cao học Nông nghiệp)

cat pect tát Tet? °

a a 2

TAP THE TAC GIA:

1 HOÀNG VĂN TIẾN : Chương 1;2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16,

Lời giới thiệu

Chương mười sáu

Chương mười bảy

: Cấu trúc và trao đổi của gluxit : Cấu trúc và trao đổi 1ipit

: Hoá sinh của quang hợp : Năng lượng sinh học (Bioenergetics) : Màng sinh học, cấu tạo và chức năng

: CO SG KHOA HOC CUA CÔNG NGHỆ GEN

:Cấu trúc axit nucleic, vai trò lưu giữ mật mã di

truyền của DNA : Cấu trúc của phân tử RNA

: Sinh tổng bợp DNA

: Quá trình sao chép thông tin (Transcription)

: Sinh tổng hợp protein (dịch mật mã di truyền)

: Điều hoà quá trình biểu hiện gen

: Chromosom của tế bào ơcariôt và sự thể hiện gen

: Miễn dịch học phân tử

: Công nghệ tái tổ hợp DNA (Công nghệ tái tạo tổ

hợp gen) : Ky thuat PCR, RAPD, RFLP và những ứng dụng trong nhan gen, lai ghép gen

LỜI GIỚI THIỆU

Nhằm cung cấp kịp thời tài liệu học tập chính thức cho đào tạo cao

học, nghiên cứu sinh và từng bước nâng cao chất lượng để hoà nhập với cộng đồng quốc tế về hai bậc đào tạo này Viện Khoa học kỹ thuật nông

nghiệp Việt Nam xin trân trọng giới thiệu giáo trình : “Sinh hoá học

với cơ sở khoa học của công nghệ gen” của tập thể tác giả : PGS.PTS

Hoàng Văn Tiến, GS.PTS Lê Khắc Thận và GS.TS Lê Doãn Diên do

PGS.PTS Hoàng Văn Tiến chủ biên Đây là cuốn sách được biên soạn

khá công phu từ các bài giảng chọn lọc của nhiều khoá đào tạo cao học,

trên cơ sở kế thừa những thành tựu mới của cộng đồng quốc tế về công

nghệ gen, kỹ thuật PCR, RAPD, RFLP Sinh hoá học hiện đại là cơ sở cho công nghệ sinh học, công nghệ gen - một trong những mũi nhọn của khoa học thế kỷ 21 Đây là lĩnh vực đang có tốc độ phát triển như vũ bão đã và đang có những tác động mạnh mẽ làm biến đổi sâu sắc trong sinh học, nông nghiệp và y học

Sinh hoá học là môn khoa học cơ sở cho nhiều ngành khoa học khác: Sinh lý học, Dinh dưỡng và thức ăn của cây trồng vật nuôi Sinh hoá học được ứng dụng, giảng dạy và học tập rộng rãi Tuy nhiên, ở nước ta nó

chưa được đầu tư thích đáng, đây là những hạn chế khách quan và chủ

quan trong biên soạn giáo trình này Mặc dầu tập thể tác giả đã làm việc

với tinh thần nỗ lực cao, nghiêm túc, song giáo trình chắc sẽ còn những

khiếm khuyết khó tránh Chúng tôi mong nhận được nhiều ý kiến đóng

góp của bạn đọc gần xa

Xin trân trọng giới thiệu cùng bạn đọc

: CƠ SỞ ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC

VIỆN KHKTNN VIỆT NAM

PHẦN MỘT

KIẾN THỨC CƠ SỞ

Chương một

CẤU TRÚC TẾ BÀO

Tuyệt đại đa số các cơ thể sống đều cấu tạo từ tế bào (trừ virut) Sinh hoá học là một ngành khoa học phối hợp giữa hoá học và sinh vật Nó nghiên cứu các quá trình

biến đổi hoá học xảy ra trong cơ thể sinh vật Phần lớn những phản ứng hoá học này

diễn ra trong tế bào Do đó muốn hiểu biết rõ về các quá trình sinh hoá xảy ra trong

cơ thể ta phải biết được cấu trúc và chức năng của từng bộ phận của tế bào

Tế bào thì rất đa dạng, ví dụ riêng cơ thể của con người được cấu tạo từ trên 200 loại tế bào khác nhau Mặc dù vậy tế bào sinh vật được chia làm 2 nhóm chính :

- Tế bào procariôt và

- Tế bào ơcariôt

Tế bào procariôt (theo tiếng Hy Lạp thì pro là trước, carion là hạt nhân) Tế bào này thường không có nhân rõ rệt, nó được bao bọc bởi một thành tế bào Tế bào procariôt điển hình như là xianobacte, tảo xanh lam, E.coli

Tế bào procariôt được xem là tổ tiên của tất cả sự sống trên hành tỉnh

Tế bào ơcariôt (theo tiếng Hy Lạp : ơ (eu) nghĩa là hạt, carion là nhân)

Tế bào ơcariôt có nhân rõ ràng, nó cấu tạo nên cơ thể động và thực vật probistes

và mycetes

l.COLI - MỘT MÔ HÌNH CÚA PROCARIÔT

Tế bào E.coli là một mô hình lý tưởng để các nhà sinh hoá học nghiên cứu Cấu

trúc của nó rất đơn giản, nuôi cấy nó rất dễ dàng và nó sinh sản rất nhanh

Bacteria gram âm E.coli trong đường ruột của người là một tế bào procariôt được

nghiên cứu kỹ lưỡng, tế bào có đường kính là lụt và chiều dài là 2u Nó được bao bọc

một lớp màng bên ngoài tiếp đến là màng tế bào hay là màng plasmic Những màng này

ngăn cản không cho tế bào phồng lên khi nồng độ các chất chứa bên trong tế bào lớn hơn ở ngoài tế bào Màng của E coli có thể chịu đựng được một áp suất thẩm thấu đạt tới 20 atm Màng của nó không chịu được những va đập về cơ học

Flagellcs và fimbriae là những sợi gắn vào màng của E.coli cũng như nhiều tế

bào vi khuẩn khác Flagelle (theo tiếng Latinh Flagel có nghĩa là cái roi da), nó

đảm nhận nhiệm vụ chuyển động của tế bào, chúng giúp đẩy tế bào E coli chuyển

động với tốc độ 50 H/giây Vì chiều dài của nó chỉ có 2k cho nên trong 1 giây nó

chuyển động được tới 25 lần chiểu dài của mình.

Fimbriae _— Pilus để giao phối

Hình 1.1

a Mô hình tế bào procariôt E coli dựa trên ảnh chụp qua kính hiển vi điện tử (Theo L.Shoemaker)

b Ảnh chụp qua kính hiển vi điện tử, nhát cắt của tế bào E coli thấy rõ :

- Màng bên ngoài của tế bào - (ME)

- Màng plasmic (MF')

- Vùng nhân (ế bào (N)

(Ảnh chụp của W.Van Iterson)

10

Pilus đảm nhiệm chức năng giao phối, còn fimbriae thì cho phép nó dính chặt

với bề mặt của vật khác

Màng tế bào hay còn gợi là màng plasmic được cấu tạo từ protein va lipit Màng

plasmic cho phép thấm qua một cách lựa chọn các chất dinh dưỡng, nó còn chứa các protein vận chuyển điện tử, có khả năng sản sinh ra năng lượng trong điều kiện hảo khí Hệ thống vận chuyển điện tử và hình thành ATP tồn tại ở màng tế bào của một

khác nhau có phân tử lượng bằng hoặc nhỏ hơn 100 chưa kể những hợp chất đại phan tử như protein và axit nucleic Cho đến ngày nay người ta biết được 200 loại

hợp chất khác nhau trong tế bào E.coli

Một tế bào E coli có chứa 15.000 ribôsôm, chúng làm nhiệm vụ tổng hợp

protein Mỗi một ribosôm có khả năng sản sinh ra 1 phân tử protein

Đối với E.coli cũng như một số tế bào vi khuẩn khác, DNA nằm ở vùng nhân, vùng này không có màng bao bọc khác với nhân của tế bào ơcariôt DNA của E.coli

là một phân tử có 2 mạch hình vòng chất đống Mỗi một mạch của DNA chứa đựng tất cả những thông tin cần thiết cho sinh trưởng và sinh sản của tế bào Trong quá

trình nhân đôi hai sợi tách nhau ra và chúng dùng để làm mẫu tổng hợp sợi bên kia

Như vậy là một tế bào được phân chia làm 2 tế bào Mỗi một tế bào con= đều mang

trong nó một sợi DNA của tế bào mẹ và một sợi mới tạo ra Trong xitoplazma của

phần lớn các vi khuẩn còn tìm thấy những đoạn nhỏ DNA hình vòng gọi là plasmid

Những thành phần này được dùng như là những công cụ không thể thay thế trong sinh vật học phân tử và công nghệ di truyền

CẤU TRUC TE BAO OCARIOT

Tế bào ơcariôt có cấu trúc phức tạp, nó chứa rất nhiều các cơ quan được bao bọc

bởi một màng và được chuyên hoá theo từng chức năng

Nhân tế bào có chứa 95% DNA của tế bào và là trung tâm điều khiển của tế bào

Nhân tế bào được bao bọc bởi màng tế bào và có nhiều lỗ Những lỗ này tạo thành một hệ phức tạp xuyên qua lớp vỏ của hạt nhân Cấu trúc phức tạp này điều khiển sự

vận chuyển protein, RNA qua lại trong nhân DNA trong nhân được tập trung thành một khối đậm đặc §ọi là chromatine bởi vì nó bắt màu rất đậm với một số thuốc

11

ình 1.3 Nhân tế bào ơcariôi

a Hinh vé theo L.Shoemaker

b Ảnh chụp nhát cất hạt nhân của tế bảo tuyến tuy chuột cống bạch qua kính hiển vi điện tử, thấy rõ ;

14

Mang ngoal / Mang trong

Mitochondri nơi mà các hợp chất lipit, gluxit và protit được oxi hoá (trong quá trình ưa khí)

để sản sinh ra năng lượng;

Hinh 1.5 Reticulum endoplasmic xu xi (RER)

Trên bé mặt của xitern của RER gắn nhiéu ribosom, làm nhiệm vụ tổng hợp protein, tích luỹ nó trong lòng mạch rồi mới xuất ra ngoài RER nối liền với màng ngoài của nhân té bao

a Hình vẽ theo L.Shoemaker

b Ảnh chụp qua kính hiển vi điện tử nhát cát RER của tế bảo gan chuột cống bạch

- Những điểm đen nhỏ là ribosem (R)

- Bộ máy Golgi (G)

- Lòng mạch (L)

Hình 1.7 ;

Bộ máy Golgi liên kết chặt với reticulum endoplasmic lam nhiém vu tich luy,

chế biến, vận chuyển các tiền tố của gluxit và lipit

a Hình vẽ theo L.Shoemaker

b Ảnh chụp qua kính hiển vi điện tử nhát cất tế bào máu của chuột cống bach Thấy rõ :

- Reticulum endoplasmic xt xi (RER)

- Vùng Xis (RC) của bộ máy Golgi

nhuộm Quá trình nhân đôi của DNA và quá trình sao chép các thông tin cla RNA

đều xảy ra ở trong hạt nhân Quá trình sao chép là giai đoạn đầu tiên nhằm thể hiện các thông tin di truyền, hoạt tính trao đổi đầu tiên diễn ra ở hạt nhân Những vùng khác của hát nhân có độ đậm cao gọi là nucléol Trong nucleol sẽ tiến hành quá trình tổng hợp RNA và lắp ráp các ribosôm

Mitochondri là nơi sản sinh ra năng lượng trong quá trình ưa khí

Mitochondri giống như là hạt nhân, nó có 2 lớp màng bao bọc : màng bên ngoài trơn nhắn còn màng bên trong thì gấp xuống thành nhiều lớp được gọi là cretes Những

màng này thường rất đàn hồi cho nên hình dáng của mitochondri rất khác nhau nhưng nhìn chung nó có dạng hình bầu dục Dịch thể bên trong là matrice Ở đó có rất nhiều ribosôm và nhiều phân tử DNA mạch vòng Mitochondri ôxy hoá triệt để gluxit, axit

béo và axit amin, năng lượng giải phóng ra dưới dạng hoá năng và được lưu giữ trong

các phân tử ATP Số lượng mitochondri thay đổi tuỳ theo loại tế bào Ví dụ tế bào gan

có chứa từ 800 tới > 2.500 và chiếm khoảng 20% thể tích của tế bào

Tế bào ơcariôt còn có rất nhiều màng tạo thành một hệ thống truyền dẫn bên

trong những cơ quan chuyên môn Hệ thống này có vai trò trong quá trình tổng hợp,

vận chuyển, dự trữ và bài tiết protein

Reticulum endoplasmic (RE) tạo thành một mạng lưới màng liên tục trong tế

bào ơcariôt Những màng này và các phần dịch chứa trong nó có tên là xiterne Xung quanh hạt nhân RE được nối với màng ngoài của hạt nhân Vùng này của RE được ghép nối với ribosôm và đặc trưng cho cái gọi là reticulum endoplasmic xù xì

(RER), ở đây xảy ra quá trình tổng hợp lipit màng và protein xuất ra ngoài Những

chất này sẽ được chuyển qua màng của RE theo dòng của xitirne, ở đó chúng được

chế biến trước khi được xuất ra ngoài tế bào

Reticulum endoplasmic trơn (REL) không chứa nhiều ribosôm, nó tham gia vào quá trình tổng hợp lipit đồng thời trong quá trình làm thay đổi và vận chuyển protein được giải phóng ra từ RER

RE nhìn chung liên hệ rất chặt chế với bộ máy Golgi Hệ thống màng của nó bao gồm một loạt các túi Golgi day dịch thể Trong bộ máy Golgi các tiền tố của gluxit

và lipit sẽ gắn với protein để tạo thanh glycoprotein và lipoprotein Các bọng bài tiết thường nằm ở sát màng plasmic

Phần lớn các tế bào động vật đều chứa các bọng tiêu hoá, đó là những lisosôm

(xuất phát từ tiếng Hy Lạp lisis có nghĩa là phân giải), nó chứa toàn bộ các enzim Lisosôm có khả năng phân giải các phân tử của chính tế bào, ví dụ như các protein,

các axit nucleic cũng như là các vi khuẩn thâm nhập vào tế bào bằng các con đường

khác nhau Những bọng xitoplasmic khác chứa những vật liệu ngoài tế bào Khi tế bào chết, lisosôm sẽ giải phóng ra các enzim, thuỷ phân tất cả các thành phần chết 18

Bộ xương tế bào (Cytosquelette) tao cho nó có hình dáng nhất định Đó là những chất protein tạo thành một lưới có cấu trúc

Cấu trúc của tế bào thực vật có nhiều điểm giống với tế bào động vật

Điểm khác rõ rệt nhất là chloroplast đảm nhận chức năng quang hợp (xem hình 8)

Vacuol được bao bọc bởi một màng đơn giản nó chứa các dịch dự trữ các muối khoáng, gluxit hoà tan và protein

Tế bào thực vật đặc biệt có chioroplast chịu trách nhiệm quá trình quang hop.”

Màng tế bào được cấu tạo từ xenluloza cứng Có các vacuol là những khoảng không lớn, nơi lưu giữ

những phế thải của tế bào

a Hinh vẽ theo L.Shoemaker

b Ảnh chụp qua kính hiển vi điện tử nhát cắt của tế bào thực vật Spirodela Thấy rõ :

Vacuol (V) Chloroplast (C) Nhân tế bao (N) (Theo K.R.Porter)

19

Chương hai

AXITAMIN_ˆ

Axit amin là thành phần cơ bản cấu tạo thành phân tử protein Phân tử axit amin

có chứa cả chức năng axit và nhóm amin ở vị trí œ so với nhóm COOH

Axit amin có công thức tổng quát như sau :

PHAN LOAI AXIT AMIN

Axit amin có hai cách phân loại :

- Phân loại theo cấu trúc hoá học

- Phân loại theo giá trị dinh dưỡng

I PHAN LOAI THEO CẤU TRÚC HOA HOC

A Axit amin cé mach hidrocacbon

1 Glixin (Gly) hay la glicocol - hay la axit a-amino-axetic

H - CH - COOH

NH,

Glixin rất phổ biến trong các phân tử protein, nhất là trong phân tử gelatin Trong phân tử protein sợi tơ tằm, glixin chiếm từ 25% đến 40% tổng các axit amin Glixin còn tham gia vào thành phần của axit mật

Mặt khác glixin còn tham gia vào quá trình giải độc ở gen như trường hợp với

axit benzoic, nó tạo thành hợp chất N-benzoil-glixin rồi thải ra ngoài

2 Alanin (Ala) hay la a-amino - propionic )

CH, =R -COOH cũng là một axit amin rất phổ biến

NH), 20

Trong phân tử Co-enzim A còn tồn tại phân tử -alanin

B Axit amin có chứa chức năng rượu

1 Serin (Ser) hay là axit œ - amino - B - hydroxi - propionic

CH,~ CH - COOH

OH NH, Nhóm OH thường bị este hoá bởi axit phosphoric để tạo thành phosphoserin, đặc trưng cho phân tử phosphoprotein như là vitelin trong lòng đỏ trứng gà

Hà - m - COOH

Q NFL

HO - ĩ =O

OH Một số kháng sinh là dẫn xuất của serin ví dụ như : cloramphenicol, xicloserin,

aZaserin

2 Treonin (Tr) hay là axit œ-amino-B-hydroxi-butiric

CHỊ GH = C= 00H

OH NH, Treonin là axif amin không thay thế đối với người

21

€ Axit amin chứa lưu huỳnh

1 Xistin (Cys) hay là axit-œ-amino mercapto-propionic Khác duy nhất với

serin là ở vị trí OH của nó được thay thế bằng nhóm SH

Nhóm thiol (SH) có vai trò quan trọng trong một số enzim Khi nhóm SH bi

phong bế hoặc bị oxy hoá tạo thành cầu disulfur thì enzim mất hoạt tính Sự trùng

hợp tạo thành axit amin xistin

2 Metionin (MeU) hay là axit œ amino-y-mercapto-butiric

CH, — CH, - ie -— COOH

CH;

Metionin cũng là axit amin không thay thế đối với người và có trong rất nhiều loại

protein Nó làm nhiệm vụ cung cấp nhóm metil trong nhiều phản ứng khác nhau

D Axit amin có hai chức năng axit và các amit cla nó

1 Axit aspactic (Asp) hay axit amino sucxinic và dạng B-amit của nó là asparagin

HOOC - CH; - CH — COOH ~ — CH, - = — COOH

Axit aspactic Asparagin

2 Axit glutamic (Glu) hoặc là axit-œ-amino-glutaric và y-amit của nó là

glutamin (Glu)

Y B a .HOOC -CH; - CH; — va — COOH pe — CH, - CH, - a — COOH

Axit glutamic Glutamin

Các loại axit aspactic và glutamic rất phổ biến trong các phân tử protein Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển amin (transamination) ở các phản ứng sinh tổng hợp axit amin

22

Hai loại axit này thường có hàm lượng tương đương trong nhiều loại protein

Chúng còn giữ vai trò dự trữ nitơ amin dưới dạng glutamin ở người và động vật

E Axit amin kiém tinh

Có 3 loại axit amin kiểm tính :

1 Lizin (Lys) hay là axit œ-e-diamino-caproic, nó có nhóm amin thứ 2 ở vị trí

Lizin là axit amin không thay thế đối với người và động vật

Cs = ou, ~ tH, - ễu, = I8 - COOH

trong một số protein (colagen, gêlatin) người ta tìm thấy hydroxilizin)

2 Arginin (Arg) hay là axit œ-amino-ồ-guanidino-valeric Giống như lizin, arginin

chứa rất nhiều trong các protein kiểm tính trong nhân của tế bào như là histon và prolamin (trong thành phần của một số prolamin, arginin chiếm tới 80, 90%)

Arginin đóng vai trò quan trọng trong chu trình sinh tổng hợp urê trong cơ thể Mặt khác hợp chất arginin-phosphat làm nhiệm vụ dự trữ năng lượng ở loài động vật không xương sống, như là creatin-phosphat ở loại động vật có xương sống

G Axit amin có chứa phân tử phenil (axit amin thom)

1 Phenilalanin (phe) hay là axit-œ-amino-B-phenil-propionic

&P - Ch, - GH- COOH

NH, Phenilalanin là một axit amin không thay thế với người và động vật

2 Tirosin (Tyr) hay là axit œ-amino (para-hydroxi-phenil) - propionic, vì nó

có nhóm phenol nên axit này mang tính chất axit yếu

Chuyển hoá tirosin tạo ra những hợp chất quan trọng như các sắc tố (melanin)

các hoocmon (như là adrenalin, tirosin)

3 Triptophan (Trp) hay là axit œ-amino indol-propionic hay là B-indolil-

H Axit amin có mạch vòng không đồng nhất

Prolin (Pro) hay là axit pirolidin-2-cacboxilic và dẫn xuất của nó là hydroxi prolin

HO ~ =

Prolin Hydroxi prolin

Hai loại axit amin này chỉ chứa nhóm imin (NH) prolin rất phổ biến trong các protein, còn hydroxi prolin thì có mức độ kém hơn

24

Ngoài 21 loại axit amin phổ biến nêu trên, đôi khi còn tìm thấy một số loại axit amin hiếm, chúng xuất hiện ở dạng tự do hoặc liên kết trong phân tử protein ví dụ như trong một số peptit có hoạt tính kháng sinh người ta tìm thấy tiroxidin,

gramixidin, baxitraxin

II PHÂN LOẠI THEO GIÁ TRỊ DINH DƯỠNG

Theo D.Soltner (1987) 21 loại axit amin có thể chia làm 2 nhóm đó là :

- 12 loại axit amin có thể thay thế được và 9 loại axit amin không thay thế :

Axit amin không thay thế Axit amin có thể thay thế

6 Lizin 6 Axit aspactic

7 Phenilalanin 7, Axit glutamic

amin có thể được chia làm 3 nhóm, bao gồm :

- 10 axit amin không thay thế

- 3 axit amin bán thay thế

- 6 axit amin có thể thay thế được

Nhóm axit amin không thay thế

1 Arginin 4 Lơxin 7 Phenilalanin 10 Valin

'2 Histidin 5 Lizin ~8 Treonin

3 Izolơxin 6 Metionin 9 Triptophan

Nhóm axit amin bán thay thế Nhóm axit amin có thể, thay thế

1 Xistin 1 Alanin

2 Glixin 2 Axit aspactic

3 Tirosin 3 Axit glutamic

4 Hydroxi prolin

5 Prolin

6 Serin

25

Sở dĩ người ta gọi là bán thay thế bởi vì nếu cơ thể thiếu xistin thì nó có thể

dùng metionin để tổng hợp thành xistin, nếu cơ thể thiếu tirosin thì nó có thể dùng phenilalanin để tổng hợp ra tirosin Vì lẽ đó trong các bảng nhu cầu về axit amin

người ta thường viết metionin + xistin

CÁC TÍNH CHẤT LÝ HOÁ HỌC CỦA AXIT AMIN

I CÁC TÍNH CHẤT VẬT LÝ CỦA AXIT AMIN

1 Đồng phân quang học

Tất cả các axit amin trừ glixin có hai H ở vị trí :nguyên tử cacbon, tất cả 20 axit

amin còn lại đều có nguyên tử cacbon œ bất đối xứng (có nghĩa là bốn hoá trị của

nó liên kết với bốn nhóm khác nhau) Ví dụ như ở hình 2.1 biểu diễn cấu trúc không

gian của phân tử alanin ta thấy rõ đồng phân quang học của phân tử là hình ảnh đối

chiếu qua gương cấu trúc không gian của nó

no Gown - Công thức Gagne

CHO H-C - OH Cong ints ais Cc luả «LÍ

HO -C-H | ' mặt phẳng H;N -C-H | H-C- NH;

| CH;OH ' ’ | | CH;OH CH, _ €Hạ

L-glixeraldehit D-glixeraldehit L-alanin D-alanin

Hình 2.1 Công thức không gian và công thức mặt phẳng của glixeraldehit và alanin

Có thể phân biệt hai dạng đồng phân quang học đó là D và L theo cấu trúc không gian tương đồng với D và L glixeraldehit Cấu trúc không gian thường khó vẽ cho nên người ta chấp nhận công thức trên mặt phẳng theo đề nghị của Fischer

Theo qui ước này thì tất cả các axit amin dạng D đều có nhóm NH; ở phía bên

~phải, các axit amin dạng L thì có nhóm NH; ở phía bên trái

Tất cả các axit amin cấu tạo nên phân tử protein đều thuộc dạng L Song trong

một số loại peptit của vi khuẩn, nhất là những loại có trong thành phần màng tế bào

và một số peptit có hoạt tính kháng sinh, người ta tìm thấy các axit amin dạng D

26

2 Khả năng hấp thu tỉa tử ngoại

Các axit amin có khả năng hấp thu tia tử ngoại có độ dài bước sóng là 230nm Một số axit amin khác có khả năng hấp thu tia tử ngoại có bước sóng 250 đến 300nm là vì trong mạch R của nó có chứa gốc phenil (như tirosin) hoặc là nhân indole (như là triptophan) Nhờ tính chất này, nếu ta có dung dịch protein không

mầu, ta có thể xác định hàm lượng của nó bằng máy quang phổ tử ngoại

3 Sự ion hoá các axit amin

Tất cả các axit amin đều có 2 nhóm có thể dễ dàng bị ion hoá đó là nhóm COOH

va nhém NH)

Một khi ta thay đổi độ pH của một dung dịch axit amin từ axit sang kiểm thì cấu

trúc của phân tử axit amin thay đổi như sau :

-H* -H†

*HạN - lấy -COOH => *H3N- “ -COO —— H;N - i - COO™

Cation (pH axit) Zwitterion Anion (pH kiém)

dién tich = +1 điện tích = 0 điện tích = -l

Khi đạt đến độ pH nào đó phân tử axit amin có 2 cực (Zwitterion) và có điện

tích bằng 0 đó chính là điểm đẳng điện của phân tử axit amin Ở điểm này độ hoà tan là tối thiểu, nếu đặt trong môi trường điện di, các phân tử cũng không chuyển

động `

Người ta có thể dễ dàng nghiên cứu độ phân ly của các phân tử axit amin bằng

cách bổ sung các dung dịch HCI và NaOH, sau đó đo độ pH sau mỗi lần bổ sung Bằng cách này người ta có thể vẽ được đường cong chuẩn độ, nhờ đó ta phân biệt

axit amin trung tính, kiểm tính và toan tính

II MỘT SỐ TÍNH CHAT HOÁ HỌC CỦA AXIT AMIN

1 Phản ứng với nhóm amin

Đối với các axit amin có gốc là phân tử phenil sẽ phản ứng với dinitrophenil (DNP)

Người ta dùng phản ứng này xác định axit amin từ đầu N của phân tử protein

27

Phản ứng của 1-fluoro 2-4-dinitrobenzen với nhóm amin của axit amin đầu N

của phân tử protein

2 Phản ứng với ninhidrin

Sản phẩm có màu xanh da trời

Qua phản ứng thấy rõ phản ứng này xảy ra theo nhiều giai đoạn Sản phẩm cuối cùng tạo ra có màu xanh da trời

Độ thấm, nhạt của dung dịch mầu tuỳ thuộc vào nồng độ axit amin Ngày nay người ta dùng phản ứng này để định lượng các axit amin trong máy phân tích axit amin tự động với độ nhạy cao

28

Chương ba

CẤU TRÚC BẬC MỘT CỦA PEPTIT VÀ PROTEIN

Từ “protein” xuất phát từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là điều quan trọng thứ nhất Thực tế, protein là thành'phần rất quan trọng của tế bào sống Nếu tính theo vật chất khô, protein chiếm một tỷ lệ khá lớn (tuỳ thuộc vào loại cơ thể sống) trong thành phần các cơ thể sống Protein đóng vai trò cấu trúc cơ bản của sự sống Toàn bộ quá trình trao đổi chất là nhờ các hoạt động enzim, mà các enzim đều có bản chất là

Trong thành phân protein có 4 nguyên tố chính là C, H, O và N, rất nhiều

protein có chứa lưu huỳnh và một số ít protein chứa phospho Hàm lượng N trong các phân tử protein động vật thường là 16%, tỷ lệ này thay đổi từ 16,5 đến 19%

trong các nguồn protein thực vật

Song ngày nay người ta chấp nhận tỷ lệ 16% là chung cho tất cả các nguồn

protein do đó chỉ cần xác định lượng N rồi nhân với hệ số 100/16 = 6,25 ta thu được

hàm lượng protein thô

Protein là hợp chất có phân tử lượng lớn bao gồm các axit amin Protein được

với nhau bằng mối liên kết peptidic Mối liên kết này có một tương đồng trong phân

tử biuret khi tiến hành trùng hợp 2 phân tử urê tạo ra

NH;-CO-NH; + NH,-CO-NH; + NH, + NH;-CO-NH-CO-NH,

Chính vì lẽ đó khi bổ sung CuSO, và dung dịch polipeptit trong môi trường kiểm

sẽ tạo thành màu xanh lục - ta gọi là phản ứng biuret Peptit được chia làm 2 loại :

- oligopeptit - bao gồm dipeptit (2 gốc axit amin) tripeptit (3 gốc axit amin) thường không cho phản ứng biuret

29

- polipeptit, bắt đầu từ tetrapeptit (bao gồm 4 gốc axit amin) đều cho phản ứng

biuret

Độ lớn của phân tử polipeptit là bao nhiêu thì được gọi là phân tử protein là chưa

thật rõ ràng Thông thường những phân tử polipeptit có phân tử lượng lớn hơn

10.000 và không vượt qua được màng xelophan thì được gọi là phân tử protein

Một khi đã tách chiết được một phân tử protein hay một peptit thì trước tiên cần

phải nghiên cứu thứ tự các axit amin trong phân tử đó như thế nào - đó chính là cấu

trúc của phân tử protein hay peptit

1 NGHIÊN CỨU THANH PHAN AXIT AMIN

1 Thuy phan protein

Để cắt mạch peptit, có thể dùng axit, kiểm hoặc các enzim Người ta không thể dùng enzim để thuỷ phân hoàn toàn một phân tử protein Thuỷ bằng kiểm sẽ làm

biến dạng hoặc thay đổi cấu trúc của một số axit amin Có thể thuỷ phân protein trong dung dịch 6N HCI ở 105°C trong ống nghiệm hàn kín hút chân không hoặc

trong môi trường nitơ với nồng độ protein rất thấp :ừ 0,5 đến 1% trong thời gian 24

giờ Phương pháp này cũng có những nhược điểm là làm chuyển hoá glutamin và

asparagin thành các axit dicarboxylic tương ứng đồng thời phá huỷ cả tryptophan

Để xác định triptophan ta phải dùng axit methane-sulforic thuỷ phân Cũng có thể

thuỷ phân bằng kiểm để xác định triptophan

2 Phân tích axit amin

Ngày nay để xác định các axit amin người ta dùng 3 loại phương: pháp sắc ký và

đã được tự động hóa gần như hoàn chỉnh

a) Sắc ký trên như trao đổi ion

Phương pháp này cho phép phân chia các axit amin thành 3 nhóm :

- Các axit amin toan tính Sẽ được nhựa trao đổi anion như Dowex2, Amberlite

IRA-400 lưu giữ lại

Nhựa -NH;°OH' + R-COOˆ -› Nhựa -NH;° OOC-R + OH-

- Các axit amin kiểm tính sẽ được các nhựa trao đổi cation (như Dowex 50 hay

là Amberlite IRC 50) lưu giữ

Nhựa -§SO; -Na°+R-NH;`” -> Nhựa -SO; *HạN-R + Na!

- Các axit amin trung tính không bị các nhựa trên lưu giữ

30

Stein và Moore lần đầu tiên đã dùng nhựa polistiren sulfonê (SO; Na’) ở độ pH

thấp, tất cả các axit amin đều ở dưới dạng cation (R-NH;") và được lưu giữ trên

đỉnh cột

Dung dịch protein sau khi thuỷ phân, lọc sạch rồi đưa lên cột, dùng các dung

dịch đệm xitrat có độ pH và lực ion táng dần để tách các axit amin khỏi cột Các axit amin tách ra tạo thành các tiểu phần, dùng thuốc thử ninhidrin để định lượng hàm lượng từng axit amin trong mẫu Kết quả thu được sẽ do máy tự động ghi trên

băng giấy dưới dạng các pic

Qua hệ thống máy tính, diện tích các pic sẽ được thể hiện bằng số lượng tuyệt đối các axit amin

Sắc ký đồ của một mẫu hỗn hợp các axit amin

Bằng phương pháp sắc ký cột với nhựa trao đổi ion polystiren sulfanat (ví dụ như Dowex 50) đã tách được

các axit amin khác nhau từ dịch thuỷ phân protein Aspartat có mạch nhánh axit nên xuất hiện đầu tiên

Trong khi đó arginin có mạch nhánh kiềm, xuất hiện cuối cùng

Trên nguyên tắc của stein và Moore, ngày nay người ta tạo ra nhiều máy tự động khác nhau để phân tích thành phần axit amin

b) Sắc ký khí Phương pháp này mới được phát hiện gần đây dùng để tách hỗn

hợp các axit amin Trong phương pháp này người ta phải chuyển tất cả các axit amin

sang dạng bay hơi bằng các phản ứng hoá học lên các cực của nó Ví dụ, metil hoá

các nhóm amin, dùng rượu hoặc phenol este hoá các nhóm COOH Sau đó chúng

được thổi qua một ống dài 2 m, đường kính 0,1mm, phía trong của ống được bao phủ bằng một màng chất lỏng Ống này được nung nóng lên 100 đến 200°C Các axit amin một phần được hoà tan trong phase lỏng không bay hơi, và một phần bay

hơi Khí mang (gaz vector) sẽ kéo theo các axit amin ra khỏi ống với tốc độ khác

nhau phụ thuộc vào độ hoà tan của chúng trong phase lỏng Có nhiều loại máy sử

31

dụng nguyên lý này để xác định hàm lượng axit amin Độ nhạy của máy đạt đến

mức độ picomole (picomole = 10”? mol)

e) Sắc khí hấp thụ

Phương pháp này mới được phát hiện gần đây, đó là sắc ký hấp thụ dạng lỏng-

chắc với độ phân giải cao với tên "Sắc ký lỏng hiệu năng cao” (High performance

liquide chromatography) Đôi khi còn gọi là "Sac ky long cao 4p" (HPLC)

Tất cả các axit amin được chuyển thành dẫn xuất aromatic bằng các phản ứng

ngay Thời gian phân tích một mẫu hỗn hợp các axit amin khoảng 25 đến 30 phút

Trong khi đó nếu dùng phương pháp nhựa trao đổi ion thì phải mất gần 10 giờ để có

thể phân tích hỗn hợp 17 axit amin

THỂ HIỆN KẾT QUẢ

Kết quả phân tích thành phần axit amin có thể được thể hiện bằng 2 cách chính sau :

- Tính hàm lượng axit amin trong 100g protein hoặc tính hàm lượng từng axit amin trong Ikg mẫu đem phân tích (ví dụ 1kg gạo, 1kg ngô, lkg bột cá, 1kg khô

dầu đỗ tương v.v )

32

- Khi biết rõ phân tử lượng của phân tử protein mà ta đem phân tích, kết quả thu

được sau khi làm tròn số có thể biết được trong phân tử protein có bao nhiêu gốc

các axit amin Ở đây dùng từ "gốc" axit amin vì khi tạo thành mạch polipeptit thì cứ

mỗi axit amin (trừ các axit amin đầu và cuối) sẽ giảm bớt một phân tử nước Ví dụ phân tử protein œ-corticotrophin của cừu có công thức thô như sau : Ala 3, Arg3,

Asp2, Glu5, Gly3, His1, Leul, Lys4, Metl, Phe3, Pro4, Ser 3, Trp1, Tyr2, Val3

II NGHIEN CUU THUTUCAC AXIT AMIN TRONG MACH POLIPEPTIT

VA PHAN TUPROTEIN

Trên nguyên tắc một mạch polypeptit bao giờ cũng tồn tại 2 đầu, một đầu NH2

và đầu kia là nhóm COOH Nếu trong phân tử protein ta tìm thấy 2 đầu NH; và 2 đâu COOH, có nghĩa là nó bao gồm 2 mạch polipeptit ; nếu không tìm thấy một đầu nào, có nghĩa là phân tử protein này có mạch polipeptit cấu trúc vòng, nếu tìm thấy

1 đầu (NH; hay COOH) có thể kết luận phân tử này có cấu trúc bán vòng ; còn nếu tìm thấy 2 đầu thì rõ ràng là phân tử protein chỉ gồm một mạch polipeptit duy nhất

SA ¬ ~

1 mạch polipeptit

Mạch vòng Mạch bán vòng

Hình 3.2 Sơ đồ cấu trúc hình thái phân tử protein

Mạch polipeptit có cấu trúc tổng quát như sau :

trong mạch polipeptit có thể bát đầu từ đầu N hoặc từ đầu C

1 Xác định axit amin trong mach polipetit tir dau N

Có nhiều phương pháp xác định nhóm œ-amin (œ-NH;) tự do, song trong cuốn sách này chỉ giới thiệu 3 phương pháp gồm : 2 phương pháp hoá học và một phương

33

a) Phương pháp dinitrophenil-aminoaxit của Sanger

Khi nghiên cứu tính chất hoá học của axit amin ta đã thấy rõ nhóm œ-amin có thể trùng hợp với dinitrofluobenzen Trong mạch polipeptit chỉ có một nhóm œ-amin tự do

Ở đầu N, khi trùng hợp sẽ tạo thành dinitrophenil-polipeptit Mối liên kết này rất

vững bến, do đó khi ding HCI dé thuỷ phân protein sẽ giải phóng ra tất cả các axit amin tự do cùng với axit amin nằm ở đầu N dưới dạng dinitrophenil-aminoaxit

(DNP-aminoaxit) Sau đó bằng phương pháp sắc ký có thể dễ dàng nhận biết tên của

b) Phương pháp phenilthiolidantoin của Edman

Về nguyên tắc của phương pháp này có dịp để cập ở phần trước Sơ đồ phản ứng

như sau :

Mạch polypeptit + phenilthioxianat —> phenilthiodantoin + mạch polipeptit

với đầu N là axit amin tiếp theo Khác với phương pháp trước phải thuỷ phân hoàn toàn phân tử protein để giải phóng ra axit amin đầu N Phương pháp này cho phép sau khi polipeptit phản ứng

với phenilthioxianat ở đầu N và làm cho mối liên kết peptit giữa axit amin đầu N với mạch polipeptit trở nên yếu, do đó dễ dàng bị tách ra khi đưa hỗn hợp vào môi

trường axit, đồng thời giải phóng nhóm œ-NH; của axit amin kế tiếp nó (xem phản

ứng) Nếu coi axit amin đầu N là thứ nhất thì sau phản ứng này sẽ tạo ra nhóm a-

amin tự do của axit amin thứ 2 Sau khi tách khỏi mạch polipeptit, bằng phương

pháp sắc ký có thể nhận biết được axit amin ở đầu N

Tiếp tục dùng phenilthioxianat để phản ứng với axit amin thứ 2 rồi lại tách ra và nhận biết bằng sắc ký

Phương pháp này gọi là phương pháp phân giải phản hồi, dùng nó có thể xác định thứ tự của các axit amin bắt đầu từ đầu N Ngày nay quá trình này đã được tự động hoá

trong máy có tên là "Máy xác định thứ tự của các axit amin" (Sequenator)

©) Xác dịnh thứ tự các axit amin bằng enzim aminopeptidaza

Enzim này chỉ thuỷ phân mạch peptit của axit amin đứng ở đầu N Sau khi tách

được axit amin thứ nhất nó sẽ giải phóng ra axit amin thứ 2 với nhóm NH; tự do

Bằng phương pháp này có thể xác định được thứ tự các axit amin từ đầu N, song

tốc độ của phản ứng chậm do đó khó có thể dùng để xác định đây đủ thứ tự các axit

amin trong một mạch polipeptit xuất phát từ đầu N

2 Xác định axit amin từ đầu C

Có hai phương pháp xác định polipeptit từ đầu C

a) Phuong pháp dùng hidrazin

Khi xử lý phân tử protein với hidrazin ở 100°C, tất cả các mạch peptit của nó bị

cắt đứt, tất cả các gốc axit amin được chuyển thành phân tử hidrazit trừ axit amin

nằm ở đầu C được giải phóng ra dưới dạng tự do, sau đó tách ra và nhận biết nó

b) Xác định thứ tự các axit amin từ dầu C bằng enzim cacboxipeptidaza

Đây là một phương pháp tuyệt vời để xác định axit amin từ đầu C Enzim cacboxipeptidaza của tuyến tụy thủy phân axit amin ở đầu C rồi giải phóng axit

trong một mạch polipeptit Vì có một số mối liên kết peptit giữa những axit amin

khác nhau, đồi hỏi một thời gian khá lầu để enzim có thể thuỷ phân được

Cả hai phương pháp dùng enzim aminopeptidaza và cacboxipeptidaza chỉ cho kết quả tốt khi phân tử protein chỉ bao gồm một mạch polipeptit Trường hợp phân tử

protein bao gồm nhiều mạch polypeptit thì kết quả thuỷ phân bằng enzim sẽ cho

nhiều axit amin khác nhau

35

3 Số lượng các mạch polipeptit trong phân tử protcin

Khi phân tích các nhóm đứng đầu của mạch polipepit trong một phân tử protein,

sẽ xây ra hai trường hợp như sau :

- Các mạch polipeptit giống nhau (do đó chỉ tìm thấy một axit amin ở đầu N và

một axit amin ở đầu C) Do đó chỉ cần xác định thứ tự các axit amin của một mạch

polipeptit ta có thể biết được cho toàn bộ phân tử protein

- Trường hợp thứ hai là : tìm thấy số axit amin đầu N và dau C nhiều hơn 1, điều

đó có nghĩa là phân tử protein bao gồm từ 2 mạch polypeptit (nếu là 2 axit amin đầu

N và 2 axit amin đầu C) hoặc nhiều mạch polipeptit (nếu tổng số các axit amin đầu

€ và đầu N nhiều hơn 2)

Việc đầu tiên trong trường hợp này là phải tiến hành tách các mạch polipeptit sau đó tiến hành phân tích thứ tự các axit amin của từng mạch polipepUit

Phương pháp tách các mạch polipeptit tuỳ thuộc vào mối liên kết giữa các mạch

đó Ví dụ, nếu các mạch liên kết với nhau bằng lực ion, hydro hay Vander Waals thì

chỉ cần thay đổi độ pH hay thay đổi lực ion, hoặc dưới tác dụng của một số hoá chất

như urê, guanidin thì có thể tách được các mối liên kết này

Trường hợp là các mối liên kết disulfit qua gốc xystein

Ví dụ :R-S-S-R'-> R-SO;H + R-§SO;H

thì phải tiến hành bằng phương pháp oxi hoá Sau khi các mạch polipeptit đã được

tách ra, dùng phương pháp tách tiểu phần đẻ thu nhận từng mạch riêng biệt

4 Xác định thứ tự các axit amin trong mach polipeptit

Trên đây đã nghiên cứu các phương pháp xác định thứ tự các axit amin từ đầu C

và từ đầu N Tuy vây các phương pháp này chỉ có thể xác định được một mạch polipeptit gồm một số gốc axit amin nhất định Do đó muốn xác định thứ tự các axit amin trong một mạch polipeptit dài, người ta phải thuỷ phân mạch đó thành những đoạn nhỏ dipeptit, tripeptit Xác định thành phần các peput nhỏ rồi lấp ghép các mạch peptit với nhau theo nguyên tắc trò chơi "đôminô”

Ví dụ ta có một hexapeptit có công thức chung là AB;C;D Theo phương pháp DNP-amino axit của Sanger cho biết A là axit amin đầu N Bằng phương pháp cacboxipeptidaza xác định được B là axit amin ở đầu € và tiếp đó là axit amin C Từ

kết quả này cho phép xác định bước đầu thứ tự các axit amin như sau :

A(BCD)CB

Sau đó dùng các phương pháp hoá học hoặc các enzim để tách hexapeptit thành

các dipeptit và tripeptit

36

Tác nhân cắt mạch polipeptit Vị trí mạch peptit bị cắt

Hoá chất

- Xyanogen bromit Nhóm cacboxIl của metionin

- Hydroxilamin Mối liên kết giữa arginin-glizin

- 2 nitro-5-thioxianobenzoat Liên kết peptit cạnh gốc xistein

- Tripsin Nhóm cacboxil của lizin và arginin

- Clostripain Cacboxil cia arginin

- Proteaza cua staphicocus Cacboxil cia aspartac va glutamat

Dùng phương pháp điện di, sắc ký trên cột trao đổi ion có thể tách được các

peptit đó, sau đó tiến hành xác định thành phần các axit amin rồi tiến hành lấp ghép

Sanger - nhà sinh hoá người Anh đầu tiên trên thế giới đã xác định đây đủ thứ

tự các axit amin của phân tử protein - insulin Công trình này tác giả phải tiến hành trong 10 năm và ông đã nhận được giải thưởng Nobel vào năm 1956 Ngày nay

người ta đã biết được thứ tự các axit amin của rất nhiều phân tử protein khác nhau

như các hoocmon: oxitoxin, vasopressin, glucagon ; các enzim: lisozim,

ribonucleaza ; globin; xitochrom C

Các axit min kết hợp trong phân tử polipeptit theo bất kỳ thứ tự nào Ví dụ chỉ

có 3 axit amin ABC ta đã có 6 mạch polipeptit khác nhau là:

ABC, ACB, BAC BCA, CAB, CBA

Trong tự nhiên có 21 loại axit amin, do đó số lượng phân tử protein có cấu trúc khác nhau là rất lớn Vấn đề này ta sẽ nghiên cứu kỹ khi tìm hiểu về quá trình sinh

tổng hợp protein trong cơ thể sinh vật

6 Khả nang hấp thu axit amin

Khi các axit amin đã được điều chế tinh khiết, thì có thể dùng chúng tiêm

truyền trực tiếp vàớ cơ thể người hoặc động vật Ngày nay người ta có thể dùng hỗn

hợp các axit amin bao gồm từ 11 đến 18 loại khác nhau với những tên thương phẩm khác nhau, song thông dụng được gọi với từ dân dã là dung dịch đạm Ví dụ như Bes(amin 5% của Cộng hoà liên bang Đức, hoặc Moriamin của Nhật

Dưới đây là thành phần của dung dịch Bestamin 5% dùng để tiêm truyền tĩnh mạch có thành phần bao gồm 5% axit amin trong dung dịch Sorbitol 50 g/lit

CH;OH

| H-C- OH

HO -C-H H-C-OH H-C-OH CH,OH

Sorbitol

Sorbitol 1A dudng glucoza ma nhém aldehit được chuyển thành chức năng rượu (OH)

Các axit amin gồm có :

L- Lizin 4,44 L- Axit aspartic 2,74

L- Metionin 2,34 N- Axetil - L-Xistein 0,34