Nghiên cứu quan hệ di truyền của một số loài thuộc họ Dầu Dipterocarpaceae ở Việt Nam dựa trên đa hình ADN genome và lục lạp Nguyễn Đức Thành*, Nguyễn Thúy Hạnh Viện Công nghệ Sinh h
Trang 1Kỷ yếu Hội nghị toàn quốc “Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống”, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, 2005 1379-1382
Nghiên cứu quan hệ di truyền của một số loài thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae) ở Việt Nam dựa trên đa hình ADN genome và lục lạp
Nguyễn Đức Thành*, Nguyễn Thúy Hạnh
Viện Công nghệ Sinh học, Viện KH&CNVN
Nguyễn Hoàng Nghĩa
Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam
Mở đầu
Các loài cây họ Dầu (Dipterocarpaceae) phân bố nhiều ở khu vực ấn Độ, Malaixia, kéo dài từ đảo Seychelle qua ấn Độ đến Philippin, tất cả gồm có 13 chi và 470 loài ở Việt Nam họ Dầu có 6 chi và khoảng trên 40 loài Phía Nam từ Quảng Nam trở vào có 24 loài, khu vực miền Trung từ đèo Ngang đến đèo Hải Vân có 9 loài, ở miền Bắc có 5 loài và 1 loài có ở cả 3 vùng Ngoài việc cung cấp gỗ, các loài cây họ Dầu còn cho một số sản phẩm khác dùng trong công nghiệp sơn và dầu bóng, trong dân gian nhân dân còn dùng để xảm thuyền [2] Theo Viện Điều tra quy hoạch rừng (1995) (1), năm 1959 diện tích các loại rừng có cây họ Dầu ở Đông Nam Bộ là 1146 275 ha (Chiếm 49% diện tích toàn vùng) Đến năm 1968 giảm xuống còn 834 050 ha (Chiếm 36% diện tích khu vực), năm 1982 giảm còn 416 900 ha (bằng 18% diện tích) và năm 1992 chỉ còn 183 081 ha (8%) Rõ ràng là việc bảo tồn các loài cây họ Dầu ở nước ta đã trở nên cấp thiết hơn bao giờ hết, nó góp phần vào việc bảo tồn nguồn gen cây rừng đang có nguy cơ tuyệt chủng ở nước ta Để công tác bảo tồn đạt kết quả tốt, việc nghiên cứu mức độ đa dạng di truyền của các loài cây này là hết sức cần thiết
Những năm gần đây, sự phát triển trong sinh học phân tử đã cung cấp những công cụ hữu hiệu cho phân tích di truyền, nó đánh dấu bằng sự ra đời của các kỹ thuật chỉ thị phân tử khác nhau như kỹ thuật RAPD, AFLP, SSR v.v Các chỉ thị này có vai trò quan trọng trong nghiên cứu đa dạng di truyền, sự phát sinh và xác định các loài [3] Trong nghiên cứu phân loại phân tử và phát sinh loài, các chỉ thị ADN lục lạp (cp DNA) cũng
đã được sử dụng để xác định nguồn gốc và phân biệt loài ở thực vật Các chỉ thị ADN lục lạp có đặc điểm rất quan trọng là tính bảo thủ cao và tần số đột biến thấp hơn so với ADN nhân Chỉ thị ADN lục lạp thường được
sử dụng là các chuỗi không mã và các gen như 16S, rbcL, atpB, matK v.v Các chỉ thị này đã được sử dụng
trong các nghiên cứu về quan hệ phát sinh loài và phân loại của nhiều loài cây như các loài cây cam chanh,
các cây họ đậu (Leguminosae), họ Hemerocallidaceae và họ Araliaceae (7, 9, 8, 10,) Đối với cây họ Dầu, việc
sử dụng các chỉ thị ADN genome và lục lạp vào nghiên cứu đa dạng di truyền và phát sinh loài cũng đã được một số tác giả công bố (5, 6,)
Trong bài này chúng tôi trình bày những kết quả về nghiên cứu quan hệ di truyền của 17 loài thuộc 6 chi họ Dầu ở Việt Nam dựa vào đa hình ADN genome (RAPD) và lục lạp với mục đích tìm hiểu sự đa dạng di truyền
của các loài này nhằm góp phần vào việc bảo tồn nguồn gen
Nguyên liệu và phương pháp
Vật liệu
17 loài cây họ Dầu sử dụng trong nghiên cứu này do Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam cung cấp bao
gồm 1 loài thuộc chi Anisoptera (A costata Korth - Vên vên), 4 loài thuộc chi Dipterocarpus (D alatus Roxb - Dầu rái, D dyeri Pierre - Dầu song nàng, D grandiflorus Blco - Dầu đọt tím, D oblusifolius Teysm - Dầu trà beng), 4 loài thuộc chi Hopea (H cordata Vidal - Sao lá hình tim, H ferea Laness - Săng đào, H odorata Roxb
- Sao đen, H reticulata Tardieu - Sao mạng cà ná), 1 loài thuộc chi Parashorea (P chinensis Wang Hsic - Chò chỉ), 3 loài thuộc chi Shorea (S obtusa Wall - Cà chít, S roxbughii G Don - Sến mủ, S siamensis Miq - Cẩm
liên) và 4 loài thuộc chi Vatica (V cinerea King - Táu mật, V mangachapoi ssp obtusifolia - Táu
duyên hải, V odorata (Griff) Sym ssp Odorata - Táu trắng, V odorata (Griff) Sym ssp brevipetiolata
Phamhoang - Táu ngâu)
7 mồi RAPD được mua từ hãng Operon, Mỹ (OPB11, OPB12, OPB13, OPB14, OPB15, OPC8, OPC9) và 4
cặp mồi lục lạp: trnD-trnT, trnH-trnK, psbC- trnS, trnM- rbcL, có trình tự đã công bố (11) và được cung cấp bởi
hãng IDT, Mỹ Các enzim giới hạn bao gồm HinfI, TaqI, HaeIII mua từ hãng Promega, Mỹ.
Phương pháp
Tách chiết ADN genome và kỹ thuật RAPD được tiến hành theo như đã công bố (11)
Kỹ thuật PCR với các mồi RAPD được thực hiện như đã công bố (3)
Kỹ thuật PCR với các mồi lục lạp được tiến hành với các phản ứng có thể tích là 25 μl bao gồm: ADN genome (50 ng); mồi cpADN (10 ng); dNTP (2,5 mM); MgCl2 (50 mM); enzim Taq polymerase (0,5 đơn vị) và đệm PCR Chu trình nhiệt bao gồm các bước: 94oC - 4 phút; 94oC - 1 phút; 57oC - 1 phút; 72oC - 2 phút, lặp lại 45
Trang 2chu kỳ từ bước 2 đến bước 4; 72 - 7 phút; giữ nhiệt độ ở 4 [10] Sản phẩm PCR được điện di trên gel
agarose 0,8%, quan sát dưới đèn cực tím
Phân tích số liệu
Các số liệu về quan hệ di truyền được phân tích bằng chương trình NTSYS pc với việc sử dụng hệ số
tương đồng di truyền Jaccard và phương pháp phân tích UPGMA
Kết quả và thảo luận
Đa hình di truyền các loài cây họ Dầu dựa trên chỉ thị RAPD
Với việc sử dụng 7 mồi RAPD đã nhân bản được 311 phân đoạn ADN từ 17 mẫu cây đại diện cho 17 loài thuộc 6 chi nghiên cứu (Hình 1), trong đó có 244 phân đoạn cho đa hình giữa các loài Số phân đoạn đa hình giao động từ 20 đến 62 tương đương với 68,97 đến 83,78% Trung bình mỗi mồi cho 34,85 phân đoạn đa hình tương đương với 14,28% Mồi OPB11 cho nhiều băng đa hình nhất (74 băng) còn mồi OPB14 cho ít băng đa hình nhất (20 băng)
Hình 1 Sản phẩm PCR của mồi OPB11(A) và OPB12 (B) với ADN genome với 17 cây họ Dầu
1-Vên vên, 2- Dầu rái, 3- Dầu song nàng, 4- Đọt tím, 5-Trà beng, 6- Sao lá hình tim, 7- Săng đào, 8- Sao đen, 9- Sao mạng,
10- Chò chỉ, 11- Cà chít, 12- Sến mủ, 13-Cẩm liên, 14- Táu mật, 15- Táu duyên hải, 16-Táu trắng, 17-Táu ngâu
Về mức độ đa hình các loài cây họ Dầu nghiên cứu bằng chỉ thị RAPD cho thấy: tất cả các loài đều cho tỷ lệ
đa hình lớn hơn 68%, trong đó loài Cà chít cho tỷ lệ băng đa hình cao nhất (92,85%), và loài Săng đào cho tỷ
lệ băng đa hình thấp nhất (68,42%) Những số liệu nhận được chứng tỏ các loài cây họ Dầu thuộc 6 chi nghiên cứu rất khác nhau về mặt di truyền
Đa hình di truyền các loài cây họ Dầu dựa vào các chỉ thị ADN lục lạp
Để phân tích đa hình ADN lục lạp của 17 mẫu cây đại diện cho 17 loài họ Dầu, chúng tôi đã sử dụng 4 cặp
mồi lục lạp trnD-trnT trnH-trnK, psbC- trnS và trnM- rbcL Với 4 cặp mồi này, các phân đoạn ADN lục lạp nằm
giữa các gen tương ứng sẽ được nhân bản và so sánh giữa các loài cây nghiên cứu Kết quả nhận được là
mỗi mồi lục lạp đều cho một băng đặc hiệu, cụ thể là với các cặp mồi trnD-trnT, trnH-trnK, psbC- trnS và trnM-
rbcL đã nhận được các phân đoạn ADN có kích thước tương ứng lần lượt là 1600 bp, 1750 bp, 1650bp, 2700
bp, đúng như các tác giả khác đã công bố (Hình 2A) Để xác định sự khác biệt về trình tự
Hình 2 Sản phẩm PCR của mồi trnD-trnT với ADN genome của 17 loài cây họ Dầu
A- sản phẩm chưa cắt và B - sản phẩm cắt bằng enzym HaeIII, M-Marker phân tử 1kb,1-Vên vên, 2- Dầu rái,
3- Dầu song nàng, 4- Đọt tím, 5-Trà beng, 6- Sao lá hình tim, 7- Săng đào, 8- Sao đen, 9- Sao mạng, 10- Chò chỉ, 11- Cà chít, 12- Sến mủ, 13-Cẩm liên, 14- Táu mật, 15- Táu duyên hải, 16-Táu trắng, 17-Táu ngâu
nucleotit của các phân đoạn ADN nhận được từ các mẫu cây đại diện cho 17 loài nghiên cứu, các sản phẩm
PCR nhận được được cắt với ba enzim giới hạn là HinfI, TaqI và HaeIII Kết quả là sau khi cắt với mỗi loại
enzim giới hạn các sản phẩm PCR đều cho đa hình cao (Hình 2B).Tổng số băng nhận được là 344 trong đó có
234 băng đa hình (chiếm 68,02%), sản phẩm mồi trnD - trnT cắt với enzim giới hạn HaeIII cho tỷ lệ đa hình là 82%, với enzim TagI là 91,84% và với Hinf1 là 73,17% Sản phẩm mồi trnH-trnK cắt với enzim giới hạn HinfI cho tỷ lệ đa hình 79,17%, trong khi đó sản phẩm với mồi psbC- trnS cũng được cắt với enzim giới hạn HinfI
nhưng cho đa hình thấp 42,86%
Như vậy, các kết quả phân tích chỉ thị cpADN cũng cho thấy các loài cây họ Dầu được nghiên cứu rất đa dạng
về di truyền
1,6 kb
3 kb
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
A
1,0 kb
3 kb 0,5 kb
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
B
1,5 kb
3 kb
0,5 kb
A
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
1,5 kb
3 kb
0,5 kb
B
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Trang 3Quan hệ di truyền giữa các loài cây họ Dầu
Biểu đồ quan hệ di truyền giữa các cây họ Dầu được xây dựng dựa trên các số liệu về đa dạng chỉ thị RAPD và
ADN lục lạp (Hình 3), cho thấy giữa các cây họ Dầu có sự khác biệt lớn về mặt di truyền (Hệ số tương đồng di truyền
giao động từ: 0,18 đến 0,58 ) Cụ thể là loài V mangachapoi ssp obtusifolia (Táu duyên hải) và V odorata (Griff)
Sym ssp brevipetiolata Phamhoang (Táu ngâu) thuộc chi Vatica có quan hệ di truyền xa với các loài thuộc các chi
khác Loài A costata Korth (Vên vên) là loài duy nhất thuộc chi Anisoptera cũng có quan hệ di truyền xa với
các loài ở các chi khác 14 loài thuộc 4 chi (Dipterocarpus, Hopea Parashorea và Shorea) và 2 loài thuộc chi
Vatica chia làm 2 nhóm có quan hệ di truyền ở mức 0,25 Nhóm thứ nhất gồm toàn bộ 4 loài của chi
Dipterocarpus (D alatus Roxb - Dầu rái, D oblusifolius Teysm - Dầu trà beng, D dyeri Pierre - Dầu song
nàng, và D grandiflorus Blco - Dầu đọt tím) và 2 loài thuộc chi Vatica (V cinerea King - Táu mật và V odorata
(Griff) Sym ssp odorata - Táu trắng) Nhóm thứ hai bao gồm 4 loài thuộc chi Hopea (H cordata Vidal - Sao lá
hình tim, H reticulata Tardieu - Sao mạng cà ná, H odorata Roxb - Sao đen và H ferrea Laness - Săng đào),
3 loài thuộc chi Shorea (S obtusa Wall - Cà chít, S siamensis Miq - Cẩm liên, và S roxbughii G Don - Sến
mủ) và 1 loài duy nhất của Parashorea (P chinensis Wang Hsie - Chò chỉ) Ashton 1982, dựa và các đặc điểm
hình thái, giải phẫu gỗ và hoá thạch đã phân họ Dầu (Dipterocarpaceae) thành 3 họ phụ là Pakarimoideae,
Monotoideae và Dipterocarpoideae Họ phụ Dipterocarpoideae có hai tông là Dipterocarpeae và Shoreae (4)
Coefficient
1
2
3
4
15
6
9
12
14
7
10
13
18
Vên vên Dầu rái Dầu trà beng Dầu song nàng Dầu đọt tím Táu mật Táu tráng Sao lá hình kim Sao mạng cà ná Sao đen
Cà chít Cẩm liên Săng đào Chò chỉ Sến mủ Táu duyên hải Táu ngâu
Hình 3 Biểu đồ quan hệ di truyền giữa các cây họ Dầu được xây dựng Dựa trên số liệu đa hình chỉ thị RAPD và ADN lục lạp
Tông Dipterocarpeae có 8 chi trong đó có các chi Dipterocarpus và Vatica nằm trong nhóm thứ nhất theo số
liệu đa hình ADN của chúng tôi còn tông Shoreae có 5 chi trong đó có các chi Parashorea, Hopea và Shorea
nằm trong nhóm thứ hai Chỉ có hai loài thuộc chi Vatica (V mangachapoi ssp obtusifolia - Táu duyên hải và V
odorata (Griff) Sym ssp brevipetiolata Phamhoang - Táu ngâu) và loài duy nhất của chi Anisoptera (A costata
Korth- Vên vên) thuộc tông Dipterocarpeae lẽ ra phải nằm trong nhóm 1 nhưng lại nằm riêng và có quan hệ di
truyền xa với hai nhóm chính
Như vậy, những kết quả về phân tích đa dạng di truyền của 6 chi họ Dầu dựa trên đa hình ADN genome và
lục lạp đã cho thấy các loài cây họ Dầu ở Việt Nam rất đa dạng về mặt di truyền Các kết quả phân nhóm dựa
vào đa hình ADN tương đối phù hợp với việc phân loại dựa vào hình thái trước đây
Kết luận
Các loài cây họ Dầu được nghiên cứu có mức độ đa dạng về mặt di truyền cao, hệ số di truyền giao động từ 0,18 đến 0,58
Kết quả phân nhóm dựa vào đa hình ADN genome và lục lạp tương đối phù hợp với phân loại theo hình thái
Tài liệu tham khảo
1 Nguyễn Duy Chuyên và Ngô An, 1995 Công trình khoa học kỹ thuật điều tra quy hoạch rừng (1991-1995) Nxb Nông
nghiệp, Hà Nội,1995
2 Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1999 Một số loài cây bị đe doạ ở Việt Nam Nxb Nông nghiệp, Hà Nội
3 Nguyễn Đức Thành, 1999 ứng dụng và phát triển các chỉ thị sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng phân tử ở lúa
Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội: 1205-1215
4 Ashton P.S, 1982 Dipterocarpaceae Trong C.G.G.J Van Steenis (ed) Flora Malesiana, Series1, Spermatophyta,
Martinus Nijhoff Publisher The Hague, 9: 237-552
5 Dayanandan S., Ashton P.S., Williams S.M., Primack R.B., 1999 Phylogeny of the tropical tree family
Dipterocarpaceae based on nucleotide sequences of chloroplast rbcL gene Amer Journal of Botany, 86: 1182-1190
6 Lee, S L., Wickneswari R, Mahani M C, Zakri A H., 2001 Comparative genetic diversity studies of Shorea Leprosula
(Dipterocarpaceae) using RAPD and Allozyme markers Journal of Tropical Forest Science 13 (1): 202-215
7 Nicolosi E, Deng Z N, Gentile A, La Malfa S, Continella G, Tribulato E., 2000 Citrus phylogeny and genetic origin of
important species as investigated by molecular markers Theor Appl Genet, 100: 1155-1166
Trang 48 Noguchi J, Hong D Y , and Grant W F., 2004 The historical evolutionary development of Hemerocallis middendorfii (Hemerocallidaceae) revealed by non-coding regions in chloroplast DNA Plant Syst Evol, 247:1-22
9 Pardo C., Cubas P., and Tahiri H., 2004 Molecular phylogeny of Genista (Legiuminosae) and related genera based on nucleotide sequences of nrDNA (ITS region) and cpDNA (trnL-trnF intergenic specer) Plant Syst Evol, 244: 93-119
10 Plunkett G.M., Wen J., and Lowry II P.P., 2004 Intrafamilial classifications and characters in Araliaceae: Insight from the
phylogenetic analysis of nuclear (ITS) anf plastid (trnL-trnF) sequence data Plant Syst Evol, 245: 1-39
11 Saghai Maroof M A., Biyashev R M., Yang G P., Zhang Q., Allard R W., 1994, Extraodirnarily polymorphic
microsatellite DNA in barley: species diversity, chromosome location, and population dynamics, Proc Natl Acad.Sci USA, 91: 5466-5470
* Công trình có sự hỗ trợ của Hội đồng Khoa học tự nhiên và đề tài “Bảo tồn nguồn gen cây rừng” của viện KHLNVN
Các tác giả xin cảm ơn GS.TSKH Lê Xuân Tú đã đọc và góp ý cho bản thảo
Summary
The study of genetic relationship between Vietnamese tree species of Dipterocarpaceae family using genomic and chloroplast DNA polymorphism
Nguyen Duc Thanh, Nguyen Thuy Hanh
Institute of Biotechnology, VAST
Nguyen Hoang Nghia
Forest Science Institute of Viet Nam
The family of Dipterocarpaceae is distributed mainly in tropic rain forests In Vietnam, the Dipterocarps distributed throughout from South to North Due to the war and the increasing of economy and population after the war, the numbers of Dipterocarps was significantly decreased To contribute to an evaluation and conservation of Vietnamese Dipterocarps genetic resources, the genome and plastome of 17 species belonging to 6 genera of Vietnamese Dipterocarps are investigated using RAPD and chloroplast DNA markers, with the aim to study the genetic diversity of the Vietnamese
Dipterocarps The results of the analyses based on RAPD and chloroplast DNA regions trnD-trnT, trnK-trnH, psbC-trnS, trnM-rbcL, indicated that the investigated species are genetically, very, divergent In addition, the grouping based on genomic and
chloroplast DNA polymorphism is mostly agreed with morphological classification Due to high level of genetic diversity, the conservation of the species should be highly considered
