Công trình này đề cập đến kết quả “Phân tích mối quan hệ di truyền tập đoàn giống cây bách xanh bằng chỉ thị RAPD và genome lục lạp”, giúp cho công tác bảo tồn và tái tạo nguồn gen quý h
Trang 1MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN TẬP ĐOÀN GIỐNG CÂY BÁCH XANH (CALOCEDRUS MACROLEPIS)
BẰNG CHỈ THỊ RAPD VÀ cpSSR
Vũ Thị Thu Hiền, Đinh Thị Phòng
Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam
Lê Anh Tuấn, Phí Hồng Hải
Trung tâm NC Giống cây rừng Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam
I MỞ ĐẦU
Bách xanh (Calocedrus macrolepis) là loài cây thân gỗ, thân thẳng, phân cành sớm và phân tán rộng
Bách xanh phân bố ở vùng núi đá vôi phía Bắc và vùng núi đất phía Nam, trong các cánh rừng nguyên sinh rậm thường xanh hỗn giao nhiệt đới gió mùa núi thấp và ở độ cao 800-1500m trên mặt biển
Bách xanh là loài cây có khả năng cho nhựa giống như các loài cây cho tinh dầu khác, do vỏ có nhiều ống dẫn nhựa lớn, nhựa có mùi tinh dầu xá xị rất thơm, gỗ màu vàng nhạt, vân có màu vàng nâu, gỗ rất cứng và chứa nhiều tinh dầu có giá trị cao trong ngành công nghiệp mỹ phẩm và gia dụng
Cũng giống như hầu hết các loài cây đặc hữu khác, việc đánh giá đa dạng quần thể di truyền mới chỉ tập trung vào một số đặc điểm hình thái, đặc biệt là cơ quan sinh sản Nhận dạng bằng hình thái đôi khi bị hạn chế vì phụ thuộc vào trạng thái mẫu thu nhận được Trong vài năm trở lại đây, việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên phân tích RFLP, AFLP, RAPD, SSR,…để đánh giá mức độ di truyền đã được áp dụng trên nhiều đối tượng cây trồng ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới và Việt Nam (Kim et al., 2006;
Mace et al., 1999; Powell et al., 1996, Đinh thị Phòng et al., 2004, Nguyễn Thị Hạnh, 2005) Trong đó, kỹ
thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) hay được sử dụng vì kỹ thuật này tương đối đơn giản,
dễ thực hiện mà có hiệu quả (Ferreira et al., 1997; William et al., 1990), còn chỉ thị genome lục lạp mang tính bảo thủ di truyền cao nên thường sử dụng để nhận dạng các loài mới
Công trình này đề cập đến kết quả “Phân tích mối quan hệ di truyền tập đoàn giống cây bách xanh bằng chỉ thị RAPD và genome lục lạp”, giúp cho công tác bảo tồn và tái tạo nguồn gen quý hiếm của Việt Nam
II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu: gồm 20 mẫu lá bách xanh do Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng, Viện Khoa học Lâm
nghiệp Việt Nam cung cấp có ký hiệu và nơi thu thập như bảng 1
Bảng 1 Nguồn gốc và ký hiệu 20 mẫu bách xanh dùng trong nghiên cứu
TT Ký hiệu
mẫu
mẫu
Nguồn gốc
Trang 26 HT6 Mẫu 159 - Hà Nội 16 QB2 Quảng Bình 2
8 LD1 Mẫu cây 1, 5 và 6 – Lâm Đồng 18 QB4 Quảng Bình 4
Các mồi sử dụng trong nghiên cứu gồm: 15 mồi RAPD (bảng 2) và 06 cặp mồi phân tích genome lục lạp với kích thước lý thuyết tương ứng (bảng 3)
Bảng 2 Trình tự các nucleotide 15 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu
Bảng 3 Trình tự các nucleotide của 06 cặp mồi phân tích genome lục lạp
thuyết (bp)
1 Dal 1-F
Dal 1-R
5’CGAAATCGGTAGACGCTACG 3’
5’GGGGATAGAGGGACTTGAAC 3’
577
trnS-R
5’ ACTTCTGGTTCCGGCGAACGAA 3’
5’ AACCACTCGGCCATCTCTCCTA 3’
3681
3 trnS-F
trnfM-R
5’GAGAGAGAGGGATTCGAACC 3’
5’CATAACCTTGAGTCACGG G 3’
1254
4 rbcL1-F
rbcL2-R
5’ATGTCACCACAAACAGAAACTAAAGCAAGT 3’
5’CTTCACAAGCAGCAGCTAGTTCAGGACTCC 3’
1381
5 rps14-F
cob-R
5’CACGGGTCGCCCTCGTTCCG 3’
5’GTG TGG AGG ATA TAG GTT GT 3’
1396
trnK-R
5’ ACGGGAATTGAACCCGCGCA 3’
5’ CCGACTAGTTCCGGGTTCGA 3’
1831
Phương pháp nghiên cứu
Trang 3Tách chiết ADN tổng số từ lá: theo phương pháp CTAB của (Doyle and Doyle, 1987) có cải tiến Kiểm
tra độ sạch và hàm lượng ADN bằng đo quang phổ hấp thụ kết hợp với điện di trên gel agarose 0,8%
Phản ứng PCR – RAPD: một phản ứng PCR có thể tích 25µl: bao gồm dung dịch đệm PCR 1X; 2,5mM
MgCl2; 2mM dNTPs; 200nM đoạn mồi; 0,5 đơn vị Taq polymerase và 10ng ADN khuôn Phản ứng PCR –
RAPD thực hiên trong máy PCR – Thermal Cycler theo chu trình nhiệt: 940C trong 1 phút; 45 chu kỳ (920C trong 1 phút; 350C trong 1 phút; 720C trong 1 phút); 720C trong 10 phút; giữ sản phẩm ở 40C Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5%, nhuộm Ethidium bromide và chụp ảnh trên máy soi gel
Phản ứng PCR lục lạp: một phản ứng PCR lục lạp có tổng thể tích là 25µl chứa: 1X dung dịch đệm
PCR; 2,5mMgCl2; 2mM dNTPs; 0,5pmol mồi xuôi; 0,5pmol mồi ngược; 50ng ADN khuôn và 0,5 đơn vị Taq polymerase Chu trình nhiệt của phản ứng là: 940C trong 2 phút; 35 chu kỳ (940C trong 1 phút; 500C - 600C trong 1 phút; 720C trong 1 phút); 720C trong 10 phút; giữ sản phẩm ở 40C Điện di sản phẩm trên gel agarose 1%, nhuộm Ethidium bromide và chụp ảnh trên máy soi gel
Phản ứng cắt enzyme hạn chế: sản phẩm PCR của các cặp mồi lục lạp được cắt bằng các enzyme
hạn chế thành phần gồm: 10µl sản phẩm PCR, 2µl 10X buffer, 2µl enzyme và 6µl H2O deion Phản ứng cắt được thực hiện ở 37oC trong vòng 12h đến 16h
Phân tích số liệu: theo quy ước: 1 = phân đoạn ADN xuất hiện và 0 = phân đoạn ADN không xuất hiện,
khi điện di sản phẩm RAPD với các đoạn mồi ngẫu nhiên Xác định hệ số di truyền giống nhau, giá trị PIC, giá trị trương quan kiểu hình (r), để lập ra biểu đồ so sánh hệ số tương đồng di truyền giữa 20 mẫu Bách xanh ở mức độ phân tử như trong công trình nghiên cứu của Đinh Thị Phòng et al., (2004) Số liệu được xử
lý bằng chương trình NTSYSpc version 2.0 (Applied Biostatistics Inc., USA., 1998)
III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Phân tích đa dạng di truyền tập đoàn giống cây Bách xanh
ADN của 20 mẫu Bách xanh được phân tích với 15 mồi ngẫu nhiên RAPD Kết quả phân tích sản phẩm PCR - RAPD điện di trên gel agarose 1,5% cho thấy, có 9/15 mồi chỉ ra tính đa hình với giá trị PIC dao động
từ 0,08 (mồi RA40) đến 0,31 (mồi RA46) Số lượng các phân đoạn ADN nhân bản với mỗi mồi xê dịch từ 2 đến 11 phân đoạn Kích thước các phân đoạn ADN được nhân bản trong khoảng từ 200bp đến 1800bp Tổng số phân đoạn ADN nhân bản được của 20 mẫu bách xanh với 15 mồi RAPD là 854 Số phân đoạn ADN nhân bản được nhiều nhất là 104 phân đoạn (mồi RA40) và ít nhất là 20 phân đoạn (mồi UBC23) (bảng 4)
Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện phân đoạn ADN khi so sánh giữa các mẫu với nhau Tổng số phân đoạn ADN khi phân tích với 15 mồi ngẫu nhiên là 56 phân đoạn Trong đó có 22 phân đoạn là đa hình (chiếm 39,29%) và 34 phân đoạn đơn hình (chiếm 60,71%)
Bảng 4 Giá trị PIC và tỉ lệ phân đoạn đa hình của 20 mẫu Bách xanh
phân tích với 15 mồi ngẫu nhiên RAPD
Phân đoạn đa hình
Phân đoạn đồng hình
Tổng số phân đoạn
% phân đoạn
đa hình
Trang 45 OPP15 0 0 3 3 0,00
Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng mồi RAPD của 20 mẫu Bbách xanh với mồi RA46 được trình bày ở hình 1A Trong số 5 phân đoạn ADN được nhân bản thì có 4 phân đoạn đa hình (chiếm 80%) Các phân đoạn có kích thước khoảng từ 0,3kb đến 1,0kb Tính đa hình ADN của các mẫu được thể hiện tương đối rõ Ví dụ ở vị trí khoảng 0,7 kb (mũi tên: ←) 6 mẫu Bách xanh QB1, QB2, QB3, QB4, QB5 và QB6 (giếng
15, 16, 17, 18, 19 và 20 tương ứng) đã xuất hiện phân đoạn ADN mới khi phân tích với mồi RA46 Trong cùng một địa phương thu mẫu cũng có sự khác biệt tại vị trí khoảng 0,8kb, mẫu HT1, HT2 và HT3 (giếng 1,
2 và 3 tương ứng) xuất hiện phân đoạn ADN, mẫu HT4, HT5, HT6 và HT7 (giếng 4, 5, 6 và 7 tương ứng) (mũi tên →) đã không xuất hiện phân đoạn ADN Kết quả phân tích trên cho thấy trong tập đoàn 20 mẫu bách xanh nghiên cứu đã có sự sai khác trong ADN genome
Tuy nhiên, khi phân tích với mồi OPP15 có 3 phân đoạn ADN được nhân bản, nhưng lại không chỉ ra tính
đa hình giữa 20 mẫu bách xanh (hình 1B)
Hình 1 Điện di sản phẩm PCR – RAPD trên gel 1,5 % agarose (A: Mồi RA46 và B: Mồi OPP15; M:
marker phân tử 1kb; Giếng 1-20: tên của 20 mẫu Bách xanh như trong bảng 1)
Mối quan hệ di truyền của 20 mẫu cây bách xanh với 15 mồi RAPD
Mối quan hệ di truyền của 20 mẫu Bách xanh thu được ở ba địa phương Hà Tây, Lâm Đồng và Quảng Bình được thể hiện trên sơ đồ hình cây và biểu đồ tọa độ (hình 2) đã phân ra làm 3 nhánh rõ ràng (nhánh I, nhánh II và nhánh II) Hệ số tương đồng di truyền của 20 mẫu Bách xanh dao động từ 0,75 đến 1 Điều đáng lưu ý ở đây, hầu hết các mẫu có cùng vùng địa lý thu mẫu đều lập thành một nhánh trên cây phân loại:
1kb
0,5kb
Trang 5+ Nhánh I gồm 7 mẫu Bách xanh thu được tại Hà Tây (kí hiệu HT1, HT2…HT7) có mức độ tương đồng di truyền trong khoảng từ 0,882 đến 0,98;
+ Nhánh II gồm 7 mẫu thu được tại Lâm Đồng (kí hiệu LD1, LD2…LD7) có mức độ tương đồng di truyền trong khoảng 0,853 đến 0,954;
+ Nhánh III gồm 6 mẫu thu được tại Quảng Bình (kí hiệu QB1, QB2…QB6) và có mức độ tương đồng di truyền khoảng từ 0,88 đến 1 Trong đó hai giống QB5 và QB6 giống nhau hoàn toàn nên có hệ số tương đồng di truyền là 1;
Hình 2 Biểu đồ hình cây và biểu đồ toạ độ của 20 mẫu Bách xanh tính theo hệ số di truyền của
Jaccard và kiểu phân nhóm UPGM
Phân tích đa hình ADN lục lạp của 20 mẫu Bách xanh bằng chỉ thị lục lạp
Song song với việc đánh giá đa dạng genome nhân bằng các chỉ thị RAPD, trong nghiên cứu này, các cặp mồi lục lạp cũng đã được sử dụng để đánh giá sự đa dạng di truyền của ADN lục lạp, chúng tôi sử dụng
06 cặp mồi lục lạp để đánh giá đa hình ADN lục lạp của 20 mẫu bách xanh, nhưng chỉ có 4/6 cặp mồi là
nhân được sản phẩm Kích thước nhân bản được của các cặp mồi Dal1R-Dal1F, trnS–trnfM, rbcL1- rbcL2
và rpS14-cob có độ dài khoảng 500bp (hình 3 A), 950bp (hình 3 B), 900bp (hình 3 C) và 1kb (hình 3D), tương ứng Tuy nhiên, điều đáng quan tâm ở đây là sản phẩm PCR của 4 cặp mồi lục lạp khi phân tích với
20 mẫu bách xanh đã không chỉ ra tính đa hình (các mẫu bách xanh đều nhân được các phân đoạn ADN có kích thước bằng nhau) Kết quả này cũng đồng nghĩa là không có tính đa hình AND genome lục lạp giữa các mẫu bách xanh
Hình 3 Điện di sản phẩm PCR lục lạp của các cặp mồi Dal1F - Dal1R (A), trnS - trnfM (B); rbcL1 -
rbcL2 (C); rps14-cob (D); M: thang phân tử chuẩn 1kb, giếng 1-20:
thứ tự sắp xếp của các mẫu bách xanh như trong bảng 1
Để có cơ sở đánh giá thêm về tính đa hình ADN lục lạp của 20 mẫu bách xanh, chúng tôi đã sử dụng 09 enzyme hạn chế để cắt sản phẩm PCR lục lạp của một số mẫu Bách xanh điển hình của mỗi địa phương khi phân tích với 4 cặp mồi nêu trên Enzyme hạn chế chỉ có thể nhận biết các vị trí các trình tự nucleotide nhất định để cắt, vì thế mà có thể nhận được sự đa hình các vùng cpDNA giữa các mẫu nghiên cứu
I
II
III
1k
1k
1kb
1k
0,5kb
0,5kb
0,5kb
0,5kb
C
D
Trang 6Phương pháp này đã được nhiều tác giả sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền và phát sinh loài khi phân tích mức độ đa dạng của các trình tự nucleotide genome lục lạp (Mason-Gamer et al., 1995; Chung
et al., 2003; Nicolosi et al., 2000; Mohanty et al., 2001, Devos et al., 2003; McMillan et al., 2004; Nguyễn
Đức Thành et al., 2005)
Kết quả cắt enzyme hạn chế: sản phẩm PCR lục lạp nhân được từ các cặp mồi trên đã được xử lý với
09 enzyme hạn chế EcoRI, NdeI, XhoI, SacI, KpnI, PstI, X-baI, BamHI, HindIII không chỉ ra các đoạn cắt đa hình
Từ kết quả phân tích ADN genome lục lap có thể cho phép chúng tôi nhận xét sự bảo thủ di truyền rất cao trong hệ genome lục lạp ở cây Bách xanh
IV KẾT LUẬN
- 15 mồi ngẫu nhiên dùng đề phân tích tính đa hình ADN genome của 20 mẫu Bách xanh thì có 9 mồi chỉ
ra tính đa hình Trong phạm vi vùng phân tích có 56 phân đoạn ADN được nhân bản, số lượng các phân đoạn ADN nhân bản với mỗi mồi xê dịch từ 2 đến 11 phân đoạn Kích thước phân đoạn ADN được nhân bản trong khoảng từ 200bp đến 1800bp
- Hệ số sai khác di truyền của 20 mẫu Bách xanh dao động từ 0,75 đến 1 và được phân làm 3 nhánh chính: nhánh I gồm 7 mẫu Hà Tây, nhánh II gồm 7 mẫu Lâm Đồng và nhánh III gồm 6 mẫu Quảng Bình
- 04/06 cặp mồi lục lạp đã nhân được sản phẩm và 09 enzyme cắt hạn chế sử dụng cho phân tích đa hình ADN lục lạp của 20 mẫu Bách xanh đã không chỉ ra tính đa hình Kết quả nhận được cho phép nhận xét thêm sự bảo thủ di truyền rất cao trong hệ gen lục lạp ở thực vật bậc cao cây bách xanh
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Chung SM., Jack ES., 2003 The development and evaluation of consensus chloroplast primer pairs that possess highly variable sequence regions in a diverse array of plant taxa Theor Appl Genet (2003) 107: 757-767
2 Đinh Thị Phòng, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội, Nguyễn Thị Hải Hà, Lê Duy Thành, Nguyễn Văn Viết,
2004 Nghiên cứu đa dạng tập đoàn giống lúa có tính kháng khác nhau với bệnh bạc lá lúa vi khuẩn
cứu cơ bản trong khoa học sự sống định hướng nông lâm nghiệp miền núi Thái Nguyên 23/9/2004:
571-574
3 Devos N., Tyteca D., Raspe O., Wesselingh RA., and Jacquemart AL., 2003 Patterns of chloroplast
diversity among western European Dactylorhiza species (Orchidaceae) Plant Syst Evol 243: 85-97
4 Doyle JJ and Doyle, 1987.Rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue Phytochem Bull 19: 11-15
5 Ferreira AR., Keim P, 1997 Genetic Mapping of Soybean [Glycine max (L.) Merr.] Using Random
Amplified Polymorphic DNA (RAPD), Plant Mol Biol Rep, 15(4): 335- 354
6 Kim MK, Park MJ, Jeong WH, Nam KC, Chung J,2006 SSR marker tightly linked to the Ti locus in
Soybean [Glycine max (L.) Merr.] Euphytica 152(3): 361-366
7 Mace ES., Lester RN., Gebhardt CG.,1999 AFLP analysis of genetic relationships among the
cultivated eggplant, Solanum melongena L., and wild relatives (Solanaceae), Theor Appl Genet 99: 626 -
633
8 McMillan E., Sun G., 2004 Genetic relationships of tetraploid Elymus speciess and their genomic
donor speciess inferred from polymerase chain reaction – restriction length polymorphism analysis of chloroplast gene regions Theor Appl Gent 108: 535-542
Trang 79 Mohanty A., Martin JP., Aguinagalde I., 2001.Chloroplast DNA study in wild populations and some
cultivars of Prunu avium L Theor Appl Genet 103: 112-117
10 Powell W, Morgante M, Andre C, Hanafey M, Vogel J, Tingey S, Rafalski A, 1996 The comparison of
RFLP, RAPD, AFLP and SSR markers for germplasm analysis Molecular Breeding 2(3): 225 - 238
11 Nguyễn Thuý Hạnh, 2005 Nghiên cứu mối quan hệ di truyền một số chi và loài cây họ dầu (Dipterocarpaceae) ở Việt Nam bằng chỉ thị RAPD và AND lục lạp Luận án cao học
12 Williams JGK, Kubelik AR, Livak KJ, Rafalski JA, Tingey SV, 1990 DNA polymorphisms amplified by
arbitrary primers are useful as genetic markers Nucleic Acids Res 18: 6531-6535
