Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường dinh dưỡng đến tạo phát sinh phôi 69 Sau 4 tuần nuôi cấy trên 3 loại môi trường dinh dưỡng khác nhau, một số phôi non được quan sát là đã 70
Trang 1NGHIÊN CỨU TẠO PHÔI SOMA THÔNG NHỰA
1
(PINUS MERKUSII) TRONG ĐIỀU KIỆN INVITRO
2
3
Vương Đình Tuấn, Nguyễn Xuân Cường, Phan Thị Mỵ Lan
4
Phân viện Nghiên cứu Khoa học Lâm nghiệp Nam Bộ
5
6
TÓM TẮT
7
Tạo phát sinh phôi và phôi soma đã đạt được kết quả tốt trên môi trường LVM có bổ sung 2,0mg/l 2,4-D
8
và 3,0 mg/l BA Trọng lượng tươi của tế bào tiền phôi tăng hơn 3 lần ở tuần đầu trên môi trường có bổng
9
sung 500mg/l glutamine Đường maltose ở 90g/l kết hợp 80mg/l ABA và 10g/l phytagel tạo phôi soma tốt
10
hơn sucrose ở cùng nồng độ Các yếu tố ảnh hưởng đến tái sinh cây xanh từ phôi soma và giai đoạn cây
11
con trong vườn ươm đang được tiến hành
12
Từ khóa: Đường maltose và sucrose, Phát sinh phôi, Phôi soma, Thông nhựa
13
14
I MỞ ĐẦU
15
Thông nhựa (Pinus merkusii Jungh & de Vriese) là một loài thông có nguồn gốc nhiệt đới, được trồng để
16
cung cấp nhựa và gỗ Do đặc điểm chịu được những điều kiện khó khăn nghèo dinh dưỡng của đất, nên
17
thông nhựa còn được dùng làm cây để phủ xanh đất trống, đồi trọc và cằn cỗi để cải thiện môi trường và cải
18
thiện thu nhập cho nông dân vùng khó khăn
19
Kỹ thuật tạo phôi soma được nghiên cứu và áp dụng nhiều để cải thiện giống cây lâm nghiệp ở các nước
20
ôn đới trong vài thập niên gần đây Lợi ích quan trọng nhất của kỹ thuật này là khả năng giữ các tế bào tiền
21
phôi soma (embryogenic tissue) của các dòng ưu việt trong điều kiện đông khô hàng vài chục năm, thậm chí
22
hàng trăm năm vẫn không ảnh hưởng đến tính di truyền của vật liệu khi được tái sinh Việc tạo thể tiền phôi
23
soma còn được dùng để tạo cây xanh của những dòng mong muốn với khối lượng lớn trong điều kiện invitro
24
để cung cấp cho sản xuất Thể tiền phôi, mặt khác, cũng là một loại vật liệu được sử dụng trong ứng dụng
25
kỹ thuật chuyển gene để cải thiện giống
26
Kỹ thuật tạo phôi soma đã thành công trên một số loài quả nón và loài cây lâm nghiệp khác Tuy nhiên,
27
hiện chưa tìm thấy kết quả nào được công bố về tạo phôi soma trên Thông nhựa (Pinus merkusii) ở Việt
28
Nam Vì thế, nghiên cứu này góp phần xây dựng kỹ thuật tạo thể phát sinh và phôi soma từ phôi non Thông
29
nhựa nhằm góp phần tạo vật liệu cho ứng dụng công nghệ gene cải thiện năng suất chất lượng Thông
30
nhựa
31
32
II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
33
2.1 Vật liệu: Phôi non của gia đình thông nhựa số 31 được cung cấp bởi Trung tâm nghiên cứu giống
34
cây rừng, Viện khoa học Lâm nghiệp Việt nam Các hóa chất của một số môi trường dinh dưỡng Litvay
35
(Litvay và cộng sự 1985), DCR (Gupta & Durzan.1986); được mua từ các hãng Merck (Đức); Sigma (Mỹ);
36
Duchefa (Hà Lan) Các máy móc, phương tiện phục vụ nuôi cấy invitro như máy cất nước Direct Q3, nồi hấp
37
(Nhật Bản), máy đo pH (Thụy Sỹ); cân phân tích (Đức) v.v
38
2.2 Phương pháp: Quả Thông non sau khi thu hái, được rửa sạch dưới vòi nước bằng xà phòng Sau
39
đó quả được vô trùng bề mặt bằng cồn 960 trong 10 phút trong tủ cấy vô trùng Quả sau đó được tráng bằng
40
nước cất vô trùng 2 lần trước khi phôi non được tách và cấy trên đĩa petri có chứa môi trường dinh dưỡng
41
Việc tạo phát sinh phôi và phôi soma được thực hiện qua một số thí nghiệm sau: Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của
42
một số môi trường dinh dưỡng cơ bản đến tạo phát sinh phôi Một số môi trường như LVM (Litvay và
43
cộng sự 1985) có cải tiến theo Lelu và cộng sự (2006); DCR (Gupta & Durzan.1986) và TE (Tang và cộng
44
sự 1998) được sử dụng Trong đó môi trường LVM, DCR có chứa các aminoacid (500g/l); cả 3 môi trường
45
Trang 2đều được bổ sung glutamine; 2,4-D (2,4 dichlorophenoxy aceticacid - 2,0 mg/l); BA ( Benzyladenine - 3,0
46
mg/l), sucrose, Phytagel (tùy điều kiện thí nghiệm), pH.5,6±10C
47
Thí nghiệm được bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại Mỗi lần 3 đĩa, mỗi đĩa chứa 10
48
phôi non Đĩa chứa phôi non được để trong tối trong phòng nuôi có nhiệt độ 24 ±20C
49
Thí nghiệm nhân sinh khối:
50
*Ảnh hưởng của nồng độ glutamine đến nhân nhanh khối phát sinh: Sau khi tạo được thể phát sinh, khối
51
phát sinh (extrusion) được tách khỏi phôi non và cấy trên môi trường tăng sinh khối chứa glutamine với các
52
nồng độ: 0; 100; 300; 500 và 700mg/l để tạo khối tiền phôi soma Môi trường có kết quả tốt ở hình ảnh (a)
53
được sử dụng
54
Thí nghiệm 2: tạo phôi soma:
55
*Ảnh hưởng của nồng độ phytagel đến tạo phôi soma: Sau khi thu được lượng sinh khối đủ lớn (sau 2
56
lần cấy chuyền), khối tiền phôi soma (150mg) sẽ được cấy sang môi trường LVM cho thành thục hóa và tạo
57
phôi soma Môi trường LVM được bổ sung phytagel (4,6 và 10g/l); ABA (80g/l); maltose (60g/l)
58
*Ảnh hưởng của nồng độ Sucrose và Maltose đến tạo phôi soma: Sucrose và maltose ở các nồng độ
59
khác nhau (30,60 và 90g/l) được bổ sung vào môi trường LVM cho tạo phôi soma Các đĩa cấy tế bào tiền
60
phôi soma sẽ được nuôi cấy trong tối ở điều kiện như trên Số liệu thành thục hóa và phôi soma được ghi
61
nhận sau 12 tuần nuôi cấy
62
*Ảnh hưởng của một số nồng độ ABA đến tạo phôi soma: Môi trường cơ bản LVM được bổ sung ABA
63
(Abscisis acid) với một số nồng độ khác nhau (0;20;40;60;80;100 và 120mg/l) Tỷ lệ tạo phôi soma được ghi
64
nhận sau 12 tuần nuôi cấy
65
*Các số liệu thu được được phân tích bằng phần mềm SPSS ver 16.1
66
67
III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
68
3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường dinh dưỡng đến tạo phát sinh phôi
69
Sau 4 tuần nuôi cấy trên 3 loại môi trường dinh dưỡng khác nhau, một số phôi non được quan sát là đã
70
xuất hiện những tế bào màu trắng nhạt từ đầu phôi (hình A) Thực tế, sau khi cấy 2-3 tuần, trên một số phôi
71
đã xuất hiện một số tế bào giống như dạng dây treo ở đầu phôi Các tế bào này lớn dần hàng ngày Tuy
72
nhiên, phải đến tuần thứ 5, khi nhuộm những tế bào này bằng 1% IKI và quan sát dưới kính hiển vi thấy các
73
tế bào có hai phần rõ rệt: phần dây treo dài gồm một số tế bào dài, trong suốt và phần đầu gổm rất nhiều tế
74
bào đã phân chia và chứa đầy tế bào chất (hình C,D) Những cụm tế bào này mới được cho là tạo phát sinh
75
ổn định Tỷ lệ phát sinh phôi được tính dựa trên số liệu này
76
Bảng 1 Phản ứng tạo phát sinh phôi với các môi trường nuôi cấy
77
TT
Môi trường Tổng số phôi cấy Tỷ lệ tạo phát sinh phôi
(%)
Ghi chú: Các chữ a và b là mức độ sai khác có ý nghia thống kê ở 95%
78
Số liệu trên bảng 1 cho thấy trong ba môi trường dinh dưỡng cơ bản được sử dụng trong tạo phôi soma
79
loài quả nón thì phản ứng của phôi non thông nhựa với môi trường Litvay cải tiến (LVM) tốt hơn hai môi
80
trường TE và DCR Tỷ lệ tạo phát sinh phôi trên môi trường LVM là 18,74%, cao hơn một cách có ý nghĩa
81
so với hai môi trường TE và DCR (lần lượt là 8,68 và 9,52%, Bảng 1) Quan sát màu sắc của các thể phát
82
sinh trên môi trường LVM thấy có màu trắng xốp, ráo nước; trong khi màu sắc của thể phát sinh trên hai môi
83
trường kia ướt hơn Một số dạng phát sinh như hình (a,b) trong (A) đã được ghi nhận Những dạng này đều
84
không phát triển hoàn chỉnh thành đầu và dây treo mà chỉ là những tế bào gần tròn Sau 8-10 tuần, những tế
85
Trang 3bào này chuyển sang màu vàng, vàng nâu, nâu đậm rồi chết Như vậy, môi trường LVM tỏ ra hiệu quả hơn
86
trong tạo phát sinh phôi Thông nhựa và được sử dụng trong suốt thí nghiệm
87
Để tạo phát sinh phôi trên Pinus taeda (Loblloly pine), Tang và cộng sự (2001) đã sử dụng 6 loại môi
88
trường dinh dưỡng khác nhau và đã ghi nhận môi trường LOB có thành phần đa lượng vi lượng giống với
89
môi trường của Murashige & Skoog cho tỷ lệ tạo phát sinh phôi cao nhất trên gia đình E-440 (16,9%) Phản
90
ứng của các gia đình Loblolly pine với các môi trường TE và DCR đều ở mức tương đối thấp (lần lượt là
91
6,1-6,5%) Trong một nghiên cứu khác, Lelu và cộng sự (2006) đã sử dụng môi trường LVM để nuôi cấy
92
phôi non của Pinus pinaster và thu được phát sinh phôi trên 100% mẫu cấy Như vậy, có thể thấy rằng bên
93
cạnh các yếu tố môi trường nuôi cấy, việc tạo phát sinh phôi còn bị chi phối bởi yếu tố di truyền Các kiểu di
94
truyền khác nhau sẽ có phản ứng tạo phát sinh khác nhau với môi trường dinh dưỡng sử dụng Thí nghiệm
95
này còn ghi nhận thời gian thu hái phôi khác nhau, thể hiện giai đoạn phát triển khác nhau của phôi, cũng
96
cho phản ứng tạo phát sinh phôi khác nhau (số liệu chưa nêu ở đây)
97
3.2 Nghiên cứu nhân sinh khối
98
+Nghiên cứu ảnh hưởng của một số nồng độ glutamine đến tăng sinh khối tế bào tiền phôi soma
99
(embryogenesis)
100
Glutamine là một nguồn nitơ hữu cơ thường được sử dụng trong nuôi cấy invitro Trong các nghiên cứu
101
tạo phôi soma loài quả nón, glutamine cũng được ghi nhận là một trong những yếu tố cần thiết trong tạo
102
phát sinh, duy trì, thành thục hóa và tái sinh cây xanh Trong nghiên cứu này, một số nồng độ của glutamine
103
đã được bổ sung vào môi trường LVM Kết quả tăng sinh khối các tế bào tiền phôi soma được thể hiện trên
104
bảng 2
105
Bảng 2 Hiệu quả của một số nồng độ glutamine đến tăng sinh khối embryogenesis
106
TT
Nồng độ glutamine (mg/l)
Trọng lượng
ở tuần 1 (mg)
Số lần tăng Trọng lượng
ở tuần 2 (mg) Số lần tăng
Môi trường : LVM; Phytagel 8g/l; sucrose (20g/l); trọng lượng ban đầu: 150mg 2,4-D (2,0mg/l);
107
BA (3,0mg/l) Các chữ a, b, c, d và e là mức độ sai khác có ý nghia thống kê ở 95%
108
Số liệu trên bảng 2 cho thấy khi tăng nồng độ glutamine bổ sung vào môi trường từ 100 đến 500mg/l,
109
trọng lượng khối tế bào tiền phôi soma tăng rất nhanh, từ 1,76 đến 3,2 lần so với đối chứng Tuy nhiên, khi
110
glutamine được bổ sung ở 700mg/l thì trọng lượng khối tiền phôi giảm xuống còn 2,42 lần Sang tuần thứ 2,
111
tốc độ tăng trưởng ở 500mg/l cao gần gấp 2 lần so với ở 300mg/l Tuy nhiên tăng trưởng ở nồng độ này chỉ
112
cao hơn mức tăng trưởng ở tuần đầu là 1,42 lần Như vậy, so sánh trong cùng nồng độ glutamine, số liệu
113
trên bảng 2 cho thấy tỷ lệ tăng trưởng ở tuần thứ nhất cao hơn tuần thứ hai Các tế bào tiền phôi được
114
quan sát là có màu trắng bạc, ráo nước và xốp (hình B)
115
Thông thường, cấy chuyển được thực hiện 2 tuần/lần Các tế bào tiền phôi hình thành sau tuần thứ nhất
116
có thể được sử dụng cho những loại thí nhiệm khác Vào cuối tuần thứ 2 màu sắc các tế bào tiền phôi đã
117
chuyển sang màu trắng đục hay vàng nhạt và sự tăng sinh giảm dần Trong thí nghiệm tăng sinh khối của
118
Pinus strobus, Klimaszewska và cộng sự (2000) ghi nhận là có thể thu được 5-6 g tế bào tiền phôi sau 4
119
tuần nuôi cấy trên môi trường MLV từ 300mg vật liệu ban đầu Sở dĩ các tế bào tiền phôi có phản ứng tích
120
cực với glutamine trong tăng sinh khối có thể là do nguồn nitơ hữu cơ mà glutamine cung cấp dễ được đồng
121
hóa hơn các nguồn nitơ vô cơ khác Ngoài glutamine, nồng độ chất điều hòa sinh trưởng (2,4-D) và BA
122
cũng tác động đến gia tăng sinh khối
123
Trang 43.3 Nghiên cứu tạo phôi soma
124
*Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ phytagel đến tạo phôi soma
125
Kết quả những thí nghiệm sơ khởi cho thấy Phytagel có hiệu quả hơn các loại agar khác trong việc tạo
126
thể phát sinh phôi thông nhựa Vì thế một số nồng độ phytagel đã được thử nghiệm để tìm ra nồng độ thích
127
hợp cho tạo phôi soma
128
Số liệu trên bảng 3 cho thấy trong việc tạo phôi soma, không có sự bổ sung các chất điều hòa sinh
129
trưởng như BA, 2,4-D, mà thay vào đó là Abscisis (80mg/l) Kết quả trên bảng 3 ghi nhận ở những nồng độ
130
thấp (4 và 6 g/l) của phytagel được bổ sung vào môi trường LVM đều không có hiệu quả tạo phôi soma
131
thông nhựa Bề mặt đĩa cấy luôn ở tình trạng thừa ẩm độ làm cho các tế bào phôi cũng không còn ở trạng
132
thái xốp, ráo Tuy nhiên, khi lượng phytagel được nâng lên 10g/l, bề mặt đĩa cấy khô ráo Các tế bào tiền
133
phôi soma giữ được trạng thái khô ráo, xốp và các tế bào soma được ghi nhận hình thành từ tuần thứ 12
134
Số lượng phôi soma được ghi nhận là 23,5 từ 150mg tiền phôi cấy ban đầu Lượng 10g/l Phytagel dùng
135
trong giai đoạn thành thục hóa và tạo phôi soma cũng đã được Klimaszewska and Smith (1997) sử dụng và
136
thu được hiệu quả tốt trong tạo phôi soma Pinus strobus Tương tự, Klimaszewska và cộng sự (2000) đã
137
thử nghiệm một số loại agar khác nhau và quan sát thấy phytagel ở nồng độ 0.8% và 1.0% là tốt nhất trong
138
tạo phôi soma pinus Các tác giả này cho rằng phytagel ở nồng độ cao có thể thay thế PEG trong điều chỉnh
139
áp suất thẩm thấu của màng tế bào
140
141
Bảng 3 Ảnh hưởng của lượng Phytagel đến tạo phôi soma
142
Môi trường LVM; ABA (80mg/l) ; 150mg tiền phôi và Maltose 60g/l Các chữ a và b là mức độ sai khác có
143
ý nghia thống kê ở 95%
144
Thực tế, ở nồng độ cao, phytagel góp phần làm giảm ẩm độ trong đĩa cấy mẫu và điều kiện này đã kích
145
hoạt việc chuyển chương trình phân chia của tế bào tiền phôi sang giai đoạn tạo phôi (Klimaszewska và
146
cộng sự., 2000)
147
+Nghiên cứu hiệu quả của nồng độ sucrose và maltose đến tạo phôi soma
148
Thông thường đường (sucrose, maltose và một số loại khác) được biết là chất không những cung cấp
149
nguồn carbon mà còn là chất điều hòa áp suất thẩm thấu rất có hiệu quả trong nuôi cấy invitro nhiều loài cây
150
trồng khác nhau Sucrose cũng thể hiện hiệu quả tốt trong tạo phát sinh phôi thông nhựa trong nghiên cứu
151
này Tuy nhiên, trong giai đoạn thành thục hóa và tạo phôi soma, nhiều kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng
152
maltose có hiệu quả hơn sucrose
153
Ba nồng độ (30, 60 và 90g/l) của mỗi loại đường được bổ sung vào môi trường LVM để tìm hiểu phản
154
ứng tạo phôi soma của Thông nhựa Số liệu trên bảng 4 cho thấy chỉ có 0,8% phôi soma được hình thành
155
nếu bổ sung 30g/l sucrose, trong khi đó tỷ lệ hình thành phôi soma ở nghiệm thức bổ sung maltose là 3,4%
156
ở cùng nồng độ (30g/l)
157
Gia tăng nồng độ sucrose hay maltose từ 30 lên 90g/l đã làm gia tăng tỷ lệ tạo phôi soma từ 0,8 lên
158
21,67% đối với sucrose và 3,4 lên 40,8% cho đường maltose (hình E) Như vậy, rõ ràng là maltose ở nồng
159
độ 90g/l tỏ ra thích hợp cho việc tạo phôi soma ở Thông nhựa
160
Bảng 4 Hiệu quả của nồng độ sucrose và maltose trong tạo phôi soma
161
(%)
Sucrose
Trang 53 90 21,67 ± 10,04 a
Maltose
-Môi trường LVM; 150mg tiền phôi, ABA (80mg/l) , Phytagel 10g/l
162
-Các ch ữ a và b là mức độ sai khác có ý nghia thống kê ở 95%
163
Khi quan sát các phôi soma ở nghhiệm thức có bổ sung maltose, hình thái phôi soma thể hiện rõ nét, các
164
lá mầm hình thành nhanh hơn phôi trong nghiệm thức có bổ sung sucrose (hình F)
165
Khi tạo phôi soma ở Pinus sylvestris, Salajova và cộng sự (1999) đã ghi nhận bổ sung 6-9% maltose đã
166
làm gia tăng số phôi soma tạo thành Tương tự, Salajova và Salaj (2005) cũng đã chỉ ra phản ứng tạo phôi
167
soma khác nhau giữa ba gia đình Pinus nigra (E7, E15 và E16) khi được nuôi cấy trên môi trường có các
168
nồng độ maltose khác nhau (3,6 và 9%), theo đó chỉ có gia đình E 16 là tạo được phôi soma với lá mầm rõ
169
rệt ở 9% maltose Trong một kết quả công bố trên loài P densiflora, Shoji và cộng sự (2005) cũng cho biết
170
maltose thể hiện hiệu quả cao hơn hẳn sucrose trong tạo phôi soma ở mọi nồng độ Các tác giả đã ghi nhận
171
đã thu được 22 phôi soma trên 50mg tế bào tiền phôi trên môi trường DCR
172
Tuy nhiên, Percy và cộng sự (2000) lại cho rằng sucrose ở nồng độ từ 6-9% đều không phù hợp cho
173
phát triển của phôi Pinus brutia TEN vì nồng độ sucrose cao có thể gây độc cho tế bào Trong khi nhiều tác
174
giả khác cho rằng nên giữ nồng độ sucrose ở 30g/l như trong giai đoạn tăng sinh khối (Lipavska và cộng sự
175
2000), nhiều người khác lại cho là sucrose có thể được sử dụng từ 10 đến 60g/l trong môi trường thành
176
thục tế bào (Iraqi and Tremblay 2001) để đạt hiệu quả cao
177
+Nghiên cứu hiệu quả của nồng độ Abscisis (ABA) đến tạo phôi soma
178
Vai trò của Abscisic acid đã được chứng minh là rất quan trọng trong tạo phôi soma Abscisis đóng vai
179
trò như một cái ngắt, chuyển giai đoạn phát triển của tiền phôi sang tạo phôi
180
Trong nghiên cứu này 7 nồng độ của ABA được thử nghiệm Số liệu trên bảng 5 cho thấy tỷ lệ tạo phôi
181
soma tăng từ 7% đến 12% khi môi trường nuôi cấy LVM được bổ sung từ 20 đến 60 mg/l ABA Tiếp tục gia
182
tăng nồng độ ABA lên 80, 100 và 120mg/l, tỷ lệ phôi soma hình thành có xu hướng giảm (từ 24,33 xuống
183
còn 15,3%, bảng 5) Như vậy, nồng độ 80mg/l ABA được xem là phù hợp cho tạo phôi soma thông nhựa
184
Hình thái, màu sắc phôi cũng được ghi nhận là tốt và có tiềm năng phát triển tạo cây xanh
185
Bảng 5: Hiệu quả của nồng độ ABA đến tạo phôi soma
186
TT
Nồng độ ABA (mg/l) Tỷ lệ tạo phôi soma (%)
- Môi trường LVM; 150mg tiền phôi; 10g/l phytagel
187
- Các chữ a, b và c là mức độ sai khác có ý nghia thống kê ở 95%
188
Nồng độ ABA trong nghiên cứu này cao hơn kết quả đạt được trên red spruce do Harry & Thorpe (1991)
189
công bố trước đó Theo đó, các tác giả này ghi nhận 40µM ABA (≈10,57mg/l) cần được bổ sung vào môi
190
trường nuôi cấy tiền phôi của red spruce để có được sự phát triển bình thường của phôi Nhưng ở Picea
191
glauca thì để phôi phát triển bình thường, môi trường nuôi cấy chỉ cần bổ sung 12 µM là đủ (Attree và cộng
192
sự 1990) Người ta cho rằng khoảng 6 giờ sau khi bổ sung ABA, thay đổi trong mức độ thể hiện gene và
193
việc tổng hợp protein đã được phát hiện Một loạt các phản ứng khác do hiệu ứng của thể hiện gene được
194
phát hiện ở 24 giờ sau khi bổ sung ABA (Dunstan và cộng sự 1998) Ngược lại, Lelu và cộng sự (1999) đã
195
Trang 6ghi nhận ABA ở nồng độ 60-120µM là cần thiết cho việc tạo phôi soma của các loài quả nón Điều này có
196
thể thấy phản ứng của các loài quả nón khác nhau với nồng độ ABA bổ sung cũng rất khác nhau
197
198
MỘT SỐ HÌNH ẢNH TẠO PHÁT SINH PHÔI VÀ PHÔI SOMA
199
200
201
202
203
204
Ghi chú: Một số hình ảnh các bước tạo phát sinh phôi và phôi soma thông nhựa
205
(A) Phôi non sau 4 tuần nuôi cấy; (B) Nhân sinh khối thể tiền phôi soma (embryogenesis); (C)(D) Tế bào
206
tiền phôi nhìn dưới kính hiển vi; (E): Hình thành phôi soma; (F): Phát triển lá mầm
207
208
IV KẾT LUẬN
209
Nghiên cứu tạo phát sinh phôi và tạo phôi soma Thông nhựa đã được thực hiện bằng nuôi cấy phôi non
210
Trong số các môi trường dinh dưỡng, môi trường LVM được ghi nhận có hiệu quả nhất cho tạo phát sinh
211
phôi Để duy trì và nhân nhanh khối tiền phôi, nồng độ glutamine (500mg/l) được ghi nhận là thích hợp Thí
212
nghiệm ảnh hưởng của một số yếu tố đến tạo phôi soma cho thấy phytagel 10g/l có hiệu quả tốt Bên cạnh
213
đó, nên bổ sung đường maltose (90g/l) và ABA (80mg/l) để thu được số lượng và chất lượng được cải thiện
214
của phôi soma Việc nghiên cứu tạo cây xanh từ phôi soma và nuôi cấy cây con trong vườn ươm đang
215
được tiến hành
216
217
TÀI LIỆU THAM KHẢO
218
Attree SM, Budimir S & Fowke LC, 1990: Somatic embryogenesis and plantlet regeneration from cultured
219
shoots and cotyledons of seedlings from stored seeds of black and white spruce (Picea mariana & Picea
220
glauca) Can.J Bot 68: 30-34
221
Dunstan DI; Dong J-Z; Carrier DJ & Abrams S, 1998: Events following ABA treatment of spruce somatic
222
embryos In vitro Cel Dev Biol-Plant 34: 159-168
223
Gupta P.K., Durzan D.J 1986 Plantlet regeneration via somatic embryogenesis from subcultured callus
224
of mature embryos of Picea abies (Norway spruce) In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant 22:
225
685–688
226
Harry IS & Thorpe TA, 1991: Somatic embryogenesis and plantlet regenration from mature zygotic
227
embryos of red spruce Bot Gaz 152 446-452)
228
Iraqi D and Tremblay FM, 2001 The role of sucrose during maturation of black spruce (Picea mariana)
229
and white spruc (Picea glauca) somatic embryos Physiol Plant.111: 381-388
230
Klimaszewska K and Smith DR, 1997: Maturation of somatic embryos of Pinus strobus is promoted by a
231
high concentration of gellan gum Physiol Plant.100: 949-957
232
Klimaszewska K, Bernier-Cardou M, Cry DR, Sutton BCS, 2000 Influence of gelling agents on culture
233
medium gel strength, water availability, tissue water potential,
234
D
C
b
a
Trang 7and maturation response in embryogenic cultures of Pinus strobus L In Vitro Cell Dev Biol—Plant
235
.36:279-286
236
Klimaszewska K; Park YS; Overton C; Maceachero I and Bonga JM, 2001: Optimized somatic
237
embryogenesis in Pinus strobus L In vitro Cell Dev Biol-Plant 37: 392-399
238
Lelu MA; Cadou MB & Klimasewska K, 2006: Simplified and improved somatic embryogenesis for clonal
239
propagation of Pinus pinaster (Ait.) Plant Cell Rep 25: 767-776
240
Lelu MA; Bastien C; Drugeault A; Gouez ML and Klimaszewska K, 1999: Somatic embryogenesis and
241
plantlet development I Pinus sylvestris and Pinus pinaster on medium with and without growth regulators
242
Physiol Plant 105: 719-728
243
Lipavska H; Svobodova H; Albrechtova J; Kumstyrova L; Vagner M and Vondrakova Z, 2000 Somatic
244
embryogenesis in Norway spruce: carbohydrate status during embryo maturation and the effect of
245
Polyethylene glycol treatment In vitro Cell Dev Biol-Plant 36: 260-267
246
Litvay J.D., Verma D.C., Johnson M.A 1985 Influence of loblolly pine (Pinus taeda) culture medium and
247
its components on growth and somatic embryogenesis of the wild carrot (Daucus carota) Plant Cell Reports
248
4: 325–328
249
Percy RE; Klimaszewska K and Cyr DR, 2000: Evaluation of somatic embryogenesis for clonal
250
propagation of western white pine Can.J.For Res 30: 1867-1876
251
Salajova T Salaj J & Kormutak A, 1999: Initiation of embryogenesis tissues and plantlet regeneration
252
from somatic embryos of Pinus nigra Arn.Plant Sci 145: 33-40
253
Salajova T, Salaj J, 2005 Somatic embryogenesis in Pinus nigra: embryogenic tissue initiation,
254
maturation and regeneration ability of established cell lines Biol Plant 49:333–339
255
Shoji M, Sato H , Nakagawa R Funada R, Kubo T and Ogita S, 2005 Influence of osmotic pressure on
256
somatic embryo maturation in Pinus densiflora J For Res (2006) 11: 449-453
257
Tang, W.; Ouyang, F.; Guo, Z C, 1998 Plant regeneration though organogenesis
258
from callus induced from mature zygotic embryos of loblolly pine Plant Cell Rep 17:557-560;
259
Tang W, Guo ZC and OUYANG F, 2001 Plant regeneration from embryogenic cultures initiated from
260
mature Loblolly pine zygotic embryos In Vitro Cell Dev Biol-Plant 37: 558 - 563
261
262
STUDY ON INVITRO INITIATION AND MATURATION OF EMBRYOGENESIS FROM PINUS
263
MERKUSII
264
265
Vuong Dinh Tuan, Nguyen Xuan Cuong, Phan Thi My Lan
266
South Forest Science Sub-Institute
267
268
SUMMARY
269
Induction of initiation and zygotic embryo formation has been studied on Pinus merkusii Immature zygotic
270
embryos show good response to modified Litvey’s cultue medium supplemented with 2,4-D (2,0mg/l) and BA
271
(3,0mg/l) in initiation Addition of 500mg/l glutamine to the culture medium has increased proliferartion rate of
272
embryogenic tissues upto 3 times in the first week of culture Combination of 90g/l maltose and 80mg/l ABA
273
in LVM solidified by 10g/l phytagel shows a higher effect than sucrose at the same concentration in
274
maturation of embryogenic tissues Factors influence on plantlet regeneration from somatic embryos and
275
transferring to nursery is under study
276
Keywords: Pinus merkusii, initiation and somatic embryo formation, maltose & sucrose
277
