Xây dựng bộ sưu tập giống vi khuẩn lên men lactic có hoạt tính probiotics

Với ý nghĩa đó em mong muốn đóng góp thêm vào nguồn vi khuẩn probiotic những chủng vi khuẩn lactic mới từ những nguồn chứa vi khuẩn lactic an toàn như thực phẩm lên men và các nguồn đã đ

SVTH: Dương Thúy Vy 1

LỜI MỞ ĐẦU

Xu hướng của con người ngày nay là quay về sử dụng các sản phẩm mang

tính thiên nhiên như từ động vật, thực vật và cả vi sinh vật…, khai thác những kinh

nghiệm cổ truyền kết hợp với kỹ thuật hiện đại và hạn chế tối đa việc đưa các hoá

chất vào cơ thể Vì vậy, khuynh hướng sử dụng liệu pháp thay thế cho liệu pháp

kháng sinh dùng trong điều trị bệnh ngày càng được chú trọng Có thể nói, liệu

pháp dùng probiotic được xem là liệu pháp thay thế khắc phục được những nhược

điểm của liệu pháp dùng kháng sinh như gây nhiều phản ứng phụ cho bệnh nhân,

chi phí lại cao và tình trạng kháng kháng sinh của vi sinh vật gây bệnh Từ lâu con

người đã biết sử dụng probiotics như một thực phẩm bảo vệ sức khỏe nhưng vào

những năm gần đây probiotics mới được đánh giá cao và nghiên cứu sâu hơn

Probiotic là tên gọi chung để chỉ những vi khuẩn có lợi ký sinh bên trong

ruột Từ “probiotic” được bắt nguồn từ Hy Lạp, có nghĩa tiếng Anh là “for life”

nghĩa là “dành cho cuộc sống” Định nghĩa của Tổ chức y tế thế giới và Tổ chức

lương nông thế giới (WHO/FAO) đề nghị vào năm 2001: “Probiotic là những vi

sinh sống trong đó khi được quản lý phù hợp về mật độ đem lại lợi ích cho sức khỏe

trên vật chủ”

Kể từ lúc được phát hiện ra vào đầu thế kỷ 20 bởi nhà bác học người Nga

Elie Matchnikoff, ngày nay probiotics đã được coi như một loại “thần dược” tự

nhiên giúp con người tăng cường sức đề kháng, cải thiện hệ tiêu hoá và giúp chống

lại rất nhiều bệnh tật phát sinh từ bên trong đường ruột, tuy nhiên các chế phẩm

probiotics (thường gọi là men tiêu hoá) không phải là thuốc, mà được xếp vào

nhóm chất bổ sung dinh dưỡng hay thực phẩm chức năng

Chính vì những lợi ích trên và theo quan điểm phòng bệnh hơn chữa bệnh, ở

các nước phát triển có xu hướng sử dụng các loại thực phẩm có lợi ích cho sức khỏe

nhiều hơn là sử dụng thuốc điều trị, cho nên các sản phẩm có chứa probiotics đã

được sử dụng tại rất nhiều nước trên toàn thế giới như Mỹ, Nhật Bản và Châu Âu…

Probiotics đã được bổ sung vào rất nhiều sản phẩm như thực phẩm thông thường:

sữa chua để ăn, sữa chua lỏng để uống, nước trái cây…đến các thực phẩm bổ sung

SVTH: Dương Thúy Vy 2

dành cho người bệnh và dưới dạng thuốc không cần kê toa như viên nén, hay dạng

bột… Châu Âu dẫn đầu trong việc tiêu thụ probiotic Mỗi người dân Pháp tiêu thụ

trung bình hằng năm 33kg yogurt trong khi mỗi người dân Mỹ chỉ tiêu thụ có 4 kg

Hiện nay tại Việt Nam đã xuất hiện trên thị trừơng một số thực phẩm chứa

probiotics như Probi (Vinamilk), Sữa uống Yakult (Yakult)

Ở nước ta hiện tại cũng đang đẩy mạnh việc nghiên cứu để sản xuất probiotic

dùng trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản Tuy nhiên sản phẩm tinh chế thì giá

thành còn cao nên hiện nay nước ta vẫn sử dụng nguồn nguyên liệu chủ yếu là các

loại phụ phẩm của ngành nông nghiệp Do đó giá thành của probiotic giảm xuống

nhiều và cũng giúp cho vật nuôi tiêu hóa tốt hơn, giảm tỉ lệ bệnh và góp phần cải

thiện môi trường

Vi khuẩn dùng rộng rải trong sản xuất probiotics và được thử nghiệm lâm

sàng nhiều nhất, là các loại Lactobacillus (như L acidophilus, L rhamnosus, L

bulgaricus, L reuteri và L casei); nhiều chủng Bifidobacterium và Saccharomyces

boulardii là những vi nấm không gây bệnh Như vậy vi khuẩn lactic là một trong

những nguồn vi khuẩn probiotic quan trọng nhất, chiếm ưu thế cao

Tóm lại, nghiên cứu phát triển và ứng dụng probiotics vào cuộc sống là một

công việc cần được quan tâm và đầu tư nhiều hơn nữa Với ý nghĩa đó em mong

muốn đóng góp thêm vào nguồn vi khuẩn probiotic những chủng vi khuẩn lactic

mới từ những nguồn chứa vi khuẩn lactic an toàn như thực phẩm lên men và các

nguồn đã được nghiên cứu là có chứa hệ vi sinh vật đường ruột, có tính kháng

khuẩn cao và những hoạt tính probiotic tốt nhất qua đồ án tốt nghiệp của em: “XÂY

DỰNG BỘ SƯU TẬP GIỐNG VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC CÓ HOẠT TÍNH

PROBIOTICS” Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm của trường đại học Kỹ

Thuật Công Nghệ, thành phố Hồ Chí Minh

SVTH: Dương Thúy Vy 3

Chương 1: GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề:

Từ trước đến nay, vi khuẩn vẫn luôn bị mang tiếng xấu vì con người thường

gắn liền chúng với bệnh tật Nhưng trên thực tế, có rất nhiều loại vi khuẩn có ích

cho chúng ta Trong hệ tiêu hóa của chúng ta có một hệ vi sinh vật với số lượng rất

lớn, trong đó có hơn 400 loài vi khuẩn khác nhau (Melissa peterson et al., 2002),

chúng được xếp vào 2 loại: vi khuẩn gây bệnh và vi khuẩn có ích Các loài vi khuẩn

sống chung với nhau tạo thành hệ sinh thái ổn định, cân bằng và là hàng rào bảo vệ,

giúp cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh đường ruột cũng như duy trì một số

hoạt động chuyển hóa của cơ thể Vi khuẩn có ích càng nhiều thì hệ tiêu hóa càng

khỏe mạnh

Các nhà khoa học mỗi ngày hiểu biết nhiều hơn về vai trò của vi khuẩn trong

việc giữ cho sức khỏe con người và nhiều lợi ích về sức khỏe liên quan đến sử dụng

đúng loại hình và mức độ của vi sinh sống Nó đang được ứng dụng rộng rãi vào

đời sống con người bởi vì tính hợp lý và hiệu quả mà nó thể hiện Probiotics với

phương cách là bổ sung những chủng vi sinh vật hữu dụng vào cơ thể nhằm làm

tăng hiệu quả sử dụng thức ăn, tăng và đảm bảo tính an toàn về sức khoẻ

Trên quan điểm về an toàn sinh học, an toàn thiết thực thì probiotics đang

chiếm thế thượng phong so với một số phương cách khác Vì rằng tính hiệu quả của

probiotics (tính trị bệnh) là sự điều hoà an toàn, tự nhiên, không làm tồn dư kháng

sinh, và phần lớn không có bất cứ ảnh hưởng có hại nào Mà với sự khắt khe của

con người thì điều này là số một Hiệu quả tác dụng của probiotics không chỉ đơn

thuần là làm thức ăn ngon hơn mà có rất nhiều tác dụng, như: tiêu hoá thức ăn và

làm bớt sự rối loạn tiêu hoá; đẩy mạnh sự tổng hợp vitamin B và một số enzyme

tiêu hoá; cải thiện sự dung nạp lactose; cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột: chúng

chiếm chỗ và trung hòa độc tố của các vi khuẩn có hại, làm giảm số lượng vi khuẩn

gây hại đồng thời tăng cường tạo các kháng thể giúp nâng cao khả năng miễn

dịch…; ngăn chặn những chỗ loét trong hệ thống tiêu hoá; ngăn chặn viêm; giảm

cholesterol; giảm tỷ lệ chết non; tăng trọng nhanh…(Theo kết quả công trình nghiên

SVTH: Dương Thúy Vy 4

cứu đạt giải Nobel y học về lợi ích của men vi sinh đối với sức khỏe của nhà bác

học người Nga Elie Metchnikoff)

Probiotics có nhiều chủng khác nhau và hiệu quả của probiotics có liên quan

đến chủng vi khuẩn cụ thể Trong đó Lactobacillus rhamnosus GG và

Bifidobacterium lactic Bb-12 là hai chủng vi khuẩn có tác dụng tăng cường tiêu hóa

và miễn dịch cho cơ thể Vì vậy nguồn vi khuẩn probiotic càng phong phú sẽ góp

thêm khả năng phòng và trị bệnh nhằm bảo vệ sức khỏe cho con người

Ở Việt Nam, probiotics cũng là đề tài mới được quan tâm trong những năm

gần đây, chủ yếu theo hướng thành lập bộ sưu tập các chủng probiotics dựa trên

họat tính kháng vi sinh vật và ứng dụng bước đầu trong dược phẩm, thức ăn gia súc

thủy sản và công nghệ lên men truyền thống Nguồn vi sinh vật có họat tính ở Việt

Nam rất dồi dào và đang là đối tượng quan tâm của nhiều Trường đại học và Viện

nghiên cứu

1.2 Mục đích đề tài:

Xây dựng bộ sưu tập các vi khuẩn lên men lactic có nguồn gốc từ thực phẩm

lên men và hệ vi sinh đường ruột có hoạt tính probiotics để làm giống khởi động lên

men truyền thống, giống sản xuất chất bảo quản sinh học (bacteriocin) và chế phẩm

vi sinh bổ sung vào thức ăn cho người, gia súc

1.3 Nội dung đề tài:

- Phân lập vi khuẩn lactic từ các nguồn mới như một số loại thực phẩm lên

men và phân của trẻ sơ sinh

- Định danh các chủng vi khuẩn lactic đến cấp giống và hướng đến định danh

cấp loài

- Kiểm tra hoạt tính probiotic của những chủng vi khuẩn lactic phân lập được

như khả năng kháng khuẩn, khả năng chịu được acid và muối mật

- Bảo quản các giống vi khuẩn lactic có hoạt tính probiotic theo điều kiện

của phòng thí nghiệm và bổ sung những chủng vi khuẩn mới vào bộ sưu tập giống

SVTH: Dương Thúy Vy 5

1.4 Ứng dụng của đề tài :

Sử dụng những chủng vi khuẩn lactic đã phân lập có tiềm năng probiotic cao

vào sản xuất ở qui mô công nghiệp

Nhóm vi khuẩn lactic có nhiều ứng dụng trong lĩnh vực chế biến thực phẩm

Các chủng vi khuẩn lactic đã phân lập, ngoài mục đích phục vụ cho việc nghiên

cứu, chúng còn có thể sử dụng làm vi khuẩn khởi động cho các thưc phẩm lên men

ở quy mô công nghiệp hoặc nuôi cấy để tách chiết bacteriocin đối với những chủng

có khả năng sinh bacteriocin cao

SVTH: Dương Thúy Vy 6

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng Quan Về Probiotics :

2.1.1 Lịch sử nghiên cứu Probiotics:

Từ cổ xưa, mặc dù chưa nhận thức được sự tồn tại của vi sinh vật, nhưng loài

người đã biết khá nhiều về các tác dụng của chúng Trong sản xuất và đời sống, họ đã

tích lũy được nhiều kinh nghiệm và các biện pháp lợi dụng các vi sinh vật có ích và

phòng tránh các vi sinh vật có hại Việc lên men lactic (muối dưa) để bảo quản thực

phẩm được thực hiện vào khoảng năm 3500 trước Công Nguyên

Ngoài ra, việc sử dụng vi sinh vật sống nhằm tăng cường sức khỏe con người

không phải là mới Hàng nghìn năm trước, rất lâu trước khi có thuốc kháng sinh, con

người đã biết tiêu thụ các thực phẩm chứa vi sinh vật sống có lợi chẳng hạn như các sản

phẩm sữa lên men Bằng chứng về quá trình sản xuất sữa lên men được ghi trong kinh

thánh (“Book of Genesis”) Theo Ayurveda, một trong số ngành y học lâu đời nhất là

khoảng 2500 năm trước Công Nguyên, sự tiêu thụ sữa chua (sữa lên men) đã được ủng

hộ để duy trì sức khỏe tốt (Chopra và Doiphode, 2002) Các nhà khoa học đầu tiên, như

Hippocrates được xem là người sáng lập ra nền y học hiện đại và những người khác

cũng chỉ định sữa lên men với tính chất dinh dưỡng và thuốc của nó, để chữa trị rối loạn

ruột và dạ dày

Năm 1857, các vi khuẩn lên men lactic (LAB) lần đầu tiên được phát hiện bởi

Louis Pasteur (Nguyễn Lân Dũng, 2005)

Năm 1878, báo cáo của Lister về việc cô lập vi khuẩn lactic từ sữa ôi, và sau đó

các vi khuẩn này cũng được cô lập từ đường ruột

Vào thế kỷ 20, trong thời gian là giáo sư tại viên Pasteur ở Paris, nhà khoa học

người Nga Elie Metchnikoff đã tiến hành nghiên cứu những tác động có lợi của LAB

đối với sức khỏe của con người và động vật Ông cho rằng sự lão hóa của con người là

do sự thối rửa của các protein và và các chất gây độc từ vi sinh vật bên trong ruột Ông

SVTH: Dương Thúy Vy 7

quan sát thấy những người dân ở Châu Âu, như người Bulgari và người Nga, họ có cuộc

sống thọ và khỏe mạnh Đó là kết quả của việc họ đã tiêu thụ lượng lớn sữa lên men

Ông kết luận việc tiêu thụ các sản phẩm lên men từ trực khuẩn (Lactobacillus) sẽ có ảnh

hưởng tích cực đến hệ vi khuẩn đường ruột do acid lactic và hợp chất sinh ra có tác

dụng hạn chế sự thối rửa và ngăn chặn các hoạt động của vi khuẩn gây hại trong ruột (A

Mercenier et all, 2002) Điều này khiến cho Metchnikoff đã khuyên trong sách của ông

rằng uống đồ uống chứa các lợi khuẩn sống như vi khuẩn lactic sẽ ngăn cản lão hóa (E

Metchnikoff, 1907)

Trong bài thảo luận " Việc kéo dài cuộc sống " (The prolongation of life),

Metchnikoff đã tuyên bố "Sự phụ thuộc của hệ vi sinh vật trong ruột đối với thực phẩm

làm cho nó có khả năng chấp nhận biện pháp thay đổi hệ vi sinh vật trong người của

chúng ta, tức là thay thế vi sinh vật có hại bởi vi sinh vật hữu ích” (Metchnikoff, 1907)

và theo ông, những chủng vi khuẩn có thể hoặc không gây hại cho con người nhưng trái

lại rất nhiều trong số đó có một vai trò quan trọng đối với sức khỏe của chúng ta Theo

lý thuyết trên, Năm 1908, Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra khái niệm “probiotic”

Trong một vài năm trước, bài thảo luận cuả Metchnikoff, Pastuer và Joubert, khi

quan sát sự đối kháng giữa các chủng vi khuẩn, đã kết luận sự tiêu thụ vi khuẩn không

gây bệnh để kiểm soát các vi khuẩn gây bệnh

Cùng thời gian đó, Henry Tissier đã phân lập được Bifidobacteria, một chủng

thuộc nhóm vi khuẩn lactic, từ phân của trẻ được nuôi bằng sữa mẹ, ban đầu có tên

thông thường là Bacillus bifidus, sau đó được xếp vào giống Bifidobacterium và nghiên

cứu nhận thấy chúng là một thành phần nổi bật của hệ vi sinh vật ruột (Ishibashi và

Shimamura, 1993) Tissier tin rằng Bifidobacteria trong cơ thể trẻ sẽ thay thế các vi

khuẩn gây thối rữa và bệnh tật Như vậy tương tự như Metchnikoff, Tissier tin vào giả

thuyết ảnh hưởng lớn của Bifidobacteria tới số trẻ em này (O ' Sullivan et al., 1992) Lý

thuyết của ông được khẳng định bởi quan sát lâm sàng trẻ nuôi bằng sữa mẹ so với trẻ

được nuôi bằng sữa hộp (Rasic và Kurmann, 1983)

Trong suốt giai đoạn bùng phát của bệnh do vi khuẩn Shigella vào năm 1917,

giáo sư người Đức Alfred Nissle đã phân lập được một chủng thuộc Escherichia coli từ

SVTH: Dương Thúy Vy 8

phân của một người lính không bị nhiễm bệnh ( Med Klin, 1918) Lúc bấy giờ vẫn chưa

có thuốc kháng sinh, Nissle đã sử dụng chủng Escherichia coli Nissle 1917 để điều trị

các bệnh nhiễm trùng đường ruột cấp tính do Salmonella và Shigella

Năm 1920, Rettger chứng minh rằng chủng Bulgarian bacillus của Metchnikoff (

sau đổi thành Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus) không thể sống trong đường

ruột của con người (Cheplin và Rettger, 1920) và hiện tượng hư hỏng của các thực

phẩm lên men đã gây ra những tranh cãi về lý thuyết của Metchnikoff trong giai đoạn

này

Sau khi Metchnikoff mất (1916), các nghiên cứu tập trung ở Mỹ nhiều lý luận

cho rằng vi khuẩn từ ruột có rất nhiều khả năng tạo ra các tác động có ích bên trong

ruột, và vào năm 1935 một số chủng thuộc Lactobacillus acidophilus được tìm thấy có

ảnh hưởng tốt khi được cấy vào ruột Nhiều thử nghiệm được tiến hành với các chủng

này và kết quả thu được đã thúc đẩy việc áp dụng trong điều trị táo bón mãn tính

Đến nay, việc nghiên cứu về việc sử dụng vi khuẩn lactic trong chế độ ăn uống

vẫn được tiếp tục Trong khi công việc ở giai đoạn trước của thế kỷ qua là đề cập đến

việc sử dụng sữa lên men để điều trị bệnh lây nhiễm đường ruột, các nghiên cứu gần đây

đã tập trung vào lợi ích sức khỏe khác của các vi sinh vật này cũng như về bảo đảm sự

sống sót của các vi khuẩn này khi ở trong vùng dạ dày-ruột và các loại thực phẩm để

vận chuyện chúng vào trong cơ thể con người (Lourens - Hattingh và Viljoen, 2001; Tri

I Wirjantoro et al, 2008; Nagendra P Shah et al, 1997 ) Rõ ràng nền tảng cho khái

niệm hiện đại về probiotics đã được thành lập

Các kiến thức có được về probiotics thông qua nhiều nghiên cứu đã thúc đẩy

mạnh mẽ ngành công nghiệp các sản phẩm sữa Từ các quan sát từ sớm của Eli

Metchnikoff và các nhà nghiên cứu khác, lịch sử của probiotics với sản phẩm sữa lên

men đã tiếp tục cho đến tận hiện đại Điều này hiển nhiên được thấy rõ qua thực tế ngày

hôm nay của thị trường thực phẩm sữa-probiotic khổng lồ đang tồn tại

SVTH: Dương Thúy Vy 9

2.1.2 Định nghĩa về Probiotics

Từ “probiotics” (pro-bios) có nguồn gốc từ Hy Lạp có nghĩa là “cho cuộc sống”

Năm 1908, Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra khái niệm “probiotic” Tuy nhiên,

định nghĩa về probiotics đã phát triển nhiều theo thời gian

Lily và Stillwell (1965) đã mô tả trước tiên probiotics như hỗn hợp được tạo

thành bởi một động vật nguyên sinh mà thúc đẩy sự phát triển của đối tượng khác Phạm

vi của định nghĩa này được mở rộng hơn bởi Sperti vào đầu những năm 70 bao gồm

dịch chiết tế bào thúc đẩy phát triển của vi sinh vật (Gomes và Malcata, 1999)

Sau đó, Parker đã áp dụng khái niệm này đối với phần thức ăn gia súc có một

ảnh hưởng tốt đối với cơ thể vật chủ bằng việc góp phần vào cân bằng hệ vi sinh vật

trong ruột của nó Vì vậy, khái niệm “probiotics” “được Parker đề nghị là “những sinh

vật và các chất góp phần cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột” (Parker et al, 1974)

Định nghĩa chung này sau đó được làm cho chính xác hơn bởi Fuller, ông định

nghĩa probiotics như “một chất bổ trợ thức ăn chứa vi sinh vật sống mà có ảnh hưởng có

lợi đến vật chủ bằng việc cải thiện cân bằng hệ vi sinh vật ruột của nó” (Fuller, 1989)

Khái niệm này sau đó được phát triển xa hơn : “vi sinh vật sống (vi khuẩn lactic và vi

khuẩn khác, hoặc nấm men ở trạng thái khô hay bổ sung trong thực phẩmlên men) mà

thể hiện một ảnh hưởng có lợi đối với sức khỏe của vật chủ sau khi được tiêu hóa nhờ

cải thiện tính chất hệ vi sinh vật vốn có của vật chủ” ( Havenaar và Huis in't Veld,

1992)

Tuy nhiên, nghiên cứu gần đây đã chứng minh vùng ruột thật sự là một hệ sinh

thái vi sinh vật ở người trưởng thành ( Tannock, 1990 ); mặc dù phương pháp trị liệu

kháng sinh, bệnh tật hoặc thay đổi chế độ ăn có thể dẫn đến thay đổi hệ sinh thái này,

nhưng trạng thái mất cân bằng này dường như có khả năng tự hiệu chỉnh ( Tannock,

1983 ) Vi khuẩn probiotic được tiêu thụ với số lượng lớn cũng không đủ để trở thành

chủng chiếm ưu thế trong ruột và có thể hiếm khi được phát hiện trong mẫu ruột hoặc

phân sau một hay hai tuần sau sự tiêu hóa

Do đó, quan trọng là chúng ta phải hiểu trên thực tế ảnh hưởng của probiotic có

thể được đem lại bởi các sự kết hợp và cơ cấu hoạt động ít thân thiết hơn và tạm thời

SVTH: Dương Thúy Vy 10

hơn so với hệ vi sinh vật của người (Sanders, 1999) Vì vậy, định nghĩa về probiotics

hiện tại chỉ còn là “vi sinh vật sống mà đi ngang qua vùng ruột và làm lợi cho sức khỏe

của người tiêu dùng” ( Tannock et al., 2000 )

Hiện nay theo định nghĩa của FAO/WHO (2001) : “Probiotics là những vi thể

sống mà với số lượng được kiểm soát hợp lý sẽ giúp bồi bổ sức khoẻ cho người tiếp

nhận”

Tóm lại, Probiotic là những vi sinh vật sống hữu dụng được đưa trực tiếp vào

trong thực phẩm Khi vào đường tiêu hóa chúng không bị giết bởi diều kiện môi trường

và enzyme trong cơ thể mà chúng có khả năng tồn tại, phát triển trong ống tiêu hóa

Chúng không gây hại cho cơ thể vật chủ, trái lại chúng còn ức chế vi sinh vật có hại, tiết

ra enzyme tiêu hóa các chất dinh dưỡng mà cơ thể vật chủ không tiêu hóa được để tạo ra

các acid hữu cơ hạ pH ruột già, chống lại sự lên men thối, nhờ thế mà bảo vệ tốt đường

tiêu hóa, cải thiện sự tiêu hóa và hấp thu dinh dưỡng của sinh vật chủ

2.1.3 Probiotic, prebiotic và synbiotic

Từ lý thuyết về probiotic , dẫn đến những khái niệm về prebiotic và synbiotic

Prebiotic được định nghĩa và đặt tên đầu tiên bởi Marcel Roberfroid (1995)

(Gibson GR, Roberfroid MB 1995) Prebiotic là hợp chất trong thức ăn không được tiêu

hóa ở đoạn trên ống tiêu hóa do cơ thể vật chủ không có Enzyme tương thích, nhưng sau

khi đi xuyên qua dạ dày, ruột non xuống ruột già, chúng lại kích thích sự sinh trưởng

của vi khuẩn hữu ích phát triển, làm thay đổi hệ vi sinh vật đường ruột ( Lactobacilli

hoặc Bifidobacteria) theo hướng có lợi cho vật chủ Sau đó khái niệm này đã được sửa

đổi như sau “Prebiotic là những thành phần lên men một cách có chọn lọc , cho phép

diễn ra một số thay đổi cụ thể cả về thành phần và hoạt động của hệ vi sinh vật bên

trong đường tiêu hóa, mà những vi sinh vật này mang lại lợi ích cho vật chủ ”

(Roberfroid, 2007) Prebiotic có vai trò gián tiếp đối với sức khỏe con người

Prebiotic được so sánh với các thực phẩm chức năng Prebiotic bao gồm các hợp

chất carbohydrates và cả non-carbohydrates, phổ biến nhất là các dạng chất xơ hòa tan

(soluble fiber) có trong các loại thực phẩm thô (dietary fiber) Thêm vào đó, sau khi

SVTH: Dương Thúy Vy 11

xem xét lại các prebiotic năm 2007, Roberfroid chỉ ra rằng có 2 loại

fructo-oligosaccharides (FOS) cụ thể bổ sung đầy đủ cho khái niệm của ông, đó là

oligofructose và inulin (Roberfroid,2007) và cho biết có thể đưa ra một số chất khác làm

prebiotic Nhiều chuyên gia tiến hành phân biệt các galactooligosaccharides (GOS) là

prebiotic thật sự GOS là một chất có nguồn gốc từ động vật được sản xuất bằng cách

chiết xuất đường sữa từ các sản phẩm sữa hoặc sử dụng các enzyme để phân hủy chúng

Các tiêu chí cơ bản của một prebiotic:

 Không bị tiêu hóa

 Thủy phân và lên men bởi các vi khuẩn đường ruột

 Kích thích có chọn lọc một hoặc một nhóm vi khuẩn nhất định

 Mang lại những lợi ích về sức khỏe cho vật chủ

Synbiotic là hỗn hợp probiotic và prebiotic có tác dụng cải thiện khả năng sống

và chiếm ngự trong đường ruột của các probiotic, sử dụng synbiotic cho nhiều hiệu quả

tốt hơn là chỉ sử dụng probiotic hay prebiotic đơn thuần

SVTH: Dương Thúy Vy 12

Bảng 2.1: Ví dụ về thành phần của prebiotic (Gibson, Roberfroid 2008)

Thành phần Inulin - các polimer của fructose (fructan) và fructo-

2.1.4 Thành phần vi sinh của probiotics (Avrelija 2010)

Probiotics được biết dến là các vi sinh vật sống thuộc vào hệ vi sinh có trong tự

nhiên, ít hoặc không có khả năng gây bệnh và có vai trò quan trọng đối với sức khỏe của

vật chủ Probiotics bao gồm một số loài thuộc Lactobacillus như Lactobacillus

rhamnosus GG, Lactobacillus reuteri, bifidobacteria và một số chủng nhất định thuộc

Lactobacillus casei, nhóm các vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, chủng Escherichia

coli Nissle 1917, ngoài ra còn có các chủng Enterococci, đăc biệt là Enterococcus

faecium SF68 Một số nấm men cũng được xem là probiotics như Saccharomyces

boulardii, Saccharomyces cerevisiae Chúng được sử dụng trong các thực phẩm

probiotic nhất là các sản phẩm sữa lên men hoặc dược phẩm Một số chủng mới được

xem là probiotic đã và đang được chú ý như Lactobacillus plantarum (gồm các loài

SVTH: Dương Thúy Vy 13

PCS20, PCS22, PCS25 và PCS26)được phân lập từ Slovenian cheese (Nam Tư) Những

loài này mang lại lợi ích lớn đối với sức khỏe cũng như khả năng miễn dịch và kháng

khuẩn cao cho con người

Bảng 2.2 : Những vi sinh vật được xem như là probiotic (Holzapfel et al 2001)

- Enterococcus faecium

- Lactococcus lactis

- Leuconostoc mesenteroides

- Pediococcus acidolactici

- Streptococcus thermophilus

- Sporolactobacillus inulinus

- Bacillus cereus var

Toyoi

- Escherichia coli Nissle 1917

- Propionibacterium freudenreichii

- Saccharomyces cerevisiae

- Saccheromyces boulardii

2.1.5 Cơ chế hoạt động và lợi ích của probiotics (Salminen et al.)

Các thí nghiệm về lợi ích của probiotic đã đưa ra một loạt các khả năng mang lại

lợi ích khi sử dụng probiotics International Life Sciences Institute (ILSI) đã đánh giá và

phân loại chức năng của probiotics đối với con người vào 4 lĩnh vực ứng dụng khác

nhau : (1) trao đổi chất, (2) viêm ruột mãn tính và rối loạn chức năng, (3) nhiễm trùng

và (4) dị ứng Mật độ cần thiết của một probiotic để đạt được một hiệu ứng lâm sàng

thường là ≥106 CFU/ml dịch ruột non và ≥ 108 CFU/g phân trong ruột già Liều lượng

SVTH: Dương Thúy Vy 14

điều trị bằng probiotic có thể cao hơn từ 10 đến 100 lần Trong tiêu chảy điều trị liều

lượng cao thì cho hiệu quả hơn Đối với các bệnh mãn tính (dị ứng, viêm hoặc các bệnh

thuộc miễn dịch) thì tác động của probiotic phị thuộc vào tương tác giữa hệ miễn dịch

đường ruột với hệ vi sinh vật tương ứng và thời gian điều trị (Avrelija 2010)

Lưu ý rằng đối với những lợi ích mang tính tiềm năng, nghiên cứu bị giới hạn và

chỉ cho kết quả sơ bộ, các tác động được mô tả chỉ thuộc về chủng được kiểm tra, không

được quy cho bất kì dòng khác của cùng một loài và không phải là tác động chung cho

toàn bộ các chủng probiotics (Gilliland và Walker, 1990)

Để có thể mang lại những lợi ích cho vật chủ, trước tiên chủng probiotics phải có

khả năng sống sót qua đường tiêu hóa nghĩa là chịu được acid, dịch tiêu hóa dạ dày, tồn

tại và phát triển được trong điều kiện có muối mật và không gây bệnh cho vật chủ

2.1.5.1 Tác động kháng khuẩn của probiotics

Probiotics có họat tính đối kháng chống lại các vi sinh vật gây bệnh như

Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Helicobacter pylori…làm

giảm số lượng vi khuẩn để ngăn chặn các mầm bệnh bằng cách cạnh tranh với các

nguồn bệnh để ngăn chặn sự bám dính vào đường ruột và cạnh tranh dinh dưỡng cần

thiết cho sự sống sót của mầm bệnh đồng thời tiết ra các chất kháng khuẩn để ức chế và

tiêu diệt những vi khuẩn cạnh tranh

Vi khuẩn probiotic tạo ra nhiều chất ức chế cả vi khuẩn Gram dương và Gram

âm, gồm có các acid hữu cơ, H2O2 và đăc biệt là bacteriocin Những hợp chất này không

chỉ làm giảm sô lượng sinh vật mang mầm bệnh mà còn ảnh hưởng đến sự trao đổi chất

của vi khuẩn và sự tạo ra các độc tố Điều này được thực hiện bằng cách giảm pH

khoang ruột thông qua sự tạo ra các acid chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ yếu là acetate,

propionate, và butyrate, nhất là acid lactic

Trong đó bacteriocin có bản chất là các peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn

để chống lại vi khuẩn khác Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả

năng kháng lại chính bacteriocin đó Ngoài ra không gây ra phản ứng dị ứng trong con

người và các vấn đề về sức khỏe, bị phân hủy nhanh bởi enzym protease, lipase Chúng

SVTH: Dương Thúy Vy 15

có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm

của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải ADN, ARN và tấn

công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào

Cụ thể như Lacticin 3147 do Lactococcus lactis sinh ra có tác dụng diệt khuẩn

trên những tế bào nhạy cảm bởi sự tương tác đầu tiên với thành tế bào Đó là nguyên

nhân mà trên màng tế bào tạo ra những kênh cho K + và phốt phát vô cơ đi ra khỏi tế

bào Trong sự nỗ lực để tái tích lũy lại những ion này, những hệ thống hấp thu phụ

thuộc ATP dẫn tới thủy phân ATP bên trong Khi ATP được yêu cầu cho sự duy trì của

những chức năng quan trọng của tế bào, như gradient pH tại màng tế bào, những chức

năng tế bào bị phá vỡ và tế bào dần dần mất năng lượng và chết

Bacteriocin của vi khuẩn lactic có thể phân loại dựa trên cấu trúc cơ bản nhưng

nó còn dựa trên kiểu hoạt động của chúng Bacteriocin class I (đại diện: nisin của

Lactococcus lactis) gắn vào lớp lipid II, ngăn sự vận chuyển các tiểu đơn vị

peptidoglycan từ tế bào chất đến vách tế bào, đo đó ngăn tổng hợp vách tế bào hoặc do

bám đựơc vào lớp lipid II, các phân tử nisin tạo lỗ xuyên màng tế bào dẫn đến tiêu bào;

bacteriocin class II (đại diện sakacin của Lactobacillus sake) là các peptide lưỡng tính

có khả năng xuyên màng tế bào tạo kênh/lỗ trên màng Lớp III (còn gọi là bacteriolysin

như lysostaphin) – protein không bền nhiệt, tác động trực tíêp lên vách tế bào đích

(hình 2.1) (Riley và Chavan, 2007 ), (Cotter et al., 2005)

SVTH: Dương Thúy Vy 16

Hình 2.1: Cơ chế kháng vi sinh vật của bacteriocin (Cotter et al., 2005)

2.1.5.2.Tác động của probiotics trên biểu mô ruột

Một khả năng cần thiết nữa của probiotic nữa là khả năng kết bám trên biểu mô

ruột do vị trí họat động của probiotics là trên bề mặt biểu mô ruột Muốn vậy chúng phải

sống sót khi đi qua dạ dày Chúng kết bám vào biểu mô ruột với số lượng lớn và đa

SVTH: Dương Thúy Vy 17

dạng góp phần tạo nên hệ vi sinh đường ruột lành mạnh và nhờ đó mang lại nhiều lợi

ích cho vật chủ

 Đẩy mạnh sự liên kết chặt giữa những tế bào biểu mô

 Bám dính cạnh tranh vị trí và nguồn dinh dưỡng với vi sinh vật gây bệnh

 Tổng hợp các hợp chất kháng và giảm số lượng vi sinh vật có hại trên bề mặt

ruột

 Cảm ứng huy động tế bào miễn dịch và họat hóa đáp ứng miễn dịch thích hợp và

đẩy mạnh sự tạo ra các phân tử phòng vệ như chất nhầy

 Giảm viêm đường tiêu hóa và sự lây nhiễm vi khuẩn như giảm viêm loét đại

tràng (Whorwell et al., 2006), ( Niedzielin et al., 2001), (Kerr, Martha, 2003)

LAB được cho là hỗ trơn trong việc điều trị nhiễm Helicobacter pylori, một trong

những nguyên nhân gây viêm loét dạ dày.( Hamilton-Miller, 2003)

 Hỗ trợ tiêu hóa cho ruột, cải thiện khả năng hấp thụ lacrose và hoạt động của các

enzyme khác (Sanders,2000), các khoáng chất (Famularo,2005) và các vitamin :

B, K…

 Giảm cholesterol, giảm huyết áp máu nhờ vào một loại peptide ức chế tên gọi là

ACE tạo ra trong quá trình lên men của LAB (Famularo,2005)

 Kháng đột biến và kháng ung thư nhờ sự tương tác của các tế bào này với các tác

nhân gây đột biến và ung thư (Mattila et al., 2002) Probiotic có thể kết dính, bao

bọc, hoặc kéo đi những yếu tố gây ung thư; kiềm chế sự sinh trưởng của vi khuẩn

gây bệnh có liên quan từ đó hạn chế các yếu tố tiền ung thư trong đường ruột

2.1.5.3.Tác động lên hệ miễn dịch của probiotics

Mặc dù cơ chế vẫn chưa được làm sáng tỏ tuy nhiên LAB được cho là có một số

hiệu ứng có lợi cho chức năng miễn dịch LAB có thể bảo vệ chống lại các mầm bệnh

bằng các phương tiện của sự ức chế cạnh tranh, Probiotics đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế

bào chủ để làm giảm đáp ứng viêm, tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng (Kerr và

Martha, 2003).tăng số lượng tế bào plasma sản xuất IgA – kháng thể chính trong chất

SVTH: Dương Thúy Vy 18

nhày cơ thể, hoạt hóa các đại thực bào cũng như tăng tỷ lệ T lympho (Reid et al.,

2003), (Ouwehand et al., 2002), kích thích đáp ứng miễn dịch bẩm sinh (mặc dù chưa

có cơ chế cụ thể) (O'Toole và Cooney, 2008)

Các thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh rằng probiotics có thể làm giảm tỷ lệ

mắc các bệnh nhiễm trùng đường hô hấp (Hatakka et al 2001) và sâu răng ở trẻ em

(Näse et al 2001)

Một nghiên cứu năm 2010 cho rằng những lợi ích của liệu pháp probiotic là

ngăn ngừa nhiễm trùng thứ phát, một biến chứng thường gặp khi dùng kháng sinh

Thuốc kháng sinh được cho là làm cho hệ thống miễn dịch vào trạng thái "tắt" trong

khi probiotics lại giúp hỗ trợ hệ miễn dịch và nhiều hơn nữa có thể nhanh chóng phản

ứng với lây nhiễm mới (ScienceDaily)

SVTH: Dương Thúy Vy 19

2.1.5.4.Tác động của probiotics đến vi khuẩn đường ruột

Hình 2.2 : Cơ chế tác động của probiotics đến vi khuẩn đường ruột bao gồm :

(1) Cạnh tranh về các thành dinh dưỡng, (2) tác động dựa vào các chuyển hóa sinh học

như tạo ra các chất gây ức chế trong quá trình lên men, (3) tạo ra các chất sinh trưởng

cho các vi khuẩn khác như Exopolysaccharide (EPS) và các vitamins, (4) tạo đối kháng

trực tiếp bằng các bacteriocins, (5) cạnh tranh vị trí bám dính trên biểu mô ruột, (6) tạo

hàng rào bảo vệ, (7) giảm viêm nhiễm, (8) kích thích đáp ứng miễn dịch bẩm sinh

(O'Toole và Cooney, 2008) (IEC (epithelial cells): tế bào biểu mô, DC (dendritic cells):

tế bào đuôi gai hoặc tế bào nhánh, T: tế bào T)

Probiotics điều chỉnh thành phần cấu tạo của vi khuẩn đường ruột Ở những

phần khác nhau của hệ tiêu hóa thì tồn tại các vi khuẩn probiotic khác nhau Khi tập

SVTH: Dương Thúy Vy 20

trung ở khoang ruột, chúng tạo nên sự cân bằng tạm thời của hệ sinh thái vi sinh vật

đường ruột, sự thay đổi này được nhận thấy một vài ngày sau khi bắt đầu tiêu thụ thực

phẩm có probiotics, phụ thuộc vào công dụng và liều lượng của giống vi khuẩn Kết

quả chỉ ra rằng với sự tiêu thụ thường xuyên, vi khuẩn định cư một cách tạm thời trong

ruột, một khi chấm dứt sự tiêu thụ thì số lượng vi sinh vật probiotic sẽ giảm xuống

Điều này đúng cho tất cả các loại probiotics

Giảm thiểu tiêu chảy do kháng sinh : Nguyên nhân là do kháng sinh làm mất cân

bằng hệ vi sinh đường ruột và khi đó Clotridium difficle và Kelbsiela oxytoca tăng lên

nhanh chóng và giải phóng độc tố gây bệnh tiêu chảy và viêm ruột Có nhiều nghiên

cứu sử dụng probiotics để chữa bệnh tiêu chảy do kháng sinh kết quả cho thấy chủng

S bolardii, S boulardii, Lactobacillus rhamnosus GG, Enterococcus faecium SF68 có

tác dụng tốt, chúng làm giảm đáng kể thời gian phục hồi khi mắc bệnh và sử dụng L

acidophilus để trị bệnh tiêu chảy do sử dụng thuốc kháng sinh erythromycin thì mang

lại hiệu quả (D'Souza, 2002), (Cremonini, 2002), (Mcfarland, 2006) Tính hiệu quả của

phòng chống tiêu chảy phụ thuộc vào chủng probiotic được sử dụng và liều lượng, có

thể giảm đến 50% mức độ của bệnh

Các loại thực phẩm bổ sung LAB, được dùng điều trị và phòng ngừa bệnh tiêu

chảy cấp , và giảm mức độ nghiêm trọng và thời gian nhiễm trùng rotavirus (virus gây

tiêu chảy cấp ở trẻ em và tiêu ở người lớn) (Reid et al., 2003), (Ouwehand et al., 2002)

Vi khuẩn probiotic điều hòa hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật đường ruột

Probiotics có thể làm giảm pH của bộ phận tiêu hóa và có thể theo cách đó sẽ gây cản

trở cho hoạt động tiết ra enzyme của vi sinh vật đường ruột

Ruột già : 1010 – 1012 CFU/g

Chủ yếu là các vi khuẩn kị khí bắt buộc và không sinh bào tử

SVTH: Dương Thúy Vy 22

Pseudomonas

Nấm men ( như Candida albicans )

Protozoa ( như Blastocystis, Chilomastix, Endolimax, Entamoeba speices,

Trichomonoashominis)

2.1.6 Hạn chế của probiotic :

Trong một số trường hợp cụ thể (như ngững người đang mắc bệnh trầm trọng)

chúng có thể có gây hại Trong một thử nghiệm điều trị lâm sàng được thực hiện bởi

nhóm nghiên cứu về viêm tụy Hà Lan (Dutch Pancreatitis Study Group), việc tiêu thụ

một hỗn hợp của 6 vi khuẩn probiotic làm tăng tỷ lệ tử vong của bệnh nhân với dự đoán

viêm tuỵ cấp nghiêm trọng (Besselink et al 2008)

Trong một thử nghiệm lâm sàng được tiến hành tại Đại học Tây Úc, nhằm thể

hiện tính hiệu quả của chế phẩm sinh học trong việc giảm bệnh dị ứng ở trẻ em, Tiến sĩ

Susan Prescott và các đồng nghiệp của cô đã cho 178 trẻ em hấp thu hoặc một probiotic

hoặc giả dược trong giai đoạn 6 tháng tuổi Những trẻ có được các vi khuẩn tốt có nhiều

khả năng phát triển một sự nhạy cảm dễ bị dị ứng (Susan Prescott et al 2008)

Một số bệnh viện đã báo cáo về nhiễm trùng lactobacillus trong máu, một bệnh

có khả năng gây tử vong, do tiêu thụ probiotics bởi những người bị suy giảm hệ thống

miễn dịch hoặc những người đang bị bệnh nặng (Susan Prescott et al 2008), (Daily

Mail, 29-1-2008)

Không có công bố nào cho thấy bổ sung probiotic có thể thay thế hệ vi sinh vật

tự nhiên của cơ thể khi chúng bị tiêu diệt hoàn toàn, các mức vi khuẩn bị biến mất trong

ngày khi lượng vi khuẩn bổ sung bị ngưng (http://www.bbc.co.uk)

2.2 Tổng quan về vi khuẩn lactic (LAB) (Owen R Fennema et al 2004)

2.2.1 Khái niệm

Vi khuẩn lactic (LAB) là một nhóm các vi khuẩn Gram dương có sự thống nhất

về hình thái , đặc điểm sinh lý, sinh hóa và sự trao đổi chất Chẳng hạn như chúng là

SVTH: Dương Thúy Vy 23

trực khuẩn ngắn hay que (rod) và cầu khuẩn (cocci) không hô hấp, không sinh bào tử

Chúng thường được tìm thấy trong các chất bị phân hủy và sản phẩm chứa lactic, acid

lactic được tạo ra như là sản phẩm chủ yếu của sự trao đổi chất và là kết thúc của quá

trình lên men carbohydrate Vì vậy LAB được dùng trong thực phẩm lên men, axit hóa

ức chế sự tăng trưởng của tác nhân gây hư hỏng Một số chủng LAB có thể sinh

bacteriocins ức chế sinh vật gây bệnh (Klaenhammer, 1987) Hơn nữa, acid lactic và các

sản phẩm trao đổi chất khác góp phần vào tăng giá trị cảm quan và cấu trúc của thực

phẩm

Vi khuẩn lên men lactic được Pasteur tìm ra từ sữa bị chua và hiện nay chúng

được công nhận là an toàn sinh học (generally recognized as safe - GRAS), do được sử

dụng thường xuyên trong thực phẩm và có đóng góp trong hệ vi sinh vật có ích của con

người

Theo bản phân loại được sửa đổi hiện nay, vi khuẩn lactic gồm khoảng 20 giống

thuộc họ Lactobacillaceae, chúng thường có dạng hình cầu (hoặc oval) và hình que,

trong đó các giống sau đây là chủ yếu nhất: Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus,

Lactobacillus, Lactococcus, Leucnostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus,

Tetragenococcus, Vagococcus và Weissella Trước đây giống Bifidobacterium cũng

được xếp vào nhóm vi khuẩn lactic trong khóa phân loại của Bergey 1957, trong đó

chúng được xem là Lb bifidum mặc dù Bifidobacterium không phù hợp với các mô tả

chung của vi khuẩn lactic mà chúng liên quan nhiều hơn đến nhóm Actinomycetaceae

một nhóm vi khuẩn Gram dương và có con đường lên men đường khác với vi khuẩn

lactic

Việc phân loại vi khuẩn acid lactic vào chi khác nhau phần lớn là dựa trên hình

thái học, chế độ và con đường lên men khác nhau, tăng trưởng ở nhiệt độ khác nhau, qui

trình sản xuất acid lactic, khả năng phát triển ở nồng độ muối cao, và chịu được axit

hoặc kiềm Phân loại theo con đường hóa học như thành phần acid béo và các thành

phần của thành tế bào, ngoài ra phương pháp sinh học di truyền hiện đại cũng được sử

dụng trong phân loại

SVTH: Dương Thúy Vy 24

Hình 2.3 : Cây phát sinh loài của vi khuẩn lactic (Owen R Fennema et al 2004)

Chú ý: - Khoảng cách tiến hóa gần bằng nhau

- Trong đó nhóm được đống khung là nhóm vi khuẩn được xem là an toàn

với con người

2.2.2 Đặc tính chung

Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, catatalase âm

tính và là vi khuẩn kỵ khí chịu oxy (aerotolerant organisms), trao đổi chất chủ yếu bằng

con đường lên men và không hô hấp do không có cytochromes, chỉ trừ giống

Bifidobacterium là kỵ khí bắt buộc.Vi khuẩn lactic có thể lên men được các đường

monosaccharid, đường disaccharid, protein tan, pepton và acid Phần lớn chúng không

lên men được tinh bột và các polisaccharid khác

SVTH: Dương Thúy Vy 25

Đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5μm Các tế bào hình cầu

xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau Kích thước tế bào trực khuẩn

lactic từ 1 - 8μm Trực khuẩn đứng riêng rẻ hoặc kết thành chuỗi

Các loài vi khuẩn lactic có khả năng rất khác nhau khi tạo thành acid lactic trong

môi trường, và sức chịu acid (hay độ bền acid) cũng rất khác nhau Đa số các trực khuẩn

lactic đồng hình tạo thành acid lactic cao hơn (khoảng 2÷3%) liên cầu khuẩn (khoảng

1%) Các trực khuẩn này có thể phát triển ở pH 3,8÷4 (cầu khuẩn không thể phát triển

được ở môi trường này), hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn ở vùng pH 5,5÷6

Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của vi khuẩn lactic ưa ấm là 25÷350C, ưa nhiệt là

40÷450C và ưa lạnh là thấp hơn 50C Khi gia nhiệt khoảng 60÷800C thì hầu hết chúng bị

chết sau 10÷30 phút

Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic thường gặp ở trong đất, trong nước, trong không

khí, nhưng chủ yếu là ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm lên men (trên các loại rau,

quả, sữa, thịt,…)

SVTH: Dương Thúy Vy 26

2.2.3 Đặc điểm hình thái một số giống LAB chủ yếu

Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình

cầu và hình que Kích thước của chúng thay đổi tùy từng loài

2.2.3.1 Giống Lactobacillus:

Phân loại khoa học:

Bảng 2.4 : Phân loại khoa học giống Lactobacillus

Chi Lactobacillus hiện bao gồm hơn 125 loài như : L acidophilus, L brevis, L

casei, L fermentum, L plantarum, L bulgaricus …

Hình 2.4 : Lactobacillus species [87]

Giới : Vi khuẩn Nghành : Firmicutes Lớp : Bacilli

Bộ : Lactobacillales

Họ : Lactobacillaceae

Giống : Lactobacillus

SVTH: Dương Thúy Vy 27

Đặc điểm: (Beijerinck, 1901)

Tế bào có dạng hình que thường dài và thon, không di động, Gram +, hiếm khi

tạo sắc tố (màu gỉ sắt và màu đỏ gạch) Glucose, các aldehydic hexoses tương tự,

cacrbohydrates là đường đơn và các rượu đa chức được chuyển hóa bằng con đường lên

men lactic đồng hình và cả dị hình tạo ra acid lactic, acid acetic, rượu và CO2

Không có khả năng chuyển hóa nitrate, trừ loài L plantarum khi ở điều kiện nhất

định Một số loài có thể phát triển ở môi trường nghèo chất dinh dưỡng, và chịu được

nhiệt độ cao Kỵ khí không bắt buộc, không tạo ra catalase, không hóa lỏng gelatin,

không phân hủy casein nhưng vài chủng có thể tạo một lượng nhỏ đạm hòa tan Không

tạo indole và H2S Tế bào còn non cho kết quả Gram dương và trở thành Gram âm khi

đã già Không có khả năng di động

Được tìm thấy trong các sản phẩm lên men từ động vật và thực vật, đặc biệt là

trong các sản phẩm sữa

Các loài thuộc giống Lactobacillus lên men đồng hình: Lactobacillus

acidophilus, L bulgaricus, L plantarum, L casei…

Các loài thuộc giống Lactobacillus lên men lactic không đồng hình:

Lactobacillus brevis, L pentoaceticus, L lycopersici, L fermenti…

SVTH: Dương Thúy Vy 28

2.2.3.2 Giống Streptococcus

Phân loại khoa học:

Bảng 2.5: Phân loại khoa học Giống Streptococcus (Rosenbach, 1884)

Gồm các loài: S agalactiae, S anginosus, S bovis, S canis, S equi, S iniae, S

mitis, S mutans, S oralis, S parasanguinis, S peroris, S pneumoniae, S pyogenes, S

ratti, S salivarius, S salivarius ssp thermophilus, S sanguinis…

Hình 2.5: Streptococcus [87]

Đặc điểm:

Có dạng hình tròn hoặc hình trứng (ovan), ít khi kéo dài thành dạng que Sau khi

phân chia theo một phương chúng thường xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc chuỗi ngắn, là

loại vi khuẩn không nha bào, Gram +, không di đông, và thường không tạo sắc tố, vỏ tế

SVTH: Dương Thúy Vy 29

bào của một số loài có thể nhận thấy trong điều kiện nhất định, đường kính tế bào

0.5-1µm

Trong môi trường lỏng, sinh khối co thể có dạng nhám có dạng hạt và nổi trên

mặt nước hoặc là dạng mịn gây đục môi trường Trên môi trường agar, khuẩn lạc

thường nhỏ hơn 1mm, trong cùng 1 loài có thể chuyển từ dạng nhám sang dạng min và

tạo chấy nhầy, bề mặt khuẩn lạc lồi

Sau khi lên men đường, sinh ra rất ít hoặc không sinh CO2 và có thể tạo ra một

lượng đáng kể ethanol, acid acetic, acid formic…khi lên men glucose trong môi trường

có tính kiềm (Gunsalus và Niven, 1942)

Không có khả năng chuyển nitrate thành nitrite, kị khí không bắt buộc, không

sống được trong môi trường với 10% muối mật, những chủng phân hủy protein chỉ có

trong nhóm enterococcus Tất cả các chủng trong Streptococcus đều có nhu cầu dinh

dưỡng rất phức tạp, một số loài có nhu cầu về vitamin B và các aminoacid trong khi số

khác có nhu cầu về các acid béo không no và gia tăng lượng CO2 Vì vậy nhu cầu về

dinh dưỡng cũng giúp ích trong việc xác định một loài (Dubos, 1948)

Sự phân loại các loài thuộc Streptococcus được đề nghị bởi (Sherman, 1937)

Theo đó, chúng được chia ra thành 4 nhóm: nhóm sinh mủ (pyogenic), viridans,

Enterococcus, và nhóm lactic Sự phân chia này dựa trên các đặc điểm sinh lý đặc trưng

tương ứng với mỗi nhóm, đặc biệt là khoảng nhiệt độ phát triển Tuy nhiên với các loài

mới được công nhận làm cho đặc điểm mỗi nhóm trỏ nên ít khác biệt nhau vì chúng

cùng lúc mang nhiều đặc điểm của hơn 1 nhóm Ví dụ: Streptococcus tiberis Diernhofer

thuộc nhóm viridans, nhưng nó lại mang những đặc mà ta có thể đặt nó vào nhóm

Enterococcus Trong khi Streptococcus acidominimus Ayers và Mudge cũng thuộc

nhóm viridans, nhưng cũng có thể xem như thuộc nhóm pyogenic

Các loài thuộc giống Streptococcus lên men lactic đồng hình: Steptococcus

cremoris, Streptococcus lactis, Streptococcus thermophillus, Streptococcus salivarius

subsp thermophilus…

Các loài thuộc giống Streptococcus lên men lactic không đồng hình:

Streptobacterium brassicae fermentati…

SVTH: Dương Thúy Vy 30

2.2.3.3 Giống Leuconostoc

Phân loại khoa học:

Bảng 2.6: Phân loại khoa học giống Leuconostoc

(Van Tieghem, 1878) emend (Hucker và Pederson, 1930)

Gồm các loài như: L carnosum, L citreum, L durionis, L fallax, L ficulneum, L

fructosum, L garlicum, L gasicomitatum, L gelidum, L inhae, L kimchii, L lactis…

Hình 2.6: Leuconostoc [83]

Đặc điểm: ( Van Tieghem, 1878), (Orla-Jensen, 1919), (Hucker và Pederson, 1930)

Leuconostoc có tế bào thường có dạng hình cầu hay oval đơn lẻ, cặp đôi hay

dạng chuỗi ngắn Trong môi trường nhất định như nước trái cây hoặc rau quả có tính

acid, tế bào có thể kéo dài thành dạng nhọn hay dạng que Một số loài tạo chất nhờn đặc

Giới: Vi khuẩn Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillales Họ: Leuconostocaceae

Giống: Leuconostoc

Photo: Fred Breidt, North Carolina State University

SVTH: Dương Thúy Vy 31

trưng khi sống trong môi trường chứa sucrose Đối với môi trường bình thường, sự tăng

trưởng được kích thích nhờ việc bổ sung cao nấm men, nước chiết cà chua hoặc rau củ

Leuconostoc là một loài ky khí không bắt buộc Khi lên men tạo ra một lượng

hạn chế acid lactic L- lactic acid luôn được tạo ra và đôi khi cũng xuất hiện D-lactic

acid Acid acetic và rượu cũng được tạo thành và khoảng ¼ lượng glucose lên men được

chuyển thành CO2

Không làm đông tụ sữa, chuyển hóa fructose thành mannitol, được tìm thấy

trong lên men sữa và rau quả, ví dụ như : Leuconostoc mesenteraides (Cienkowski) Van

Tieghem

2.2.3.4 Giống Pediococcus

Phân loại khoa học:

Bảng 2.7: Phân loại khoa học giống Pediococcus (Claussen, 1903)

Gồm các loài như: P acidilactici, P cellicola, P claussenii, P damnosus, P

ethanolidurans, P inopinatus, P parvulus, P pentosaceus, P stilesii

Giới: Vi khuẩn Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillales Họ: Lactobacillaceae Giống: Pediococcus

SVTH: Dương Thúy Vy 32

Hình 2.7: Pediococcus sp [84]

Đặc điểm: ( Balcke, 1884)

Pediococcus là những tứ cầu khuẩn hoặc song cầu khuẩn, có khi đơn lẽ hoặc

thậm chí chuỗi ngắn, Gram dương, không di động, catalase âm

Khoảng nhiệt độ tối ưu là 25-32o

C, chúng là vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc, có thể phát triển trên môi trường rắn với sự có mặt của không khí

Quá trình trao đổi chất chủ yếu là quá trình lên men đồng hình, không có khả

năng chuyển hóa nitrate thành nitrite, khả năng phân hủy protein kém vì vậy chúng có

nhu cầu rất cao về thành phần dinh dưỡng từ môi trường

Loài điển hình là Pediococcus cerevisiae Balcke

2.2.4 Đặc điểm sinh lý- sinh hóa

2.2.4.1 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau Chúng

không chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cở bản như cacbon, nitơ,

SVTH: Dương Thúy Vy 33

photphat và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu về một số chất cần thiết khác như vitamin,

muối vô cơ…

a Nhu cầu dinh dưỡng cacbon

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydrat cacbon từ các monosaccarit

(glucoza, fructoza, manoza), các disaccarit (saccaroza, lactoza, maltoza) cho đến các

polysaccarit (tinh bột, dextrin)

Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào

và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ

b Nhu cầu dinh dưỡng nitơ

Phần lớn vi khuẩn lactic không tự tổng hợp được các hợp chất chứa nitơ Vì vậy

để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn

trong môi trường

Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men,

trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton,…Hiện nay cao nấm men là nguồn nitơ

được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất tuy nhiên ở quy mô công nghiệp không

thể sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém

c Nhu cầu về vitamin

Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào,

nên rất cần thiết cho hoạt động sống Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có

khả năng sinh tổng hợp vitamin Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin

Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch

tự phân nấm men…

d Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác

Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ

khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các acid hữu cơ

SVTH: Dương Thúy Vy 34

Một số acid hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn

lactic như acid xitric, acid oleic Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrat, dẫn

xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quả các chủng

vi khuẩn lactic

Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid axetic cũng có những tác động quan

trọng đến sự sinh trưởng của tế bào Nên người ta thường sử dụng acid axetic dưới dạng

các muối axetat để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic

e Nhu cầu các muối vô cơ khác

Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đày đủ, vi khuẩn lactic rất cần các

muối vô cơ Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho,

lưu huỳnh, magie đặc biệt là mangan, vì mangan giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn

định cấu trúc tế bào

f Nhu cầu dinh dưỡng oxi

Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống được trong môi trường có oxy và vừa sống

được trong môi trường không có oxy

+ Trong điều kiện hiếu khí sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với điều

kiện kỵ khí, trong điều kiện này từ một phân tử glucose sẽ bị oxy hóa hoàn toàn thành

CO2 và H2O và tổng hợp các enzyme, từ một phân tử glucose tạo ra 36 hoặc 38 ATP,

+ Trong điều kiện kỵ khí từ một phân tử glucose chỉ tạo ra 2 ATP do đó lượng cơ

chất bị phân hủy rất nhanh và tổng hợp một số chất kháng khuẩn

2.2.4.2 Quá trình trao đổi chất (Owen R Fennema et al 2004)

Một tính năng cần thiết của LAB trong quá trình trao đổi chất là khả năng lên

men carbohydrate, các ATP tạo ra được sử dụng cho các mục đích tổng hợp sinh học

khác và sản phẩm cuối cùng chủ yếu là acid lactic (từ 50% carbon của đường) LAB có

khả năng lên men các loại đường hexcose (glucose, mannose, galactose, fructose…),

disaccharide (lactose, saccharose…); pentose (arabinose, xylose, ribose…) và các hợp

SVTH: Dương Thúy Vy 35

chất liên quan Chúng chỉ sử dụng được các loại đường ở dạng đồng phân D Tuy nhiên,

LAB có thể thích ứng với nhiều điều kiện khác nhau làm thay đổi cách thức trao đổi

chất và dẫn đến các sản phẩm cuối cùng tạo ra cũng khác nhau

Dựa vào khả năng lên men lactic từ glucose, người ta chia vi khuẩn lactic làm hai

nhóm: Lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình (hình 2.8)

a Lên men lactic đồng hình

Trong lên men đường, LAB sử dụng 2 cách thức chủ yếu là vận chuyển đường tự

do (transport) và phosphoryl hóa đường (phosphorylation) bởi glucokinase (cần 1 ATP)

Một số loài sử dụng phosphoenolpyruvate : sugar phosphotransferase system (PTS), mỗi

phosphoenolpyruvate là một phần tử cho phosphate, trong trường hợp này đòi hỏi một

liên kết phosphate có năng lượng cao để hoạt hóa phân tử đường

Con đường Glycolysis hay con đường EMB (Embden-Meyerhof-Parnas

pathway) được sử dụng bởi hầu hết các LAB (ngoại trừ leuconostocs, nhóm III

Lactobacilli, Oenococci và Weissellas) tạo ra fructose-1,6-diphosphate (FDP) và nhờ

FDP aldolase để tiếp tục chuyển thành dihydroxyacetonephosphate (DHAP) và

glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) đối với những chất có mức phosphoryl hóa ở 2 vị

trí, sau đó tạo thành pyruvate Trong điều kiện có nhiều đường và hạn chế oxy, pyruvate

bị khử thành acid lactic bởi lactate dehydrogenase (nLDH) và NAD+, do đó NADH đã

được oxy hóa trước đó, khi thế oxy hóa khử được cân bằng, sản phẩm cuối cùng được

tạo ra chủ yếu là acid lactic và quá trình này được gọi là lên men lactic đồng hình

b Lên men lactic dị hình

Ngoài ra còn có một số con đường lên men khác như: con đường pentose

phosphate, con đường pentose phosphoketolase pathway, con đường hexose

monophosphate, con đường phosphogluconate và được gọi chung là

6-phosphogluconate/phosphoketolase (6-PG/PK) Đặc điểm của con đường này là sự khử

hidro ngay từ bước đầu tạo 6-phosphogluconate Theo sau đó là sự tách carbon tạo

pentose-5-phosphate và tiếp tục chuyển hóa thành glyceraldehyde-3-phosphate (GAP)

SVTH: Dương Thúy Vy 36

và acetyl phosphate.GAP được tạo thành tương tự như trong con đường glycolysis và

kết quả là tạo ra acid lactic Trong điều kiện không có mặt của các chất nhận điện tử,

acetyl phosphate sẽ bị khử tạo thành ethanol thông qua CoA và acetaldehyde Khi quá

trình này tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm khác như CO2, ethanol thì nó được

gọi là lên men lactic dị hình

Thông thường, LAB lên men đồng hình chủ yếu lên men bằng con đường

glycolysis và ngược lại LAB lên men dị hình sử dụng con đường 6-PG/PK Tuy nhiên

cần chú ý nhận xét trên không phải dúng cho tất cả các trường hợp (Owen R Fennema

et al 2004)

SVTH: Dương Thúy Vy 37

Hình 2.8: Con đường lên men glucose

SVTH: Dương Thúy Vy 38

(A) Lên men đồng hình (con đường glycolysis,, EMB)

(B) Lên men dị hình (con đường 6-phosphogluconate/phosphoketolase)

Các enzyme tham gia vào quá trình : 1 Glucokinase; 2 Fructose-1,6-diphosphate

aldolase; 3 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; 4 Pyruvate kinase; 5 Lactate

dehydrogenase; 6 Glucose-6-phosphate dehygrogenase; 7 6-phosphogluconate

dehydrogenase; 8 Phosphoketolase; 9 Acetaldehyde dehydrogenase; 10 Alcohol

dehydrogenase

2.2.5 Sản phẩm của quá trình lên men và khả năng sinh các chất kháng

khuẩn ở vi khuẩn lactic

Các vi khuẩn lactic có khả năng tổng hợp một sốt lượng lớn các enzyme ngoại

bào kích thước hệ thống tiêu hóa như: tổng hợp enzyme amylase, protease, lipase,

glycolase và lactic dehydrogenase Khi sử dụng làm probiotic chúng có tác dụng hỗ trợ

tiêu hóa, phân giải protein và lipid, giúp giảm cholesterol, cải thiện khả năng dung nạp

lactose…

LAB dùng làm probiotics đóng vai trò nổi bật trong ruột bằng việc tổng hợp

vitamin: vitamin B, acid folic, biotin (vitamin H), vitamin K

Vi khuẩn sinh acid lactic tạo ra một số các sản phẩm biến dưỡng có khả năng

ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh như: H2O2, CO2, diacetyl và các

bacteriocin…

SVTH: Dương Thúy Vy 39

Bảng 2.8: Sản phẩm biến dưỡng và kiểu hoạt động đối kháng

Sản phẩm biến dưỡng Kiểu hoạt động đối kháng

tính thấm của màng

Hydrogen peroxide

Lactoperoxide

Oxy hóa các protein cơ bản

Acid lactic Acid lactic không bị phân hủy mà thấm

vào màng làm giảm pH nội bào Nó cũng liên quan đến quá trình biến dưỡng như:

oxidative phosphorylation

tổng hợp protein

Vi khuẩn lactic được xem là probiotic khi chúng có khả năng ức chế và cạnh

tranh các vi khuẩn gây hại cũng như các mầm bệnh bên trong cơ thể (in vivo) bằng cách

sinh ra các chất có tính kháng khuẩn như đã nêu trên Có rất nhiều nghiên cứu tập trung

vào bacteriocin và phổ kháng khuẩn của bacteriocin, kết quả cho thấy khả năng kháng

khuẩn của chúng vẫn còn rất hạn chế, phần lớn chúng chỉ có thể kháng lại các vi khuẩn

Gram dương như kháng một số loài có liên quan mật thiết (các chủng Lactobacillus

khác) hoặc kháng các vi khuẩn sinh bào tử Gram dương như Bacillus và Clostridium

(Holzapfel et al 1995),

Tuy nhiên vẫn có một số nghiên cứu khác cho thấy LAB có thể kháng lại một số

vi khuẩn Gram âm như: Salmonella, Escherichia coli và Helicobacter licobacter

(Skytta¨ et al., 1992; Helander et al., 1997; Niku-Paavola et al., 1999) có thể là nhờ vào

việc sản sinh ra các chất có trọng lượng phân tử thấp (như H2O2, acid lactic, các hợp

chất dễ bay hơi) và các hợp chất thứ cấp… trong quá trình trao đổi chất đã làm cho phổ

kháng khuẩn của chúng được mở rộng hơn đối với vi khuẩn Gram âm Chủng L

SVTH: Dương Thúy Vy 40

acidophilus LA1 có khả năng kháng lại cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm như

Staphylococcus aureus, L monocytogens, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri,

Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa và Enterobacter cloacae và

Helicobacter pylori (Bernet-Camard et al., 1997), (Michetti et al., 1999)

Mặc dù LAB không có khả năng kháng lại nhiều loại vi khuẩn Gram âm nhưng

trong thực tế thì người ta quan tâm nhiều đến khả năng kháng vi khuẩn Gram âm của

LAB hơn vì các vi khuẩn Gram âm thường là những vi khuẩn có hại và gây bệnh cho

người như E coli gây tiêu chảy, Salmonella gây bệnh thương hàn và Helicobacter gây

viêm loét dạ dày…

2.3 Tổng Quan Về Phương Pháp Phân Lập Và Tuyển Chọn Vi khuẩn Lactic

2.3.1 Nhu cầu tìm kíếm các nguồn probiotics mới

Trong những năm gần đây, khả năng kháng lại thuốc kháng sinh của vi khuẩn

khá phổ biến trong sự điều trị bệnh của con người và động vật Vì thế sự tiếp tục tìm ra

những chất kháng vi khuẩn mới đang trở nên quan trọng trong lĩnh vực thuốc Để hạn

chế sử dụng quá nhiều thuốc kháng sinh hóa học trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi,

một sự lựa chọn hợp lý là ứng dụng của một số protein của vi khuẩn như thuốc kháng

sinh Trong số đó, sự sản xuất probiotics từ vi khuẩn lactic đã thu hút nhiều sự chú ý do

bacteriocin của LAB có phổ kháng khuẩn rộng hơn so với các giống khác và có tiềm

năng được dùng làm chất bảo quản thực phẩm và ứng dụng trong dược phẩm