Ôn tập sinh học tuan 13 adn tái tổ hợp và các phương pháp phân tích gen may 2021 (1)

TUẦN 13:CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH GEN Công nghệ ADN tái tổ hợp =>cách mạng trong công nghệ sinh học • N/C chức năng gen/hệ gen SV = tìm ra bản thiết kế phân

Trang 1

TUẦN 13:

CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP

VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH GEN

Công nghệ ADN tái tổ hợp =>cách mạng trong công nghệ sinh học

• N/C chức năng gen/hệ gen SV = tìm ra

bản thiết kế phân tử SV

• Cải biến gen theo ý muốn

• Chuyển các gen vào các loài mới

CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP Công nghệ ADN tái tổ hợp là một tập hợp các kỹ thuật được phát triển

để khuếch đại, duy trì và cải biến các trình tự ADN ở mức độ in vitro và in vivo (bên trong ống nghiệm, hoặc tế bào, hoặc cơ thể)

1 Enzyme giới hạn

2 Điện di trên gel agarose

3 Vector

4 Tách dòng gen

5 Kỹ thuật PCR và ứng dụng

6 Tạo thư viện DNA hệ gen

7 Tạo thư viện cDNA

8 Giải trình tự ADN theo phương pháp của Sanger

9 Các phương pháp lai phân tử (lai Southern blot,

Northern blot, Western blot), FISH trong phân tích

gen

10 Công nghệ chỉnh sửa gen

CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP

VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH GEN

ENZYME GIỚI HẠN VÀ ỨNG DỤNG

https://biologydictionary.net/restriction-enzymes/#foobox-1/0/molecularscissors.jpg Cần cây kéo phân tử

1 ENZYME GIỚI HẠN VÀ ỨNG DỤNG

Enzyme giới hạn = cây kéo phân tử

= giúp cắt DNA thành các đoạn mong muốn

(Endo-nuclease) (Restriction enzyme)

Lịch sử phát minh cây kéo phân

tử (enzyme giới hạn)

− Nhận biết trình tự ADN đặc trưng

− Cắt trình tự ADN đích Enzyme giới hạn

Restriction

genome của E.coli K12 (CH3) Nobel in Physiology or Medicine in 1978

Trang 2

− Trình tự nhận biết là trình tự đối xứng

(palindrome) => Đọc xuôi và ngược đều giống

nhau

− Có > 3500 loại RE = nhận biết và cắt các

trình tự khác nhau

− Tên của enzyme giới hạn:

EcoRI

Chữ cái 1=

Chữ đầu của tên giống

Escherichia

Hai chữ cái 2 và 3 = hai

chữ đầu tiên của tên loài

coli

Chứ cái thứ 4= chủng vi khuẩn

RY13

Ký tự 5= số la mã chỉ số enzyme RE

− Một số dạng RE được sử dụng trong sinh học phân tử:

o Nhận biết 4 cặp Nu=>256 bp (average)

o Nhận biết 6 cặp Nu => 4096 bp (average)

o Nhận biết 8 cặp Nu => 65.500 bp (average)

Ví dụ : Vị trí cắt của các RE trên NST11

 Enzyme giới hạn thủy phân liên kết phosphodiester

 Enzyme giới hạn cắt đầu bằng hoặc đầu dính

a Cắt đầu bằng

b Cắt đầu dích 5’

c Cắt đầu dích 3’

Ứng dụng RE:

Lập bàn đồ giới hạn

─ Xác định các vị trí cắt enzyme giới hạn

trên ADN

Đoạn ADN 13 (13-kb)

Cắt enzyme giới hạn với EcoRI và BamHI:

DNA tái tổ hợp

One possible combination

DNA ligase seals strands

DNA fragment added from another molecule cut by same enzyme.

Base pairing occurs.

Restriction enzyme cuts sugar-phosphate backbones.

Restriction site

DNA 5

5

3

2

3

1

Sticky end

GAATTC

G

G GAATT CG AATT C

C TTAA

o Đầu dính bổ sung nhau =>

bắt cặp với nhau

Ứng dụng RE: tạo ADN tái tổ hợp

o Mạch khung được nối lại bằng enzyme DNA ligase

=> tạo ra DNA tái tổ hợp

DNA tái tổ hợp: là phân tử ADN được tạo ra bởi việc nối hai hoặc nhiều phân tử ADN khác nhau

Trang 3

2 ĐIỆN DI TÊN GEL AGAROSE

 Phân tách các đoạn DNA

 Xác định kích thước các đoạn DNA

 Xác định sự có mặt của đoạn DNA và hàm lượng

 Phân tích cắt enzyme giới hạn

 Dòng điện 1 chiều

 DNA tích điện – => +

 Các yếu tố ảnh hưởng đến điện di:

o Điện trường (cường độ)

o Kích thước đoạn DNA

o Thuốc nhuồm huỳnh quang

 Phân tách các đoạn DNA

 Xác định kích thước các đoạn DNA

 Xác định sự có mặt của đoạn DNA và

hàm lượng

 Phân tích cắt enzyme giới hạn/PCR…

3 VECTOR

 “Vector" là hệ thống/ hoặc nhân tố mang đoạn ADN ở bên trong tế bào vật chủ.

Ví dụ: Plasmid =>vector

3 VECTOR

 Vector nhân dòng: Vector dùng để tạo bản sao đoạn ADN

"cloning vector“

 Vector biểu hiện: dùng để biểu hiện đoạn gen

"expression vector"

 Có hai loại vector chính:

5/27/2021

Cloning vector:

tạo bản sao đoạn ADN trong tế bào vật chủ.

1 Vùng khởi đầu tài bản(ori)

2 Gen kháng kháng sinh

3 Vị trí đa điểm cắt (MCS)

Origin of replication

(Antibiotic resistance gene)

(Multi-cloning site)

Trang 4

Expression vector:

=> chứa cấu trúc biểu hiện gen

o Promoter

o Ribosome binding site

o Terminator/ (polyA site)

1 Vùng khởi đầu tài bản(ori)

2 Gen kháng kháng sinh

3 Vị trí đa điểm cắt (MCS)

Vector con thoi (Shuttle vector)

5/27/2021

Shuttle vector for E coli and Saccharomyces cerevisiae

Vector có thể sao chép

ở hai vật chủ khác nhau

─ Nhân dòng đoạn DNA là gì?

 Tách được một đoạn DNA ra khỏi hệ gen

 Tạo ra số lượng lớn bản sao của đoạn DNA đó Bacterium

Bacterial chromosome

Plasmid

2

1 Gene inserted into plasmid Cell containing gene of interest

Recombinant DNA (plasmid)

Gene of interest Plasmid put into bacterial cell

DNA of chromosome (“foreign” DNA) Recombinant

bacterium

4 NHÂN DÒNG ĐOẠN DNA

─ Vector cho nhân dòng DNA

 Điểm khởi đầu sao chép (Ori)

 Gen chỉ thị (Kháng kháng sinh)

 Vị trí đa điểm cắt (MCS)

Ori

ampr

4 NHÂN DÒNG ĐOẠN DNA

─ Enzyme giới hạn và đầu dính

 Các đầu dính bổ sung với nhau thì bắt cặp với nhau

 Các đầu dính (của cùng một enzyme giới hạn) => bắt cặp với nhau

─ DNA ligase

 Nối các mạch khung phosphodiester

Ori

ampr

Trang 5

Kết quả cắt nối ADN

tải tổ hợp:

• Tạo ra plasmid có

gen mong muốn

• Tạo ra cả vector

không có gen

• Phải chọn được vector mang

gen

Các bước ADN tải tổ hợp:

• Tinh sạch Vector và

ADN chứa gen đích

• Cắt vector với gen

đích bằng RE

• Nối vector và gen

đích bằng DNA ligase

Chọn lọc xanh-trắng

5/27/2021

+ Gen chèn vào giữa LacZ gene tạo khuẩn lạc trắng

+ Vector không chứa DNA ngoại lai chèn vào giữa LacZ gene tạo khuẩn lạc xanh

khuẩn lạc trắng

Biến nạp

khuẩn lạc xanh

Không có khuẩn lạc

+ Gen mã hóa enzyme xúc tác X-gal thành màu xanh

Figure 20.4

Bacterial plasmid

TECHNIQUE

RESULTS

amp R gene lacZ gene

Restriction site

Hummingbird cell

Sticky ends Gene ofinterest Humming-bird DNA fragments Recombinant plasmids Nonrecombinant

plasmid Bacteria carrying plasmids

Colony carrying non-with intact lacZ gene

Colony carrying recombinant plasmid with disrupted lacZ gene One of many bacterial clones

Nhân dòng và

chọn lọc vector

mang gen mong

muốn

Foreign genome Cut with restriction enzymes into either small

fragments or largefragments

Recombinant plasmids

Plasmid clone (a) Plasmid library

(b) BAC clone

Bacterial artificial chromosome (BAC)

Large insert with many genes

(c) Storing genome libraries

4 NHÂN DÒNG ĐOẠN ADN

5/27/2021

Đưa gen vào vector biểu

hiện phải theo đúng

chiều

 Cắt vector bằng 2 RE

 Cắt gen bằng 2 RE

 Nối đúng chiều của 2

vị trí cắt

Nhân dòng vào

culture to form a clone

of cells containing the

“cloned” gene of interest Gene of

interest

Protein expressed from gene of interest Protein harvested Copies of gene

Basic research and various applications

3

4

Basic research

on protein

Basic research

on gene

Gene for pest resistance inserted into plants

Gene used to alter bacteria for cleaning

up toxic waste

Protein dissolves blood clots in heart attack therapy

Human growth hormone treats stunted growth

4 NHÂN DÒNG ĐOẠN DNA Ứng dụng

của nhân dòng DNA

Trang 6

5 KỸ THUẬT PCR VÀ ỨNG DỤNG

Kary Mullis

Invented PCR 1983

• Dr Kary Mullis phát minh PCR năm 1983

• PCR đã tạo ra cuộc cách mạng trong sinh

học phân tử

• Kỹ thuật PCR(……… … )

là phản ứng chuỗi trùng hợp:

– tạo nhiều bản copy (….…… ……… )

của một đoạn DNA đích

– trong thơi gian ngắn (………)

hàng tỷ bản copy

~2-3h polymerase chain reaction

• Thành phần phản ứng PCR:

– ADN khuôn – dNTP (ATP, GTP, CTP, TTP) – 1 cặp mồi (xuôi, ngược) – ADN polymerase (có khả năng đọc sửa, bền nhiệt)

– Buffer cho ADN polymerase – Mg2+(cofactor)

Thermal cycler

 DNA khuôn

 Là trình tự đoạn ADN cần được sao chép Được

gọi là ADN đích.

 Kích thước đoạn được PCR: ~50 đến ~4000 cặp

Nu (có thể hơn tùy vào enzyme và điều kiện pư).

 DNA khuôn cần được tinh sạch trước khi PCR

Thành phần phản ứng PCR

Reverse Primer

Forward Primer

Target DNA length ~50 -4000 bp

3’

5’

3’

 Cặp mồi (primer)

 Trong tế bào (in vivo), các mồi cho sao chép ADN là các đoạn ARN sợi ngắn là điềm khởi đầu cho sap chép ADN.

 Trong phản ứng PCR (in vitro), các mồi (primers) là các sợi AND ngắn được tổng hợp hóa học có trình tự bổ sung với phần đầu và phần cuối của đoạn AND đích cần nhân lên.

Reverse Primer

Forward Primer

Target DNA length~50 -4000 bp

3’

5’

3’

3 DNA polymerase

• Chỉ tổng hợp sợi mới theo chiều từ 5’ đến 3’.

• Sợi mới được tổng hợp bổ sung với sợi khuôn

DNA polymerase

Taq Polymerase

• DNA polymerase từ vi khuẩn Thermus aquaticus vì có khả năng bền nhiệt.

• Taq polymerase không có khả năng đọc sửa, có thể tổng hợp sai (tạo đột biến).

–Các enzyme bền nhiệt và có khả năng đọc sửa như (Pfu or KOD…) được ưu tiên sử dụng

• Taq không có khả năng tổng hợp đoạn DNA dài

–Để tổng hợp đoạn DNA dài (lên tới 35 kb) thì dung Tfl polymerase

Trang 7

 dNTPs

 dNTPs (deoxynucleosides) nguyên liệu để

tổng hợp sợi DNA mới.

A

A T

T

C

G G

5 Buffer

 Duy trì môi trường pH tốt co enzyme Taq, cung cấp Mg++

 Nồng đô Mg++ cần được tối ưu cho từng phản ứng với từng cặp mồi và sợi khuôn.

 Ít Mg++ có thể không có sản phẩm PCR, còn nhiều Mg++ có thể giảm tính đặc hiệu và tạo

ra băng phụ.

PCR

Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:

1 biến tính

2 gắn mồi

3 kéo dài chuỗi

PCR

Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:

1 biến tính

2 gắn mồi

3 kéo dài chuỗi

Ứng dụng của PCR

pathogenic microorganisms…)

trước sinh, bệnh di truyền, bệnh ung thư).

Agriculture Molecular biology

Archaeology Botany

Medicine Cell biology

Forensics

Nhược điểm của PCR

Trang 8

Tạo đột biến điểm định hướng

(site-directed mutagenesis)

5/27/2021

6 TẠO THƯ VIỆN DNA HỆ GEN

A complementary DNA (cDNA) – được tạo ra bởi phản

ứng phiên mã ngược (RT-PCR)

 cDNA library => transcriptome

Thư viện cDNA cho biết các gen nào được biểu hiện ở

mô, cơ quan, giai đoạn phát triển của cơ thể

7 TẠO THƯ VIỆN cDNA

DNA in nucleus mRNAs in cytoplasm

7 TẠO THƯ VIỆN cDNA

mRNA Reverse transcriptase Poly-A tail

DNA strandPrimer

5

53

3 A A A A A AT T T T T

Tạo thư viện cDNA

mRNA Reverse transcriptase Poly-A tail

DNA strandPrimer

5

3

A A A A A A

T T T T T

Trang 9

mRNA Reverse transcriptase Poly-A tail DNA

strandPrimer

DNA polymerase

5

3

A A A A A A

T T T T T

nucleus mRNAs in cytoplasm

mRNA

Reverse transcriptase Poly-A tail

DNA strandPrimer

DNA polymerase

cDNA

5

3

A A A A A A

T T T T T

8 GIẢI TRÌNH TỰ ADN

THEO PHƯƠNG PHÁP CỦA SANGER

Frederick Sanger

Invented DNA sequencing (1975)

DNA (template strand) 5

3

C C C C

T T G G A A A

G DNA polymerase

Primer 5

3

P P P OH G

dATP dTTP

Deoxyribonucleotides Dideoxyribonucleotides

(fluorescently tagged)

P P P H G

ddATP ddTTP ddGTP

5

3

C C C C

T T G G A A A

DNA (template strand) Labeled strands

Shortest Longest 5

3

ddC ddG ddA ddA

ddA ddG

ddG ddT ddC

G GT GT G G G G G G G G G G G G G G G G A

Direction

of movement

of strands Longest labeled strand

Detector Laser

Shortest labeled strand RESULTS

Last nucleotide

of longest labeled strand Last nucleotide

of shortest labeled strand

G G G A A C C T

• Dựa trên nền tảng PCR

• Chỉ dùng một mạch khuôn

• Chỉ dùng 1 mồi (primer)

• Có thêm ddNTP

8 GIẢI TRÌNH TỰ ADN THEO PHƯƠNG PHÁP CỦA SANGER

Kết thúc tổng hợp chuỗi ngẫu nhiên

Figure 20.12a

DNA

(template strand)

TECHNIQUE

Primer Deoxyribonucleotides Dideoxyribonucleotides

(fluorescently tagged)

DNA

polymerase

5

3

G G

dATP dCTP dTTP dGTP

ddATP ddCTP ddTTP ddGTP

T T G G

G

C

T

A

Figure 20.12b

DNA (template

Direction

of movement

Detector

Laser

Shortest labeled strand

TECHNIQUE (continued) 5

3

G

G C C C C

T A

A A T T G ddC

ddC

ddG

ddA ddA

ddA ddT

3

5

T T G C T T G C G T T G C G A T T G C

GA T T G C G A G

T T C G A

GT

T T C G A

GT A

T T C G A

GT

G G G

Trang 10

Figure 20.12c

RESULTS

Last nucleotide

of longest

labeled strand

Last nucleotide

of shortest

labeled strand

G

G G

A

A C

C T

Direction

of movement

Detector

Laser

Shortest labeled strand

9 CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH GEN

 Lai Southern blot

 Lai Northern blot

 Lai Western blot

– Lai Southern blot: lai ADN-ADN

– Lai Northern blot : lai AND với ARN

– Lai Western blot: lai protein – protein (kháng thể )

6 CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ

Nguyên lý:

 Các DNA có trình tự bổ sung với nhau =>bắt cặp với nhau (lai với nhau)

 Mẫu dò (probe):

o Đoạn DNA ngắn có trình tự

bổ sung với một sợi của gen đích (vùng bảo thủ)

=> liên kết đặc hiệu gen đích

o Mẫu dò gắn tín hiệu phóng xạ/huỳnh quang => phát quang => nhận biết

Tín hiệu huỳnh quang ở đâu

=> gen đích ở đó

Lai ADN-ADN= Southern blot

ADN hệ gen

Màng lai

ADN

Tách DNA hệ gen

Các bước tiến hành:

Cắt enzyme giới hạn

Điện di

Chuyển ADN lên

Ủ màng lai

với mẫu dò

Chụp ảnh x-ray/huỳnh quang

DNA

Phân tích đa hình các đoạn cắt giới hạn (RFLP)

Ứng dụng của Southern blot

Trang 11

Normal -globin allele

Sickle-cell mutant -globin allele

Large fragment

Normal allele Sickle-cell allele

(a) DdeI restriction sites in normal and

sickle-cell alleles of the -globin gene (b) Electrophoresis of restrictionfragments from normal and

sickle-cell alleles

201 bp

175 bp

376 bp

Large fragment

Ví dụ: Lai Southern blot

Figure 20.11 DNA  restriction enzyme

3 2

1

4

TECHNIQUE

I Normal

-globin allele

II Sickle-cell allele III Heterozygote

Restriction fragments Nitrocellulosemembrane (blot)

Heavy weight

Gel

Sponge Alkaline Paper towels

II

I III

II

Preparation of restriction fragments Gel electrophoresis

DNA transfer (blotting)

Radioactively labeled probe for -globin gene

Nitrocellulose blot

Probe base-pairs with fragments

Fragment from sickle-cell

-globin allele Fragment from normal - globin allele

Film blot

Hybridization with labeled probe 5 Probe detection

Ví dụ: Lai Southern blot

– Lai Southern blot: lai ADN-ADN

– Lai Northern blot : lai ADN với ARN

– Lai Western blot: lai protein – protein (kháng thể )

9 CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ ỨNG

 Mẫu dò DNA => bổ sung mRNA (gen đích)

 Mẫu dò ( gắn tín hiệu phát huỳnh quang) => phát hiện mRNA gen đích

Lai ADN với ARN Nguyên lý:

 Các DNA có trình tự bổ sung RNA=>bắt cặp với nhau (lai với nhau)

Northern blot

 Mẫu dò DNA

=> có trình tự

bổ sung với 1

gen đích

 Mẫu dò có

đánh dấu

huỳnh quang

=> phát hiện

sự có mặt của

gen đích

Ứng dụng của Northern blot

ở:

– Các mô – Cơ quan – Các giai đoạn phát triện của cơ thể – Phát hiện các gen biểu hiện mạnh, gen biểu hiện yếu, các gen gây bệnh, hoặc chống chịu sâu bệnh v.v…

Tiêu đề	Công Nghệ ADN Tái Tổ Hợp Và Các Phương Pháp Phân Tích Gen
Trường học	University of Science
Chuyên ngành	Biology
Thể loại	essay
Năm xuất bản	2021
Thành phố	Hanoi

Định dạng
Số trang	13
Dung lượng	4,29 MB