Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men part 7 pptx

Ly tâm tách xác tế bào thu hồi dung dịch chứa enzym với tốc độ 4000 vòng/phút trong thời gian 15 phút... Hút 1 ml dung dich p-NPG 10 mM cho vào ống nghiệm, đặt vào bình ồn nhiệt có nhiệt

12.8 HOAT DO ENZYM INVECTAZA (B-FRUCTOZIDAZA)

1 Nguyên tắc

Phương pháp dựa trên cơ sở thuỷ phân đường sacaroza bởi enzym có trong dịch chế phẩm nghiên cứu thành glucoza va fructoza Xác định lượng đường khử tạo thành sẽ tính được hoạt độ enzym Đường khử trong môi trường kiểm nóng

sẽ khử axit 2-hydroxy 3,5-đintrobenzoie hay axit 3,5-đinitrosalicylic (3,5-DNS) màu vàng thành axit 2-hydroxy 3-amino 5-nitrobenzoic mau đỏ da cam Đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng ^ = 575 nm của dung dịch sau phản ứng sẽ xác định được lượng đường khử tạo thành

Đơn vị hoạt độ invectaza là lượng enzym xúc tác thuỷ phân được một micro mol sacaroza ở 25°C trong thời gian một phút

2 Hoá chất và dịch chiét enzym

- Dung dịch đệm axetat 0,LM; pH = 4,7

Phối trộn 529 ml dung dịch axit axetic 1M với 471 ml dung dịch axetat natri 0,1M nhận được 1 lít dung dịch đệm Kiểm tra lại trên máy pH met

- Dung dịch phản ứng kiêm trong 3,5-DNS

+ Hoà tan nóng 10 g axit 2-hydroxy 3,5-dinitrobenzoic trong 200 ml dung dịch NaOH 2M (dung dịch À)

+ Hoà tan 300 g natri kali tartrat trong 500 mÌ nước cất (dung dịch B) + Phối trộn hai dung dịch A và dung dịch B, bổ sung nước cất tới 1 lít và lọc

~ Dung dịch sacaroza 1 M

- Dung địch đường nghịch đảo 5 mM

Phối trộn hai dung dich glucoza 5 mM va dung dich fructoza 5 mM theo ty

le 4: 1 (v/y)

- Chiết rút enzym:

Cân 10 g nấm men cho vào 20 ml dung dịch NaHCO; 0,1M hay dung dịch dem pyrophosphat 66 mM, pH = 8,5 Nghiền tế bào bằng máy nghiền trong thời gian 2 phúy Để yên hỗn hợp trong thời gian 24 giờ (ít nhất một đêm) 6 40°C (hay ở nhiệt độ môi trường) Ly tâm tách xác tế bào thu hồi dung dịch chứa enzym với tốc độ 4000 vòng/phút trong thời gian 15 phút

3 Tién hanh

- Mẫu thí nghiệm: Hút 100 pl dung dich sacaroza 1M va 350 pl dung dich đệm axetat pH = 4,7 cho vào cuvet 2 ml, dat vio bình ổn nhiệt có nhiệt độ 25°C trong thời gian 5 phút, sau đó bổ sung 50 gì dịch chiết enzym (nếu cần phải pha loãng dịch chiết enzym) Lắc mạnh và giữ nguyên ở nhiệt độ này trong thời gian đúng 20 phút Bổ sung 500 jl dung dịch 3-5DNS, lắc mạnh và đặt vào máy điều nhiệt 100°C (hoặc nhúng vào nước sôi) trong thời gian đúng 5 phút Sau đó lấy cuvet ra và đặt ngay vào nước đá Đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng A = 575

nm đối ngược với mẫu kiểm chứng

- Mẫu kiểm chứng: Mẫu kiểm chứng được tiến hành như mẫu thí nghiệm, chỉ khác là dung dịch 3-5DNS được bồ sung vào trước khi bổ sung dịch chiết enzym

- Xây dựng đường chuẩn của dung địch đường nghịch đảo:

Hút X ml dung dịch đường nghịch đảo 5 mM và (2 - X) ml dung dịch đệm axetat pH = 4,7 cho vào các ống nghiệm, sau đó bổ sung 2 ml dung dich chat phản ứng 3-5DNS Lắc mạnh hỗn hợp và đặt vào máy điều nhiệt 100°C, giữ nguyên trong thời gian đúng 5 phút Lấy hỗn hợp ra cho ngay vào nước đá Do

độ hấp thự ánh sáng ở bước sóng À = 575 nm đối ngược với mẫu trắng

Đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng ^.= 415 nm của dung dịch sau phản ứng sẽ xác định được lượng phosphat tạo thành

Đơn vị hoạt độ phytaza là lượng enzym xúc tác thuỷ phân phytat natri giải phóng một micro mol phosphat vô cơ ở 37°C, pH = 5,5 trong thời gian một phút

2 Hoá chất và dịch chiết enzym

- Dung dich dém axetat pH = 5,5

203

Hoa tan 18,1 g CH;COONa, 0,147 g CaCl,.2H,O va 1,68 ml CH,COOH bang trong nước cất, sau đó định mức tới 1 lít đụng dịch đệm Kiểm tra lại trên máy pH met

- Dung dich dém axetat pH = 5,5 với Tween 20

Hoa tan 18,1 g CHyCOONa, 0,147 g CaC1;.2H¿O và 1,68 ml CH,COOH băng trong nước cất, sau đó định mức tới I lít dung địch đệm Kiểm tra lại trên máy pH met Bổ sung 100 mg Tween 20 vào dung địch đệm nhận được

-_ Dung địch tạo phức mầu

+ Dung dich axit nitric (dung dich A): phdi tron 70 mi dung dich HNO; 65% vai 130 ml nude cat

+ Dung dich amoni monovanadat (dung dich B): Hoa tan 2,35 ¢ NH¿VO; trong 400 m1 nước 60°C, bd sung 20 ml dung dich A, làm nguội và định mức tới

1 lít Dung địch có thể bảo quản 4 tuần ở nhiệt độ phòng

+ Dung dịch amoni heptamolypdat tetrahydrat (dung dịch C): hoa tan 100

mg (NH¿)¿MozO¿¿.4H¿O trong 900 ml nuée cất, bổ sung thêm 10 ml NH,OH 25%, sau đó định mức tới | lit Dung dich có thể bảo quản 4 tuần ở nhiệt độ phòng

+ Dung dich tạo phức màu: phối trộn 250 ml dung dich B, 250 ml dung dich C va 165 ml dung dich HNO, 65%, sau đó định mức tới 1 lí Dung dich được chuẩn bị trong ngày sử dụng

- Dung dich phytat natri 5 mM (pH = 5,5)

Hoà tan 7,03 g CaHgOa¿P¿Nax; trong 1 lít dụng dich dém axetat pH = 5,5 Dung dịch được chuẩn bị vài phút trước khi tiến hành phản ứng

- Dung dich natri dihydrophosphat 2 mM

Hoa tan 15,601 mg natri dihydrophosphat trong dung dich đệm axetat, định mức tới 100 ml

- Tach chiét enzym

Dich canh trường 4°C được bố sung (NH4)2SOq tới độ bão hoà 65%, khuấy trộn đều và giữ ở nhiệt độ này trong 30 phút Ly tâm tách kết tủa và thu hồi kết tủa phytaza trong 1 — 3 ml dung dich đệm axetat pH= 5,5 với Tween20 tuỳ theo hoạt độ enzym thu được

3 Tiến hành thực nghiệm

-_ Mẫu thí nghiệm: Hút 400 pl dung dich phytat natri 5 mM cho vào cuvet

2 ml, dat vào bình ổn nhiệt có nhiệt độ 37°C trong thời gian 5 phút, sau đó bổ sung 200 gì dịch chiết enzym (nếu cần phải pha loãng dịch chiết enzym) Lac mạnh và giữ nguyên ở nhiệt độ này trong thời gian đúng 20 phút Bồ sung 400

pl dung dich dimg phản ứng tạo màu, líc mạnh và để trong 10 phut Do do hấp thụ ánh sáng ở bước sóng À = 415 nm đối ngược với mẫu kiểm chứng

- Mẫu kiểm chứng: Tiến hành như đối với mẫu thí nghiệm, nhưng dịch chiết enzym đã được vô hoạt bằng cách đun sôi

-_ Xây dựng đường chuẩn của dung dịch natri dihydrophosphat

Hut X ml dung dich natri dihydrophosphat 1 mM va (2 — X) ml dung dich đệm axetat pH = 5,5 cho vào các ống nghiệm, sau đó bổ sung 2 ml dung địch tạo phức màu Lắc mạnh hỗn hợp và để trong 10 phút Đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng +x= 415 nm đối ngược với mẫu trắng

Đơn vị hoạt độ -giucosidaza là lượng enzym xúc tác thuỷ phân p-nitrophenylglucoza giải phóng một micro mol p-NP ở 30°C, pH = 4,8 trong thời gian một phút

2 Hoá chất và dich chiét enzym

- Dung dich đệm axetat 0,05 M, pH = 4,8

Phối tron 529 ml dung dich axit axetic 0,5 M với 471 ml dung dich natri axetat 0,05 M nhận dugc 1 lit dung dịch đệm Kiểm tra lại trên máy pH met

-_ Tách chiết enzym

Dịch canh trường được kết tủa enzym trong dung dịch etanol 4°C nồng độ

75% , hoặc kết tủa trong dung dich (NH4)2SO, độ bão hoà 80% Hoà tan kết tủa nhận được trong dung dịch đệm axetat 0,05 M, pH = 4,8

3 Tiến hành thực nghiệm

Đối với mẫu thí nghiệm

Hút 1 ml dung dich p-NPG 10 mM cho vào ống nghiệm, đặt vào bình ồn nhiệt có nhiệt độ 50°C trong thời gian 3 phút, sau đó bổ sung 200 nl dịch chiết enzym (nếu cần phải pha loãng dịch chiết enzym) Lắc mạnh và giữ nguyên ở nhiệt độ này trong thời gian đúng 15 phút Bổ sung 1 ml dung dịch NazCO¿ IM dừng phản ứng, lắc mạnh và để trong 10 phút Đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng À = 405 nm đối ngược với mẫu kiểm chứng

Đối với mẫu kiểm chứng

Enzym được vô hoạt bằng cách bổ sung l ml dung dịch Na;CO; IM vào trước khi bổ sung I ml dung dich p-NPG

Xây dựng đường chuẩn của dung dịch p-nitrophenol

Đường chuẩn được xây dựng từ dung địch p-NP pha trong dung dịch hỗn hợp (dung địch dém axetat pH = 4,8 và dung dich Na,CO, 1M, tỷ lệ 1 : 1) nồng

độ từ 0,1 #M tới 0,5 HM Đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng ^ = 405 nm đối ngược với mẫu trắng

4 Kết quả

Hoạt độ enzym được xác định thông quả đường chuẩn xây dựng được

13.1 KIEM TRA PHƯƠNG PHÁP KHỨỬ TRÙNG KHÔ

1 Nguyên tắc

Khử trùng các dụng cụ thủy tỉnh hoặc kim loại bằng khí nóng khô ở nhiệt

độ 160°C trong thời gian 2 giờ (hoặc ở nhiệt độ 170°C trong thời gian 1 giờ),

2 Dụng cụ

- Ti sấy (tốt nhất là dùng tủ sấy điện) có hệ thống điều khiển nhiệt độ gồm

bộ phận ngắt nhiệt và nhiệt kế Với nhiệt độ từ 150 đến 170°C thì độ chính xác cần thiết là +1°C

- Nâng nhiệt độ tủ sấy lên t6i 160°C và giữ ở nhiệt độ này trong thời gian

2 h hoặc sấy ở nhiệt độ 170°C trong thời gìan | h

5 Kiểm tra mức độ tiệt trăng

~ Mỗi lần sấy nên có thể đưa mẫu kiểm định vào sấy cùng Mẫu kiểm định mức độ tiệt trùng bằng khí nóng là chế phẩm bào tử 8acilius subtilis Sau khi

sấy các mẫu chế phẩm này được để trong các điều kiện thích hợp cho vi khuẩn

}

: 20Ỷ

Nếu có sự phát triển vi khuẩn ở các mẫu này thì chứng tỏ việc khử trùng trên chưa đảm bảo

13.2 KIỂM TRA PHƯƠNG PHÁP KHỦ TRÙNG ẨM

Nồi hấp (autoclavage)

Khử trùng bằng hơi ở nhiệt độ 121C trong thời gian 20 phút Phương pháp này dùng để khử trùng các môi trường có khả năng chịu được nhiệt độ 121°C, các dụng cụ thủy tỉnh, các màng lọc, các dụng cụ làm từ cao su hoặc nhựa bên với nhiệt

là +I°C

4 Tiến hành

~ Các bình chứa môi trường được nút kín bằng các nút đậy hoặc bằng bông không thấm nước và được bọc trong giấy chống thấm đầu (giấy Kraf\) hoặc giấy nhôm Nếu dùng nút đậy có vít xoắn thì nên xoắn nhẹ Lượng dịch chứa trong bình không được quá l lít nếu hấp trong điều kiện nói trên Với thể tích địch

lớn hơn thì cân hấp ở nhiệt độ cao hơn hoặc kéo dai thai gian hấp Bình chứa dịch cân có khoảng trống khá lớn để đảm bảo không bị trào bọt ra ngoài

- Các dụng cụ cần được bao bọc trong giấy chống thấm dau (gidy Kraft) hoặc cho vào trong các Túi tiệt trùng Cẩn sắp xếp dụng cụ và các bình có chứa các môi trường không quá đầy để có các khoảng trống cho hơi có thể lưu thông được

- Mở van xả, bật công tắc điện (cần xem kỹ các chỉ dẫn kèm theo cho mỗi nồi hấp)

- Khi nhiệt d6 dat 100°C, hoi nude bat đầu thoát ra, để vài phút cho không khí trong nồi thoát hết ra, đóng van xả để nâng dan áp suất lên 1,05 kG/cm’, giữ

áp suất này trong thời gian 20 phút

- Ngất điện để áp suất tự giảm dần đến áp suất thường, mở van xâ từ từ cho hơi nước thoát ra ngoài tránh làm bật nút các bình môi trường

- Mỡ nắp thùng và để nhiệt độ giảm xuống, đóng chặt các nút xoáy của các bình chứa môi trường và lấy các vật dụng đã khử trùng ra

5 Kiém tra mite độ tiệt trùng

- Méi ldn hap, cé thể đưa mẫu kiểm định vào hấp cùng Để kiểm tra mức

độ tiệt trùng của nồi hấp, có thể dùng giấy chỉ thị đặc hiệu mà màu của nó có thể thay đổi phụ thuộc vào nhiệt độ hoặc chế phẩm bào tử Bøcillus stearo- thermophilus và một nhiệt kế chính xác được dùng để đảm bảo nhiệt độ đạt được tới 121°C

13.3 KIEM TRA PHƯƠNG PHÁP KHỦ TRÙNG BẰNG NHIỆT

GIÁN ĐOẠN

1 Nguyên tắc

Khử trùng bằng hơi ở nhiệt độ 100°C trong thời gian 30 phút mỗi ngày và trong 3 ngày liên tiếp nhau Nhiệt độ lần đầu có tác dụng diệt các vi sinh vật ở đạng vô tính Bào tử sẽ hình thành trong khoảng thời gian giữa 2 lần xử lý nhiệt

và những bào tử này sẽ bị tiêu diệt vào lần xử lý nhiệt thứ ba Nếu thể tích môi trường lớn hơn L lít thì cần phải kéo dài thời gian ở mỗi lần gia nhiệt Phương pháp này thường dùng để khử trùng các môi trường nuôi cấy có chứa các chất

đễ bị phân hủy ở nhiệt độ lớn hơn 100°C

- Nang nhiệt độ tới 100°C và dừng nhiệt độ này trong 30 phút

- Làm nguội và bảo quản ở nhiệt độ 25 - 30°C

- Lam lai các bước nói trên trong 2 ngày tiếp theo

20

5 Kiém tra mite do tiét tring

- Sử dụng chế phẩm bào tử Bacilius stearothermophilus thích hợp cho phương pháp khử trùng này Sau khi quá trình khử trùng kết thúc, đem chế phẩm nuôi cấy ở điều kiện thích hợp Nếu có sự phát triển của chúng thì có nghĩa là việc khử trùng chưa đảm bảo

13.4 KIỂM TRA PHƯƠNG PHÁP LỌC KHỬ TRÙNG

1, Nguyên tắc

Với các lỗ lọc có kích thước 0,2 pm có thể lọc và giữ lại toàn bộ vị sinh vật trên màng lọc Người ta có thể sử đụng lọc áp suất hoặc lọc hút chân không, trong đó lọc dưới áp suất sẽ tốt hơn là lọc chân không vì lọc chân không có nguy cơ dễ bị nhiễm tạp nếu lắp các bộ phận không kín

Phương pháp này thường dùng để tiệt trùng các dung dịch dé bi phan hiy

bởi nhiệt

2 Thiết bị

- Hệ thống lọc bao gồm:

+ Màng lọc, kích thước các lỗ lọc 0,2 wm Mang loc có đường kính 142

mm dùng cho mẫu có thể tích lớn và đường kính 47 mm dùng cho mẫu có thể

~ Xác định bọt khí:

+ Bình kiểm tra bọt khí có ! ống đưa khí vào, điểm cuối của ống này được đặt gần sát đáy bình, dưới mặt nước, còn ống thoát khí đặt phía trên và đậy bình bằng nút bông

+ Đóng van A, dé dich chảy khá lâu đảm bảo thấm ướt màng lọc

+ Mở van A và B, đóng van C

+ Tăng dần áp suất khí cho tới khi nhìn thấy các bọt khí xuất hiện

+ Kiểm tra áp suất trên áp kế: Nếu áp kế chỉ giá trị áp suất tương ứng với

áp suất chỉ dẫn của nhà sản xuất thì mọi điểm của hệ thống lọc đều kín và màng lọc đang ở trạng thái tốt Nếu áp kế chỉ giá trị áp suất lớn hơn với áp suất chỉ dân của nhà sản xuất thì có thể các điểm nối của hệ thống lọc chưa kín, còn nếu

áp kế chỉ giá trị áp suất nhỏ hơn với áp suất chỉ dẫn của nhà sản xuất thì chứng

- Lấy địch đã lọc cho vào ống vô trùng và để vào trong tủ ấm để kiểm tra

cớ sự phát triển của vi sinh vật hay không

21

Chuong 14 ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

14.1 CHUAN BI MAU PHAN TICH

1 Nguyên tắc lấy mẫu

Các mẫu lấy để kiểm tra vi sinh cần đảm bảo hai diéu kiện sau:

- Số lượng mẫu lấy phải đảm bao do tin cay, dai diện và đủ số lượng

- Mẫu lấy kiểm tra phải đảm bảo đúng tình trạng vi sinh trong mẫu có nghĩa là không bị nhiễm hoặc không có sự phát triển thêm của vi sinh vật đã có sẵn trong mẫu

2 Pha loãng

Trước khi phân tích cần có cách xử lý mẫu hợp lý tuỳ theo loại sản phẩm Nếu mẫu ở dạng rắn hay nửa rắn thì cần nghiên nhỏ hoặc đồng hoá kỹ để tạo ra một dung dịch huyền phù và hoà tan trong một dung dịch có khả năng hoà tan tốt loại sản phẩm đó Còn nếu mẫu ở dang lỏng thì có thể dùng pipet để lấy mẫu

Mẫu cần được pha loãng ở mức thập phân nối tiếp nhau theo bội số của 10 (ví dụ cần pha loãng 1/10 hay 10ˆ! có nghĩa là lấy Iml sản phẩm ban đầu với 9

mi dịch pha loãng và độ pha loãng tiếp theo là 1072, 1073, 10 nếu cần thì phải pha loãng tới 10”

Tuỳ theo sản phẩm mà có thể chọn một trong số dung dịch pha loãng sau

(bang 14.1):

- Nước cất

- Nước muối sinh lý

- Dung dich Ringer

- Dung dịch Trypton hay Trypton muối

- Dung địch Trypton đệm

Bảng 14.1: Bảng thành phần các dung dich pha loãng

Nude mudi | Dung dich Ringer | Trypton muối | Trypton đệm

Nước cất hoặc nước

| 94 toại lon Pha đủ cho 1 lít

phận tách các chùm ánh sáng trung tâm Khi đó các ánh sáng

ở trung tâm không đập thẳng vào đối tượng quan sát và mat ta không thấy được

do đó thị trường

213

vẫn hoàn toàn tối Các tia sáng xiên gặp đối tượng sẽ phản xạ trở lại, trên nên đen nổi bật vật được chiếu có màu sáng lấp lánh Các trường hợp đặc biệt thường soi kính biển vi nên đen như nghiên cứu chuyển động của vật soi, xem xét các vi khuẩn có roi hay không, phân biệt một cách tốt nhất các hạt protein

và cầu khuẩn

- Kinh hiển vì với thiết bị tương phần pha: Soi kính hiển vị với thiết bị tương phản pha cho phép thay đổi pha của các tia sáng khi di qua đối tượng quan sát, sẽ làm thay đổi biên độ ánh sáng do đó mà vật được quan

sát trở nên tương phản hẳn lên sơ với nên Sự tăng độ tương phản này tác động đến sự tạo thành hình ảnh Soi kính hiển vi với thiết bị tương phản pha cho một hình

ảnh khách quan hơn, đặc biệt trong trường hợp kiểm tra các vật còn sống hay

không {ví dụ nấm men đang tạo bào tử)

- Kinh hiển vị huỳnh quang: Kính hiển vì huỳnh quang dựa trên một

kỹ thuật đặc biệt mà các vật soi được nhìn thấy nhờ ánh sáng huỳnh quang

của chính nó hoặc do được xử lý với các chất huỳnh quang Các chất màu huỳnh quang nhìn thấy rất rõ trong ánh sáng cực tím, tạm chí ở nồng độ

rất loãng và các ảnh hưởng xấu của ánh sáng hầu như bị loại bở hoàn toàn Kỹ

thuật này thường sử dụng trong, các trường hợp đặc biệt như xác định các tế bào

- Bộ lọc xanh: dùng để chụp ảnh khi soi cũng như kiểm tra các đối tượng quan sát nhuộm màu đỏ

- Bộ lọc vàng: dùng để chụp ảnh khi soi cũng như kiểm tra các đối

tượng quan sát nhuộm màu xanh da trời

- Bộ lọc xanh đa trời: dùng để chụp ảnh các đối tượng quan sát không nhuộm màu cũng như tạo ra độ tương phản cho các vật có mầu vàng và vàng

xanh

- Dụng cụ cấy: que cấy thẳng hoặc que cấy đầu tròn

chuẩn bị như thế này cần soi ngay vì nước rất để bay hơi, Có thể kéo dài thời gian sử dụng bằng cách bôi vaselin hay parain xung quanh mép lá kính cho giọt dịch không bị khô

- Chuẩn bị tiêu bản giọt treo: Giọt mẫu được lấy bằng que cấy đầu tròn hay bằng que cấy thẳng được chấm lên lá kính Lá kính này được đặt lên phiến kính đặc biệt có một chỗ lõm hình tròn ở giữa Giọt mẫu này phải treo lơ lửng không được tiếp xúc với các mép và đáy của chỗ lõm hình tròn trên phiến kính Boi vaselin hay parafin xung quanh mép lá kính Giọt treo sẽ như là được bịt kín trong buồng kín và vì vậy cho phép quan sát được đối tượng nghiên cứu trong vài ngày

- Chuẩn bị tiêu bản vết khô: Một giọt mẫu đặt Tên phiến kính khô, sạch, không dính dâu mỡ Dùng que cấy hay thành bên của lá kính dàn đều, càng mỏng càng tốt Đề khô trong không khí ở nhiệt độ phòng hoặc có thể hơ nhẹ trên đèn cồn Tiêu bản này thường dùng khi nhuộm màu bên trong tế bào

1 Nguyên tắc

Tăng số lượng vỉ sinh vật nhờ lọc trên màng lọc có kích thước 1ỗ lọc nhỏ hơn kích thước của vì sinh vật cần phát hiện Có thể cố định và nhuộm màu tế bào ngay trên màng lọc Màng lọc sấy khô sẽ trong suốt nếu được xử lý bằng rượu benzylic hoặc dầu thông, dần quế

2 Thiết bị

- Hệ thống lọc chân không (hình 14.1): Màng lọc có đường kính 47 - 50

mm, có kích thước lễ 1,2 um để tách nấm men và nấm mốc hoặc 0.45 um để lọc

vi khuẩn loại lớn (hình cầu, câu khuẩn, hình que) hoặc 0,2 km để lọc vi khuẩn loại nhỏ hoặc bào tử vi khuẩn Bình chan khong V=1000 ml Nén ding mang lọc có kích thước lỗ 12 jum dé loc sơ bộ nếu thấy cần

- Ruou benzylic hoặc dầu thông, đầu quế

- Dung dich xanh methylen Loffer: Lay 30 ml dung dich xanh methylen đã bão hoà bằng cồn đưa vào binh định mức 100 ml, ding nước cất định mức tới ngấn bình

4 Tiến hành

~ Chuẩn bị hệ thống lọc chân không, chú ý màng lọc phải được hấp vô trùng

- Lọc:

+ Lọc sơ bộ nếu dung địch có nhiều cặn hoặc vấn đục

+ Mẫu cần đưa vào lọc một cách vô trùng và lượng mang đi lọc phụ thuộc vào nồng độ vi sinh vật có trong mẫu (ví dụ: bia chưa lọc thì chỉ cần dùng 1 mi]; bia lọc rồi 50 - 200 ml; nước máy 500 ml)

- Cố định tế bào: Cân phải cố định các tế bào vị sinh vật trước khi nhuộm màu để tránh rửa trôi tế bào

+ Ngay sau khi lọc xong, làm nóng màng ở nhiệt độ 50 - 60°C trong 20 phút hoặc để ở nhiệt độ phòng | - 2 gid dé làm khô màng lọc

- Nhuém mau:

+ Đặt màng lọc vào hệ thống lọc và ngâm trong dung dịch xanh methylen trong thời gian 15 phút, sau đó rửa bằng nước cất cho tới khi nước rửa không, còn màu xanh

+ Màng lọc đã nhuộm được sấy ở nhiệt độ 50 - 60°C trong 20 phút hoặc để

ở nhiệt độ phòng thì thời gian làm khô màng lọc 1 - 2 giờ

- Làm mất màu màng lọc và soi kinh hiển vỉ: Màng lọc đã sấy khô vẫn có thể còn màu, có thể làm cho màng mất màu và trở nên trong suốt nếu rửa bằng dung môi hữu cơ Để có thể quan sát tốt hơn khi soi kính hiển vi nên chọn dung

môi có độ nhớt không thấp quá và có chỉ số khúc xạ thích hợp Trong thực tế thì thường dùng các dung môi như đầu thông, dầu quế hay rượu benzylic

+ Cho một giọt dung môi lên phiến kính

+ Đặt một miếng màng lọc đã nhuộm màu có đường kính khoảng 6 mm lên phiến kính

+ Dùng lá kính đậy lên và tránh không để có bọt khí Màng lọc trở nên trong suốt nhờ có dung môi

+ Quan sát đưới kính hiển vi ở độ phóng đại 600 - 1000

- Bảo quản mẫu làm tài liệu tham khảo: Sau khi quan sắt xong, tiêu bản có thể được bảo quản bằng cách cho vào dầu (thường dùng dầu cọ Canada) và đóng gói niêm phong

5 Kết quả

Quan sát dưới kính hiển vi cho phép nhìn thấy rõ hình thái các tế bào và thấy được sự khác nhau giữa nấm men, nấm mốc, cầu khuẩn, trực khuẩn Tuy nhiên phương pháp này không cho phép biết được trước khi lọc tế bào này còn sống hay chết và rất để bị nhầm lần các vết đen hay cặn với tế bào vi sinh vật Chú ý: Có thể tham khảo tài liệu để chọn dung dịch nhuộm màu thích hợp cho từng loại vi sinh vat Dé phát hiện Pediococcus và Laetobacillus có trong

217

nấm men giống, thường nhuộm màu Gram hoặc dùng xanh Victoria thay cho xanh methylen

14.2.3 Nuôi cấy trong môi trường lông

1 Nguyên tắc

Lấy mẫu trong điều kiện vô trùng và cấy ngay vào môi trường thích hợp đã khử trùng Sau một thời gian nuôi cấy, số lượng vi sinh vật có trong mẫu cần phân tích tăng lên, nhờ vậy để phát hiện sự có mặt của vỉ sinh vật bằng cách quan sát mức độ dục, sự tạo khí cũng như màu và mùi của dịch nuôi cấy