Nghiên cứu mức độ biểu hiện của biến thể hmor 1a ở tế bào máu ngoại vi trên bệnh nhân nghiện chất dạng thuốc phiện điều trị mathadone thay thế

Đánh giá mức độ biêu hiện cùa thụ the u - opioid trên bệnh nhân nghiện chắt dạng thuốc phiện điều trị methadone thay thế.... TÓM TÁT KHÓA LVẶNTiêu dề: Nghiên cứu mức độ biêu hiện cua biế

Bộ GI ÁO D ỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y T É

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGVYẺN THỊ THẢO

NGHIÊN cứư -MỨC Độ BIÊU HIỆN CỦA

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP cú NHÂN Y KHOA

KHÓA 2019-2023

Hà Nội - 2023

NGUYÊN THỊ THẢO

NGHIÊN CỨU MỨC Độ BIÊU HIỆN CỦA

TRÊN BỆNH NHÂN NGHIỆN CHÁT DẠNG THUÓC PHIỆN ĐIÈƯ TRỊ METHADONE THAY THÉ

Ngành dào tạo Kỳ thuật Xét nghiệm Y học

em lãm khóa luận Em xin dược Cam ơn TS Tạ Văn Thạo cùng cãc anh chị nhân viên Trung tâm xẽt nghiệm Chcmedic dã chi bao nhiệt tinh vã tạo điều kiện giúp dờ

em rất nhiều

Em cũng xin bày tó lòng biết cm sâu sắc ten Ban lãnh đạo cân bộ Trung Tâm Kỉịm Chuẩn Chất Lượng Xét Nghiệm Y Ilọc - Trường Dại học Y Há Nội dà tạo diều kiện cho cm được thục hành trên tnuig tâm giúp em lãm quen vời môi trường nghiên cữu khoa học và các trang thiết bị mây móc hiện dại lũn cùng xin gin lời Cam

cm chân thành tói các thầy cỏ khoa Kỳ thuật Y hục dã tận tình truyền dạt kiến thức

vá luôn tạo diều kiện cho em trong quã trinh học tập tại Khoa vổn kiến thức tiếp thu dược trong quá trinh học tập không chi làm nền tang cho em trong quá trinh nghiên cứu khỏa luận mã còn là hành trang quý báu cho công việc Cua cm trong tương laiCuối cúng em vò cùng blot ơn bố mẹ người thân dà luôn ung hộ và bẽn Cạnh dồng hành cũng em Cám ơn những người bạn dã luôn dộng viên, giúp dờ vá là chỗ dựa tinh thần vững chắc giúp em vượt qua mọi khó khán trong suốt quá trinh học tập

vá nghiên cứu tại Trường Đại hục Y Há NỘI

Hả NỘI Tháng 6 nãm 2023Sinh viên

Nguyen Thị Tháo

LỜI CAM ĐOAN

Kinh gũi:

Phòng Quán lý dào tạo Dại học - Trường Dại Học Y Hà Nội

Hội dồng chẩm khóa luận tốt nghiệp

Tỏi lã Nguyen Thị Thao Sinh viên Tô 30 Lóp Y4XNYH - Khóa 117 Trường Đại học Y Hà Nội Tôi xin cam đoan:

1 Đây lã khóa luận do tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hưởng dẫn cua Ths Nguyền Quỳnh Giao vá ThS Trịnh Thị Phương Đung Khoa Kĩ thuật Y Học Trường Đại học Y Hà Nội

2 Cãc số liệu và thòng tin trong nghiên cứu lã chinh xác trung thực và khách quan do chinh tòi thực hiện vã thu thập

Neu có bất ki sự sao chép nào tòi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Hà Nội Tháng 6 nám 2023

Người cam đoan

Nguyễn Thị Tháo

MỤC LỤC

ĐẬT VẤN ĐÈ 1

CHƯƠNG I: TÔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Các khái niệm 3

1.1.1 Chắt dạng thuốc phiện 3

1.1.2 Nghiện chất dạng thuốc phiện 3

1.1.3 Methadone 3

1.2 Các quy định VC diều trị nghiện các chất dạng thuốc phiện bang methadone 6

1.2.1 Các giai đoạn trong quá trinh điều trị 6

1.2.2 Quy định về khám lâm sàng và xẻt nghiệm 6

1.3 Tình hình điều trị methadone trên thế giới và trong nước 7

1.3.1 Trẽn thề giới 7

1.3.2 Tại Việt Nam 8

1.4 Mửc độ biêu hiện thụ thề p-opioid 9

1.4.1 Phàn tích mức độ biểu hiện gen 9

1.4.2 Cấu tnìc thụ thê opioid 9

1.4.3 Các biến thê ghép nối cua thụ thè p-opioid và vai trô 11

1.5 Các phưomg pháp phân tích mức độ biêu hiện gen 13

CHƯƠNG 2 ĐỎI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứt’ 17

2.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.1 Mầu nghiên cứu 17

2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân 17

2.1.3 Tiêu chuẩn loịũ trừ 18

2.2 Thời gian, địa diem nghiên cứu 19

2.2.1 Thời gian nghiên cứu 19

2.2.2 Địa điếm nghiên củu 19

2.3 Phương pháp nghiên cúu 19

2.3.3 Hóa chắt thiết bị sư dụng trong nghiên cửu 19

2.3.4 Sơ đỗ nghiên cứu 21

2.3.5 Quy trinh nghiên cứu 22

2.4 Xữlý số liệu 29

CHƯƠNG 3: KÉT QƯÁ NGHIÊN cút' 30

3.1 Đặc điểm chung cua dổi tượng nghiên cứu 30

3.2 Kct quà tách chiết ARN 30

3.3 Kết quá chuẩn hỏa quy trinh Realtime-PCR 32

3.3.1 Kết qua điện di xác định nhiệt độ gẳn mồi 32

3.3.2 Kct qua phân lích melting curve xác định nồng độ mỗi 33

3.4 Kết qua realtime PCR và đánh giá mức dộ biêu hiện cua thụ thê p 35 CHƯƠNG 4 BÀN LƯẬN 39

4.1 Đánh giá dặc diẽni chung cua các đỗi lượng nghiên cứu 39

4.2 Đánh giá kết qua tách chiết /\RN 39

4.3 Bàn luận quá trinh chuẩn hóa quy trinh kì thuật Realtime-PCR 41

4.3.1 Ưu nhược diem cua Real-time PCR I bước và 2 bước 41

4.3.2 Ưu nhược diêm cùa phương pháp real-time PCR sir dụng sybe geen so với taqman prore 42

4.3.3 Lý do chúng tôi chọn housekeeping gene beta-actin Lãm tliam chiếu 44 4.3.4 Melting curve 45

4.4 Đánh giá mức độ biêu hiện cùa thụ the u - opioid trên bệnh nhân nghiện chắt dạng thuốc phiện điều trị methadone thay thế 46

KÉT LUẬN 48

KI ÉN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHÁO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ* VIẾT TÁT

DNA Deoxyribonucleic Acid

ARN Ribonucleic Acid

mARN ARN thông tin

MOR Muy opioid receptor

PCR Polymerase Chain Reaction

Realtime-PCR Phan ứng chuỗi polymerase thin gian thựcqRT PCR Quantitative Reverse Transcription PCRCDTP Các chất dạng thuốc phiện

Báng 2-1 Trùúi tự mồi thiết kể 22

Bàng 2-2 Thảnh phần phan ủng tồng hợp cDNA 24

Bang 2-3 Thành phần phan ứng PCR gen hMOR-1 A 25

Bàng 2-4 Chu ki nhiệt phan ủng PCR gen hMOR-1 A 25

Bang 2-5 Thành phần phán úng PCR gen nội chuẩn beta-actin 26

Bang 2-6 Chu ki nhiệt phàn úng PCR gen nội chuần beta-actin 26

Bâng 2-7 Thành phần phán úng chạy Melting curve 27

Băng 2-8 Chu trình nhiệt chạy Melling curve 27

Bang 2-9 Thành phần phản úng realtúne-PCR cua gen hMOR-1A 28

Bang 2-10 Thành phần phàn úng realtime-PCR cua gen nội chuẩn beta-actin 28

Bang 3-1 Đặc điềm chung cùa đối tượng nghiên cứu 31

Bâng 3-2 Kết quà tách chiết ARN 31

Bàng 3-3 Kết quá Ct và đánh giá mức độ biểu hiện cua biến the h.MOR-1 A 35

Báng 3-4 Mức độ biêu hiện biến the hMOR-1 A và liều điều trị 38

Bàng 4-1 so sánh s YBR Green và TaqMan probe 43

Báng 4-2 So sánh nghiên cứu của chúng tôi với tãc gia N.Vousooghi 47

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1-1 Vị trí thụ thê p-opioid trước synap 10Hình 1-2 Vị trí gen OPRM1 trẽn NST số 6 10Hình 1-3 Sơ đỗ cấu trúc gen OPRM1 cua con người vã nỗi thay thế 12Hình 1-4 Sơ đổ cẩu trúc gen OPRM1 vã các biến thê mỗi nỗi MOR-1A từ

gen OPRM1 cua người 13Hĩnh 1 -5 Quá trinh tống họp cDNA 14Hình 1-6 Nguyên lý cúa phân ứng real time PCR sư dụng SYBR Green 15Hình 1-7 Biêu đồ một đường biêu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ

huỳnh quang phát ra tử ổng phân ửng khi nhận dược ánh sánhkích thích vào mỏi chu kỳ nhiệt 16Hình 2*1 Sơ đồ nghiên cứu 21Hĩnh 2-2 Chu trinh nhiệt cùa phan úng realtime-PCR 29Hình 3-6 Kết qua đo nồng độ ARN sau tách chiết cùa màu chửng C5 30Hình 3-1 Ket qua điện di gen liMOR-lA 32Hình 3-2 Kết qua diện di gen nội chuẩn beta-Actin 32Hình 3-3 Kct qua phân tích melting curve cùa I1MOR- 1A ỡ các mức nồng

độ mồi 33Hĩnh 3-4 Kết qua phân tích melting curve cua hMOR-lA ơ nồng dụ

8X 33Hĩnh 3-5 Kct qua phàn tích melting curve cua B-Actin ờ nồng độ IX và

10X 34Hỉnh 3-7 Kct qua realtime-pcr màu bệnh B3 35Hình 3-8 Kcl qua realtime màu chứng C6 35Hình 3-9 Biêu dồ đánh giá mức độ biêu hiện cua Ỉ1MOR-1A cua nhóm

bệnh so với nhỏm chứng 37Hình 4-1 Nguyên li cùa PCR I bước và PCR 2 bước 42

TÓM TÁT KHÓA LVẶN

Tiêu dề: Nghiên cứu mức độ biêu hiện cua biến thê thụ thè p-opioid ớ tế bào máu ngoại vi trên bệnh nhân nghiện chất dạng thuốc phiện điểu trị methadone thay thế

Tỏm tắt:

Điều trị duy tri bàng methadone là phương pháp diều trị được sư dụng phổ biền nhất hiện nay ơ bệnh nhân nghiện chất dạng thuốc phiện Mỏi cá thể

là riêng biệt nén mức độ biếu hiện cua thụ thê p-opioid sè khác nhau do dó mức

độ dáp ứng vói methadone lã khác nhau Phân tích mức độ biểu hiện cua gen qua đó xem xct mức dộ đáp ứng với methadone cùa từng cá thế giúp dam bao phương pháp dien trị an toàn vá hiệu qua chuyên biệt cho tùng cá thề và giám dược nhũng tác dụng phụ không mong muốn

Nghiên cứu nãy sư dụng phương pháp nghiên cứu bệnh - chúng, phân tích mức độ bicu hiện cua thụ thê p-opioid cua 9 bệnh nhân nghiện chắt dạng tìiuổc phiện dang dien trị methadone thay thề tại trung tâm cai nghiện trẽn địa bàn tinh Ninh Binh bằng kí thuật RT- qPCR Nghiên cứu diều tra biêu hiện mRNA cua biến thế ghép nổi hMOR-1 A thu được kết qua như sau: Mức độ biêu hiện cua biến thê thụ thê p opioid ớ tế bão mâu ngoại vi trên bệnh nhân nghiện chắt dạng thuốc phiộn đang điều trị methadone thay thế tảng 1.25 lần (p<0.05) so với nhóm người khỏe mạnh

Từ khóa: Methadone, nghiện thuốc phiện Thụ the muy oppioid RT- qPCR 11MOR

D/\T VÀN DẺ

Nghiện chất dạng thuốc phiện (CDTP) là tinh trạng sứ dụng lặp di lập lại nhiều lần CDTP với liều lượng ngây cảng tàng, dẫn đến trạng thãi nhièm d<K chu kỳ mạn tinh, bị lệ thuộc về thế chất và tâm thần Nghiện chất dạng thuốc phiện nói chung và ma túy nói riêng gây ra nhùng tác hại nghiêm trọng về mật sức khóc, tốn hại về mặt xã hội

Có nhiều loại thuổc được chi định để diều trị tinh trạng phụ thuộc chất gây nghiện Methadone, một chắt chu vận (full agonists), một trong sổ thuốc thuộc nhóm giam đau opioid được sư dụng nhăm lãm giâm các triệu chúng cai nghiện

và thêm thuốc Các loại thuốc opioid này hoạt động chu yếu trên thụ the mu opioid (MOR) 1 thụ thề kết hợp với protein G giống như Rhodopsin loại A (GPCR) 11 ] Thực tế diều trị methadone cho thấy sự dao động liều khá lởn giữa các cá thè điều trị Cùng với chiến lược dien trị hiện tại nhiều phương pháp tiếp cận nun mỡ rộng hộp còng cụ lâm sàng dang được phát triển đê hồ trợ điều trị bệnh đà dược dề cập như điều trị liên quan đền lính vực phân tư như dược lý

di tniyềiì học (treatment-pliannacogenomics) với rất nhiều nghiên cứu tập trung vào lình vục này Bên cạnh đõ, các biến thê ghép nối trong hướng dần điều trị đích (alternative splicing to guide targeted opioid medications), di truyền học bicu sinh (epiegenitics-in formed opiod treatment), cần sa dùng trong y to (Medical cannabinoids - cannabidiol) hay vaccines là nhừng lình vục mới đang dần dược tiếp cận

Phân tích mức dộ biêu hiện cua gen qua dỏ xem xét mức độ đãp úng vói methadone cua tùng cá thê giúp dam bao phương pháp diều trị an toàn và hiệu quá úiig dụng vào việc phát triển thuốc điểu trị nhắm đích vảo các biển thê ghép nối ngày càng dược quan tàm trong nỗ lục cá nhàn hóa và tối tru hóa liệu pháp diều trị trong tương lai Sự ghép nối gen là một phương pháp hiệu quá tạo

ra sự da hình trong chức nâng protein Sự ghép nối thay thề có liên quan đen việc sán xuất các protein khác nhau thòng qua sự tái lỗ hợp các exon theo các cách khác nhau Các biên thề cùa thụ thề p opioid được tạo ra từ sự ghép nỗi phân tư tiền mRNA duy nhất Nghiên cứu trên mò hình dộng vật và người phụ thuộc opioid cho thấy sự thay dối trong biêu hiện U1ARN cua cãc biến thê mu opioid receptor ờ các vùng cùa nào và tể bào máu ngoại vi là khác nhau Đo dô chúng tỏi tiến hành để tài:

“Nghiên cứu mức dộ biểu hiện cúa biến the thụ the fl opioid trên bệnh nhãn nghiện chất dạng thuốc phiện điều trị methadone thay thế”

Vởi cãc mục tiêu sau:

Ị.Chiiãn hóa quy trình kì thuật qRT-PCR nghiên cứu mức (tộ biếu hiện cùa biển thế mối nổi hMOR-JA

2 Bước (tầu dành giã mức độ bleu hiện cua biền the hMOR-tA trẽn bệnh nhàn nghiện chất dụng thuốc phiện diều trị methadone thay thể.

CHƯƠNG 1: TÔNG ọ VAN’ TÀI LIỆU

1.1 Các khái niệm

1.1.1 Chat dạng thuốcphiện

Chất dạng thuốc phiện (CDTP) (opialc.opioid) là tên gọi chung cho nhiều chất nhu thuốc phiện morphine, heroin, methadone buprenophine codein pethidine, fcntanyle, có biểu hiện làm sàng tương tự và tác dộng vào cùng diêm tiếp nhận tương lự ờ não CDTP như thuốc phiện, morphine, heroin lã nhùng CON mạnh (gày khoái cam mạnh): thời gian tác dụng nhanh nên người bệnh nhanh chóng xuất hiện triệu chúng nhiễm độc hệ thần kinh trung ương; thời gian bán huy ngắn do dó phai sư dụng nhiều lần trong ngày và nếu không

sử dụng lại sè bị hội chứng cai Vi vậy, người nghiện CDTP (đặc biệt lã heroin) luôn dao động giừa tinh trạng nhicm độc hệ thần kinh trung ương và tinh trạng thiêu thuốc (hội chủng cai) nhiều lần trong ngày, là nguồn gốc dần hụ đẻn nhùng hành vi nguy hại cho ban thân và những người khác [2]

1.1.2 Nghiện chất dọng thuốc phiện

Người nghiện CDTP lã người sứ dụng lặp di lập lại nhiều lần CDTP với liều lượng ngây càng tăng, dần đến trạng thãi nhiễm dộc chu kỳ mạn tính, bị

lệ thuộc về thế chắt và tâm thần vào chắt đó Các dặc diem chuẩn đoán nghiện CDTP: Có 3 trơ lèn trong 6 nhóm triệu chứng lâm sàng sau trong vòng I năm trơ lại dây: thèm muốn mành liệt phai dũng CDTP, mắt kha năng kiêm soát dùng CDTP klú giảm hay ngùng sư dụng CDTP xuất hiện hội chúng cai cỏ hiện tượng tâng dung nạp CDTP sao nhãng nhùng nhiệm vụ vá thích thú khảc, luôn tim bang được CDTP [3]

1.1.3 Methadone

Methadone lả CDTP tông hợp cô tãc dụng dưực lý tương tự như các CDTP khác nhưng không gây nhiễm độc hộ thần kinh trung ương và không gảy khoái cam ơ liều diều trị có thỏi gian bán húy dài (tning binh là 2411) nên chi cần sư dụng 1 lần trong ngày là du đê không xuất hiện hội chứng cai Hội chúng cai được định nghĩa là trạng thãi phan ứng cùa cơ thè khi cất hoặc giam chất

ma túy đang sứ đụng ớ nhùng người nghiện ma túy Biêu hiện làm sàng của hội chứng cai khác nhau phụ thuộc vào loại ma túy dang sứ dụng Thang đảnh giá mức dộ cua hội chúng cai dựa trên quy định cùa Bộ Y tế dựa trên các biêu hiện lâm sàng bao gồm: nhọ trung binh, trung bình nặng vã nặng

Methadone có độ dung nạp ỏn định nén ít phai tâng liều khi diều trị làu dải Methadone dược hấp thu hoàn toàn và nhanh chóng qua đường uống (Methadone dược hấp thu khoáng 90% qua đường uống) Tác dụng khoang 30 phút sau khi uống vã dạt nồng độ tối da trong máu sau khoang 3-4 giỡ Thời gian dạt nồng dộ ồn định trog mâu khoảng 3-5 ngày sau mỏi lần thay dói liều diều trị

Methadone dược dùng đe điều trị thay thế nghiện CDTP nhầm ngân chận tinh trạng “thèm nhở" CDTP vốn là yếu tố chinh dàn tới tái sứ dụng các chất này, ngán các tác dụng cua CDTP vốn lá yếu tố chinh dẫn tới tái sư dụng các chất này ngân các tác dụng cua CDTP khi nó dược dưa vào cơ the (không có cam giác "phê" nếu sứ dụng CDTP) kiềm chế cãc triệu chửng cai CDTP trong khoáng 23-36 giờ vã không gãy "phò" khi sử dụng Điều trị thay the các CDTP bảng thuốc Methadone là một diều trị lâu dài có kiêm soát, giã thảnh ré được

sư dụng theo dường uống, dưới dạng siro nên giúp dự phòng câc bệnh lây truyền qua dường máu như HIV, viêm gan B c dồng thời giúp người bệnh phục hồi chức nàng tâm lý, xà hội, lao dộng và tái hòa nhập cộng dồng

Những lợi ích cua Methadone:

Một nghiên cứu kéo dãi 6 nẫm cùa Viện Sức khoe tâm thần Trung ương

về Liệu pháp Methadone kết hợp với tư vấn và liệu pháp tâm lỷ ở 51 đổi tượng nghiện CDTP cho thấy:

- Giám rõ rệt hành vi sứ dụng chắt dạng thuốc phiện bất hợp pháp: Tỵ lệ người dùng ma túy từ 100% giâm xuống 18% sau 6 tháng, giâm xuống 9% sau

2 nám diêu trị

- Giâm dáng kế số người sứ dụng qua dường tiêm chích: Tử 35% khi bát dầu nghiên cứu giám xuống côn 3.2% sau I tháng Không còn tiêm chích sau

18 tháng Không có nhiễm HIV trong quá trinh nghiên cứu

- Giảm rò rệt các hành vi lấy tiên, bán dỗ dạc de dọa cưởng ép người thân trong gia dinh: Tý lệ đối tượng sai phạm trên 25 ngày/thãng từ 70% trước điều trị giâm xuồng còn 5,5% sau I tháng Den tháng thứ 5 chi còn 2.8% bệnh nhân

có sai phạm dưới 20 ngày/thâng

- Giam cãc phạm pháp hình sự ngoài xà hội: Trước diều trị 13 dối tượng

có tiền án tiền sự vi hành vi trộm cấp buôn bán ma tủy Trong suốt quà trinh nghiên cứu chi I đối tượng bị bầt sau 2 tháng diều trị do buôn bản ma túy

- Lâm giam rất nhiều sỗ tiền chi cho ma tủy bẩt hợp pháp: Trước nghiên cứu các dối tượng chi trung binh 300.000 đồng/ngảy, sau 2 tháng diều trị chi còn hon 3% đối tưọng mua ma túy vởi sỗ tiền bang 10% trước dó và 23% mua với số ticn bang 1% trước diều trị [4]

Thực tế lại các quốc gia vã một số tinh/thành phố trong ca nước tricn khai chương trinh đã tông kết: Bệnh nhân tham gia chương trinh điều trị methadone

đà cãi thiện rỏ rệt về tâm lý sức khoe, nhận thúc, giảm gánh nặng, trơ lại là người có ích cho gia dinh Góp phần cai thiện ổn định an ninh trật tự xà hội và giám các hành vi vi phạm pháp luật liên quan dến ma túy [7]

1.2 Các quy định về điều trị nghiện các chất dạng thuốc phiện bằng methadone

1.2.1 Các giai đoạn trong (ỊUÚ trình điều trị

Mỏi bệnh nhân tham gia chương trình đều trái qua 3 giai đoạn cua quá trinh điều trị Giai đoạn dò lieu thưởng là 02 tuần đằu điều trị giai đoạn điều chinh liều từ tuần thử 3 cùa quá trinh điều trị và có thê kéo dài từ 1 đến 3 tháng và giai đoạn điều trị duy tri lã kin đạt được liều mà người bệnh dược sứ dụng liều có hiệu qua tồi ưu duy tri trong ít nhất 4 tuần liên tục vã không tái

sư dụng CDTP trong it nhất 4 tuần liên tục thi dược xác định lã giai đoạn duy tri

1.2.2 Quy (tịnh về khám làm sàng và xét nghiệm

Khám lâm sàng nhầm xác định được tinh trạng và mức độ lệ thuộc CDTP cua người bệnh, cãc bệnh lý kèm theo, các yếu tố tâm lý xã hội anh hương đến quá trinh diều trị các vấn dề cắp bách về sức khóe vã tâm lý xà hội cua người bệnh cần phai giái quyết Các nội dung thám khâm cụ thề như sau: Đánh giá sức khóe toàn trạng: Thảm khám toàn diện, đặc biệt các bệnh lý: viêm gan suy gan lao và bệnh phối HIV/A1DS bệnh tim mạch, tinh trạng dinh dường và tinh trạng thai nghén Đánh giá sức khoe tâm thần: hoang lương, ao giác, kích động.trầm cám.ý tương và hành vi tự sát tự huy hoại cơ thế.các l ơi loạn ỳ thức, đặc biệt là tinh trạng lũ lần Đánh giá nhũng dấu hiệu liên quan dền sữdụng ma túy: các vet tiêm chích, viêm da ãp xe tấc mạch, viêm nội tâm mạc bán cấp, dầu hiệu suy tim loạn nhịp tim: các biêu hiện nhiễm dộc hộ thần kinh trung ương: ngu gà đi loạng choạng, nói ngọng, tái xanh, nõn, và mồ hỏi: các dấu hiệu nhiêm dộc hoặc hội chứng cai liên quan đến sư dụng các CDTP Các rối loạn cơ thê liên quan đen sữ dụng rượu và các CGN khác Dối với xét nghiệm, ngoài các xét nghiệm thường quy như còng thức máu xẻt nghiệm men gan: ALT(SGPT) AST(SGOT): xét nghiệm nước tiêu tim CDTP bảng test

nhanhibộnh nhân cần thực hiện cãc xét nghiệm cẩn thiết khác: xẽt nghiệm phát hiện nhiễm HIV(khi người bệnh lự nguyện), xét nghiệm chẩn đoán nhiễm viêm gan B c (nếu có điêu kiện) vá một sổ xét nghiệm chuyên khoa khi có chi định: chân đoán lao các bệnh tim mạch, chân đoán có thai

1.3 Tình hĩnh diều trị methadone trén thế giói vả trong nước

c trong nhóm nghiện heroin giam rỏ rệt Hiện nay tại Mỳ có 750 trung tâm methadone dien trị cho trên 210.000 người nghiện heroin vào năm 2012 Ớ Australia, điều trị nghiện heroin bang methadone triẽn khai tù năm 1993 đen năm 2009 có 70% bệnh nhãn nghiện CDTP được điều trị băng methadone.Tại khu vục Châu Á rất nhiều quốc gia đã triển khai chương trình Tuy nhiên, quy mô triển khai và hiệu qua chương trinh ớ các nước khá khác nhau Hồng Kong Trung Quốc Indonesia là nhũng quốc gia triẻn khai khá sớm chương trinh ngày càng mớ rộng vã dụt dược nhiều lợi ich Hống Kong triền khai chương trinh năm 1972 trong nỏ lực đối phó với tinh trạng tội phạm có xu hướng gia táng Đen năm 2012 có 20 phông khám đưa vào hoạt dộng với hơn 9.000 người được dien trị Việc mơ rộng chương trinh dà cỏ những anh hương dáng kê giúp giam mức độ hành vi phạm tội trẽn quốc đao nãy và từ dó ngăn ngừa dại dịch HIV/AIDS Trung Quốc khởi dộng chương trinh nám 2004 đến năm 2008 đà có 500 phòng khám với 80.000 người đưực điều trị Indonesia bắt đầu chương trinh nám 2003 và có khoảng 1.300 người dược điều trị vào năm

2012 Một số quốc gia cũng dã triền khai chương trinh nhưng không dạt hiệu quá Thái Lan dưa chương trinh diều trị nghiện CDTP bang thuốc methadone nàm 1979 Tinh dền 2012 có khoáng 1000- 10000 người dang dược diều trị Thái Lan lã một nước không quan tâm mơ rộng chương trình, do dó tý lệ nhiễm HIV tiếp tục tảng trong nhóm nghiện chất ma túy (NCMT) Myanmar dà trial khai thi diêm chương trinh diều trị methadone tại 6 diêm trên toàn quốc với 400 người tham gia Sự cam kết cua quốc gia này chưa thực sự mạnh mè mặc đủ 80% trong số 195.000 người NCMT nước này dương tính với H1V

1.3.2 Tại Hột Nam

Việt Nam dã thục hiện thi diêm chương trình dien trị thay thế các CDTP bang thuốc methadone từ năm 2008 tụi Hai Phông và Hỗ Chi Minh Sau một thời gian triền khai chương trinh dã cho thấy nhũng hiệu quà rõ rệt với chi phi tiết kiệm so với cai nghiện bắt buộc như: Tại thời điểm 3 tháng và 6 tháng, việc

sứ dụng heroin và các hành vi nguy cơ lày truyền HIV giâm rỏ rệt Việc sư dụng ma túy trong số nliừng người nghiện ma túy đà giám từ 100% khi bất đầu diều trị xuồng 27.5% ớ tháng thứ 3 và tiếp tục giam còn 15.9% sau 24 tháng; giam nguy cơ lây truyền các bệnh qua đường máu như IIIV và viêm gan B C;

4 trong tông số 956 người bệnh dược điều trị methadone chuyên thành H1V dương tinh sau 24 tháng diêu trị methadone; giám tội phạm liên quan đến ma túy; tý lệ người bệnh tự bão cáo có các hành vi VI phạm pháp luật đã giâm từ 40.8% xuống 1.34% sau 24 tháng diều trị: mâu thuần với nhiều thành viên trong gia dinh và hàng xóm giâm từ 41% xuống còn 1% sau I năm; tý lệ người cỏ việc làm trước diêu trị là 64,04% và sau 24 tháng điêu trị là 75.9%; diêm chất lượng cuộc sống theo thang diêm cua WHO có sự cai thiện về mặt thê chất (81

so VỚI 69): về mật tinh thần (69 so với 56): vã null trạng xà hội (56 so với 50) Chi phi diều trị methadone ước tinh từ 10.000-15.000 VND/ngưởi bệnh/ngảy nhưng người bệnh dược hoàn toàn miền phi diêu trị

Methadone không gãy hại cho bầt cử cơ quan quan trọng nào cùa cơ thê Các tác dụng ngoại ý có thê xuất hiện it tác hại hơn so với các nguy cơ cùa sư dụng rượu, thuốc lã và các CDTP bất hợp pháp khác Nguy cơ lớn nhất liên quan đến Methadone lã quá liều Nguy cơ quá liều đặc biệt cao trong giai đoạn

dò liều Methadone hoặc khi Methadone được sứ dụng cũng với cãc thuốc an thằn khác Thời gian xuất hiện tác dộng muộn và thỏi gian ban huy kẽo dãi làm cho quả lieu methadone khó phát hiện, tác dộng cua ngộ dộc Methadone cỏ thê

dc dọa tinh mạng người bệnh nhiều giờ sau khi uống thuốc

1.4 Mức độ biểu hiện thụ the p opỉoỉd (MOR)

1.4.1 Phân tích mức độ biếu hiện gen

Biếu hiện gen là quá trinh chuyền dối thông tin di truyền chứa trong gen thành sân phàm trong tế bão sống, từ dó tinh trạng tương ứng dược tạo thành ớ kiêu hĩnh có thè quan sát được [3], Quà trinh dịch mã dược mà hóa trong gcn thành cấu trúc protein hoặc RNA hiện diện vá hoạt dộng trong tề bào Các gen biêu hiện bao gồm các gen dược phiên mã thành RNA thông tin (mRNA) vã sau dỏ được dịch mà thành protein, cũng như các gcn dược phiên mã thành RNA.[4]

Phân tích biêu hiện gen lá nghiên cứu sự phiên nứ của RNA bảng cách định lượng RNA trong tế bào.ị 5] Phàn tích biếu hiện gen định hrọng mức RNA thông tin (mRNA) hoặc mức phiên mã RNA chức năng không dược dịch mà trong một

tể bào Cho dù một RNA dược dịch mà thành protein hay được sir dụng trực tiếp trong tế bào các mức độ phiên mà RNA có thê cung cấp nhùng hiểu biết quan trọng về cách một hoặc nhiều tề bào dang hoạt dộng

1.4.2 Cẩu trúc thụ thế opioid

Có tất ca bón gen thụ the opioid, bao gồm thụ thê muy (OPRM1), thụ thê delta (OPRD1), thụ thê kappa (OPRK1) vá thụ thế giống như opioid (OPRLI)

Mỗi loại thụ thế có bay miền xuyên màng, ba vòng nội bão ba võng ngoại bão một đầu tận cùng N ngoại bào và một đầu tận cũng c nội bão

Hình 1-1 Vị tri thụ thế p-opioid trước synap

Thụ thê p opioid có thè tốn tại trước hoặc sau khớp thần kinh tùy thuộc vào loại tổ bão Các thụ the p-opioid chu yểu tồn tại trước synap ờ vũng xăm quanh cồng nào và ờ sừng sau bề mật cúa tuy sống (cụ thê là chất keo cua Rolando ) Các khu vực khác mà chúng đà dược định vị bao gồm lớp dám rối bẽn ngoài cùa khứu giác, trong một số lóp cua vô nào và trong một số nhãn cùa amygdala Một số MOR cùng được tim thấy trong đường ruột Kích hoạt các thụ the này ửc che hoạt dộng nhu dộng gãy táo bón một tác dụng phụ chinh cua chất chu vận p.[5]

gen OPRM1 không chi ơ chuột vã người mà côn ở hem 30 loài Tất ca cãc loài đều chứa một ban sao cua gen OPRM 1 Giai trinh tự bộ gcn cũng cho thấy cãc gen liền kề với OPRM I dược bao tồn.

Sau khi thụ thê opioid được kích hoạt bui chắt chu vận opioid (opioid agonist) nội sinh như endorphin, ngoại sinh như morphin fentanyl, methadol [7] các tiêu dơn vị Ga, G0Y phàn ly vã hoạt dộng trẽn các con đường khác nhau Sau khi phân ly ticu dơn vị Ga sẽ chuyên sang tương lâc trực tiếp với kênh tiết lưu K nội bào (Inward rectifying potassium channels - Kir3) Sự bất hoạt kênh xay ra sau khi thúy phàn GTP thành guanosin diphosphate Quá trinh này sè gây ra hiện tượng tảng phân cực tế báo và ửc che hoạt dộng trương 1\rc thần kinh (tonic neural activity) Trong cãc nghiên cứu chứng minh tác dụng ức chế cua opioid dối với sự hưng phấn thần kinh dược

lả do tương tác cua cãc thụ the opioid với kênh Kir3 đổng thời tiêu dơn vị Gpỵ

sè ức chế các kênh canxi phụ thuộc điện thế, cùng với sự ức chế hoạt dộng cua andenyl cyclase lãm giảm dòng chày Ca 2+ phụ thuộc sự cAMP cùng giam Kct quá là ngăn chận việc giái phóng chất dần truyền thần kinh giam đau như glutamate, chất P Ngoài ra còn các nghiên cứu khác gần đây chứng minh hoạt dộng cùa receptor opioid liên quan đến hệ thống tin hiệu MAPK (mitogen* activated protein kinase) hay cơ chế phụ thuộc P«arrestin30.[8]

Các biến thế ghép nồi cùa thụ thề p-opioid và vai trò

Quá trinh cẩt nồi tiền I11RNA thay thế cùa gen OPRX11 tạo ra nhiều thụ thê mu opioid, góp phần váo sự da dạng và phức tạp cua cãc phan ủng opioid dược thấy ơ người và động vật chúng ta biết rằng gen OPRM1 một ban sao trai qua quả trinh ghép nối thay thề rộng rài tạo ra một loụt các biển thê nối phức tạp hơn nhiều so vói các biến thế dược xác định bơi các nghiên cứu dược

lý ban dầu Các biến the mỗi nối OPRM1 náy có thê được phân loại chu yếu thành ba loại khác biệt về cấu trúc:

(1) biển thê 7 TM-C terminal (full-length 7 TM C-tenninal):

(2) biến the cắt ngẩn 6 TNÍ

(3) biến thè đơn TM (single TM variants)

Tất cà đều dược bao tồn từ loài gặm nhấm sang người Bằng chứng tích lũy chi ra rang các biến thê mối nối OPRM I này đóng vai trô quan trọng trong dược lý ụ-opioid.[9]

Hình ỉ-3 Sư dơ cấu trúc gen OPRMỈ cúa cơn người và nơi thay thế Trèn cùng là cấu n úc gen OPRM1 Tiềp theo là ghép nồi 7TSÍ 6TM và ỈTMvởi cấn n úc protein dự đoán dược hiền thị ớ bèn phai và màu exon dược

niđ hóa phù hợp với sư đồ nổi.

Gen thụ the p-opioid (MOR-1) OPRMl trai qua quá trinh ghép nói thay thế rộng rài tạo ra một loạt cãc biến thê mổi nối Trong số các biến thế này MOR-1A là một biên thê mỗi nối nguyên vẹn, giữ intron giống liệt với MOR-

1 ngoại trừ đuôi nội bào cuối dược mã hóa bơi exon 3b khá phong phú và được

bao tồn từ loài gặm nhẩm sang người [10] Vi vậy chúng tôi chọn MOR-IA cho nghiên cửu này.

Hình 1-4 Sư dồ cầu trúcgen OPRM1 và các biến Ihếmổì nơi MOR-1A từ

gen OPRMl cúư người Ị11Ị

1.5 Các phương pháp phân tích mức độ bỉều hiện gcn

Kháo sát biếu hiện gcn được định nghĩa đơn gián là việc nghiên cứu về cách mà gen đó được phicn mà đê tông họp nên các san phâni có chức nàng sinh học - cãc dóng RNA chức năng hoặc câc sản phẩm proteins, có nhiều phương pháp dùng đế phân tích mức độ biểu hiện cua gcn như microarrays, RNA-seq qRT-PCR

Microarrays và RNA-scq thường được sư dụng đế so sánh cấu hình biếu hiện gen cua các tế bào trong các diều kiện khác nhau Lượng dữ liệu được tạo

ra từ nhùng thi nghiệm nãy lã rất lớn Các microarrays có thê phân tích hàng nghìn gen và về nguyên tắc RNA-seq có thê phân tích mọi gcn được biêu hiện tích cực Tuy nhiên phương pháp này cẩn còng cụ hóa chất hiộn đại vã chi phi khá lởn Trong đó, kỳ thuật Realtime-PCR tên gọi khác là PCR định lượng, được coi lã một "công cụ vàng" dê thực hiện cãc khao sát liên quan tởi nucleic acid với độ chinh xác dộ nhạy cao và tiết kiệm chi phi hơn

Quantitative Reverse Transcription PCR (qRT-PCR) là kỳ thuật PCR định lượng với khuôn ban dầu lã RNA qRT-PCR gồm 2 bước cliinh là tống hợp cDNA và real time- PCR Quá trinh tỏng hợp cDNA dược thực hiện bang cách phiên mã ngược RNA thành cDNA bơi enzyme phiên mã ngược [12]

Đầu tiên, cãc phàn tư RNA dược polyadenyl hỏa bới poly (A) polymerase và chuyển đối thành cDNA bơi cnzym phiên mà ngược với mồi oligo-dT

RNA Ouôl poty • A

r - ~ AAAAAAAA

trrn

Môlolipc-dT Enx»m phiến ma npixơe

ĩ • I r

c _I

DNA polymerate I cONA

vã kéo dài Tuy nhiên khác vói PCR kiêm tra san phẩm sau khi phán ứng kết thúc, real time PCR tại mồi chu kỳ trong quá trinli realtimc-PCR này số lượng DNA dược do theo thời gian thực bang cách sử dụng hóa chất huỳnh quang SYBR Green xen kè vào các sợi dôi DNA SYBR Green là một loại mâu huỳnh quang cỏ ãi lire rắt cao khi có Sự hiện diện cũa sợi dôi DNA và ái lực này là do khá nâng chèn cùa máu vào giữa sợi đôi DNA và lãm cho sợi dôi DNA phát

trong quá trinh phan úng PCR xay ra.[13]

Hình 1-6 Nguyên lý cùa phân ứng real time PCR sir dụng SĨVR Green Ị14Ị

Các tin hiệu này được phát hiện và giũ lại dưới dạng biêu dồ từ dó có thè dưa ra dánh giá về số lượng sàn phàm khuếch đại DNA đích có mặt ỡ mỗi chu

kỳ Chu kỳ ngưỡng hay Ct là chu kỳ nhiệt mà ớ tại thời diêm nãy thiết bị real time ghi nhận dưục tin hiệu huỳnh quang phát ra từ ổng phân ứng bắt dầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền Ct cua một ổng phan ủng real-time PCR sớm hay muộn (Ct thấp hay Ct cao) tùy thuộc vào số lượng ban DNA đích ban đầu

có trong ống phàn ứng

- Phát hiện các gen có nguồn gốc từ các retrovirus: 1 -IIV’ cúm gia cằm

- Dùng đẽ nghiên cứu biêu hiện gen

- Xác định sự biêu hiện cua gcn được biến nạp hay chuyên nạp vào vật chú mới

- Thu được đầy đu chiều dãi của gen quan tàm

Trong nghiên cứu này chúng tòi sư đụng kĩ thuật qRT PCR dè nghiên cứu mức bộ biêu hiện cua biến thê mu oppioid ớ bệnh nhãn nghiện chất dạng thuồc phiện dang sư dụng methadol

CHƯƠNG 2 ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN củv

2.1 Đối tượng nghiên cíni

Nghiên cứu lụa chọn trên 9 bệnh nhân nghiện chất dạng thuốc phiện đang điều trị methadol trẽn địa bân tinh Ninh Binh và 9 tinh nguyện viên khóe mạnh tham gia nghiên cứu

2.1.1 Mầu nghiên cíni

Mầu máu loan phần 2 mi chống dông EDTA

2.1.2 Tiêu ch nan hen chọn bệnh nhân

Nhỏm chứng:

Ngưởi khỏe mạnh không mấc các bệnh li di tniycn tim mạch, bệnh li màn tinh, ung thư không sư dụng các chất dạng thuốc phiện

Tàm trạng thoai mái site khoe tinh thần ôn định, không bị stress

Đồng ỷ tham gia và ung hộ nghiên cứu

Nhóm bệnh:

Bệnh nhàn được chân doán lộ thuộc vào các chất dạng thuốc phiện theo

QĐ 3140/ỌĐ-BYT năm 2010 vả Nghị định 90/2016/NĐ-CP nám 2016

- Tiêu chuẩn lãm sàng:

Theo Bàng phàn loại quốc tế bệnh tột lần thứ 10 (ICD-10) năm 1992 cùa

Tô chúc Y tề the giỏi: chẩn đoán xác định nghiện ma tuý nhóm Opiats khi có

du tối thiêu 3 trong 6 nhóm triệu chứng sau dày dã dược bicu hiện vào một lúc nào đó trong vòng 12 tháng trơ lại dây:

a) Thêm muốn mạnh mè hoặc cam thấy buộc phai sư dụng ma tuý nhóm Opiats

b) Khó khán trong việc kiêm tra thói quen sư dụng ma tuý nhóm Opiats như thời gian bầt đầu kết thúc hoặc lieu lưọng sư dụng

c) Xuất hiện hội chúng cai ma tuý nhỏm opiats khi ngùng hoặc giâm đáng

ke lieu lượng ma luỷ nhóm opiats đang sử dụng hoặc phai dũng lại ma tuý nhôm Opiats dê lãm giam nhẹ triệu chúng hoặc lãm mất hội chủng cai ma tuý nhóm Opiats

d) Có khuynh hướng táng liều dê chấm dirt hậu qua do lieu thấp gãy ra.d) Sao nhàng các thú vui sớ thích, công việc trước dây bang việc tìm kiếm

vã sư dụng ma tuý nhóm opiats

e) Tiếp tục sử dụng ma tuý nhóm opiats mặc dũ biểt tác hại thậm chi đà

có bằng chứng rỏ ráng về tác hại cua ma tuý nhóm Opiats dối vởi ban thân gia đinh và xà hội [16]

- Tiêu chuẩn xét nghiệm:

Phai xãc định dược sự có mặt cua ma tuỷ nhóm Opiats trong nước tiêu

Cỏ the xẽt nghiệm nước tiêu tim ma tuý nhóm Opiats bảng phương pháp Test nhanh (thường sứ dụng dê sàng lọc)

Thoa màn các diều kiện sau dược lira chọn vào nghiên cửu

+ Bệnh nhân dang diều trị Methadone có thời gian điều trị ít nhất 03 tháng+ Tuồi > 18 tuổi

+ Đồng ý tham gia nghiên cửu

2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ

Nhóm chứng:

- Dang sứ dụng các loại thuốc ửc chế mien dịch, tim mạch

- Cỏ tiền sừ mẩc ung thư và các bệnh liên quan, bị càng tháng thằn kinh

- Không dồng ý tham gia nghiên cứu

Nhóm bệnh:

- Phụ thuộc vảo các loại thuốc lạm dụng khác như amphetamine, rượu, thuốc lá vã tiêu thụ bầt kỳ loại thuốc được kê đơn nào khác có the anh hướng dền hệ thần kinh trung ương

- Cãc vấn đề về thần kinh, tâm thần, tim mạch hoặc nội tiết trong quả khứ hoặc hiện tại

- Bất kỳ bệnh viêm hoặc nhiễm trũng nào hiện tại bao gồm nhiềm HCV HBV và HIV

2.2 Thòi gian, dịa điểm nghiên cứu

2.2.1 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 1/2023 Thang 6/2023

2.2.2 Dịa điếm nghiên cứu

+ Ca sỡ điểu trị methadone tại tinh Ninh Binh

+ Khoa Kỳ thuật Y học Trưởng Đụi hục Y Hả Nội

+ Trung tâm kiêm chuần chất lượng xét nghiệm Đại học Y Hà Nội

+ Bộ môn hóa sinh Trường Đại học Y Há Nội

+ Trung tâm Xét nghiệm Chemidic

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thiết kể nghiên cún

Nghiên cứu bệnh chúng

2.3.2 Cữ mầu nghiên cửu

- Chọn mẫu có chu đích Tông số mẫu nghiên cứu là 18 (trong dó có 9 mẫu chúng vã 9 màu bệnh) thoa màn tiêu chuẩn chọn mầu và tiêu chuân loại trừ

2.3.3 Hóa chất thict bị sứdụug trong nghiên cứu

a Thiết bị

- Máy realtime PCR

- Máy PCR

- Mây ly tâm

- Mây chụp ánh gel ưv

- Pipet paster và đầu cỏn (vãng, xanh ) các loại, ống eppendorf các loại the tích, giấy lau gang tay hộp đựng dầu côn đã qua su dụng, nước cất Dụng cụ phái dược vô trùng tuyệt dối bang cách hấp ướt 120°c trong 20 phútb) Hóa chất

- Hóa chất tách chiết mARN: Kít tách chiết DNA/ARN cua geneAll Hãn Quốc, bao gồm các hỏa chất sau: Đệm BL Đém RB1 Đệm BW Đệm TW, RNAase- free water Proteinase K carrier ARN cột lọc micro s

- Hóa chất dùng cho phan úng tổng họp cDNA: buffer RT dNTP enzym phiên má ngược

- Hóa chất dùng cho phàn ứng PCR: master mix mỗi xuôi, mồi ngược RNAase- free water cDNA

- Hóa chất diện di: điện di trên gel agarose 2%: bột agarose, dung dịch đệm TBE Blue Loading Dye Runsafe DNA ladder 50bp

- Hóa chất dũng cho phân ứng realtime PCR: master mix mồi xuôi, mồi ngược RNAase- free water

2.3.4 Sơ đồ nghiên cứu

Hình 2-1 Sư dồ nghiên cím