Báo cáo khoa học nghiên cứu phân lập và chuyển gen lúa liên quan đến tính chịu hạn vào giống lúa việt nam

coli, Agrobacterium • Nhân dòng gen, ghép nối DNA, cắt enzyme giới hạn… • Đánh giá giá sinh trưởng, phát triển và khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen ĐẶT VẤN ĐỀ VẬT LIỆU & PHƯƠ

Trang 1

B BÁO ÁO C CÁO ÁO KHOA HỌC KHOA HỌC

Nghiên cứu phân lập và chuyển gen liên quan đến tính chịu hạn vào giống lúa

Việt Nam

B BÁO ÁO C CÁO ÁO KHOA HỌC KHOA HỌC

Nghiên cứu phân lập và chuyển gen liên quan đến tính chịu hạn vào giống lúa

Việt Nam

Hà Nội, 03-2017

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆPVIỆT NAM

VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP

1

Báo cáo khoa học

Trang 2

Đặt vấn đề

Vật liệu và phương pháp

Kết quả nghiên cứu

Kết luận & Kiến nghị

4

1

2

3

Nội dung báo cáo

Trang 3

AN NINH LƯƠNG THỰC CHO LOÀI NGƯỜI

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trang 4

Dự đoán mức độ thiếu nước cho sản xuất nông

Trang 5

“Hạn hán, xâm nhập mặn đang vượt quá khả

năng chống đỡ của Việt Nam”

sedac.ciesin.columbia.edu

Trang 6

Giải pháp nào cho nền nông nghiệp hiện nay?

gmcropss.yolasite.com permaculturenews.org

Cải tạo giống

Trang 9

Nhân tố phiên mã đáp ứng hạn ở thực vật

Nhóm AREB/ABF: phụ thuộc ABA

Nhóm AP2/ERF gồm 4 phân nhóm DREB, Rav, ERF

Nhóm NAC: nhóm nhân tố phiên mã lớn nhất ở thực vật

Nhóm bZIP, MYB, Zinc fingers, HD-Zip protein …

Trang 10

Nhân tố phiên mã đáp ứng hạn ở lúa

ĐẶT VẤN ĐỀ Joshi et al., 2016

Trang 11

Nhân tố phiên mã OsDREB1A

Trang 12

WT: 16%

OsDREB: 57-90%

Trang 13

14 ngày: 52.72%

28 ngày: 73.36%

Trang 14

 Phân lập được gen mã hóa nhân tố phiên mã OsDREB1A/2A liên quan tính chịu hạn trên giống lúa Việt Nam.

 Tối ưu hóa được qui trình chuyển gen thông qua vi khuẩn A

tumefaciens trên một số giống lúa Việt Nam.

 Tạo ra được một số dòng lúa chuyển gen mã hóa nhân tố phiên mã có khả năng chống chịu tốt với bất lợi hạn/thiếu

nước trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Mục tiêu nghiên cứu

Trang 16

Vật liệu

• Mẫu thực vật : Tập đoàn 48 giống lúa Việt Nam do Viện KHKT nông lâm nghiệp Miền núi phía Bắc và Trung tâm tài nghiên thực vật cung cấp.

• Thư viện cDNA xử lý hạn do Phòng Bệnh học Phân tử cung cấp.

• Chủng vi khuẩn : Vi khuẩn E coli DH5α, chủng Agrobacterium

LBA4404 do Phòng Bệnh học Phân tử cung cấp

• Vector pBI và các cặp oligo nucleotide (Sigma)

• Thiết bị : máy PCR, máy RT-PCR, máy giải trình tự, hệ thống điện di, máy chụp ảnh huỳn quang, cột sắc ký…

• Hóa chất dùng cho sinh học phân tử và nuôi cấy mô tế bào thực vật đảm bảo độ tinh khiết cần thiết

ĐẶT VẤN ĐỀ VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP

Trang 17

Phương pháp

• Đánh giá khả năng tạo callus và tái sinh cây lúa

• Nhân bản gen bằng PCR

• Đánh giá số lượng bản sao của gen chuyển: Southn blot, qRT-PCR,

tỷ lệ nảy mầm trên Hygromycin

• Biến nạp cấu trúc biểu hiện gen vào lúa

• Tách chiết DNA plasmid, DNA hệ gen, RNA

• Biến nạp vi khuẩn E coli, Agrobacterium

• Nhân dòng gen, ghép nối DNA, cắt enzyme giới hạn…

• Đánh giá giá sinh trưởng, phát triển và khả năng chịu hạn của các dòng lúa chuyển gen

ĐẶT VẤN ĐỀ VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP

Trang 18

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Trang 19

Nội dung I

PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR

CHUYỂN GEN OSDREB1A/OSDREB2A

ĐẶT VẤN ĐỀ VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP KẾT QUẢ

Trang 20

Sơ đồ phương pháp phân lập gen

Hệ gen/cDNA của lúa đã

Vector chuyển gen pBI-OsDEB1A/OsDREB2A

Vector nhân dòng pUC19

Trang 21

Nhân bản trình tự mã hóa OsDREB1A

Trang 22

Nhân bản trình tự mã hóa OsDREB2A

A: RNA tổng số B: PCR sơ cấp trình tự OsDREB2A từ cDNA giống Cườm dạng

C: PCR lồng D: Sơ đồ cặp mồi

Trang 23

Dòng hóa trình tự mã hóa OsDREB1A/OsDREB2A

Giếng 1 - 5: Giống Cườm Dạng

Giếng 6-9: Giống Mộc Tuyền Giếng 12-17: Giống Cườm Dạng

Trang 24

Kiểm tra pUC19 tái tổ hợp trình tự mã hóa

OsDREB1A/OsDREB2A

Kết quả điện di PCR từ khuôn plasmid các vector pUC19 tái tổ hợp sử

dụng cặp mồi gen/vector

OsDREB1A OsDREB2A

Trang 25

Kiểm tra pUC19 tái tổ hợp trình tự mã hóa

Điện di sản phẩm cắt giới hạn (BamHI) các vector pUC19 tái tổ hợp

Trang 26

Kết quả giải trình tự mã hóa OsDREB1A

Trình tự

pUC19-MtOsDREB1A

Trang 27

Kết quả so sánh trình tự mã hóa OsDREB2A

Phân lập thành công trình tự mã hóa gen OsDREB1A và

OsDREB2A

Trang 28

Thiết kế vector chuyển gen pBIG

Trang 29

Sàng lọc thể biến nạp vector pBI101 tái tổ hợp

pBI-Ubi pBI-Lip9

Đã thiết kế thành công cấu trúc biểu hiệu gen

OsDREB1A/OsDRB2A điều khiển bởi promoter

Ubiquitin & Lip9

Trang 31

Khả năng hình thành callus của tập đoàn giống

lúa Việt Nam

Trang 32

lúa Việt Nam

Trang 33

20, 26, 34, 44 và 47 là những giống có tiềm năng

tạo callus cao nhất

lúa Việt Nam

Giống 110660,7389 46 2459,1275 873,4214 4,8E-272 1,7148

Môi trường 1450,639857 2 725,31993 257,6157 7,58E-64 5,4013

Môi trường và giống 7975,480877 90 88,616454 31,47438 4,6E-105 1,5272

Trong nhóm 777,081 276 2,8155109

Trang 34

Khả năng tái sinh của một số giống lúa Việt Nam

Trang 35

Hình 3: Khả năng tái sinh của tập đoàn giống lúa

8, 20, 26, 28, 34, 44 và 47 là các giống lúa có tỷ lệ

tái sinh trung bình trên 55%

Giống 21757,01 25 906,5421 119,3535 6,7E-105 2,0116

Môi trường 11496,94 3 3832,313 504,5546 5,47E-93 4,4084

Môi trường và giống 12722,17 72 176,6968 23,2635 3,57E-67 1,6146

Trong nhóm 1519,087 200 7,595437

Trang 36

5 giống có tỷ lệ hình thành callus cao và tái sinh tốt là

YUNLU103-1B, Chành Trụi, LUYIN46, LP-5M và

IR80416-B-152-4 tiếp tục được khảo sát tiếp nhận gen lạ

Trang 37

Khả năng tiếp nhận gen lạ của 05 giống lúa Việt

Nam với một số quy trình

Qui trình Giai đoạn Chành trụi

(%)

1B (%)

YUNLU103-LUYIN46

152-4 (%)

IR80416-B-Phòng

Bệnh học

phân tử (I)

Chọn lọc 1 50 ± 2,04 20,33 ± 1,67 15,53 ± 1,78 19,39 ± 1,57 21,53 ± 1,98 Chọn lọc 2 38 ± 1,53 5,26 ± 1,01 2,34 ± 0,67 4,33 ± 0,51 6,21 ± 0,62

PCR* 0

Trang 38

Nội dung III

TẠO GIỐNG LÚA CHÀNH TRỤI

CHUYỂN GEN

Trang 39

Cấu trúc biểu hiện OsDREB1A/OsDREB2A

Nos-T

Lip9 / Ubi

Trang 40

Sàng lọc thể biến nạp vector biểu hiện

OsDREB1A/OsDREB2A trên A tumefaciens

Trang 41

Biến nạp cấu trúc biểu hiện

OsDREB1A/OsDREB2A vào lúa Chành Trụi

Cấu trúc gen chuyển Hạt lúa Chọn lọc 1 Chọn lọc 2 Tái sinh

Trang 42

Sàng lọc các dòng Chành Trụi chuyển gen

pBIG-OsDREB1A

Trang 43

Sàng lọc các dòng Chành Trụi chuyển gen

Trang 44

Sàng lọc cây chuyển gen thế thệ T 0

Cấu trúc gen chuyển Tái sinh PCR dương tính

Trang 45

Kết quả theo dõi của các dòng lúa chuyển gen T 0

Cấu trúc gen chuyển Bầu đất Nhà lưới Trổ bông Kết hạt Thu hạt T1

Trang 46

Kết quả sàng lọc các dòng T 1 chuyển gen

Trang 47

Kiểm tra số bản copy bằng Southern Blot

Thu được 9 dòng lúa chuyển gen OsDREB1A

đồng hợp tử (5 dòng Lip9, 4 dòng Ubi)

Giếng 1-5: Lip9- OsDREB1A Giếng 8-11: Ubi -OsDREB1A

Trang 48

Ước tính số lượng bản sao và tính trạng đồng

hợp tử các dòng lúa chuyển gen T 1

Số hạt kiểm tra

Số hạt nảy mầm trên Hygromycin

PCR dương tính

Kiểu gen

Dị hợp (Aa)

Đồng hợp (AA)

Trang 49

Kết quả sinh trưởng của các dòng lúa chuyển gen

Cấu trúc gen Số cây Sinh trưởng

Trang 51

Thu được 4 dòng lúa chuyển gen (L3,

L5, U1 và U4)

Đánh giá sinh trưởng và phát triển các dòng

chuyển gen T 2

Trang 52

Đánh giá khả năng giữ nước các dòng chuyển

gen T 2 khi mất nước cưỡng bức

Trang 53

Trang 54

Khả năng giữ nước và phục hồi

Trang 55

Đánh giá khả năng chịu hạn và tạo hạt (T 3 )

20 ngày tuổi: hạn 2 tuần

Trang 56

Đánh giá khả năng chịu hạn và tạo hạt (T 3 )

40 ngày tuổi: hạn 3 tuần

Các dòng chuyển gen có khả năng phục hồi 20-30%

Dòng L5 có khả năng chịu hạn cao nhất.

Trang 57

OsDREB1A tăng cường biểu hiện trong cây

chuyển gen khi xử lý hạn

Trang 58

Đánh giá biểu hiện gen trong cây chuyển gen

Trang 60

KẾT LUẬN

 Trình tự mã hóa OsDREB1A kích thước 720 bp đã được phân lập thành công và giải trình tự

từ DNA tổng số của giống Cườm Dạng 1 và cDNA của giống Mộc Tuyền; trình tự mã hóa

OsDREB2A kích thước 825 bp đã được phân lập thành công và giải trình tự từ cDNA giống

Cườm Dạng 1 Tạo được 04 cấu trúc vector chuyển gen: Ubi:OsDREB1A, Ubi:OsDREB2A,

Lip9:OsDREB1A và Lip9:OsDREB2A làm vật liệu phục vụ công tác tạo giống cây trồng chịu

hạn theo định hướng chuyển gen.

 Khả năng tạo callus và khả năng tái sinh chồi từ callus của tập đoàn giống lúa trồng ở Việt Nam phụ thuộc chặt chẽ cả hai yếu tố giống và môi trường Có 05/47 giống lúa (LP-5M, IR80416-B-152-4, YUNLU103-1B, Nếp Khau Để Đỏn và Chành Trụi) có tỷ lệ tạo callus lớn hơn 75% trên môi trường MS có bổ sung 2,4D Có 05/26 giống lúa (LUYIN46, IR80416-B- 152-4, LHY-4, YUNLU103-1B và Chành Trụi) có khả năng tái sinh chồi từ callus đạt trên 70% trên môi trường tái sinh TS2 (MS + 2mg/l BAP + 0,5mg/l kinetine) Quy trình chuyển gen cho giống Chành Trụi đã được thiết lập thành công với tỷ lệ xấp xỉ 15%.

ĐẶT VẤN ĐỀ VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP KẾT QUẢ KẾT LUẬN

Trang 61

 Kết quả sàng lọc kiểu gen và đánh giá kiểu hìnhđã xác định được 04 dòng

Chành Trụi chuyển gen đồng hợp đã duy trì đến thế hệ T3(L3 và L5, cấu trúc

Lip9:OsDREB1A; U1 và U4, cấu trúc Ubi:OsDREB1A) có khả năng phục hồi, kết

hạt (tỷ lệ hạt chắc đạt 13,33 - 20%) sau 03 tuần ngừng cung cấp nước Kết quả

nghiên cứu biểu hiện (sqRT-PCR và qRT-PCR) cho thấy OsDREB1A và gen chỉ thị chịu hạn (DIP, SALT) ở cây chuyển gen đều được tăng cường biểu hiện trong điều kiện hạn và có khác biệt so với cây đối chứng.

ĐẶT VẤN ĐỀ VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP KẾT QUẢ KẾT LUẬN

Trang 62

KIẾN NGHỊ

 Tiếp tục nghiên cứu khả năng duy trì tính ổn định ở các thế hệ T 3 ,

T 4 Của 04 dòng lúa chuyển gen Chành Trụi đã tạo ra trong nghiên cứu ở các thế hệ tiếp theo (tính bền vững di truyền, khả năng duy trì tính chống chịu, năng suất….).

 Mở rộng nghiên cứu chuyển gen OsDREB1A và OsDREB2A dưới

sự điều khiển của các promoter hoạt động cảm ứng stress vào các đối tượng cây trồng khác để phục vụ công tác chọn tạo giống.

ĐẶT VẤN ĐỀ VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP KẾT QUẢ Kết luận

Trang 63

 Tiếp tục nghiên cứu các đặc tính sinh học của protein OsNLI-IF

 Tiếp tục nghiên cứu đánh giá khả năng sinh trưởng và chống

chịu của các dòng cây chuyển gen ở các giai đoạn phát triển và các thế hệ khác nhau.

 Đánh giá tiềm năng ứng dụng OsNLI-IF trong nghiên cứu tạo

giống cây trồng chống chịu hạn.

KIẾN NGHỊ

Tiêu đề	Nghiên cứu phân lập và chuyển gen liên quan đến tính chịu hạn vào giống lúa Việt Nam
Tác giả	NCS. Cao Lệ Quyên
Trường học	Viện Khoa Học Nông Nghiệp Việt Nam
Thể loại	Báo cáo khoa học
Năm xuất bản	2017
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	63
Dung lượng	2,53 MB