(Luận Văn) Phân Lập Và Tuyển Chọn Những Chủng Nấm Men Có Khả Năng Lên Men Rượu Cao Từ Bánh Men Thu Thập Tại Yên Phong Bắc Ninh

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 3.1 Đối Tượng và Phạm Vi Nghiên Cứu

Đối Tượng

Bánh Men thu thập từ Huyện Yên Phong Tỉnh Bắc Ninh.

Phạm vi nghiên cứu

Trong phòng thí nghiệm vi sinh của khoa Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm.

Thời gian và địa điểm

Từ tháng 12 năm 2014 đến tháng 7 năm 2015, nghiên cứu đã được thực hiện tại phòng thí nghiệm công nghệ vi sinh thuộc khoa Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.

Thiết bị, dụng cụ, hóa chất

- Thiết bị vô trùng : nồi hấp và tủ sấy

- Thiết bị nuôi và giữ giống : tủ cấy, tủ nuôi vi sinh, tủ lạnh, tủ lạnh sâu

- Thiết bị hỗ trợ quan sát : kính hiển vi quang học, buống đếm hồng cầu

- Thiết bị đo mật độ tế bào : máy so màu UV

- Các thiết bị khác : cân phân tích, máy đo PH, máy khuấy từ, lò vi song v.v.v

- Bình tam giác, cốc đong, bình chuẩn độ

- Ống nghiệm, đĩa peptri, que cấy, micropipet, pipet, hộp đầu côn

3.3.3 Hóa chất 3.3.3.1 Môi trường Hansen luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

Bảng 3.1 Thành phần của 1 lít môi trường Hansen

STT Tên hóa chất Hàm lƣợng(g/l)

3.3.3.2 Môi trường malt – cao nấm men và peptone

Bảng 3.2 Thành phần của 1 lít môi trường Malt – Cao Nấm Men - Peptone

STT Tên hóa chất Hàm lƣợng(g/l)

Xanh methylene là thuốc nhuộm kiềm, được tạo ra khi cho 30ml dung dịch xanh methylene và 1ml dung dịch KOH 10% vào 100ml nước.

Nội dung nghiên cứu

- Phân lập được các chủng nấm men từ bánh men

- Tuyển chọn một số chủng nấm men có khả năng lên men rượu mạnh

- Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy của chủng được chọn

Các phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Phương pháp nghiền và pha loãng mẫu [7]

Tiến hành chọn mẫu và nghiền nhỏ thành bột mịn, sau đó pha 1g mẫu với 9ml nước cất và tiến hành hấp khử trùng.

Để tạo ra các độ pha loãng khác nhau, bạn cần lấy 1ml dung dịch và cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất Tiếp tục quy trình này bằng cách hút 1ml từ ống nghiệm vừa pha và đưa vào ống nghiệm mới chứa 9ml nước cất Lặp lại quy trình này từ 6 đến 7 lần để đạt được các độ pha loãng mong muốn.

Các bước phân lập Bước 1: thu thập mẫu

Bước 2: lấy 1(g) mẫu pha với 9ml nước cất

Bước 3: lấy 1 ml nước mẫu đem pha loãng với hệ số 10

Bước 4: pha môi trường Hansen

Bước 5: hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 0 C trong vòng 15 phút

Bước 6: cấy trên môi trường thạch với các độ pha loãng khác nhau Bước 7: nuôi trong tủ ấm 30 0 C trong khoảng 24 đến 48 giờ

Bước 8: chọn khuẩn lạc cấy sang môi trường lỏng

Bước 9: cấy sang môi trường rắn

Bước 10: cấy chuyển sang môi trường thạch nghiêng để khuẩn lạc được đồng nhất

3.5.3 Phương pháp cấy truyền và giữ giống [3]

Nhằm mục địch bảo quản giống tránh thoái hóa

Tiến hành rót 10ml môi trường vào ống nghiệm rồi thành trùng ở

121 0 C trong 15 phút Để nghiêng cho nguội môi trường rồi ta cấy theo hình ziczac, sau đó nuôi trong tủ ấm 1 đến 2 ngày trong điều kiện 30 độ

C Bảo quản giống ở 4 0 C trong tủ lạnh

3.5.4 Phương pháp quan sát đặc điểm hình thái 3.5.4.1 Quan sát chủng giống khuẩn lạc [7] luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

Hình 3.1 Hình ảnh 1 số khuẩn lạc

Pha loãng nấm men ở nồng độ thích hợp và dùng pipet để lấy chính xác 0,1ml dịch vào đĩa petri chứa môi trường phân lập Sử dụng que thủy tinh vô trùng để trải đều dịch trên bề mặt đĩa, với mỗi độ pha loãng cấy trên 2 đĩa Đặt các đĩa thạch đã cấy ngược lên giá nuôi ở nhiệt độ 30°C và sau 48 giờ, tiến hành quan sát hình thái khuẩn lạc.

3.5.4.2 Quan sát chủng giống qua kính hiển vi [6]

Để làm tiêu bản sống, hãy dàn đều một lượng sinh khối tế bào nấm men với một giọt nước cất vô trùng trên lam kính Đặt mép lamen sát với mép giọt canh trường, sau đó nghiêng kính 45 độ và từ từ hạ xuống để giọt canh trường bị ép giữa lá kính và phiến kính Cuối cùng, quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi.

Để nhuộm màu xanh methylene, cần dàn đều sinh khối tế bào nấm men trong giọt xanh methylene trên lam kính Đặt một mép của lamen sát với mép giọt canh trường, sau đó nghiêng lamen một góc 45 độ và từ từ hạ xuống để ép giọt canh trường giữa kính và phiến kính Cuối cùng, quan sát tiêu bản kính hiển vi để thu được kết quả.

Hình 3.2 Ảnh kết quả của việc quan sát qua kính hiển vi chủng 43.1

3.5.5 Phương pháp dịch chiết malt [1]

Nghiền 100g malt và hòa với 300ml nước cất, sau đó đun ở 45°C trong 30 phút Tiếp theo, thêm 200ml nước cất, tăng nhiệt độ lên 70°C và khuấy đều Sử dụng Lugol để kiểm tra cho đến khi không còn xuất hiện màu xanh, sau đó lọc và thanh trùng ở 110°C trong 30 phút Cuối cùng, bảo quản sản phẩm trong tủ lạnh ở 4°C để sử dụng dần.

3.5.6 Phương pháp đếm số lương tế bào trên buồng đếm hồng cầu [7]

Dàn đều tế bào nấm men trong giọt nước cất vô trùng trên buồng đếm hồng cầu Đặt mép lamen sát với mép giọt canh trường, sau đó nghiêng lamen một góc 45 độ và hạ từ từ để giọt canh trường bị ép giữa buồng đếm hồng cầu và phiến kính Cuối cùng, quan sát và đếm số lượng tế bào dưới kính hiển vi.

3.5.7 Phương pháp xác định sinh khối nấm men bằng phương pháp đo OD

[7] luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

Tế bào nấm men phát triển trong dịch nuôi cấy sẽ làm cho dịch trở nên đục và chuyển sang dạng huyền phù Độ đục của dịch nuôi cấy tỷ lệ thuận với mật độ tế bào nấm men có mặt trong đó.

Nấm men có khả năng hấp phụ ánh sáng trong khoảng bước sóng 550 – 620 nm; mức độ hấp phụ càng cao cho thấy mật độ tế bào nấm men càng lớn, dẫn đến giá trị OD đo được cũng tăng lên.

Bật máy so màu và chuyển sang bước 620 nm Hút 1-2 ml mẫu đối chứng vào cuvet, sau đó đưa vào giếng đo Đợi máy hiển thị kết quả và ghi lại giá trị OD đo được.

3.5.8 Phương pháp xác định khả năng lên men [1]

Trong quá trình lên men dịch đường, nấm men sản sinh ra khí CO2, khí này sẽ làm ống Durhan nổi lên trong ống nghiệm Chủng nấm men nào có khả năng lên men mạnh sẽ tạo ra nhiều khí và đẩy ống Durhan lên nhanh nhất.

- Tiến hành: cho 20ml dịch gồm môi trường cơ sở và 1 – 2 % loại đường mà định thử khả năng lên men vào ống nghiệm có chứa sẵn ống durhan

Thanh trùng ở 121 0 C trong 15 phút Để nguội và cấy nếm men vào quan sát và tính thời gian lên men của các chủng đẩy ống Durhan lên cao 5cm

3.5.9 Phương pháp chưng chất xác định nồng độ rượu [8]

Tiền hành: lấy 100ml dịch sau khi đã lên men có nhiệt độ khoảng

Cho 20°C vào bình định mức 100ml, sau đó rót dịch lên men và định mức lên khoảng 300ml Tiến hành chưng cất cho đến khi lượng rượu thô đạt khoảng 100ml thì dừng lại và đậy kín rượu thô Sử dụng cồn kế để đo và đọc giá trị phần nổi lên của cồn kế.

Tính nồng độ cồn theo công thức

Trong đó N1: là nồng độ cần tính luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

N2 : Nồng độ cồn chưng cất được V1: thể tích dịch đem chưng cất V2 thể tích rượu chưng cất được từ V1

KẾT QUẢ THẢO LUẬN

Kết quả phân lập

Tại huyện Yên Phong, tỉnh Bắc Ninh, tôi đã thu thập mẫu bánh men và phân lập được 50 chủng nấm men Giá trị OD đo được cho thấy sự sinh trưởng và phát triển của nấm men trong môi trường Hansen lỏng.

Bảng 4.1 Kết quả đo giá trị OD của 50 chủng nấm men phân lập đƣợc

Giá trị mật độ quang

17 26.3 0.693 1.345 1.549 1.738 1.761 1.770 1.773 luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

47 11.3 0.543 1.517 1.613 1.674 1.682 1.700 1.733 luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

50 12.3 0.482 1.380 1.614 1.649 1.693 1.718 1.737 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 50 chủng được tôi trình bày trong bảng 4.2

Bảng 4.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 50 chủng nấm men STT Ký hiệu chủng Đặc điểm khuẩn lạc

1 21.1 Tròn, lồi, bề mặt bóng màu trắng sữa, không có tâm

2 21.2 Tròn, bề mặt bóng, màu trắng ngà, không có tâm

3 21.3 Hơi tròn, bẹt, bề mặt bóng, màu trắng sữa, có tâm

4 22.1 Tròn, lồi, bề mặt bóng màu trắng sữa, không có tâm

5 22.2 Hơi tròn, bẹt, bề mặt bóng, màu trắng ngà, có tâm

6 22.3 Tròn, bẹt, bề mặt bóng, màu trắng sữa, có tâm

7 25.3 Tròn, lồi, bề mặt bóng màu trắng ngà, không có tâm

8 24.2 Hơi tròn, bề mặt bóng, màu trắng ngà, không có tâm

9 24.1 Tròn, lồi, bề mặt bóng,màu trắng ngà, có tâm

10 25.1 Hơi tròn, bề mặt bóng, màu trắng ngà, không có tâm

11 23.3 Tròn, lồi, bề mặt bóng màu trắng ngà, không có tâm

12 23.1 Hơi tròn, bề mặt nhăn, màu trắng ngà, có tâm

13 25.2 Hơi tròn, bẹt, bề mặt bóng, màu trắng ngà có tâm

14 26.1 Tròn, lồi bề mặt nhăn, màu trắng sữa, không có tâm

15 23.2 Tròn, lồi, bề mặt bóng, màu trắng sữa, không có tâm

16 26.2 Tròn, lồi, bề mặt bóng, màu trắng sữa, không có tâm

17 26.3 Tròn, lồi, bề mặt bóng màu trắng ngà, không có tâm

18 26.4 Hơi tròn, bẹt, bề mặt bóng, màu trắng ngà, có tâm

19 29.1 Tròn, lồi, bề mặt bóng, màu trắng sữa, không có tâm

20 29.2 Hơi tròn, bề mặt bóng, màu trắng ngà, không có tâm

21 29.3 Tròn, lồi, bề mặt bóng, màu trắng sữa, không có tâm

22 29.4 Tròn, lồi, bề mặt bóng màu trắng ngà, không có tâm luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

23 27.1 Hơi tròn, bề mặt bóng, màu trắng ngà, không có tâm

24 27.2 Tròn, lồi, bề mặt bóng, màu trắng sữa, không có tâm

25 30.1 Tròn, lồi, bề mặt bóng màu trắng ngà, không có tâm

26 30.2 Tròn, bẹt, bề mặt bóng, màu trắng ngà, có tâm

27 30.3 Hơi tròn, bề mặt bóng, màu trắng ngà, không có tâm

28 30.4 Tròn, lồi, bề mặt bóng, màu trắng sữa, không có tâm

29 28.1 Tròn, lồi, bề mặt bóng màu trắng ngà, không có tâm

30 28.2 Hơi tròn, bẹt, bề mặt bóng, màu trắng ngà có tâm

31 28.3 Hơi tròn, bề mặt bóng, màu trắng ngà, không có tâm

32 28.4 Tròn, lồi, màu trắng ngà, có tâm

33 27.3 Hơi tròn, bẹt, bề mặt bóng, màu trắng ngà có tâm

34 27.4 Hơi tròn, bề mặt bóng, màu trắng ngà, không có tâm

35 32.1 Tròn, bẹt, màu trằng sữa, không có tâm

36 32.2 Hơi tròn, bẹt, màu trắng sữa, không có tâm

37 32.3 Tròn, lồi, bề mặt nhăn màu trắng sữa, có tâm

38 32.4 Hơi tròn, bề mặt bóng, màu trắng ngà, không có tâm

39 34.1 Tròn, bề mặt bóng, màu trắng ngà, có tâm

40 3.3 Tròn, lồi, bề mặt bóng màu trắng ngà, không có tâm

41 4.2 Tròn, lồi, bề mặt bóng màu trắng ngà, không có tâm

42 4.4 Hơi tròn, bẹt, bề mặt bóng, màu trắng ngà có tâm

43 3.7 Tròn, lồi, bề mặt bóng, màu trắng sữa, không có tâm

44 5.8 Hơi tròn, bề mặt bóng, màu trắng ngà, không có tâm

45 5.3 Hơi tròn, bẹt, bề mặt bóng, màu trắng ngà có tâm

46 5.2 Tròn, lồi, bề mặt bóng, màu trắng sữa, không có tâm

47 11.3 Tròn, lồi, bề mặt bóng màu trắng ngà, không có tâm

48 3.5 Hơi tròn, bề mặt bóng, màu trắng ngà, không có tâm

49 4.3 Hơi tròn, bẹt, bề mặt bóng, màu trắng ngà có tâm

50 12.3 Tròn, lồi, bề mặt bóng, màu trắng sữa, không có tâm luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

Tuyển chọn một số chủng nấm men cá khả năng lên men rượu mạnh

4.2 Tuyển chọn một số chủng nấm men có khả năng lên men rƣợu mạnh Để tuyển chọn được một số chúng có khả năng lên men rượu mạnh, từ 6 chủng mà tôi đã chọn được thông qua đánh giá sơ bộ Tôi tiến hành các thí nghiệm tiếp theo để chọn ra được các chủng có khả năng lên men rượu mạnh

4.2.1 Thử khả năng lên men các loại đường

Quá trình lên men chuyển hóa đường trong dịch đường thành rượu ethylic và CO2 nhờ nấm men Các chủng nấm men có khả năng lên men mạnh sẽ tạo ra khí nhanh chóng hơn.

Glucose là loại đường mà tất cả các chủng nấm men đều có khả năng sử dụng Nếu thử nghiệm với D-glucose cho kết quả dương tính, chúng ta sẽ tiếp tục kiểm tra với các loại đường khác.

Tiến hành thí nghiệm bằng cách cho 20 ml dịch môi trường cơ sở và 1-2% loại đường vào ống thủy tinh có ống Durhan, sau đó thanh trùng ở 121°C trong 15 phút Sau khi để nguội, cấy 100 ml nấm men đã tăng sinh trong môi trường Hansen lỏng vào môi trường đã chuẩn bị Tiến hành quan sát và theo dõi sự sinh khí CO2 của các chủng trong vòng 30 giờ, đồng thời nâng ống Durhan lên cao 5 cm để ghi nhận kết quả.

Hình 4.1 Kết quả thử khả năng lên men đường glucose của một số chủng

Bảng 4.3 Kết quả thử khả năng lên men các loại đường

22.1 Nổi sau 18 giờ Nổi sau 18 giờ Khổng nổi 26.2 Nổi sau 30 giờ Nổi sau 34 giờ Khổng nổi 28.2 Nổi sau16 giờ Nổi sau 25 giờ Nổi sau 19 giờ 32.3 Nổi sau30 giờ Không nổi Nổi sau 34 giờ 32.4 Nổi sau 27 giờ Không nổi Nổi sau 30 giờ 34.1 Nổi sau 12 giờ Nổi sau 20 giờ Nổi sau 21 giờ

Từ bảng 4.3, chúng tôi đã xác định được ba chủng 22.1, 28.2 và 34.1 có khả năng lên men mạnh, với thời gian nổi lên ngắn nhất trong quá trình đẩy ống Durhan Do đó, ba chủng này sẽ được sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.

4.2.2 Thử khả năng lên men trong dịch chiết Malt

Cho 20ml dịch chiết malt vào ống thủy tinh Durhan và thanh trùng ở 121°C trong 15 phút Sau khi nguội, cấy nấm men đã được tăng sinh trong môi trường Hansen lỏng vào ống Theo dõi thời gian tạo khí CO2 và nâng ống Durhan lên cao 5cm.

Hình 4.2 Hình ảnh kết quả thử khả năng lên men trong dịch chiết malt

Lưu ý dịch chiết malt quá đặc lên ta sẽ pha loãng dịch chiết malt với nước cất theo các tỉ lệ 9:1, 8:2, 7:3 để đánh giá

Bảng 4.4 Kết quả thử khả năng lên men dịch chiết malt ở các tỉ lệ khác nhau Các tỉ lệ pha loãng

Tỉ lệ 9:1 Tỉ lệ 8:2 Tỉ lệ 7:3

Thời gian(giờ) nổi ống Durhan

Thời gian (giờ)nổi ống Durhan

Thời gian (giờ) nổi ống Durhan

34.1 7 34.1 12 34.1 13 luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

Theo bảng 4.4, chủng 34.1 cho thấy khả năng lên men mạnh nhất trong dịch chiết malt ở tỉ lệ pha loãng 9:1, với thời gian nổi ống Durhan ngắn nhất ở các tỉ lệ pha loãng.

Dựa vào đặc tính của nấm men là loài sinh vật kỵ khí tùy tiện, tôi tiến hành thử nghiệm hoạt tính Catalase để đánh giá ba chủng nấm men này có phải thuộc về vi sinh vật kỵ khí tùy tiện hay không.

Tiến hành thí nghiệm bằng cách lấy một ít sinh khối của từng chủng vi sinh vật lên lá kính và nhỏ trực tiếp vài giọt H2O2 vào Kết quả quan sát cho thấy có hiện tượng sủi bọt khí, từ đó kết luận rằng ba chủng vi sinh vật này thuộc loại kỵ khí tùy tiện.

Hình 4.3 Hình ảnh một số chủng thử hoạt tính catalase

4.2.4 Xác định nồng độ cồn và tuyển chọn

Việc xác định nồng độ cồn là cần thiết để chọn lựa chủng có khả năng lên men tạo ra rượu ethylic mạnh nhất Phương pháp này bao gồm việc chưng cất dịch tinh bột cơm và dịch chiết malt.

Bảng 4.5 Kết quả chƣng cất dịch tinh bột cơm và dịch chiết malt

Dịch tinh bột cơm Dịch malt

Chủng Độ rượu(%) Chủng Độ rượu(%)

Qua bảng 4.5 tôi thôi chủng 34.1 có khả năng lên men mạnh, sau khi lên men thu được rượu với độ rượu cao hơn 2 chủng 22.1 và chủng 28.2

Dựa trên kết quả từ các thử nghiệm, tôi đã chọn chủng 34.1, chủng có khả năng lên men rượu mạnh nhất, để sử dụng trong các thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy tiếp theo.

Khả năng sử dụng nguồn carbon ( đường glucose)

Nghiên cứu về ảnh hưởng của nồng độ đường đối với sự sinh trưởng và phát triển của chủng nấm men 34.1 đã cho thấy những kết quả đáng chú ý, được minh họa qua hình ảnh.

Hình 4.4 Đồ thị kháo sát sự ảnh hưởng của nồng độ đường tới sự phát triển của chủng nấm men 34.1

* Kết luận: Qua biểu đồ ta kết luận nồng độ đường tối thích cho chủng 34.1 là 3%

Khả năng sử dụng nguồn nitơ (peptone)

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng peptone được thể hiện qua đồ thị sau

Hình 4.5 Đồ thị khảo sát ảnh hưởng của nồng độ peptone đến sự phát triển của chủng nấm men 34.1

* Kết luận : Qua đồ thị khảo sát ta kết luận nồng độ peptone tối thích cho chủng 43.1 là 10 g/l.

Ảnh hưởng của PH

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng pH có ảnh hưởng đáng kể đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng nấm men 34.1 Kết quả này được thể hiện rõ qua các hình ảnh minh họa trong bài viết.

Hình 4.6 Đồ thị khảo sát ảnh hưởng của PH ban đầu đến sự sinh trưởng phát triển của chủng nấm men 34.1

* Kết Luận: Dải PH tối thích cho chủng nấm men 34.1 là PH =6

Định danh sơ bộ

Dựa trên việc phân lập các chủng vi khuẩn và đặc điểm hình thái khuẩn lạc, cũng như các thí nghiệm về khả năng lên men và xác định nồng độ cồn, tôi đã chọn ra chủng 34.1 với khả năng lên men rượu tốt nhất Đồng thời, chủng 43.1 được sơ bộ định danh thuộc giống Saccharomyces cerevisiae.