Tìm hiểu cơ chế tác dụng, làm tăng hoạt tính sinh học của cây bằng phương pháp tổng hợp

Hiện nay, việcnghiên cứu thành phần, phân lập thành phần có hoạt tính sinh học từ các cây thuốc,tìm hiểu cơ chế tác dụng của chúng, làm tăng hoạt tính sinh học của cây bằngphương pháp tổ

MỞ ĐẦU

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nóng ẩm cây cối phát triểnquanh năm Đó là nguồn tài nguyên vô cùng phong phú và quý giá Theo các nhàthực vật học, nước ta có khoảng 12000 loài cây thuộc 2500 chi và 300 họ [3], [4]

Trong dân gian có rất nhiều cây thuốc và bài thuốc quý có ý nghĩa rất lớntrong việc bảo đảm sức khỏe của con người Các loài cây được con người sử dụnglàm thuốc, một số cây còn sử dụng làm thực phẩm phục vụ đời sống con người,làm hương liệu cho ngànhh mỹ phẩm Để sử dụng cây cỏ làm thuốc, người ta cóthể bào chế để làm các vị thuốc hoặc tách ra những tinh chất có hoạt tính sinh họccao để bào chế thành các loại thuốc viên, tiêm truyền khác nhau Hiện nay, việcnghiên cứu thành phần, phân lập thành phần có hoạt tính sinh học từ các cây thuốc,tìm hiểu cơ chế tác dụng của chúng, làm tăng hoạt tính sinh học của cây bằngphương pháp tổng hợp là vấn đề luôn được sự quan tâm của các nhà khoa học trênthế giới

Cây đại hoàng (Rheum sp.) thuộc họ Rau răm (Polygonaceae) là một loại

thuốc quý trong cả Đông y lẫn Tây y Ở trên thế giới đặc biệt là Trung Quốc vànước ta đã dùng làm vị thuốc chữa một số bệnh như: sỏi thận, vàng da, ứ huyết,đau bụng, ăn không tiêu… Gần đây, các nhà khoa học Trung Quốc đã tìm ra chấtemodin trong rễ cây đại hoàng có hoạt tính chống virus SARS Tuy nhiên việcnghiên cứu về cây đại hoàng chưa đầy đủ và hệ thống đặc biệt là ở nước ta.Vì vậy,chúng tôi đã tiến hành "Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của cây đại

hoàng (Rheum officinale Baill.)" nhằm góp phần tìm kiếm những hợp chất có hoạt

tính sinh học cao dùng làm thuốc chữa bệnh

Chương 1

TỔNG QUAN

1.1 KHÁI QUÁT VỀ HỌ RAU RĂM (Polygonaceae) [9]

1.1.1 Họ rau răm (Polygonaceae) [9]

Họ Rau răm hay còn gọi là họ Nghể, họ Kiều mạch có danh pháp khoa học

là Polygonaceae, là một nhóm thực vật 2 lá mầm chứa khoảng 50 chi và 1.120 loài

cây Nó là thân thảo, cây bụi và cây thân gỗ nhỏ với các cơ quan sinh sản đơn tínhxuất hiện trên cùng một cây hay hai cây khác nhau

Họ này được đặt tên theo hình dạng của hạt: chẳng hạn hạt của cây đạihoàng có tiết diện ngang là một hình tam giác

Trong hệ thống Cronquist thì họ Polygonaceae được đặt trong bộ chính của

nó, nhưng các hệ thống phân loại mới hơn lại coi họ này như là một phần của bộ

Caryophylales Họ này có mặt rộng khắp trên thế giới trong các khu vực ôn đới.

Còn ở trong các khu vực nhiệt đới có số lượng loài ít hơn

1.1.2 Phân loại [9]

Họ này được chia làm 2 phân họ là Polygonoideae và Eriogonoideae:

* Phân họ Polygonoideae được đặc trưng bởi sự thiếu vắng của tổng bao và

sự có mặt của bẹ chìa (các bao (vỏ, mang bọc)) phát triển từ các lá kèm ở gốc láđính kèm Một số bẹ chìa có các tua lông Phân họ này bao gồm khoảng 330 chi và

Oxyria Oxytheca Parapteropyrum

Như vậy, đại hoàng (Rheum sp.) thuộc chi Rheum của phân họ Polygonoideae.

1.1.4 Một số cây cỏ thuộc họ Rau răm (Polygonaceae) và tác dụng của

chúng [3].

Chúng tôi xin giới thiệu một số cây điển hình và một số dược lý của chúng:

*Rumex acetosella L (Toan thảo) là loại cây có lá ăn được, mát, lợi tiểu.

*Rumex crispus L (Dương đề nhăn) là vị thuốc có tác dụng bổ, lọc máu, lá

chứa crisophanol chống vi khuẩn và nepodin chống nấm chứa Fe trị cholesterol

*Rheum officinale Baill (Đại hoàng dược dụng) là loại cây dùng làm thuốc

trị ăn không tiêu, đau bụng

*Polygonum odoratum cloru (Rau răm) là loại cây dùng làm gia vị BTN,

làm tinh dầu, tê liệt ruột và tử cung

*Polygonum multiflorum Thunb (Hà thủ ô) được sử dụng làm thuốc, củ ăn

được, bổ, làm giảm đau, trị đau đầu, trị bướu, làm đen tóc…

1.2 CÂY ĐẠI HOÀNG VÀ CÔNG DỤNG CỦA NÓ TRONG ĐỜI SỐNG [2]

1.2.1 Cây đại hoàng (Rheum sp.)[2]

Cây đại hoàng có tên khoa học là Rheum sp Còn gọi là xuyên đại hoàng, tướng quân, mã đế hoàng, nó thuộc họ Rau răm (Polygonaceae) Vị thuốc đại

hoàng là thân rễ phơi hay sấy khô của nhiều loại đại hoàng như: chưởng diệp đại

hoàng (Rheum tanguticum L.), đường cổ đặc đại hoàng (Rheum tanguticum Maxim ex Reegl) hoặc dược dụng đại hoàng (Rheum officinale Baill.) hoặc một vài Rheum khác như: Rhubarb, Rheum emodi, Rheum pulmatum, Rheum

rhabarbarum, Rheum palaestinum… Tất cả chúng đều thuộc loài cây đại hoàng và

họ Rau răm (Polygonaceae).

* Vị thuốc đại hoàng này có màu rất vàng cho nên gọi là đại hoàng (đại làlớn, hoàng là vàng) Nó có khả năng tống cái cũ và thay cái mới rất nhanh chóngnhư dẹp loạn cho nên người ta gọi là cây tướng quân

Hình 1.1: Cây Đại Hoàng (Rheum officinale Baill.)

1.2.1.1 Mô tả cây [2]

Đại hoàng bao gồm rất nhiều cây khác nhau như:

*Chưởng diệp đại hoàng (Rheum palmatum L.) là một cây sống lâu năm, rễ

thô, to, thân cao tới 2m, giữa rỗng, mặt thân nhăn Lá ở dưới to dài, có cuống dài,phiến lá hình tim cắt thành 3-7 mép, thùy hơi có răng cưa hoặc hơi cắt, lá ở phíatrên thân nhỏ hơn Cụm hoa mọc thành chùm khi còn non, hoa có màu tím đỏ Câynày chủ yếu mọc hoang và một phần được trồng ở Tứ Xuyên, Cam Túc (TrungQuốc)

*Đường cổ đặc đại hoàng (Rheum tanguticum Maxim ex Reegl) cũng là

một cây sống lâu năm cao tới 2m, lá có phiến cắt rất sâu thành thùy Cây này mọchoang ở Tứ Xuyên, Thanh Hải, Cam Túc Tại Cam Túc có trồng một số cây

*Cây dược dụng đại hoàng (Rheum officinale Baill.) cũng là một cây sống lâu

năm nhưng thấp hơn, chỉ cao chừng 1,5 m Lá mọc so le, cuống dài Phiến lá hìnhtrứng phía cuống hình tim, đường kính 40-70 cm, phiến không chia thùy mà chỉ cắtsâu chừng 1/4 Hoa màu xanh nhạt hay màu vàng trắng nhạt

1.2.1.2 Phân bố, thu hái và chế biến

Sự phân bố của cây đại hoàng là rất rộng rãi và phong phú:

*Những loài đại hoàng đã và đang được di thực vào nước ta Cây mọc tốt,

ưa khí hậu mát ẩm và ở độ cao trên 1000m thì thích hợp hơn

Hiện nay, vị thuốc đại hoàng ta phải nhập của Trung Quốc, trước kia nhậpcủa một số nước Châu Âu Người ta thường hái thân rễ của những cây đã sống trên

3 năm, đào vào các tháng 9-10 Đào về, rửa sạch đất cát, cắt bỏ phần ở trên mặtđất, rễ nhỏ, cạo vỏ ngoài Củ to quá có thể bổ làm 2 hoặc làm 4 mà phơi cho dễ,dùng lạt xâu treo trong trần nhà để cho khô là dùng được (nếu dùng trong nước)hoặc cạo bỏ vỏ ngoài rồi đánh bóng nếu để xuất khẩu

*Một số cây đại hoàng khác nhau phân bố ở những nơi khác nhau tùy theođịa hình và khí hậu:

+ Rhabarb phân bố ở Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản…

+ Rheum emodi phân bố ở Ân Độ…

+ Rheum pulmatum thường phân bố ở Inđônêsia…

+ Rheum rhabarbarum thường phân bố ở Đức…

+ Rheum palaestinum ở Tây Ban Nha…

1.2.2 Công dụng của cây đại hoàng

*Đại hoàng có ý nghĩa về mặt y học: Đại hoàng có vị đắng, tính lạnh, cótác dụng làm tăng tiết mật, kháng khuẩn, lợi niệu Với liều lượng vừa phải (0,5-2g) nó chữa được các bệnh như: hạ lị, ứ huyết, thấp nhiệt gây vàng da Và gần đây,cây đại hoàng còn được dùng để làm thuốc giúp tiêu hóa, chữa kém ăn, ăn khôngtiêu, đau bụng, ung thư phổi… và một số bệnh khác

*Một số bài thuốc chữa bệnh có sử dụng cây đại hoàng ở Việt Nam

+ Chữa đau bụng, bí đại tiện, nôn mửa: (bài thuốc của Trương Trọng Cảnh)

có tên là đại hoàng cam thảo thang: đại hoàng 7g, cam thảo 4g, nước 300 ml sắccòn 100 ml Uống lúc đói [2]

+ Chữa sỏi mật: (Bài thuốc của Đỗ Trung Hàm, Nguyễn Thị Dung, NguyễnVăn Tường) có: Kim tiền thảo 40g, uất kim 12g, mộc hương 12g, nhân trần 12g,chỉ sát 12g, đại hoàng 12g [2]

+ Bảo vệ gan: (Bài thuốc bảo vệ gan của Trần Văn Hiền): diệp hạ châuđắng 24g, nhân trần 6g, mã đề 6g, rau má 6g, ngũ vị tử 12g, uất kim 6g, đại hoàng4g [12]

+ Viêm gan, vàng da, vàng mắt: Nhân trần 30g, dành dành 12g, vỏ đạihoàng 10g [12]

+ Huyết ứ biểu hiện mất kinh, bế sản dịch sau đẻ, đau bụng sau đẻ, khối ởbụng và ngoại thương Liều lượng 3-12 g Chống chỉ định dùng trong thời kỳ kinhnguyệt và khi có thai

*Theo y thuật cổ truyền Trung Quốc, cây đại hoàng có khả năng khử độctrong cơ thể người Các nghiên cứu gần đây của tiến sĩ Luo cho biết "Các chiếtsuất từ cây đại hoàng có khả năng khống chế sự sinh sản của virus corona gây bệnhSARS bằng cách vô hiệu hóa protease 3CL - thành phần không thể thiếu trong tácnhân gây bệnh" [9]

Nhóm của Luo cũng phát hiện ra chiết suất từ cây đại hoàng có thể khửhoạt tính của virus cúm và 1 loại virus chuyên gây các bệnh ở đường hô hấp ở trẻ

em và người già

*Đại hoàng có ứng dụng về cả mĩ phẩm: Người ta có thể nhuộm tóc bằngthảo mộc để chống bệnh ung thư da đầu do nhuộm hóa chất độc hại Cho 200gchồi đại hoàng đã phơi khô vào 0,5 lít rượu rồi đun đến khi còn một nửa, để nguội,lọc rồi bôi lên tóc [9]

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY ĐẠI HOÀNG (RHEUM SP.)

1.3.1 Nghiên cứu thành phần hóa học của cây đại hoàng (Rheum sp.)

Nhìn chung các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây đại hoàng nóiriêng và về cây đại hoàng nói chung ở Việt Nam còn chưa đáng kể Trên thế giới

đã có nhiều nghiên cứu về cây đại hoàng, sau đây là một số nghiên cứu thành phầnhóa học của cây đại hoàng đã được công bố:

1.3.1.1 Phân tách và tinh chế galloyl và hydroxycinamoyglucozo từ cây đại hoàng (Rhubarb) [19].

Rhubarb được tìm thấy ở Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật Bản Nhóm các

tác giả: Yhosiki Kashiwada, Gen-Ichiro Nonaka, Itsuo Nishika, Takashi Yamagishi

đã phân tách được 5 hydroxynamoyglucozo và galloyl và cấu trúc của chúng đượcxác nhận dựa vào số liệu các loại phổ MS và 13C-NMR

O

CH2

OH OH

2 G(β)) G Cinn 1,2-di-O-galloyl-6-O-cinnamoyl- β)-D-glucose

3 G(β)) H Coum 1,2-di-O-galloyl-6-O-P-coumaroyl- β)-D-glucose

3a H H Coum 6-O-P-coumaroylglucose

4 G(β)) Coum G 1,6-di-O-galloyl-6-O-P-cinnamoyl- β)-D-glucose

4a H Coum H 2-O-P-coumaroylglucose

5 G(β)) Coum H 1-O-galloyl-2-O-P-coumaroyl- β)-D-glucose

6 G(β)) Coum H 1-O-galloyl-2-O-cinamoyl- β)-D-glucose

7 G(β)) Cinn G 1,6-di-O-galloyl-6-O-cinnamoyl- β)-D-glucose

8 G(β)) H H 1-O-galloyl- β)-D-glucose(β)-glucogallin)

9 H G H 2-O-galloylglucose

10 H H G 6-O-galloylglucose

11 G(β)) H G 1,2-di-O- galloyl- β)-D-glucose

12 G(β)) H G 1,6-di-O- galloyl- β) -D-glucose

13 H G G 2,6-di-O- galloylglucose

14 G(β)) G G 1,2,6-tri-O- galloyl- β)-D-glucose

Các chất 1; 2; 6 ->8; 10->14 được tìm thấy trong đại hoàng của TrungQuốc, 4->12; 14 trong đại hoàng ở Triều Tiên và 2; 3; 7->12; 14 cũng được tìmthấy trong đại hoàng Nhật Bản

1.3.1.2 Phân tách galloysuccozo từ những cây đại hoàng ở Trung Quốc

và Triều Tiên [20]

Với phương pháp chạy sắc ký cột và phân tích cấu tạo dựa vào phổ MS,

1H-NMR, 13C-NMR, các tác giả Yhoshiki Kashiwada, Gen-Ichiro Nonaka, ItsuoNishika đã tìm được ra 5 chất Galloysuccozo [10]

O

OH OH

1

O R 2

O

O O

4 3

1'

5'

6' 4' 3'

Rheum emodi là cây thuốc quan trọng được tìm thấy ở vùng Wealth của ấn

Độ K Suresh Babu, P V Srinivas, B Praveen, K Hara Kishore, U.Suryanarayana Murty, J Madhusudana Rao đã tách chiết xuất được 4 chất sạch cócấu trúc sau:

O OH

O (CH2)17 CH3

Người ta phát hiện ra thành phần trong rễ của cây đại hoàng có tên khoa

học là Rheum Pulmatuml L được trồng ở Indonesia có khả năng chống bệnh ung

thư da Đó là những hợp chất cytotoxic và các tác giả Isao Kubo, Yoshihiro Murai.Iwang Soediro, Soediro Soetarno, Soelaksono Sastrođihardjo đã tách được:Pulmatin, chrysophanein, Physcionis, 4’-O-metypeiceid, rhapontin và cấu trúc củachúng đã được xác định bằng các phương pháp phổ 1H-NMR, 13C-NMR, UV, MS

9 7

Từ cây đại hoàng (Rheum Rhabarbarun) tại Đức các tác giả Jurgen

Schmidt, Uwe Himmelreich, Gunter Adam đã dùng phương pháp tách chiết,

phương pháp sắc ký ngược dòng, chạy bản mỏng …thu được 3 chất Cấu trúc củachúng được xác định bằng phổ 1H-NMR, 13C-NMR, IR, LC-MS

H

30 29

1

5 10

26

8 7 6

15 16

12 11

14 9

Đại hoàng có tên khoa học là rheum palaestium có mặt ở Tây Ban Nha Nó

là cây thuốc lâu năm, thân dài từ 15-40 cm leo lên trên mặt đất, lá tròn to đườngkính từ 20-50 cm, bề mặt lá nhăn Hoa màu xanh nhạt, quả hình tam giác Nó cótác dụng nhuận tràng, Tác giả: Talal A Aburjai đã phân tách được 2 dẫn xuất củastinben từ phần gốc của thân cây

O

OH OH

Sắc ký ngược dòng với tốc độ cao (HSCCC) là một loại sắc ký cột của hệchất lỏng - chất lỏng được phát minh bởi ITO Trong công nghệ phân tách tiên

tiến, nó được sử dụng rộng rãi để tách những hợp phần có hoạt tính từ những câythuốc Trung Quốc và những sản phẩm tự nhiên khác Ưu điểm của HSCCC có thểlàm tinh khiết ankaloit, hydroxyantraquinon, flavononit, saponin

Nhóm chức của axit cacboxylic và các hydroxylphenol tronghydroxyantraquinon được xác định bằng tính chất đặc trưng là độ axit - bazơ Cácphân tử hydroxyantraquinon khác nhau thì có độ axit khác nhau, do đó chúng đượcphân tách bằng phương pháp sử dụng thang pH Việc tinh chế được điều chỉnhtừng bước theo thang pH bởi HSCCC chỉ tinh chế được 4 hydroxyantraquinon(emodi, aloe-amodin, chrysophanol và physcion) còn tinh chế rhein rất chậm Vớinghiên cứu gần đây, việc sử dụng thang pH vẫn được phát triển trong HSCCC.Điều chỉnh nhiệt độ trong điều kiện tốt nhất, các tác giả [15] đã phân tách được 5hydroxyantraquinon và axit xinamic từ dịch chiết thô của cây đại hoàng:

OH OH

O

OH O

H H

1.3.2 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của cây đại hoàng (Rheum sp.)

*Cây đại hoàng thuộc loại cây thuốc của y học dân gian Việt Nam kết hợpvới một số cây thuốc khác làm thang thuốc chữa được rất nhiều loại bệnh Ở Việt

Nam đã chiết xuất được axit chrysophanic từ cây đại hoàng (Rheum pulmatuml L.)

để điều chế ra cream chrysophanic có khả năng chống nấm [6]

*Trên thế giới, đặc biệt là Trung Quốc từ rễ cây đại hoàng (Rheum

officinale Baill.) các nhà khoa học đã phân lập được 5 hợp chất hydroxyantraquinon

có khả năng chống vi khuẩn: Rhein > emodin > aloe-emodin> chrysophanola>physicion Trong đó emodi là tác nhân chống virus SARS [17]

1.4 THÀNH PHẦN HÓA HỌC HOẠT TÍNH CỦA CÂY ĐẠI HOÀNG (Rheum sp.) [2]

Trong cây đại hoàng có 2 chất có tác dụng trái ngược nhau là hợp chất thuliễm và hợp chất có tác dụng tẩy

1.4.1 Loại hợp chất có tính thu liễm - Là hợp chất có tannin (rheotanno glucozit).

Thành phần chủ yếu trong các rheotanno glucozit là glucogalin Khi thủyphân glucogalin sẽ cho axit galic và glucoza Ngoài ra còn có axit galic, catechin

và tetrain Khi tetrain chịu tác động của axit loãng sẽ cho glucozareosmin(rheomin), axit xinamic và axit galic.

CH2OH

O

Glucogallin

1.4.2 Loại hoạt chất có tác dụng tẩy

Reoantragucozit có các chất chủ yếu sau đây:

Chrysophanol : C15H10O4

Aloe - emodin : C15H10O5

Rhein : C15H10O6

Emodin hay Rheum emodin : C15H10O5

Emodin - monometyl ete : C16H12O5

Tỉ lệ các antraglucozit toàn bộ trong cây đại hoàng vào chừng khoảng 2 4.5%, trong đó một phần tồn tại ở trạng thái tự do, một phần ở trạng thái kết hợp

-Ở đại hoàng tươi (theo Wasicky và Hein) chỉ có antraglucozit ở dạng kết hợp

Aloe-emodin

Chương 2

THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là rễ của cây đại hoàng được sử dụng phổ biến trong

y học cổ truyền Việt Nam Mẫu được cung cấp bởi tiến sĩ Lê Thị Thu Nhạn - Viện

Y học Cổ truyền Trung Ương vào tháng 7 năm 2006

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

2.1.2.1 Xác định tên khoa học của cây đại hoàng

Qua nghiên cứu các tài liệu tham khảo, chúng tôi xác định cây đại hoàng

nghiên cứu có tên khoa học là Rheum officinale Baill và gọi là dược dụng đại

hoàng

2.1.2.2 Định tính các hợp chất có trong rễ cây đại hoàng.

2.1.2.3 Phân lập và nhận dạng một số cấu tử có trong rễ cây đại

hoàng.Tách bằng phương pháp ngâm chiết, sắc ký cột, sắc ký lớp bản mỏng, tinhchế Sử dụng một số phương pháp vật lý hiện đại để xác nhận cấu trúc hợp chấttách được

2.1.2.4 Thử hoạt tính sinh học đối với một số chất phân lập được từ các

dịch chiết

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu

+ Sử dụng phương pháp ngâm chiết để tách chất khỏi rễ cây.

+ Sử dụng các phương pháp sắc ký để phân tích, phân tách hỗn hợp vàphân lập các hợp chất như: Sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS), Sắc ký lỏng ghépkhối phổ (LC/MS), sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột, tinh chế bằng dung môi

+ Sử dụng các các phương pháp vật lý hiện đại để xác định công thức phân

tử, công thức cấu tạo của các hợp chất như: Phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng(MS), phổ cộng hưởng từ 1H-NMR, 13C-NMR và 2D-NMR

+ Xác định hoạt tính sinh học đối với vi sinh vật kiểm định

2.2 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT

2.2.1 Thiết bị

+ Nhiệt độ nóng chảy đo trên kính hiển vi đặt ở bộ môn Hóa hữu cơ

+ Phổ hồng ngoại FT-IR ghi trên máy IMPACT-410 dưới dạng viên nénvới KBr đo tại Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

là: n-hexan-etyl axetat, n-hexan-axeton tăng dần độ phân cực.

+) Sắc ký lớp mỏng: Dùng bản mỏng đế nhôm tráng sẵn silicagel (Merck).

Hệ dung môi dùng cho sắc ký lớp mỏng là n-hexan-etyl axetat, n-hexan-axeton,

etyl axetat-metanol với tỉ lệ phù hợp để khả năng tách tốt nhất

+) Các dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm

2.2.3 Hóa chất

+) Dung môi: Metanol, n-hexan, etyl axetat (EtOAc), axeton, butanol

+) Thuốc hiện hình: Vanilin trong H2SO4 đặc

+) Hóa chất khác: H2SO4, NaOH, FeCl3 5%, bột Mg, dung dịch HCl đặc,dung dịch CH3COOH 5%, anhidrit axetic, thuốc thử Dragendorf

2.3 THỰC NGHIỆM

2.3.1 Thu nhận dịch chiết

Rễ cây sau khi thu mua được làm sạch và sấy khô ở 400C, đập nhỏ và ngâmchiết bằng metanol công nghiệp Dịch thu được đem cất thu hồi dung môi dưới ápsuất thấp thu được cặn chiết tổng Cặn chiết tổng được xử lý theo sơ đồ sau đây:

Sơ đồ 2.1: Thu nhận các chiết phẩm từ mẫu khô.

Chúng tôi lấy 1kg mẫu khô, sau khi lấy được dịch tổng, cất quay chânkhông thu được dung môi và dịch cất quay (không cần đến khô kiệt) Để kết tinh,đem lọc hút chân không thu được dịch chiết B và 16,341 g kết tủa A

Đối với dịch chiết B:

+ Dịch chiết B đem chiết với nước và n-hexan (Vnước: Vn-hexan = 1:1) thu được

dịch nước 1 và dịch n-hexan (chiết đến khi n-hexan không xuất hiện màu).

+ Dịch nước 1 đem đi chiết với clorofom (Vnước: Vclorofom = 1:1) thu đượcdịch nước 2 và dịch clorofom (chiết đến khi clorofom không xuất hiện màu)

+ Dịch nước 2 đem đi chiết với etyl axetat (Vnước: Vetyl axetat = 1:1) thu đượcdịch nước 3 và dịch etyl axetat (chiết đến khi etyl axetat không xuất hiện màu)

+ Dịch nước 3 đem đi chiết với butanol (Vnước: Vbutanol = 1:1) thu được dịchnước 4 và dịch butanol (chiết đến khi butanol không xuất hiện màu)

2.3.2 Định tính các lớp chất trong cặn chiết

Mẫu khô Ngâm trong Metanol Dịch tổng

1.Cất đuổi dung môi 2.Lọc hút chân không

Chiết với nước và n-hexan

2.3.2.1 Định tính Sterol

Lấy 0,01 g cặn tổng thêm 2ml dung dịch NaOH 10% đun cách thủy đếnkhô Hòa tan cặn trong 3ml CHCl3, lấy dịch clorofom để làm phản ứng với các Sterolbằng thuốc thử Liebeman-Bourchardt (hỗn hợp gồm 1ml anhydrit axetic + 1mlclorofom để lạnh ở 00C sau đó thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc)

Lấy 1ml dịch clorofom rồi thêm 1 giọt thuốc thử dung dịch xuất hiện màuxanh bền trong một thời gian là dương tính

Lấy 2ml nước lọc cho vào ống nghiệm, thêm một ít bột Mg kim loại, sau

đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thủy vài phút đến khi xuấthiện kết tủa màu đỏ nâu hoặc hồng là dương tính với Flavonoit

Nếu đem axit hóa ống có kiềm bằng một vài giọt axit HCl đậm đặc sẽ làmcho dịch đang trong suốt mất màu vàng, xuất hiện vẩn đục và có thể tạo ra kết tủa

Nếu bọt cao quá 3-4 cm và bền vững 15 phút là có dấu hiệu dương tính

Dung dịch 1: 100ml CH3COOH loãng + 1ml dung dịch FeCl3 5%.

Dung dịch 2: 100ml H2SO4 đậm đặc + 1ml dung dịch FeCl3 5%

Cách tiến hành:

Lấy 0,01 g cặn tổng cho vào ống nghiệm, thêm vào 1ml dung dịch 1, lắcđều cho tan hết Nghiêng ống nghiệm và cho từ từ 1ml dung dịch 2 theo thành ốngnghiệm, quan sát sự xuất hiện màu đỏ nâu giữa các lớp chất lỏng

Nếu không xuất hiện màu đỏ nâu là phản ứng âm tính với các glucozit trợtim, vì glucozit luôn luôn có mặt của các deoxysacarit

2.3.3 Xử lý phần kết tinh A

Phần kết tủa A rửa sạch, sấy khô với áp suất thấp ở khoảng 40oC thu được

m = 16,341 g Chúng tôi tiến hành kiểm tra chất kết tủa A trên sắc ký lớp mỏng vớicác hệ dung môi sau:

+ Hệ dung môi n-hexan: Etyl axetat = 8:2 thì nhận thấy trên bản mỏng cho

7 chấm tròn với 6 chấm màu vàng có độ đậm nhạt khác nhau và có giá trị Rf là Rf

x 100 = 75; 66; 63; 51; 49; 36 Một chấm phát hiện bằng đèn tử ngoại có giá trị Rf

là Rf x 100 = 79

+Hệ dung môi n-hexan: Etyl axetat = 1:1, chúng tôi không thu được chấm

tròn nào

+ Hệ dung môi n-hexan: Etyl axetat = 9:1, chúng tôi thấy có những chấm

màu không thể phân tách, chiếu bằng đèn tử ngoại thấy có một chấm sáng tách rahẳn với những chấm màu với giá trị Rf là Rf x 100 = 88

Như vậy quá trình chiết tách được thực hiện theo sơ đồ 2.2:

(Để thuận tiện chúng tôi ký hiệu n-hexan là H và etyl axetat là E)

Sơ đồ 2.2: Quá trình chiết tách kết tủa A

+ Một gam kết tủa A được tiến hành trên sắc ký cột sử dụng hệ dung môi

rửa giải n-hexan - Etyl axetat với tỷ lệ 100 ÷ 0 theo độ tăng dần của hệ dung môi

phân cực thu được các phân đoạn A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7

+ Phân đoạn A1 thu được ở hệ dung môi chạy cột n-hexan: Etyl axetat =

99:1 có xuất hiện kết tinh hình kim, màu vàng da cam Rửa sạch, sấy khô, kiểm trasắc ký lớp mỏng, chúng tôi chỉ thu được duy nhất một chấm tròn màu vàng Kiểmtra thuốc thử vanilin - H2SO4 đặc vẫn chỉ thu được một chấm tròn với giá trị Rf1 x

100 = 88 (Rf1 là giá trị Rf trong hệ dung môi n-hexan: Etyl axetat = 9:1) và có

nhiệt độ nóng chảy là 196 ÷ 1970C Chúng tôi ký hiệu là chất T1(II.16)

+ Phân đoạn A2 thu được khi chạy với hệ dung môi n-hexan: Etyl axetat =