Sản xuất thử các chế phẩm sinh vật và vacxin dùng cho việc chẩn đoán chính xác bệnh sốt xuất huyết dengue viêm não nhật bản và trong dự phòng bệnh viêm não nhật bản

DAT VAN DE 1, DAC DIEM VIRUT HOC VA LICH SU CUA BENE: Bệnh viêm não Nhật Bản VNNB là bệnh cĩ hội chứng não cấp, gay ra bồi vizut VNNB, 1 thành viên của nhĩm B các Arbovirul, thuộc gia đì

BỘ Y TẾ VIÊN VỆ SINH DỊCH TẾ HỌC

CHƯƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP NHÀ NƯỚC 64B

ĐỀ TÀI 64B-0403

“NGHIÊN CỨU ỨNG DỰNG ĐỀ SAN XUAT THU CAC CHE PHAM

SINH VAT VÀ VACXIN DUNG CHO VIEC CHAN DOAN CHINH XÁC BỆNH SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE (SXHD) , VIEMNAO NHAT BAN (VNNB) VA TRONG DU PHONG BENH VNNB, *

GOONS THING NOME

HÀ NỘI - 1990

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI:

GS.TS HOANG THUY NGUYEN

NHUNG NGUOITHUC HIEN:

BS Nguyén Thi Hong Hanh

CO QUAN THUC HIEN:

VIEN VỆ SINH DỊCH TẾ HỌC, HÀ NỘI

1, SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM VĂC-XIN VIÊM NAO NHAT BAN TINH KHIET VA BAT HOAT

A DAT VAN DE

1, DAC DIEM VIRUT HOC VA LICH SU CUA BENE:

Bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) là bệnh có hội chứng não cấp, gay ra bồi vizut VNNB, 1

thành viên của nhóm B các Arbovirul, thuộc gia đình Togaviriđae, giòng Flavivirut Quan sát dưới

trúc của virut có 3 thành phần: lôi nucleocapsid, vỏ glycoprotein và bề mật của hạt viru Bề mặt của

hạt virut mang kháng nguyên ngưng kết hồng cầu và hoại (inh trung hòa Vật liệu di truyền là ARN Bệnh VNNB lần đầu tiên được biết năm 1871 tại Nhật Bản Một vài vụ dịch xảy ra ö Nhật năm 124

và virnt đã được phân lập bằng cách tiem truyền vào não thỏ Năm 1934, Hayashi tiêm truyền vào não khi; đến năm 1935, Kasahara phan lập dược virut từ não 1 tử thi ð Tokyo Ching Nakayama da dude

từ muối, tế bào Vero, LLC-MK2, BHK21, Những dòng tế bào này dược sử dung trong kỹ thuật tạo đầm hoại tử Virut nhân lên ö tế bào não trong giai doạn cấp gây ra hiện tượng phù nề ò não, xung, huyết và xuất huyết vì thể làm hủy hoại tế bào thần kinh Những thay đổi này xây ra chủ yếu Ö chất xám, Thần kinh trung ưởng bị tổirthương gây ra rối loạn chức năng hô hấp, tuần hoàn, thận, lách Nhiễm viru quá đường rau thai cũng đã được chúng mình

2 BỆNH CẢNH LÂM SÀNG:

“Tỉnh nghiêm trọng của bệnh biểu hiện ö bệnh cảnh lâm sảng Thời kỳ ú bệnh Lử 6-16 ngày, sau

đồ khôi bệnh ồ ạt bằng các triệu chứng sốt cao, đau dầu, buồn nôn, chóng mặt, hoa mắt và lỉ bi O trẻ nhỏ thường cô đâu bụng và la chảy Tiếp theo lã các triện chứng thần kinh: cũng gầy, số ánh sáng, rối loạn tỉnh thần và trạng thái bị kích thích, nặng hón là liệt nửa ngưũi trên boặc liệt toàn thân Trẻ em

thường lên còn có giật; ð người lón tý lệ này đưới 10% Từ vong xăy ra vào ngày thứ 5 - thứ 9 Giai đoạn cấp có thể qua đi hoặc bệnh nhân khối, hoặc kéo đài với các biển chứng thân kinh, tim, phối

IgM xuất hiện trong mầu và Irong nước não tủy của bệnh nhân Ö máu ngoại vi, bạch cầu không tăng,

tế bàơ limphô 'T giảm Viêm đường tiết niệu võ (rùng, tìm thấy hồng cầu và alhumin trong nước tiểu áp lực nước não tủy tăng, xét nghiệm có bạch cầu, Prôtein tăng nhẹ (50-100mg5) Điện não đồ không bình thưởng Ö 706 sổ sống sót có rối loạn tâm thần hoặc liệt vàn động, đặc biệt là ð trẻ em

3 CHẨN ĐOÁN PHÒNG THÍ NGHIỆM:

3,1, Não tử thì:

- Cổ thể tìm kháng nguyên virut VNNB bằng kỹ thuật miễn địch huỳnh quang,

~ Phân lập virut bằng cách tiêm truyền vào não chuột hoặc trên nuôi tế bào muỗi đồng C6/36

3.2, Máu và nước não tủy:

~ Phân lập virút từ máu và nước não tủy rất khó có kết quả vì virut tập trung ò hệ thần kinh,

- Xét nghiệm huyết thanh kép de tim đọng lực kháng thể (máu 2 cao hón máu l ít nhất là 4 lần) bằng kỹ thuật ức chế ngưng kết hồng cầu và kết hợp bổ thể Sử dụng kỹ thuật miễn dich men ELISA

đế phát hiện kháng thể IgM hoặc lgG

4 DỊCH TẾ HOC VNNB:

Bệnh viêm não Nhật Bản được phan b6 d chau A bao gồm Nhật Bán, Trung Quốc, Dai Loan,

“Triều Tiên, Philippin, hầu hết các nước Đông Nam A va An Do Hàng nấm ð Nhàt có khoáng 20,

trường hợp, Ò Trung Quốc trên 10000 trường hợp Gần dây tỷ lệ này có giảm di, nhưng ö Ấn Độ, Nepal và phía Bác Đông Nam Á thì lại tăng lên vào những năm 197 Dịch bùng nố ð Ấn Dộ năm

1973 và năm 1983 có (ren KLGQO trường hợp (Bernard N.Fields -David M.Knipe), Thái Lăn có 3,3 trường họp/100.000 dân (Somsacl)

Ô Việt Nam bệnh xây ra ö hầu hết các tình phía Bắc và địch bệnh nghiêm trọng vào những, tháng hè, cao độ là tháng 5 - tháng 7 Nhìn vào bản đồ địch tế học ta thấy: 18 tỉnh phia Bắc, tren địa bàn của 107 Quận, Huyện, thị có lưu hành VNNB trên tổng số 262 Quận, Huyện, thị (40,896), Trong,

khi dồ ö miền Trung và miền Nam chỉ cổ 5 trên tổng số 148 Quận, Huyện, thị có lưu hành dịch

Theo thông báo dịch tế học (số 69/9/1989) từ năm 1976-1988 số mắc hội chứng não cấp thấp nhất là năm 1981 với số mắc 1095 trường hợp và chết 298 trường họp (27,29) cao nhất là năm 1985

với số mắc 3381 và chết là 669 trưởng họp (19,8%) Tỷ lệ mắc/100.000 dân là 2,84-5,18 và tý lệ chết 0,5-1,3 Trong hội chứng não cấp có 75% la viêm não Nhật Bản, Nhóm tuổi cảm nhiễm nhất là 1- LŨ tuổi đặc biệt là trẻ <5 tuổi, Ô miền Bắc nuốc ta bệnh lưu hành quanh năm Yếu tổ ảnh hưởng đến tỷ

lệ mắc là chỉ số mật độ vécto, sau đó, là ổ chứa và sau cùng là tuổi cảm nhiễm Muỗi Culex

trilaeniorhynchus là vécto chỉnh truyền bệnh - Muối đẻ trứng và phát triển trong các ao hồ, đâm lầy

~ chim và lọn là ổ chứa trong thiên nhiên Vùng khí hãu nóng virul xuất hiện ö muỗi vào tháng 7, sau 1-3 tuần thì lộn và chim nhiễm viruL Vài tuần tiếp theo virul được muỗi truyền cho người Vấn đề phòng bệnh bằng điệt vécid thực hiện rất khó khan Muỗi Culex trítaeniarhynchus sống trong các tuộng löa, đầm lầy, ao bồ trên J điện rộng khó diệt, tiêm phòng vacxin cho lợn cũng rất khó khăn vì sau 4 tháng tuổi, lọn mồi hết miễn địch me truyền và 6-7 tháng luổi đã giết thị, do đó khoảng cách còn lại để tiêm vácsin rất ngắn Vậy vácxin phòng bệnh cho người là cần thiết và là biện pháp tích cực nhất

5 VĂCXIN PHÒNG BỆNH VNNB:

Mitamura va CTV (1936), Takenouchi và CTV (1938) đã nghiên cũu sản xuất (hữ vàcxin 'VNNB từ não chuột được tiêm truyền virut VNNB và bất hoạt bằng formalia Sau đó, Takagy và Takenouchi thủ công hiểu của vàcxin này bằng cách gây miễn dịch trên chuột rồi thử thách bằng chủng

3

virut độc lực, Kết quả này được khẳng định bằng cách phát hiện kháng thể trưng hòa ô khi sau khi tiem väccin Milamura cho thử trên thực địa và nhận xét có đáp ứng miễn dịch ö vùng có lưu hành dịch và đáp ứng kém hon ö vùng khong có lưu hành địch

Nam 1944, Kii thong bdo v8 vacxin bất hoạt thử trên ngựa có công hiệu tốt

Năm 1946-1949, Mỹ và Nhật đã hợp tác nghiên cứu về công hiệu của văcxin VNNB đo Nhật sản xuất Đã chọn vùng có lưu hành dịch ở Nhật là Okayama Kết quả thống kê cho thấy tý lệ mắc giầm 1/3-1/4 Đến thôi gian này, vãodin sản xuất đón giản là hỗn dịch não chuột ahiểm virut VNNH được xit ly bang Formalin,

Năm 1954, trong việc sản xuất vacxia VNNB ö Nhật đà có yêu cầu kiểm dịnh chất lượng về ham hiong Protein, Tu đó Bộ y tế Khát thiết lặp hệ thống sàn xuất và kiếm dink vacxin VậcxÍn được thữ trên thực địa ö 4 vùng có lưu hành dich: Tokyo, Toyama, Shiga v8 Osaka va 2 vùng không có dịch

là Sapporo và Kitami để đánh giá công hiệu và quan sat các phần ứng phụ

Năm 1957, việc sẵn xuất đi vào kế hoạch va chat hong dude nang cao: hàm lướng Prôtêin (rong vexin là ,2mgjml

Năm 1962, 2 nhóm nghiên cửu vicxin VNNB [a "Biken" 6 Osaka va "Nisseiken"ð Tokyo nghiên cứu tình chế vaexin bang siêu ly lâm hạ thép bam Itong Protein trong vacxin xuống 0,02mg/ml

Năm 1965, Nhậnsản xuất vagxin VNNB (it nd chuột được xử lý bằng Prôtamin sulfal, bất hoạt bang formalin va sau cing tỉnh chế bằng sieu ly tâm Từ đó chất lượng vàcxin VNNB sẵn xuất ngày cảng có chất lượng,

"Từ năm 1959 đến 1981, Trung Quốc nghiên cứu sản xuất vàcxin sống giảm độc lực bằng chúng virut VNN độc lực, truyền 110 lần trên tế bào phôi gà, sâu đó cấy truyền trên tế bào thân chuột đất

109 lần vẫn còn thấy có yếu tổ gây độc thân kinh (Li và CTV, 1966) Chũng virur này tiếp tục được lựa chọn bằng phương pháp tạo đám hại tử (chủng 12-1-7),

Nam 1973, Yuva CTV sử dụng chúng 3-8, cũng bất nguồn tứ chúng 12-1-? và giảm độc lực của virut bằng tia cục tím,

Năm 174, Chen và Wang chạn lọc virut thuần khiết về di truyền bằng kỹ thuật tạo dám hoại

tử để sản xuất vacain, Tht nghiém vacxin này trên 8000 trẻ em ö vùng không tư hành địch, kết quả 50⁄8 cô đáp ứng kháng thể,

Năm 1981, Yu và CTV lại truyền chủng này Š lần bằng đường tiêm dưới da cho chuột số sinh, đạt được một giống giảm độc bực cao (chủng 14-2), tiếp tục la chọn và cuối cùng «6 được 1 giống nhan lên mạnh hón, tính miễn dịch khá hon so với chúng ban đầu

Tứ nam 1968, vaoxin được tỉnh chế ở trình độ cao hon bằng siều ly tăm Thử nghiệm thực dị trên người đã được tiến hành rộng rãi ö Thái Lan và đạt công hiệu 91% Vãctin này đã được tổ chúc tiêm phòng trong quần thể dân ex đông ö Nhật Bản, Đài Loan và Trung Quốc Gay miễn địch 2 lần, cách nhau 7-14 ngày (mmÌ=I liều); liều nhắc lại tiêm sau 3-4 nam Quan sắt dịch tế học trên quần thể dân cử này cho thấy không có phân ứng phụ và không có trường hợp biến chững viêm não sau khi iếm vaexia,

Nam 1971, Fukai yêu cầu độ tỉnh khiết của viexin VNNB phải cao: hàm lượng TCA-Prötein không quá 001mg/mlL

Hiện nay ö Nhật Bản, văcxin VNNB bất hoạt và Linh khiết được sản xuất từ não chuột có tỉnh

an toàn và công hiệu cao, đồng thời vacxin thé he thứ 2sản xuất bằng công nghề gien đang dược nghiên

3

cửu để thử nghiệm i

6 GIỐNG VIRUT VNNB DE SAN XUAT VACXIN:

‘Ching Nakayama được chọn để san xudi vicxin ding cho ngưi và dong vật, nhưng có một số

chying virut VNNE phân lập được có tính kháng nguyên khdc vai virut Nakayama, cho nên một số tác, giả đã nghiên cứu vấn đề này Đây là một công việc hết súc phức tạp, rất khó phân biệt nếu đùng các phướng pháp huyết thanh học đón giản như các phản ứng UCNKHC, KHBT và trung hòa

Nam 1962, Okuno và CTV sử dụng kỹ thuật hếp phụ kháng thể c chế ngưng kết hồng cầu và

đã (hành công trong việc xếp loại 22 chủng phân lập được hầu hết ö Nhật Bản tữ 1935 đến nay thành

3 tập miễn dich;

~ 1-58 và Nakayama - NIH: týp đại diện là "1-58",

+ 17 chủng khác đại diện là "JaGAr-01";

- Chũng Nakayama-REVLL có tính chất giữa hai chủng trên xếp loại là "tớp trưng gian”;

- Những chũng còn lại không xép loại

Aizawa và CTV, Han và CTV đã chứng minh được một số tính kháng nguyên khác nhau giữa

chủng Nakayama-NIH và nhiều chủng kháe bằng kỹ thuật trung hòa giảm dám hoại lữ

Năm 1968, Katsurađa đùng chủng JaG Ar-01 và Nakayama-NIH sản xuất văcxin và so sánh kết quả đáp ứng kháng thể trên ngưỡi ö Hokkaido là vùng Không có lưu hành VNNE Kết quả cho thấy

hiệu giá khẩng thể trung hòa cao ö virut cùng loại và thấp hon Ö virut khác loại

Ngày nay, văcxin bất hoạt và tỉnh chế đã được sản xuất từ 5 chủng Nakayama-NIH, Nakzyama- yakken, JaGAr-01, Yokoshiba (YS) và TS 2 ching Nakayama-MIH va Nakayama-yaltken c6 nguồn

gốc mbit nhau (phan lập nam 1935 từ não người), Nhật Bán sử dụng chúng Nakayama-NIH để sân

7 TIÊU CHUẨN CHỌN GIỐNG VIRUT SAN XUAT VACXIN:

Từ năm 1935 đến 1945, luại văcxin làm từ não chuột và bất hoạt bằng Formalin được sản xuất

ö Nhật Bản và chủng sản xuất là Kalinina dược phân lập năm 1935 tì não tử thi Chủng này có tính kháng nguyên không thay đổi (Mitamura),

Sau chiến tranh thể giỏi lần thứ 2, chủng Naksyama-NIH được sử dụng rộng rãi để sẵn xuất vacxin viem não cho người và cả cho động vật Chúng Naksyama-NIH có những tiêu chuẩn sau:

1- Chủng dùng sản xuất phải có khả năng sinh kháng (hể dịch thể và kháng thể trung gian tế bào để có (hề kháng lại các chũng virut VNNB hoang dại,

3- Chúng virut nhân lên tối trên vật chủ hoặc trên tế bão nuôi để có thể sẵn xuất vácxin đại trà;

3- Tĩnh bên vũng về nhiệt của chũng tốt, đăm bảo väcxín dạng dung dịch cố hiệu lực ít nhất 1 năm và lâu hón nếu được đông khô và bảo quản ö 4°C;

phản ứng toàn (han sau khi tiêm vãoxin

“Trong tiêu chuẩn chọn giống theo Medhat A.Darwish và William Mcd, Hammon thì virut cần đội 4 tiêu chuẩn:

1- Chúng phải (huần khiết về mặt di truyền;

2- Chùng phải thuần dòng: sẽ luôn luôn cổ định đường chuẩn bất hoại,

3- Chủng không gây độc thần kỉnh để đẳm bảo an toàn;

4+ Chang có khả năng gây miễn dịch cao trong quân thể dân cư

Nhiều tác giả chứng minh chủng Nakayama-NIH đạt tất cả các tiêu chuẩn trên và nó vẫn là chủng hiện nay, Viện Biken, Nhật Bản dang ding để sản xuất vàcin VNNB

3, TIẾP NHẬN CHUYỂN NHƯỢNG KỸ THUẬT SẢN XUẤT VĂCXIN VNNR:

Để góp phần giảm tý lệ mắc, tỷ lệ chết và đi chứng thần kinh đo virut VINNB gây ra và nhằm đáp ứng nhụ cầu ngày càng cấp bách về việc phòng bệnh VNNB mội cách đặc hiệu, Khoa virut (Viện 'VSDTH Hà Nội) đã nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vãcxin VNNB bất hoạt và tỉnh khiết, thông qua việc tiếp nhận chuyển nhượng kỹ thuật sản xuất và kiếm định väcxin này từ Viện Biken (Trường ĐH

"Tổng họp Osaka, Nhật Bản) Đây là một qui trình sẵn xuất rất phức tạp, đòi hỏi ứng dụng các kỹ thuật

cao về vitut hac, sinh hoa hoc va miễn dich học, nhằm đạt mục tiêu đã dề ra trong đề tài 64B-0403 của chưỡng trình nghiên cứu khoa học cấp nhà nước và họp đồng 74 với Úy Ban Khoa học Nhà nước.

B VAT LIEU VA PHUGNG PHAP

L THIET BI, SUC VAT THI NGHIEM, SINA PHAM VA HOA CHAT: 1,1, Sinh phim co ban:

~ Chũng virut viêm não Nhật Bán Nakayema (NIH, Nhật Bán),

~ Vác-xin viêm não Biken Nhật Bản,

~ Vãcdn VNNB chuẩn Biken, Nhật Bản

1,2, Sức vật thí nghiệm:

Chuột Selss 3 -# tuần tuổi,

- Chuột ổ 1 - 2 ngày tuổi,

- Bường vô trùng,

- Máy siêu ly tám 65.0M) vòng/phút "SORVAL"

- Thiết bị siêu lọc Amicon,

- Bình nÍ-4o lông git ging virat,

= May đồng khô sinh phẩm và vắc-in,

Máy nghiền não,

- Máy quay điện 1Ú,

- Lò sấy tt,

- Máy giật (để rung khô chuột sau khi rữa)

1.4 Dụng cụ thủy tĩnh ngoại trung tính:

~ Chai to loại 1000 m], 2000m], 5000 m], 10/000 mì,

~ Chai bé ioai 100 ml, 200 ml 500 ml,

~ Chai hình nón loại 100 m], 20 mì, 500 ml, 1000 mi,

~ Cốc thủy tĩnh loại 50 ml, 100 ml, 200 mi, $00 ml, 1000 ml,

~_Ống đong 5U mì, 100 ml, 200 ml, 500 ral, 1000 ml, 2000 ml,

~ Chai Roux audi té bao loai 1000 ml,

~ Chai vuông nuôi tế bào loại 250 ml,

- Hộp lồng đường kinh 10 em,

- Pipét Pasteur,

= Pipét chia độ: | mi, 2 ma, S ma, 10 ov, 20 ml, 30 ml,

= Phéu lọc loại đường kính 5 em, 10 cm, 15 cm,

- Bình edu Joai 250 mi, 500 mi,

~ Bình cầu khía để tách tế bào loại 250 mI, $00 ml,

- Albumin bo (BA)

~ Huyết thanh bê (CS)

- Huyết thanh bê bào thai (FCS)

- Kháng viêm aio Nakayama IgG Vien Biken, Nhật Bản

- Khang viem no Nakayama IgG gắn Peroxydava Viện Biken, Nhật Bản

~ Bôm tiêm 1 nl, 2 ml, Š mf, 10 ml,

= Pipét 1 ml, 2 ml, $ ml, 10 mh,

~ Hop long ding kinh Sem,

- Tam lam ELISA,

= Chai audi té bao $0 ml, 100 ml - $00 ml,

- :Ống ly tâm loại 34 ml, 100 ml

1.7, Một số nguyên liệu, dụng cụ khắc:

~ Kéo tọ phẫu thuật,

+ Kéo nhỏ loại phẫu thugt mắt,

- Bom tiém ty dong Cornwall,

- Quần áo vô trùn/

2 SẲN XUẤT VÀ BẢO QUẦN GIỐNG VIRÚT VIÊM NAO (NAKAYAMA)

DB SAN XUAT VACXI

2-1 Não chuột (80g) từ 225 nào chuột được gây nhiễm và liệt + 0,81 M/75 PBS, pH 8,0, da duoc

Nghiên đồng nhất 10.000 vòng/phút trong 2) phút để có dược hốn dịch nào 10% (Trong quá

trình nghiền giữ õ nhiệt độ 4*C bằng cách đặt chai não vào chậu đựng đá)

2.2, Ding phéu có đường kính 1Ũ cm đặt vào chai 2 1 và phếu đã chuẩn bị có phủ 1 lốp gạc 1.3 Hỗn dịch virút đã nghiên đồng nhất 10% dược lọc qua gạc

2.4 Lự tâm hỗn địch trên ö tốc độ 5000 vong/phiit, $0 phuit, 4°C

Nước nổi (740 ml) được rót vào chải 1 L

2.8 Chai hỗn địch virut được đạt vào chậu dá Cho vào từ tử 74 ml Protamin sulfat 19% (06 khuấy từ trong 30 phat)

3,6 Lự tâm 5000 vòng/phút trong SŨ phút, 4°C,

Nước nồi cho vào chai 1

2.7 Dùng phốu có đường kính 10 cm, đưộc phủ với màng lọc nylon

00 ml nước nổi được lọc qua màng lọc nylon, rồi cho thêm vào 8mi gielatin 556 Lác đều,

8, Lọc vô trăng; qua các màng lọc 293 mm đường kính: 0,45 em, Dacron, 0,8 4m, AP25;

làng lọc được xử lý với PBS, pHi 7,4 có 0,05%: gielatin;

~ Sau đó, lọc 800 m hỗn dich ching virut

3.8 Đóng hỗn dich vir6t vào ống theo nhủ cầu: 2 mÍ, 5 mi

~ Ống đà chuẩn bị đặt lên chậu đá;

“Chế ý: đeo găng và kính để đăm báo an toàn

Pha theo hiệu giá đã định: 1 - 4x 10” PFU/ml, tiem cho chuột để sản xuất văcxin

%

3 CHUAN BỊ CHỦNG VIRÚT ĐỂ SAN XUẤT VÄCXIN:

10

1 L4y ống chủng virit bio quân trong nỉ-tở lỏng Cho tan chảy đưi vòi nước

2 Pha hỗn dịch vì rút ð nông độ I - 4x 10” PEU/mi trong môi trường M199 có 0226 giêlatin Khối lượng pha bao nhiêu (heo yêu cầu săn xuất, nh theo công thức:

Số chuột tiem x 0,05 ml

trong châu đá (42C),

3, Dùng bơm tiêm loại 1 mi và kim tiêm não Tiêm vào vùng não giữa tai và mãi vôi khối lướng 0,03 ml/con

4, Chuột tiêm xong được cho vào lồng đã chuẩn bị, Theo rôi, nhật bỏ những chuội chết

khối lượng dung địch giống cần thiết Bảo quản lọ giống

4 SỐ ĐỒ TIÊM VÀO NÁO CHUỘT, GẶT VÀ XỦ LÝ BẰNG PRÔTAMIN

SULFAT:

“Chuẩn bị hỗn địch giống virat

“Tiêm vào nào chuột

Chọn L nhật chuột liệt sau 72 gid

GAL nao và bảo quản nào đã gat

Chuẩi bị nghiên đồng nhất não trong M/7S PBS, pH§ (2096)(1H)

Xitly Protamin Sulfat (0.9 mg/ml)

5, THEO DOI GAT NAO CHUỘT LIỆT:

các triệu chứng sau:

~ 1 chân sau liệt và chội ra;

~ Tĩm vào thất lưng xách lên thì chân đuổi ra;

- Thả chuột xuống, tự nĩ khơng đứng dậy được

§.2 Lưới rửa chuột đặt rong chậu nước đấy

5.3 Dùng béo cất vào nách chuột cho chảy hết máu Cho chuột vào lưới đã chuẩn bị ở trên, Lúc

ơy mơ vơi nước chây ïLmuội sào bể rữa chuột Khoảng 300 con chuột rũa vào 1 lưới, L châu

5:4, Nhấc lối rửa chuột sang 1 châu rửa khác cũng bằng nước vời; chuột đưộc rữa 4 lần với nước vời như vậy

3,5 Sau đĩ rửa 1 lần với dung địch 0,002% Hibiten

$6, Rửa 4 lần bằng nước cất

5/7 Thả lưới rửa chuột vào máy quay làm khơ; quay trong 1 phút cho ráo nước

58, Chuột đã khơ chuyển qua phịng gắt

§.9 Xếp chuột vào khay, 50 chuột cho mỗi khay

3.10, Mơ bộc lộ não chuột trắng buồng võ trùng, ELLE, Hat nao bằng kim nối liền với hệ thống bom hút chân khơng

5412, GặL 200 não chuột vào 1 chai Day bằng nút cao su

3.13 Bảo quản ngay vào ti lạnh - 8ŨĐC, càng nhanh càng tốt

6 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN ĐỒNG NHẤT VÀ XỦ LÝ

HON DICH VIRUT BANG PROTAMIN SULFAT:

6.1, Lựợ dựng não chuột lấy từ -B0°C ra, để ð nhiệt độ phịng trong vài phái, đùng thìa thép

Khơng rỉ xến ra thành mảnh nhỏ, tồi cho vào bình thép khơng vĩ để nghiền đồng nhất Irong M/75 PBS,

HBO dé cĩ ndng do 20%, te d6 10,000 vong (phút trong l5 phút

6.2, Phéu loc dvge dal 4 Lop ga

6.3 Hỗn dịch não 20%: được lọc qua 4 lớp pac

6.4 Hồn dịch này gọi là "1 H"

6:5 Ly tam 5000 vịng/phút trong 50 phút Lấy nước nổi gọi là "1 NỈ 6:6, Cho vào từ từ Prơtamin sulfat 1% để đạt nồng độ cuối càng là 1 #g/1 ml

%7, Khuấy từ từ trong 30 phit 84°C

6.8 Ly tâm 5000 vịng/phút trong 50 phat 6 4°C Lay nước néi loc qua miang nylon: đồ là "2N", 6.9 Cho thêm Eormalin đế cĩ nồng độ cuối cũng 0,06% và 0,005M EDTA - 3Na

6,10, Bảo quản hỗn dich virút trong 60 ngày ư 42C:

7 TÔM TẮT SÓ ĐỒ TINH CHẾ:

Tiến địch virúL bắt hoạt 700 m1

Loc qua mang Nylon - Thêm vào 1/100 thể ch của EDTA - 4Na 1%,

Ly tam 5000 vongiphat, 5U phút, 49

Cô đặc băng siêu lọc để có được 35ml

'Tửa Arhônium sulfat bão hòa 1/3 thé tích (10,2 ml)

Lấy 16, mi nước nổi cho vào ống ly lâm

‘Thém vido 16,5 ml Sucroza 409 cầm cho thẳng xuống đầy

Siêu ly lâm 26.000 vongphot trong 26 gid (May Sorval)

Lấy cặn”+ 5 ml hén dich virút ð đấy (Tráng ống bằng M/75 PBS, pH1,4 có 0,125

và 0,01% EDTA - 4Na) giclatin

Tiộn cáê hỗn dịch virút thu được lại,

- Loe qua các lọc: AP 25, HA daœron, PH và dacrou Dang dich vàcxin đặc tỉnh khiết: Bảo quản ð 4°C,

8 TINH CHẾ VĂCXIN VNNB TÙ HỒN DỊCH VIRÚT BAT HOẠT:

$1 Hin dich vicút đã bất hoạt bằng formalìn để ð 4°C sau 6Ú ngày, được lấy ra từ phòng lạnh

Kiểm tra tủa đẹp: nước nồi trong hay bị nhiễm khuẩn

8.2 Lau miệng chai sạch bằng khăn tấm cồn MÔ bỏ nút cao su, miệng chai phủ bằng giấy tầm cồn

83 Lọc loại bổ tủa qua nylon mesh (2 - 3 lớp mesh dùng lọc cho 20 lít hồn địch)

8.4, Hồn dịch vaodn thô đã lọc được ly sâm 5000 vòng/phút trong 50 phút ð 4°C, lấy nước nổi Lấy mẫu để định lượng khẩng nguyên (ELISA) và TCA - protein

8.5 Co đặc vàccin bằng thiết bị siêu lọc Amicon, để ð nhiệt độ đ°C, Chú ý theo dõi lọc thưởng, xuyên và cho thêm vãcxin từ từ Nước loại sau sieu lọc phải gi lại vào { lợ vô trùng Lượng văcxia cô đặc hàng 1/20 khối lượng ban đầu Nếu cô đặc 500 mI vácxin thì còn lại 25 rnl - sau đó tráng loc bang M15, PBS, pH 7,4 co 0,01% EDTA - 4Na, gielatin 0,12%, để thụ lại được 100 ml vãcxin

- TCA - Prôteïn 2 mí

8.7 Tia Amonium sulfat bao hda: 1/3 thé tích

Vacuin sau khi ch dac bang siêu lọc để ö 4C (chậu đá) Nhỏ amônium sulfat bào hòa từ từ,

Vita nhỏ giọt vừa lắc nhẹ chai vãcxin, sau đó cho khuấy từ 30 phút 6 4°C DEO 4°C qua dém cho ta các protein của chất nào cộn lại

8.8 Ly tâm 5000 vòng/phút trong 30 phút ö 4°C, để loại bỏ tủa

8.9 Lấy nước nổi để siêu ly tâm bằng máy siêu ly âm Hitacbi 35p, rotor rp-2), 10 ống (94mlống) Ly tâm 19.000 vòng/phúi trong 13 giò Trước khi ly (âm nhỏ kiểm tra máy, làm vệ sinh

và lau đầu rotor, Sau khi ly âm xong cùng nhỏ làm vệ sinh máy và kiểm tra máy,

"Trong nghiên cứu sản xuất thực nghiệm chúng tôi sử dụng máy siêu ly tâm Sorval (Mỹ) loại lý tâm 8 ống, rotov nhỏ, 34 ml/ểng, Siêu ly tâm với suerôza 40% Trước hết dùng pipét cho 16 ml sucrô⁄a 40% vào ống, sau đó nhọ nhàng cho 16 mi hỗn địch virút cô đặc lên trên:

- Can bằng từng cặp ống (cần thật chính xác),

- Nhẹ nhàng đặt vào ro¡or từng cặp ống da can bang,

~ Đặt rotor vào máy ly tám, kiểm tra lại nắp đậy, theo thứ tự, tốc độ, thời gian, nhiệt độ, chân không,

- Khởi hành máy vận động và tự đông báo hiệu thời gian, tốc độ, chân không, Bao giỏ đủ tốc

độ thì tính thôi gian từ đó Với máy siễu ly tâm Sorsal th tốc độ là 26.000 vòng/phút trong 26 gid

8.10, Tắt máy, bao gid may dimg băn, môi mồ náp, [ay rotor ra nhẹ nhàng đạt vào buồng vô, trùng Lần uot dat các Ong vào giá để ống (trong chậu đá 4°C)

Ding pipét Paslcui bái từng lốp của 3 lớp (tiền hành từng ống một):

ˆ Hôn phần đầy xong, tráng ống bàng PBS pH 7,4 có 0/01% EDTA - 4Na

8.11 Thẩm tích vẽcxin đặc, loại bd sucroza:

- Dũng M15 PBS pH 72 có 0,005% formalin

- Ngâm đồi thẩm lích trong PBS pH 7.2

14

~ Buộc thất lại L đầu,

- Dũng pÍpét cho tử từ vãcxin đặc vào ruột dồi (chú ý nên để cho dồi lòng, không nên thất chật

sẽ võ đồi)

- Thả đồi vào chai dung dịch thẩm tich có khuấy từ Để 4°C, 8 gid thay Jung địch tấm tích 1

ân trong 3 ngày, cho đến khi do suorôza (rong dung dịch thẩm tích không còn nữa

Nhấc dồi ra, thấm nhọ cho khô nước Dặt dồi vào cốc (để trong đá), nhẹ nhàng cất miệng đồi

và từ lữ hút ván đặc đã thẩm tích vào 1 chai vô trùng hoặc đong ngay vào ống dong, dé sau đó tính chất bảo quản cần phải cho them:

- 1# thimerosal (xông độ cuối cùng 0,009%)

- 19 tween 80- (nồng độ cuối cùng 0,0007%)

8.12, Lọc võ trùng:

- Tráng loc bing M/75, PBS pI] 7,4 06 0,05% gietatin,

~ Lọc vaexin ac qua mang loc: AP25, HA, Dacron va PH

~ Sau cling cho M119 đặc 1 lần qua màng lọc để cuối cùng có 11 ml vâcxin,

- Lấy mẫu để thử hàm lượng kháng nguyen (ELISA) va TCA - prötôin

8.13 Vicxin bán thinh phdm (Batch Solution):

Hiệu gia ELISA cia vacxin sẽ pha bằng 100x1,5 = 150 Nếu biệu giá của vắcxin đặc bằng 1500 thì phái pha loãng váctin đặc 10 lần (1500 : 150 = 10)

hi đó sẽ pha 1000 ml vécxin nhu sav:

C KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG VẮC-XIN VIÊM NAO NHẬT BẢN

SN XUẤT TẠI KHOA VIRÚT, VIỆN VSDTH, HA NỘI

Khoa Virát (Viên về sinh dịch tế học, Hà Nội) đã sản xuất thừ nghiệm 5 loại vắc-xÍn viêm não Nhật Bản Vắc-xin dược bất hoại, tinh chế bằng siêu ly tâm và kiểm tra chất lượng theo qui trình của Viện Biken, Trường Đại bọc Osaka, Nhật Bản

1.ĐO pH CỦA VẮC-XIN:

Sit dung may đo pH MICRO PH 2000, CRISON với các dung dich chuẩn pH4 và pH 7,02

"Tiến hành đo như phương pháp đo pH vôi tất cả các dung dịch

pH ofa vac-xin phai 6 trong khoảng 6,8 đến 7,4,

- Folin

2,3 Dung cy, may moc:

- Dung dịch A: (pha ngay trước khi dùng)

Hoa tan 0,8 g Natri hydroxyt trong nước cất, rồi thêm 4 g Nai cacbonat, lắc cho tan đều Thêm nước cất vừa đủ 100ml

= Dung dich B: (pha ngay trước khi dùng)

7

- Ly tâm 3400 - 3508 vòng/phu, 2 phút, Ö nhiệt độ phòng

- Ruta tha bing 2 ml dung dich TCA 5%

- Ly tâm 3400-3500 vòng/pnau, 20 phút, 8 nhigt độ phòng Loại nước nổi

~ Thếm vào mỗi ống 2,5 mỹ đụng dich , lắc đều, để 30 phút ö nhiệt độ phòng

- Thêm 2,5 mÌ nước cất,

= Them 0.5 mi dung dich Folin, để 30 phút ð 37 °C,

~ Để nguội rồi đo độ hấp phy ð bước sóng 750 nm

- Dựng đường chuẩn nông do protein, tồi đựa theo đường chuẩn tính nồng độ protein trong

(CSc dung dịch thimerosal chuẩn có tồng độ 50, 100, 150 g/m

- Dithizon 7 WAKO

+ Cachou tetraclorit WAKO

- Nước amoaia WAKO

+ Natsi sunfis, khan waKO

3.3 Dung cy, may moc:

- Máy quang phố Shimadzu,

~ Dung dịch địIhiron (002/6:

Can 2:mg dithizon, them cachon tetracloriL đến 109 ml

- Nưộc amonia 60% (ON):

Dong 60 ml nước amonia, thêm nước cất đến 100 ml

3.5 Tiển hành:

- Nhỏ lần lướt nước cất (làm đối chứng), các dung dich thimerosal chadn và mẫu vắc xin vào các ống (mỗi mẩu 2 ống, mỗi ag 0.5 mb)

“Thêm nước cất cho vừa đủ 5 ml

- Thêm 10 mÏ dithion, lắc mạnh trong 5 phút

- Để cho tách riêng lắp nước và CCH Hút hộ hết lốp nước ð trên

~ Thêm 1Ô ml nước cát, lắc mạnh Hút bỏ hết lớp nước,

- Thêm nước amonia, lắc, rồi lại hút bò lớp trên (3 lần)

- Rửa làn nữa bằng 10 mì nước cất

~ Thêm 1 thìa Natri sulfet khan để dừng phản ứng,

~ Do độ hấp phụ ò bước sóng 480 nm, trên máy quang phố

- Dựng đường chuẩn nồng độ thimerosal, rồi đựa theo đó tính nồng độ thimerosal trong vắc-xin

“Các dụng địch Focmaldchyl chuẩn có nồag 49 2, 4, 6 agin

4.3 May mée, dung cys

- May quang phổ Shimadzu

- Công thạch anh dai Tem

~ Pipet thủy tỉnh

- Ống thủy tính

4.4 Chuẩn bị dụng địch:

= Dung dịch Focnaldchyl chuẩn:

Can 388,8 mg hexamethylcmtctranim thêm nước cất vữa đủ 500 rml, Nông độ Focmaldehy!

19

2,4, 6ugiml

- Dung dich axctylaxeton:

Hòa tun 150 g amoni axetat trong một lượng nutdc thich hop, thém 3 ml awit axetic va 2 ml axctylaxeton, rbi thêm nước cất vừa đủ 1000 nal

- Đun cách thủy 100°C, 15 phi, ri tam ngudi bang nước vòi

- Đo độ hip phy 0.415 nm trém may quang phổ

~ Dựng đường chuẩn nồng độ Focmaldchyt, rồi dựa theo đô tinh ndag độ Focmaldehyt (rong vắc-xia

5 THỦ AN TOÀN (trên chuột Jang):

~ Chọn thỏ nặng 1,5 ke trở lên và có thân nhiệt duôi 39,3 °C

- Cho nhịn an trước khí tiêm 1 ngay

~ Đo thân nhiệt trước khi tiêm

~ Tiêm tình mạch tai cho 3 thé (1 ml vac-xin/1kg)

- Đo thân nhiệt thỏ trong 3 - 5 giờ sau khi tiêm (30 phút 1 lân)

Vic-sin dược coi là đạt tiêu chuẩn (chí nhiệt tổ âm tính) nếu trong thời gian này (hân nhiệt

mỗi thỏ không tăng 0,6 C tờ lên.

7 THỦ VÔ TRÙNG:

Dùng môi tevdng Thioglycoltat (Eiken) để thữ vị khuẩn và nấm

7.1 Chuẩn bị môi trường:

~ Pha 29,3g môi trường trong 1000ml nước cất, đun nóng cho tan

= Rot vao céc ống khuẩn tà, mỗi Sng 40m\ môi trường

~ Đây nút bông rồi xấy khử trùng 6 121 %C trong 20 phút

- Lâm lạnh ngay bằng nước vôi dé loai Oz

Số lọ vão-xin trong mỗi loại được lấy để thử võ trùng như sau:

`Väe-sin dược cói là vô trùng nếu sau 14 ngày không thấy vi khuẩn hoặc nầm phát triển

8, THU BAT HOAT:

Mục đích: để khẳng định sự bất hoạt hoàn toàn của virút viêm não Nhật Bản bằng cách cấy vắc-xin trên tế bào nuôi và tiêm não chuột

'Vắc-xin bán thành phẩm được thứ trên tế bào BHK2I và chuột Hồn dịch virúL bất hoạt và vắc-xin thành phẩm được thử trên chuột

8.1 Thử trên tế bào BHK21 theo số đồ sau:

Hì

“Thêm môi trường duy trì (100m1 chai tế bào)

“Thay môi trường (3 ngày sau}

Để Š 35+ 12C và quan sắt trong 2 tuần

“Ghi kết quả như sau: 4

- Tế bào không thoái hóa

- Nghỉ ngồ tế bào (hoái hóa

[_ + TẾ bào thoái hóa rõ rệt,

Sau 14 ngày lấy tự mỗi chai 5 ml dịch tế bào (chỉ lấy ò các mẫu vắc-xin chơ tất cả các chai tế bào (-) hoặc (+)), trộn đều để thừ trên chuột

Tỗn địch virút bất hoạt 30 chuột |

Tịch tế bio edy vie-xin ban thank phdm | 10 chuột

“Theo dõi chuột trong 14 ngày sau khi tiêm, Vắc-xin được coi là bất hoạt hoàn toàn nếu tế bào không bị thoái hóa và tất cả chuột sống bình thường

9 THỦ CÔNG HIỆU CỦA VẮC-XIN (bằng ký thuật trung hùa giảm đám hoại tử)

Mục đích: (im cong hiệu của vác-xin vim não Nhật Băn dựa trên hiệu giá kháng thể trung hòa

trên chuột,

2

+ Bicacbonat 7%, + Đỏ nhenol 0.5%

+ Dich chiét men bia 10%

+ Da trung tinh 0,25%

+ Albumin ba 10%, + Dung dich LE 06 0,2% albumin bo, + Trứng gà có phôi 9 ngày

~ Huyết thanh đương,

- Vée-xin viêm não Nhật Bán chuẩn (chủng Naleyama loại 181)

~ Chuột nhất cải 4 tuần tuổi

- Sản xuất huyết thanh miễn dịch trên chuột nhất:

ha vắc-xin: vắc-sin chuẩn loạt I8I và mẫu vắc-xin được pha loãng 1/16, 1/32, 1/64 (x 16, x 32, x64) với M/75 PBS, pH7,4 06 0,02% gielatin

Gây miễn dịch chờ chuột và lấy máu:

Mỗi độ pha loãng được tiêm phúc mạc cho 10 chuột, mỗi chuột 2 liều 0,5m! cách nhau 7 ngày:

"Máu chuột dược lấy 7 ngày sau khi tiêm mũi thứ 2 Dể riêng niáu mỗi chuột vào Ï ống, để 4°C, qua dem, Chai, gop chung huyết thanh của các chuột được tiêm vắc xin cũng dộ pha loãng mỗi chuột

ấy 0,1m), Ly tâm 3000 vòng/phủt, 30 phút Lấy nước nổi (huyết thanh), rồi pha huyél thank 1/10 trong dụng địch L.E có 0,2% BA, Bất hoạt huyết thanh 1/108 56°C trong 30 phút rồi giữ ò -20°C

- Chuẩn bị tế bào phôi gà:

“Tế bào phôi gà được lách bằng trypsin 0,2% và được pha trong môi (rường nuội cấy là LẺ cổ

5%: huyết thanh bê đến nồng độ 250 x 10” tế bào/m, Sau đó tế bào được nhớ vào các địa Pclri đường

kinh 5cm (Smml/1 đĩa), rồi để tủ ấm CO2, 37°C qua dem,

- Pha huyết thanh:

Huyết thanh được pha loãng bằng dụng dich LE có 0,2% BA như sau:

~ Chuẩn bị dung địch virũt thủ thách:

Dung địch virút thờ thách được pha dến 200 PEV/0,4ml bằng LE có 02%BA

- Chuẩn bị lốp thạch thứ nhất:

+ Dòng dịch A: Thêm 500ml nước cfit vao 8g Noble Agar, xy 121 C/40 phút

+ Dung dịch B: Thêm 250 mì nước cất vào 5g, Lactalbumin hydralysat, xy 1 152C/40) phút

Đổ dụng dich B vào A, rồi thêm 100 mì glue0za 46, 100ml dung dich Barle's 10x, Sn dịch

chiết men bia Để nguội đến 50°C, rồïïêm 32m1 bicacbonat 7%, Imi Erythromycin, Ll Kanamycin,

1ml Eungiron và 0,5 ml Viecillin

- Chuẩn bị lớp thạch thứ hai:

+ Thêm 850ml nước cất vào 8g Noble Agar, xấy 121°C/40 phút

+ Thêm 100ml dụng dịch Earle's 10x và 36m] đỗ trong tinh 0,256 vào dung dịch trên, giữ ð 50°C

"That nghiệm trung hịa được tiền hành như sau:

1m† huyết thanh mối độ pha lộng + 1ml virút thử thách

là hiệu giá kháng thể làm giảm 50%, dám hoại tử, y; Tỷ l€ giảm đám hoại từ (4)

x: DO pha lỗng của huyết than

š: Số đâm hoại từ cơa mơi độ huyết thanh nha lỗng

+; 8ố đánn hoại Lữ của virút thử thách

"hoa của vắc-xin phải cao hĩn của vắc-xio chuẩn

Khi đồ hiệu giá kháng thể rung hi

Hiệu giá kháng tì

D KẾT QUẢ

+iểm định về chãt lượng và so sánh với vắc-xin chuẩn của Nhật Bản:

Bang 1: Két quả kiểm tra chất lượng loạt 4

- Bảng 2: Kết quả kiếm tra chất lượng boat 5

Báng3: Kết quả kiểm tra chất lượng lost 1

- Bằng 4p Két qué kiểm tra chất lượng lo§t 2

- Bảng SỈ Kết quả kiểm tra chất lượng loật 3-

~ Hình 1: Hình ảnh hạt virút trong vắc-sin dưới kính hiển vi điện từ ö độ phông đại 60,000 [ăn

và 120.000 lần, Kết quả kiểm tra cho thấy vắc-xin NNB do Khoa Virot (Viện vệ sinh dịch tế học Hà

Nội) sản xuất đạt tiêu chuẩn về hàm lượng prôtein, fucmaldehyl, thừmcresal, độ pH, vô trùng, Dất hoạt, công hiệu, nồng độ khưng nguyên và an (oàn (những tiêu chuẩn qui định về chất lượng ví

VNNB của Nhật Bản kênt theo)