Xây dựng và ứng dụng các quy trình xác định dư lượng thuốc trừ sâu thuộc các nhóm clo hữu cơ lân hữu cơ, cúc tổng hợp và carbamat thường sử dụng trên rau bằng phương pháp hplc và gc

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO NGHIỆM THU XÂY DỰNG VÀ ỨNG DỤNG CÁC QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG THUỐC TRỪ SÂU THUỘC CÁC NHÓM CLOR HỮU CƠ, LÂN HỮU CƠ, CÚC TỔNG HỢP

Trang 1

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO NGHIỆM THU

XÂY DỰNG VÀ ỨNG DỤNG CÁC QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG THUỐC TRỪ SÂU THUỘC CÁC NHÓM CLOR HỮU CƠ, LÂN HỮU CƠ, CÚC TỔNG HỢP VÀ CARBAMAT THƯỜNG SỬ DỤNG TRÊN RAU BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VÀ GC

Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Văn Đức Tiến PGS.TS Nguyễn Đức Tuấn

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

THÁNG 6/2011

Trang 2

Tại TPHCM, mỗi ngày có khoảng 1200 tấn rau các loại nhập vào thành phố, trong đó

có khoảng 3% lượng rau có nhiễm dư lượng thuốc trừ sâu Hiện nay phương pháp phát hiện dư lượng thuốc trừ sâu phổ biến nhất vẫn là phân tích nhanh bằng phương pháp sinh hóa với các bộ kit của Đài Loan hay Thái Lan Tuy nhiên, phương pháp này không phát hiện được thuốc trừ sâu nhóm cúc tổng hợp và nhóm clor hữu cơ, độ nhạy của phương pháp đối với từng thuốc trừ sâu có khác nhau nên không biết được mẫu rau nhiễm thuốc trừ sâu có vượt mức cho phép hay không Một số trung tâm thuộc khu vực phía Nam có khả năng xác định dư lượng thuốc trừ sâu đã định danh cụ thể, dưới hình thức dịch vụ theo yêu cầu của khách hàng nên tốn nhiều thời gian và không

có tính chủ động để có thể áp dụng ngoài thị trường Từ thực tế này, việc nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng các thuốc trừ sâu trong từng nhóm mà nông dân thường sử dụng là một thách thức đối với nhà phân tích

Mục tiêu của đề tài

Xây dựng và ứng dụng các quy trình xác định dư lượng thuốc trừ sâu nhóm carbamat, lân hữu cơ, clor hữu cơ và cúc tổng hợp thường sử dụng trên rau bằng phương pháp HPLC và GC

Phương pháp nghiên cứu

1 Điều tra bộ thuốc trừ sâu mà nông dân sử dụng phổ biến trên rau

2 Thiết lập cách thức tạo mẫu giả định trong phòng thí nghiệm

3 Xây dựng quy trình chiết và làm giàu mẫu phân tích từ mẫu giả định

4 Xây dựng và ứng dụng quy trình xác định dư lượng thuốc trừ sâu nhóm carbamat thường sử dụng trên rau bằng phương pháp HPLC với đầu dò huỳnh quang

5 Xây dựng và ứng dụng quy trình xác định dư lượng thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ thường sử dụng trên rau bằng phương pháp GC với đầu dò NPD

6 Xây dựng và ứng dụng quy trình xác định dư lượng thuốc trừ sâu nhóm clor hữu

cơ, cúc tổng hợp thường sử dụng trên rau bằng phương pháp GC với đầu dò ECD

Kết quả nghiên cứu

1 Đã xác định danh mục thuốc trừ sâu mà nông dân sử dụng phổ biến trên rau

2 Đã xây dựng quy trình chiết và làm giàu mẫu phân tích các thuốc trừ sâu phổ biến

từ mẫu giả định trong phòng thí nghiệm

3 Đã xây dựng và ứng dụng quy trình xác định dư lượng thuốc trừ sâu nhóm carbamat thường sử dụng trên rau bằng phương pháp HPLC với đầu dò huỳnh quang

4 Đã xây dựng và ứng dụng quy trình xác định dư lượng thuốc trừ sâu nhóm lân hữu

cơ thường sử dụng trên rau bằng phương pháp GC với đầu dò NPD

5 Đã xây dựng và ứng dụng quy trình xác định dư lượng thuốc trừ sâu nhóm clor hữu cơ, cúc tổng hợp thường sử dụng trên rau bằng phương pháp GC với đầu dò ECD

Trang 3

Everyday, there are about 1,200 tons of green vegetables imported into Ho Chi Minh city Three percentages of that have determined to have pesticide amount higher than permitted residue levels Currently, the biochemical tests are often used to detect quickly pesticides However, the tests do not detect pyrethroid and organochlorine pesticides, detection limit of each pesticide is different that leads to their results can not approve if the pesticide amount is higher than accepted residue level Several analytical laboratories in the South have capability to quantify the pesticide which is required by customer As a result, the waste time and reality are limited Therefore, study on quantitative determination of residue of commonly used pesticides on green vegetables is challenged

Objectives

Development and application of the HPLC and GC methods for quantitative determination of residue of carbamate, organophosphorous, pyrethroid, and organochlorine pesticides, which are commonly used on green vegetables

Methods

1 Investigation of list of pesticides which are commonly used on green vegetables

by farmer

2 Establishment of assumed samples in the laboratory

3 Establishment of extraction and clean-up of assumed samples

4 Quantitative determination of commonly used carbamate pesticides residue on green vegetables by HPLC with fluorescence detector (FLD)

5 Quantitative determination of commonly used organophosphorous pesticides residue on green vegetables by GC with nitrogen phosphorus detector (NPD)

6 Quantitative determination of commonly used organochlorine and pyrethroid pesticides residue on green vegetables by GC with electron capture detector (ECD

4 The GC-NPD method was developed, validated, and applied for quantitative determination of commonly used organophosphorous pesticides residue on green vegetables

5 The GC-ECD method was developed, validated, and applied for quantitative determination of commonly used organochlorine and pyrethroid pesticides residue

on green vegetables

Trang 4

Trang

1.1 Tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài 2 1.2 Thuốc trừ sâu và tình hình sử dụng tại Việt Nam 2

1.8 Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang và

1.9 Hệ thống sắc ký khí với đầu dò ion hóa ngọn lửa

phosphor – nitrogen (NPD) và đầu dò cộng kết điện tử (ECD) 18

2.1 Chất chuẩn, nguyên liệu, hóa chất, dung môi, trang thiết bị 20 2.2 Điều tra bộ thuốc trừ sâu nông dân thường sử dụng trên rau

ở thành phố Hồ Chí Minh và 8 tỉnh cung cấp rau cho thành phố 22

2.3 Thiết lập cách thức tạo mẫu giả định trong phòng thí nghiệm 22 2.4 Xây dựng quy trình xác định dư lượng thuốc trừ sâu nhóm carbamat

thường sử dụng trên rau bằng HPLC với đầu dò huỳnh quang 23

2.4.1 Xác định điều kiện phân tích đồng thời các thuốc trừ sâu nhóm carbamat 23 2.4.2 Xây dựng quy trình chiết và làm sạch mẫu 23

2.5 Xây dựng quy trình xác định dư lượng thuốc trừ sâu nhóm

lân hữu cơ thường sử dụng trên rau bằng GC với đầu dò NPD 25 2.5.1 Xác định điều kiện phân tích đồng thời các thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ 25 2.5.2 Xây dựng quy trình chiết và làm sạch mẫu 25

2.6 Xây dựng quy trình xác định dư lượng thuốc trừ sâu nhóm cúc tổng hợp

và clor hữu cơ thường sử dụng trên rau bằng GC với đầu dò ECD 26

Trang 5

2.6.2 Xây dựng quy trình chiết và làm sạch mẫu 26

2.7 Ứng dụng các quy trình xác định dư lượng thuốc trừ sâu

nhóm carbamat, lân hữu cơ, cúc tổng hợp thường phun trên rau –

So sánh kết quả phân tích với các phòng thí nghiệm

lân hữu cơ, cúc tổng hợp thường phun trên rau - So sánh kết quả phân tích

với các phòng thí nghiệm đạt ISO/IEC 17025 tại TPHCM 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC 1: Thuốc trừ sâu nhóm carbamat PL-01 PHỤ LỤC 2: Thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ PL-14 PHỤ LỤC 3: Thuốc trừ sâu nhóm cúc tổng hợp và clor hữu cơ PL-29 PHỤ LỤC 4: Phiếu điều tra nông dân về hiện trạng sử dụng thuốc BVTV

trên rau của nông dân tại TPHCM và 8 tỉnh cung cấp rau cho thành phố PL-44

Trang 6

Từ viết tắt Từ nguyên Nghĩa tiếng Việt

Association Official Analytical Chemist

The Association of Southeast Asian Nations

Chinese National Standards Electron Capture Detector Environmental Protection Agency Food and Agriculture Organization

Flame Ionization Detector Fluorescence Detector Gas Chromatography High Performance Liquid Chromatography

Internal Standard International Union of Pure and Applied Chemistry

Liquid Chromatography Lethal Dose 50

Limit of Detection Limit of Quantitation Methanol

Maximum Residue Limits Multi Residue Methods Mass spectrometry

Acetonitril Lượng ăn vào hằng ngày chấp nhận được

Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính tắc

Hiệp hội các quốc gia Đông Nam Á

Bảo vệ thực vật

Bộ tiêu chuẩn quốc gia Trung Quốc Đầu dò cộng kết điện tử

Cơ quan bảo vệ môi trường

Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hiệp quốc

Đầu dò ion hóa ngọn lửa Đầu dò huỳnh quang Sắc ký khí

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Nội chuẩn Hiệp hội Quốc tế về hóa học thuần túy

và ứng dụng Sắc ký lỏng Liều làm chết 50% thú vật thử nghiệm Giới hạn phát hiện

Giới hạn định lượng Methanol

Dư lượng tối đa cho phép Phương pháp xác định đa dư lượng Khối phổ

Trang 7

Relative standard deviation Standard deviation

Solid Phase Extraction Solid Phase Micro Extraction

Trimethyl sulfonium hydroxyde Ultraviolet

World Health Organization

nitrogen o- phthaldehyd Thời gian cách ly Phần tỉ

Phần triệu Phân tử lượng

Độ lệch chuẩn tương đối

Độ lệch chuẩn Chiết pha rắn

Vi chiết pha rắn Trung bình Trimethyl sulfonium hydroxyd

Tử ngoại

Tổ chức Y tế thế giới

Trang 8

Trang

Bảng 1.1: Mức dư lượng cho phép của một số thuốc trừ sâu trên rau ăn lá 17

Bảng 2.1: Các chất chuẩn được sử dụng trong nghiên cứu 20

Bảng 2.2: Các loại thuốc trừ sâu dùng trong nghiên cứu 21

Bảng 3.1: Tần suất sử dụng các thuốc trừ sâu theo điều tra của Chi cục BVTV

TPHCM

28

Bảng 3.2: Thể tích dung dịch chuẩn của các thuốc trừ sâu carbamat khảo sát

cần thêm vào rau

29

Bảng 3.3: Mô ̣t số điều kiê ̣n sắc ký đã khảo sát 30

Bảng 3.4: Chương trình rửa giải gradient sử du ̣ng cho điều kiê ̣n 3 30

Bảng 3.5: Hiệu suất thu hồi của các carbamat với quy trình chiết bằng ACN

Bảng 3.8: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của 6 carbamat 39

Bảng 3.9: Phương trình hồi quy, hệ số tương quan của các carbamat khảo sát 39

Bảng 3.10: Các giá trị thống kê của các phương trình hồi quy của các carbamat 40

Bảng 3.11: Phương trình hồi quy của các carbamat sau khi đánh giá 40

Bảng 3.12: Kết quả khảo sát độ đúng và độ chính xác của các carbamat (n = 18) 40

Bảng 3.13: Kết quả khảo sát LOD và LOQ của các carbamat 40

Bảng 3.14: Thể tích dung dịch chuẩn của các thuốc trừ sâu lân hữu cơ khảo sát

cần thêm vào rau

43

Bảng 3.15: Chương trình nhiệt trong GC với đầu dò NPD 43

Bảng 3.16: Hiệu suất thu hồi của các lân hữu cơ với quy trình chiết bằng ACN

Bảng 3.19: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của 7 thuốc trừ sâu lân hữu cơ 49

Bảng 3.20: Phương trình hồi quy, hệ số tương quan của các lân hữu cơ 49

Bảng 3.21: Các giá trị thống kê của các phương trình hồi quy của các lân hữu

cơ

49

Bảng 3.22: Phương trình hồi quy của các lân hữu cơ sau khi đánh giá 50

Bảng 3.23: Kết quả khảo sát độ đúng và độ chính xác của các lân hữu cơ (n =

18)

50

Trang 9

tổng hợp khảo sát cần thêm vào rau

Bảng 3.26: Chương trình nhiệt trong GC với đầu dò ECD 53

Bảng 3.27: Hiệu suất thu hồi của các thuốc trừ sâu cúc tổng hợp và clor hữu cơ

với quy trình chiết bằng aceton (n=6)

Bảng 3.30: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của 6 thuốc trừ sâu cúc tổng

hợp và clor hữu cơ

58

Bảng 3.31: Phương trình hồi quy, hệ số tương quan của các thuốc trừ sâu cúc

tổng hợp và clor hữu cơ

58

Bảng 3.32: Các giá trị thống kê của các phương trình hồi quy của các thuốc trừ

sâu cúc tổng hợp và clor hữu cơ

59

Bảng 3.33: Phương trình hồi quy của các thuốc trừ sâu cúc tổng hợp và clor

hữu cơ sau khi đánh giá

59

Bảng 3.34: Kết quả khảo sát độ đúng và độ chính xác của các thuốc trừ sâu cúc

tổng hợp và clor hữu cơ (n = 18)

59

Bảng 3.35: Kết quả khảo sát LOD và LOQ của các thuốc trừ sâu cúc tổng hợp

và clor hữu cơ

60

Bảng 3.36: Liều phun thuốc trừ sâu trên một nghiệm thức rau 1 m2 62

Bảng 3.37: Kết quả phân tích dư lượng các thuốc trừ sâu trên các mẫu rau ngoài

đồng (n=4)

63

Bảng 3.38: Kết quả phân tích dư lượng thuốc trừ sâu thường sử dụng trên các

mẫu rau, củ, quả được lấy tại các chợ đầu mối trên địa bàn TPHCM tại Chi cục BVTV TPHCM (n=2)

64

Trang 10

Trang

Hình 2.1: Rau muống được trồng thủy canh trong nhà lưới 20

Hình 2.2: Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang kết nối với bộ tạo dẫn xuất

sau cột

22

Hình 3.1: Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn của các carbamat khảo sát với pha động

theo điều kiện 1

30

31

Hình 3.4: Phổ UV tại thời gian lưu của các carbamat với pha động theo điều

kiện 3

31

Hình 3.5: Sắc ký đồ của dịch chiết carbamat trong rau bằng methanol 32

Hình 3.6: Sắc ký đồ của dịch chiết carbamat trong rau bằng ethyl acetat 33

Hình 3.7: Sắc ký đồ của dịch chiết carbamat trong rau bằng ACN 34

Hình 3.8: Sắc ký đồ của dịch chiết carbamat trong rau bằng ACN, phân tích

bằng HPLC với đầu dò huỳnh quang

35

Hình 3.9: Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn carbamat khảo sát với đầu dò huỳnh quang 36

Hình 3.10: Sắc ký đồ mẫu trắng Điều kiện sắc ký như hình 3.8 38

Hình 3.13: Sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn A (lân hữu cơ) ở mức dư lượng cho

phép

44

Hình 3.14: Sắc ký đồ của dịch chiết thuốc trừ sâu lân hữu cơ trong rau bằng

ethyl acetat, rửa giải với acetonitril – toluen (3:1)

45

Hình 3.15: Sắc ký đồ của dịch chiết thuốc trừ sâu lân hữu cơ trong rau bằng

ethyl acetat, rửa giải với dicloromethan – ethyl acetat (7:3)

45

Hình 3.16: Sắc ký đồ của dịch chiết thuốc trừ sâu lân hữu cơ trong rau (được

phun hỗn hợp chuẩn A) bằng acetonitril, rửa giải với acetonitril – toluen (3:1)

46

Hình 3.17: Sắc ký đồ của dịch chiết thuốc trừ sâu lân hữu cơ trong rau (được

phun hỗn hợp chuẩn B) bằng acetonitril, rửa giải với acetonitril – toluen (3:1)

47

Hình 3.19: Sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn A (cúc tổng hợp và clor hữu cơ) ở

mức dư lượng cho phép

54

Hình 3.20: Sắc ký đồ của dịch chiết thuốc trừ sâu cúc tổng hợp và clor hữu cơ

trong rau bằng acetonitril, rửa giải với acetonitril – toluen (3:1)

55

Trang 11

diethyl ether (5:1)

Hình 3.22: Sắc ký đồ của dịch chiết thuốc trừ sâu cúc tổng hợp trong rau (được

phun hỗn hợp chuẩn B) bằng aceton, rửa giải với n-hexan – diethyl ether (5:1)

56

Trang 12

Trang

Sơ đồ 3.1: Quy trình chiết thuốc trừ sâu carbamat từ rau bằng MeOH 32

Sơ đồ 3.2: Quy trình chiết thuốc trừ sâu carbamat từ rau bằng ethyl acetat 33

Sơ đồ 3.3: Quy trình chiết thuốc trừ sâu carbamat từ rau bằng acetonitril 34

Sơ đồ 3.4: Quy trình chiết thuốc trừ sâu carbamat từ rau bằng acetonitril, phân

tích bằng HPLC với đầu dò huỳnh quang

35

Sơ đồ 3.5: Quy trình chiết thuốc trừ sâu lân hữu cơ từ rau bằng ethyl acetat 44

Sơ đồ 3.6: Quy trình chiết thuốc trừ sâu lân hữu cơ từ rau bằng acetonitril 46

Sơ đồ 3.7: Quy trình chiết thuốc trừ sâu cúc tổng hợp và clor hữu cơ từ rau

Trang 13

Tên đề tài: Xây dựng và ứng dụng các quy trình xác định dư lượng thuốc trừ sâu

nhóm carbamat, lân hữu cơ, clor hữu cơ và cúc tổng hợp thường sử dụng trên rau bằng phương pháp HPLC và GC

Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Văn Đức Tiến

PGS.TS Nguyễn Đức Tuấn

Cơ quan chủ trì: Chi cục Bảo vệ thực vật thành phố Hồ Chí Minh

Thời gian thực hiện đề tài: 12/2008 – 5/2011

Kinh phí đƣợc duyệt: 320.000.000 đồng (Ba trăm hai mươi triệu đồng)

Mục tiêu

Xây dựng và ứng dụng các quy trình xác định dư lượng thuốc trừ sâu nhóm carbamat, lân hữu cơ, clor hữu cơ và cúc tổng hợp thường sử dụng trên rau bằng phương pháp HPLC và GC

Nội dung

6 Xây dựng và ứng dụng quy trình xác định dư lượng thuốc trừ sâu nhóm clor hữu

cơ, cúc tổng hợp thường sử dụng trên rau bằng phương pháp GC với đầu dò ECD

Sản phẩm của đề tài

1 Báo cáo kết quả đề tài

2 Đĩa CD-ROM lưu toàn bộ kết quả nghiên cứu của đề tài (1 đĩa)

3 Một danh sách tổng hợp các thuốc trừ sâu thường được sử dụng trên rau ở thành phố Hồ Chí Minh và 8 tỉnh cung cấp rau cho thành phố

4 Quy trình xác định dư lượng thuốc trừ sâu nhóm carbamat thường sử dụng trên rau bằng phương pháp HPLC với đầu dò huỳnh quang

5 Quy trình xác định dư lượng thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ thường sử dụng trên rau bằng phương pháp GC với đầu dò NPD

6 Quy trình xác định dư lượng thuốc trừ sâu nhóm clor hữu cơ, cúc tổng hợp thường

sử dụng trên rau bằng phương pháp GC với đầu dò ECD

7 Hai bài báo đăng trong tạp chí Dược học

8 Ngoài ra còn hướng dẫn 1 khóa luận dược sĩ đại học, 1 luận văn thạc sĩ và biên soạn 1 tài liệu giảng dạy sau đại học

Trang 14

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chất lượng rau hiện nay đang là một vấn đề cần được quan tâm Tại TPHCM, mỗi ngày có khoảng 1200 tấn rau các loại nhập vào thành phố, trong đó có khoảng 3% lượng rau có nhiễm dư lượng thuốc trừ sâu Hiện nay phương pháp phát hiện dư lượng thuốc trừ sâu phổ biến nhất vẫn là phân tích nhanh bằng phương pháp sinh hóa với các bộ kit của Đài Loan hay Thái Lan Phương pháp này chủ yếu dùng để định tính nhóm thuốc, không phát hiện được thuốc trừ sâu nhóm cúc tổng hợp và nhóm clor hữu cơ, độ nhạy của phương pháp đối với từng thuốc trừ sâu có khác nhau nên không biết được mẫu rau có nhiễm thuốc trừ sâu vượt mức cho phép hay không Một

số trung tâm thuộc khu vực phía Nam có khả năng xác định dư lượng thuốc trừ sâu đã định danh cụ thể, dưới hình thức dịch vụ theo yêu cầu của khách hàng Các quy trình định lượng chỉ áp dụng cho từng chất cụ thể như vậy sẽ tốn nhiều thời gian và không

có tính chủ động để có thể áp dụng ngoài thị trường Từ thực tế này, yêu cầu đặt ra là phải có một phương pháp định lượng nhanh, chính xác, phù hợp với bộ thuốc trừ sâu nông dân thường sử dụng nhằm rút ngắn thời gian trả lời kết quả so với điều kiện hiện nay Điều này rất có ý nghĩa đối với công tác kiểm tra quản lý nhà nước Bên cạnh đó kinh phí phân tích mẫu cũng sẽ được giảm đi

Nhằm góp phần giải quyết từng bước vấn đề phân tích, kiểm tra dư lượng thuốc trừ sâu, đề tài này được thực hiện nhằm tìm ra một quy trình chung xác định dư lượng thuốc trừ sâu theo từng nhóm thuốc mà nông dân thường sử dụng trên rau bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao và sắc ký khí để có thể áp dụng tại các Chi cục Bảo

vệ thực vật TPHCM và các tỉnh phía Nam phục vụ cho việc giám sát dư lượng thuốc trừ sâu trên rau ngoài thị trường

Mục tiêu của đề tài là xây dựng và ứng dụng các quy trình xác định dư lượng thuốc trừ sâu nhóm carbamat, lân hữu cơ, clor hữu cơ và cúc tổng hợp thường sử dụng trên rau bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và sắc ký khí (GC)

Để đạt được mục tiêu trên, đề tài đã thực hiện các nội dung sau đây:

6 Xây dựng và ứng dụng quy trình xác định dư lượng thuốc trừ sâu nhóm clor hữu cơ, cúc tổng hợp thường sử dụng trên rau bằng phương pháp GC với đầu

dò ECD

Trang 15

1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài

1.1.1 Tình hình ngoài nước

Trên thế giới, nhiều tác giả đã đưa ra phương pháp xác định nhanh dư lượng thuốc trừ sâu trong rau, bao gồm phương pháp phân tích nhanh hóa học, phương pháp thử sinh học nhanh dựa trên nguyên tắc ức chế men acetylcholinesterase (AChE), phương pháp ELISA Tuy nhiên, các phương pháp này chủ yếu là định tính một chất hoặc một nhóm chất nào đó Việc xác định dư lượng các thuốc trừ sâu thuộc nhóm clor hữu cơ (DDT, endosulfan), lân hữu cơ (diazinon, clorpyrifos, phenthoat, fenitrothion, …), nhóm cúc tổng hợp (cypermethrin, fenvalerat, esfenvalerat, lambda-cyhalothrine, ….)

và carbamat (fenobucarb, isoprocarb, aldicarb, methomyl, …) đã được nhiều nước trên thế giới nghiên cứu từ lâu, đặc biệt là Trung Quốc, sử dụng các phương pháp GC-

MS, HPLC, LC-MS

1.1.2 Tình hình trong nước

Hiện nay phương pháp phát hiện dư lượng thuốc trừ sâu trên rau phổ biến nhất vẫn là phân tích nhanh bằng phương pháp sinh hóa với các bộ kit của Đài Loan hay Thái Lan Phương pháp này chủ yếu dùng để định tính nhóm thuốc, không phát hiện được thuốc trừ sâu nhóm cúc tổng hợp và nhóm clor hữu cơ, độ nhạy của phương pháp đối với từng thuốc trừ sâu có khác nhau nên không biết được mẫu rau nhiễm thuốc trừ sâu

có vượt mức cho phép hay không Kết quả của test nhanh hiện nay chỉ dừng lại dưới hình thức cảnh báo Ở một số cơ sở như Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm, Trung tâm Kiểm định thuốc và khảo nghiệm thuốc bảo vệ thực vật phía Nam, Trung tâm Kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường 3, Viện vệ sinh y tế công cộng… có khả năng phân tích xác định dư lượng thuốc trừ sâu đã định danh cụ thể, dưới hình thức dịch vụ theo yêu cầu của khách hàng

Việc ứng dụng các phương pháp sắc ký như HPLC và GC để phân tích đơn dư lượng

đã được phát triển mạnh nhằm kiểm tra dư lượng của một loại thuốc trừ sâu đã định danh trước trong nông sản Tuy nhiên, để kiểm tra độ an toàn của sản phẩm, người ta không thể kiểm tra từng chất, xét cả về thời gian và chi phí Do vậy, việc nghiên cứu

để kiểm tra từng nhóm (tập hợp nhiều loại thuốc có hoạt chất cùng gốc hóa học) và nhiều nhóm thuốc trừ sâu đã được tập trung nghiên cứu

1.2 Thuốc trừ sâu và tình hình sử dụng tại Việt Nam

Thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) là các chế phẩm có nguồn gốc từ hóa chất, động vật, thực vật, vi sinh vật và các chế phẩm khác dùng để phòng trừ sinh vật gây hại tài nguyên thực vật Theo quyết định số 49/2008/QĐ-BNN của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn ban hành ngày 27 tháng 3 năm 2008, ở nước ta chỉ riêng thuốc trừ sâu,

đã có tới 292 dạng hoạt chất với 959 tên thương phẩm được phép lưu hành [2] Hiện tại, số lượng hoạt chất và tên thương phẩm được phép lưu hành đã tăng lên rất nhiều theo danh mục thuốc BVTV được phép sử dụng, hạn chế sử dụng, cấm sử dụng ở Việt

Trang 16

Nam theo Thông tư số 36/2011/TT-BNNPTNT của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn ban hành ngày 20 tháng 5 năm 2011

Các thuốc BVTV, tùy theo đối tượng sinh vật hại, được chia thành các nhóm như thuốc trừ bệnh, thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ, thuốc diệt chuột … Trong đó, thuốc trừ sâu tùy theo nguồn gốc hay cấu trúc hóa học cũng được chia thành các nhóm như cúc tổng hợp, lân hữu cơ, clor hữu cơ, carbamat và thuốc trừ sâu sinh học

Cơ chế tác động của thuốc trừ sâu chủ yếu dựa trên hai tác động chính là:

- Nội hấp hay lưu dẫn: Thuốc thấm vào trong tế bào và xâm nhập vào hệ thống mạch dẫn trong cây Sâu chích hút hoặc ăn phần vỏ cây có phun thuốc rồi chết

- Thấm sâu: Thuốc thấm vào mô cây và diệt những côn trùng sống ẩn dưới những phần phun thuốc

Thuốc BVTV sau khi phun lên cây trồng sẽ lưu lại trên cây một thời gian Tùy từng loại thuốc, từng loại cây sẽ có thời gian lưu lại khác nhau Do đó, cây trồng sau khi phun thuốc phải có thời gian cách ly thích hợp để đảm bảo lượng thuốc tồn dư trong nông sản không ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng [5]

Theo tổ chức Lương nông thế giới, dư lượng thuốc BVTV là "những chất đặc thù tồn

lưu trong lương thực và thực phẩm, trong sản phẩm nông nghiệp, trong thức ăn và vật nuôi do việc sử dụng thuốc BVTV gây nên" Dư lượng thường được tính bằng

miligam hoặc microgam chất độc trong 1 kilogam nông sản [22]

Độ độc cấp tính của thuốc BVTV được biểu thị qua liều gây chết trung bình (LD50) của chuột, từ đó suy ra cho người và đô ̣ng vâ ̣t máu nóng Căn cứ vào đô ̣ đô ̣c cấp tính của thuốc BVTV trên người , WHO phân chia thành 5 nhóm độc khác nhau : Ia (rất

đô ̣c), Ib (đô ̣c cao), II (đô ̣c trung bình), III (ít độc), IV (rất ít đô ̣c) [22]

Nhiều loa ̣i thuốc có khả năng tích lũy trong cơ thể người và đô ̣ng vâ ̣t máu nóng , gây

đô ̣t biến tế bào, kích thích tế bào khối u ác tính phát triển , ảnh hưởng đến bào thai và gây di ̣ da ̣ng đối với các thế hệ sau Các biểu hiện tác hại này phát sinh chậm , do thuốc tích lũy dần trong cơ thể , gọi là nhiễm độc mãn tính Người và đô ̣ng vâ ̣t máu nóng nếu ăn phải thực phẩm có dư lượng của các chất có lư ợng hấp thu hằng ngày (ADI) lớn hơn 0,005 mg/kg trong một thời gian dài dễ bi ̣ ngô ̣ đô ̣c mãn tính [39]

Thời gian cách ly (PHI) là khoảng thời gian ngắn nhất từ khi phun thuốc lên cây cho đến khi thuốc phân hủy đạt mức dư lượng tối đa cho phép [4]

1.3 Nhóm thuốc carbamat

Nhóm thuốc trừ sâu carbamat có nguồn gốc từ acid carbamic và có khả năng giết côn trùng tương tự như nhóm lân hữu cơ Chúng được sử dụng trong nhà, sân vườn và trong nông nghiệp Kiểu tác động là ức chế men AchE, làm ảnh hưởng đến xung dẫn truyền thần kinh Khi dẫn truyền kích thích thần kinh, ở đầu mút dây thần kinh sản sinh ra acetylcholin để dẫn truyền kích thích Sau khi làm xong nhiệm vụ dẫn truyền qua các đầu mút thần kinh, acetylcholin được thủy phân nhờ men AchE Khi men này

bị ức chế bởi carbamat, acetylcholin không bị thủy phân, sẽ tích lũy lại với lượng lớn làm cho dây thần kinh bị tổn thương và đứt đoạn, sự kích thích thần kinh bị rối loạn

Trang 17

và tê liệt, côn trùng sẽ chết Đối với người và động vật khác, carbamat cũng tác động theo cơ chế này [39]

Carbamat đầu tiên là carbaryl được giới thiệu vào năm 1956, và từ đó nhóm thuốc carbamat được sử dụng rộng rãi trên khắp thế giới Carbamat tác động trên động vật

có vú qua đường hít thở, qua da và đường miệng Chúng đặc biệt rất độc với côn trùng bộ cánh màng Các thuốc carbamat thường ở dạng rắn hoặc hơi lỏng, ít tan trong nước, tan nhiều trong dung môi hữu cơ phân cực hoặc phân cực trung bình [39]

1.3.1 Các phương pháp phân tích dư lượng nhóm carbamat

1.3.1.1 Test nhanh của Đài Loan hay Thái Lan [6]

Dựa vào đặc tính ức chế men acetylcholinesterase của các loại thuốc trừ sâu nhóm carbamat và lân hữu cơ Khi cho men acetylcholinesterase vào dịch chiết mẫu rau quả

có chứa dư lượng thuốc trừ sâu lân hữu cơ hay carbamat thì một phần men này bị ức chế chỉ còn lại một phần thừa Men acetylcholinesterase tự do (không bị ức chế) thủy phân acetylcholin tạo ra cholin và acid acetic Dựa vào phản ứng tạo màu của acetylcholin và thuốc thử GT mà xác định được mức độ thuốc trừ sâu có trong rau quả Các thuốc thử GT gồm GT1: men acetylcholinesterase, GT2: acetylcholin, GT2.1: natri acetat, GT3: hydroxylamin, GT3.1: natri hydroxyd, GT4: acid hydroclorid, GT5: sắt (III) clorid

Phản ứng tạo màu của acetylcholin với các thuốc thử GT diễn ra như sau:

Acid hydroxamic GT 5 Acid acetyldroxamic ferric

+ 3 H+

Acid acetyldroxamic ferric là dạng phức chất, hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 540 nm Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhằm xác định dư lượng thuốc trừ sâu nhóm carbamat và lân hữu cơ hiện nay Thời gian phân tích tương đối nhanh, có độ nhạy khác nhau tùy theo từng thuốc trừ sâu, có thể áp dụng ngay tại nơi sản xuất rau hay tại các chợ đầu mối Tuy nhiên phương pháp này chỉ mang tính chất định tính, không thể khẳng định dư lượng (nếu dương tính) có vượt mức cho phép hay không nên chưa đủ cơ sở pháp lý để xử lý lô hàng nông sản

1.3.1.2 Một số phương pháp phân tích dư lượng nhóm carbamat bằng kỹ thuật sắc

ký

Trên thế giới, việc phát triển các phương pháp xác định dư lượng các thuốc trừ sâu nhóm carbamat đã có từ lâu và có nhiều công trình đã công bố Các phương pháp phân tích bằng GC ít phổ biến hơn có lẽ do carbamat dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao Các phương pháp phân tích bằng HPLC, kết nối với bộ tạo phản ứng sau cột và phát hiện bằng đầu dò huỳnh quang được ứng dụng rộng rãi nhất

Trang 18

a Các phương pháp phân tích bằng HPLC

- Phương pháp phân tích đa dư lượng theo CNS 13570-2 [18]:

Đây là tiêu chuẩn quốc gia của Trung Quốc, áp dụng để phân tích đa dư lượng các thuốc trừ sâu bằng sắc ký khí (GC-NPD, GC-ECD, GC-MS) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (LC-MS, HPLC-FLD) Các carbamat có thể phân tích theo phương pháp này bao gồm: aldicarb sulfoxyd, aldicarb sulfon, oxamyl, methomyl, 3- hydroxy carbofuran, 3- keto carbofuran, aldicarb, metolcarb, propoxur, carbofuran, carbaryl, 1-naphthol, thiodicarb, isoprocarb, methiocarb Phương pháp này áp dụng chương trình dung môi gradient phối hợp giữa nước, acetonitril và methanol để tách các chất carbamat, dùng phản ứng sau cột để tạo dẫn xuất, phát hiện bằng đầu dò huỳnh quang, sau đó có thể phân tích khẳng định tiếp bằng LC-MS

Quá trình xử lý mẫu bao gồm các bước: chiết bằng acetonitril, loại nước bằng muối natri clorid, loại tạp trên cột chiết pha rắn aminopropyl, rữa giải bằng hỗn hợp dicloromethan và methanol

Dẫn chất 1-hydroxy ethylthio-2-methylisoindol hấp thụ bức xạ ở bước sóng 340 nm

và phát xạ huỳnh quang ở bước sóng 440 - 465 nm

- Các tác giả Khin L Zan và Somporn Chantara với nghiên cứu "Phát triển phương

pháp xác định dư lượng carbofuran và carboxin trong bắp cải bằng HPLC-UV" [26]

- Các tác giả Fernandez M., Pico Y., Manes J với nghiên cứu "Xác định dư lượng

thuốc trừ sâu nhóm carbamat với kỹ thuật chiết pha phân tán rắn và LC-MS" [23]

- Các tác giả Sanchez-Brunete C., Rodriguez A., Tadeo J với nghiên cứu "Xác

định đa dư lượng carbamat trong đất bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao" [31]

Trang 19

b Các phương pháp phân tích bằng GC

- Các tác giả Harald Farber và Heinz F Scholer với nghiên cứu: "Sắc ký khí xác

định các carbamat sau khi methyl hóa bằng trimethyl sulfonium hydroxyd", xác định

13 carbamat trong mẫu nước [24]

- Các tác giả Masaru Kawasaki, Tsuyoshi Inoue, Katsuharu Fukuhara và Sadao

Uchiyama với nghiên cứu "Xác định dư lượng thuốc trừ sâu nhóm carbamat và lân

hữu cơ trong thực phẩm bằng GC-MS với phương pháp làm sạch mẫu bằng cột SPE"

[29]

1.3.2 Một số thuốc trừ sâu nhóm carbamat thông dụng [16]

1.3.2.1 Methomyl

Công thức phân tử: C5H10O2S PTL: 162,21

Tên theo IUPAC: S-methyl N-(methyl carbamoyl oxy) thioacetimidate

Công thức cấu tạo:

Độc tính: LD50 trên chuột: 17- 24 mg/kg (đường uống)

LD50 trên chuột lang: 15 mg/kg (đường uống) ADI: 0,03 mg/kg thể trọng/ngày

Phân loại độc theo WHO: Nhóm I Các chế phẩm: Laminat 40 SP, Lannate 40 SP…

Độc tính: LD50 trên chim: 71 mg/kg (đường uống) trong 8 ngày

LD50 trên cá: 0,88 mg/kg (đường uống) trong 96 giờ

Trang 20

ADI: 0,003 mg/kg thể trọng/ngày Phân loại độc theo WHO: Nhóm Ia Các chế phẩm: Ở nước ngoài aldicarb có tên thương mại là Temix Ở nước ta, aldicarb không có trong danh mục thuốc trừ sâu được phép sử dụng

1.3.2.3 Carbofuran

Công thức phân tử: C12H15NO3 PTL: 221,25

Tên theo IUPAC: 3,3-dihydro-2,2dimethyl benzofuran 7-yl-methyl carbamate

O

O NH

Độc tính: LD50 trên chuột: 8 mg/kg (đường uống)

LD50 trên chó: 15 mg/kg (đường uống) ADI: 0,01 mg/kg thể trọng/ngày Phân loại độc theo WHO: Nhóm Ib Các chế phẩm: Fudaran 3G, Sugadan 30G…

1.3.2.4 Carbaryl

Tên theo IUPAC: 1-naphthyl methyl carbamate

LD50 trên chó: 2500 mg/kg (đường uống) ADI: 0,01 mg/kg thể trọng/ngày

Phân loại độc theo WHO: Nhóm II Các chế phẩm: Sevin 43 WF, Sebaryl 85 BHN…

Trang 21

1.3.2.5 Isoprocarb

Tên theo IUPAC: 2-isopropyl phenyl methyl carbamate

O NH

LD50 trên chuột: 500 mg/kg (tiếp xúc niêm mạc) ADI: 0,004 mg/kg thể trọng/ngày

Phân loại độc theo WHO: Nhóm II Các chế phẩm: Mipcide 20EC, Vimipc 20BTN…

1.3.2.6 Fenobucarb

Tên theo IUPAC: 2-sec-butylphenyl methyl carbamate

O NH

LD50 trên thỏ: 10250 mg/kg (tiếp xúc niêm mạc) ADI: 0,012 mg/kg thể trọng/ngày

Phân loại độc theo WHO: Nhóm II Các chế phẩm: Bassan 50EC, Baside 50EC…

1.4 Nhóm thuốc lân hữu cơ

Thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ là một nhóm lớn trong thuốc BVTV, do có nhiều ưu điểm: phổ rất rộng, hiệu quả nhanh, ít tồn tại lâu trong môi trường nên nhóm thuốc

Trang 22

này được sử dụng rất phổ biến Thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ là thuốc trừ sâu tổng hợp hóa học, có nguồn gốc là những ester, amid hoặc dẫn xuất thiol của acid phosphoric Đa số các chất trong nhóm lân hữu cơ ít tan trong nước, tan nhiều trong dung môi môi hữu cơ, hóa hơi ở nhiệt độ cao, dễ bị thủy phân trong môi trường acid hoặc kiềm Nhóm lân hữu cơ gây độc tính rất cao trên trên thần kinh ở người và động vật máu nóng, thuốc giải độc đặc hiệu là atropin

Trong danh mục các thuốc BVTV được phép sử dụng tại Việt Nam, nhóm thuốc lân hữu cơ chiếm 37,5% Theo Quyết định số 19/2005/QĐ – BNN ngày 24/03/2005, danh mục thuốc trừ sâu được phép sử dụng cho cây rau chỉ có một chất thuộc nhóm lân hữu cơ là fenitrothion, do đó việc xây dựng một phương pháp có khả năng tầm soát các thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ trên rau là cần thiết và có ý nghĩa thiết thực khi việc sử dụng thuốc BVTV ở Việt Nam chưa hợp lý [7]

1.4.1 Các phương pháp phân tích dư lượng nhóm lân hữu cơ

Trên thế giới, việc phát triển các phương pháp xác định đa dư lượng (MRMs) các thuốc BVTV đã có từ lâu (1960) và có nhiều công trình đã công bố Các thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ có tính chất hóa hơi ở nhiệt độ cao mà không bị phân hủy nên các phương pháp phân tích bằng sắc ký khí chiếm ưu thế so với các phương pháp sử dụng sắc ký lỏng

- Phương pháp phân tích đa dư lượng thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ theo AOAC 968.24 [14]

Các thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ được phân tích trong phương pháp này gồm: dimethoat, diazinon, fenitrothion, methidathion, malathion, profenofos Dư lượng thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ được chiết từ mẫu rau với dung môi ethyl acetat Dịch chiết được lọc và lấy một lượng đem đi hóa hơi, cắn được định mức chính xác với một lượng dung môi và đem phân tích trên thiết bị GC – NPD Phương pháp cho hiệu suất thu hồi từ 87%-93%

Điều kiện sắc ký: cột mao quản Elite – 1: 100% methyl polysiloxan, chiều dài 30 m, đường kính trong 0,32 mm, bề dày lớp phim 0,25 µm Nhiệt độ buồng tiêm: 260o

C Lưu lượng khí mang nitơ: 14 psi Lò cột: Chương trình nhiệt: 60-270oC Đầu dò NPD: Lưu lượng không khí nén: 100 ml/phút, lưu lượng khí hydro: 2 ml/phút Nhiệt độ đầu dò: 300oC

- Các tác giả Beatriz I A Kaipper, Luiz A S Madureira và Henry X Corseuil với

nghiên cứu “Sử dụng SPE than hoạt trong phân tích đa dư lượng thuốc trừ sâu trong

cà chua” [15] Các thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ được phân tích trong phương pháp

này gồm: methamidophos, acephat, malathion, methylparathion Dư lượng thuốc trừ sâu được chiết xuất bằng ethyl acetat với sự trợ giúp của sóng siêu âm Dịch chiết được lọc qua màng lọc 0,45 µm và được cô quay gần cạn (2 ml) để chuyển sang làm sạch bằng SPE Cột SPE than hoạt được chuẩn bị như sau: đáy cột được lót bông thủy tinh, các lớp tiếp theo gồm 5 mm Na2SO4, 200 mg than hoạt, 5 mm Na2SO4 Cột được hoạt hóa bằng 10 ml methanol, mẫu chiết cô đặc được tải lên cột và được rửa

Trang 23

giải với 10 ml dicloromethan – ethyl acetat (7:3) Dịch rửa giải được hóa hơi bằng cô quay cho đến cạn, cắn sau đó được định mức chính xác với một lượng dung môi và được phân tích trên GC – NPD Hiệu suất thu hồi của phương pháp từ 85%-100% Điều kiện sắc ký: Cột mao quản HP – 5 : 5% biphenyl + 95% dimethyl polysiloxan, chiều dài 30 m, đường kính trong 0,32 mm, bề dày lớp phim 0,25 µm Nhiệt độ buồng tiêm: 210oC Lưu lượng khí mang hydro: 3 ml/phút Lò cột: chương trình nhiệt: 40 –

220oC Đầu dò NPD: lưu lượng không khí nén: 60 ml/phút, lưu lượng khí hydro: 3 ml/phút Nhiệt độ đầu dò: 300oC

- Các quy trình của các tác giả khác chủ yếu cải tiến giai đoạn làm sạch mẫu và làm giàu mẫu trên cột SPE với các loại pha tĩnh khác nhau Các loại pha tĩnh cổ điển như silica gel, nhôm oxyd không được sử dụng phổ biến nữa vì nhược điểm phân cực rất mạnh dễ hấp phụ mạnh thuốc trừ sâu, khó rửa giải dẫn đến hiệu suất thu hồi thấp Các loại pha tĩnh mới tiên tiến được sử dụng nhiều như: GCB, C18, NH2, PSA, SAX, SDVB và dạng kết hợp các loại trên trong cùng một cột SPE hoặc sử dụng 2 cột ghép liên tiếp (cho hiệu quả làm sạch và hiệu suất thu hồi cao) [34]

- Kỹ thuật vi chiết pha rắn (SPME) cũng được sử dụng trong phân tích dư lượng thuốc BVTV cho hiệu quả cao và rút ngắn thời gian phân tích Các tác giả Chai Mee

Kin, Tan Guan Huat và Asha Kumari với nghiên cứu “Áp dụng kỹ thuật vi chiết pha

rắn (SPME) phát hiện thuốc trừ sâu trong rau bằng kỹ thuật sắc ký khí với đầu dò cộng kết điện tử (ECD)” [17] Các chất được phân tích theo phương pháp này gồm:

carbaryl, diazinon, clorothalonil, malathion, clorpyrifos, quinaphos, profenofos, endosulfan, β-endosulfan Mẫu rau sau khi được chiết với dung môi hữu cơ nhờ siêu

α-âm được lọc, sau đó tiến hành vi chiết pha rắn và phân tích trên GC – ECD

1.4.2 Một số thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ thông dụng [36]

1.4.2.1 Clopyrifos

Công thức hóa học: C9H11Cl3NO3PS

Khối lượng phân tử: 350,6

Tên theo IUPAC: O,O-diethyl O-3,5,6-trichloro-2-pyridyl phosphoothioate

Trang 24

Khối lượng phân tử: 304,3

Tên theo IUPAC:

O,O-diethyl O-2-isopropyl-6-methylpyrimidin-4-yl phosphoothioate

Diazinon tồn tại ở dạng lỏng, màu vàng nhạt, trong suốt Nhiệt độ hóa hơi: 83 – 84oC

Khối lượng phân tử 229,3

Tên theo IUPAC: O,O-dimethyl S-methylcarbamoylmethyl phosphoodithioate

Tên theo IUPAC: O,O-dimethyl O-4-nitro-m-tolyl phosphoothioate

Fenitrothion tồn tại ở dạng lỏng màu vàng nâu, có mùi khó chịu Nóng chảy ở 0,3oC, hóa hơi ở nhiệt độ 140-145o

C, tan trong nước (14 mg/l ở 30oC), trong isopropanol

Trang 25

(138 mg/l ở 20oC), tan tốt trong các dung môi hữu cơ như: cồn, hydrocarbon có vòng thơm, hydrocarbon có clor

Độc tính cấp đường uống : LD50 chuột 1700 mg/kg Xếp loại độc tính cấp 2 theo

WHO

1.4.2.5 Methidathion

Công thức hóa học: C6H11N2O4PS3

Tên theo IUPAC: S-2,3-dihydro-5-methoxy-2-oxo-1,3,4-thiadiazol-3-ylmethyl

O,O-dimethyl phosphoodithioate hoặc

3-dimethoxyphosphinothioylthiomethyl-5-methoxy-1,3,4-thiadiazol-2(3H)-one

Methidathion tồn tại ở dạng tinh thể không màu Nóng chảy ở 40oC, hóa hơi ở 117o

C Tan trong nước (200 mg/l ở 25o

C) Ở 20oC, methidathion tan trong cồn (150 g/l), trong aceton (670 g/l), trong toluen (720 g/l)

Độc tính cấp đường uống : LD50 chuột 25-70 mg/kg, LD50 thỏ 63-80 mg/kg Xếp loại độc tính cấp 1b theo WHO

1.4.2.6 Phenthoat

Công thức hóa học: C12H17O4PS2

Tên theo IUPAC: S-α-ethoxycarbonylbenzyl O,O-dimethyl phosphoodithioate hoặc

Công thức hóa học: C11H15BrClO3PS

Trang 26

Tên theo IUPAC: (RS)-(O-4-bromo-2-chlorophenyl O-ethyl S-propyl

phosphoothioate)

Profenofos tồn tại ở dạng lỏng màu vàng, trong suốt có mùi tỏi, nóng chảy ở 17-18oC, tan trong nước (28 mg/l ở 25oC), tan tốt trong các dung môi hữu cơ như: aceton, hexan, toluen, dicloromethan

Độc tính cấp đường uống : LD50 chuột 358 mg/kg, LD50 thỏ 700 mg/kg Xếp loại độc tính cấp 2 theo WHO

1.5 Nhóm thuốc cúc tổng hợp

Các thuốc cúc tổng hợp (pyrethroid) được chia làm 2 nhóm [20], [40]

- Nhóm I (không có nhóm cyano): allethrin, bioallethrin, bifenthrin, permethrin, phenothrin, prallethrin, resmethrin, bioresmethrin, tefluthrin, tetramethrin

d Nhóm II (có nhóm cyano): hầu hết các thuốc nhóm cúc được lưu hành ở Việt Nam đều thuộc nhóm này Ví dụ: cyfluthrin, cyhalothrin, lambda-cyhalothrin, cypermethrin, alpha-cypermethrin, deltamethrin, fenpropathrin, fenvalerat, esfenvalerat, flucythrinat, flumethrin, tau-fluvalinat

1.5.1 Các phương pháp phân tích dư lượng nhóm cúc tổng hợp

Giống như các thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ, nhóm cúc tổng hợp thường được phân tích bằng phương pháp sắc ký khí với đầu dò MS hay đầu dò có tính chọn lọc và độ nhạy cao ECD

- Các tác giả Alvin Chai Lian Knee & Lau Seng với nghiên cứu “Phát hiện thuốc

trừ sâu nhóm cúc tổng hợp trong rau bằng chiết pha rắn và sắc ký khí”[9] Các thuốc

trừ sâu được được phân tích trong phương pháp này gồm có cypermethrin, permethrin, fenvalerat, deltamethrin, lambda–cyhalothrin Dư lượng thuốc trừ sâu được chiết bằng

100 ml aceton, 75 ml dicloromethan và 15 g natri clorid trong vòng 3 phút với sự trợ giúp của máy đồng hóa mẫu Dịch chiết được lọc qua giấy lọc có chứa 3 g natri sulfat khan, cô quay còn 2 ml, cho lên cột chiết pha rắn chứa 10 g silicagel và được rửa giải với 80 ml hỗn hợp methylen clorid – hexan (1:1) Dịch rửa giải được cô quay đến cắn, cắn sau đó được hòa tan lại với một lượng dung môi chính xác và được phân tích trên

GC – ECD Hiệu suất thu hồi của phương pháp từ 67,3% – 114,7 % Điều kiện sắc ký: Cột mao quản Hewlett-Packard 6890 với đầu dò ECD Nhiệt độ buồng tiêm: 260oC Lưu lượng khí N2: 3 ml/phút Lò cột: chương trình nhiệt: 1200C (0,5 phút), tăng l0- 0

C/phút đến 1800C, tăng 60C/phút đến 2400C, tăng l00C/phút đến 2800C (12 phút) Nhiệt độ đầu dò: 280oC

- Các tác giả Anna Sannino, Mirella Bandini, và Luciana Bolzon với nghiên cứu

“Phát hiện thuốc trừ sâu nhóm cúc tổng hợp trong rau và trái cây bằng sắc ký khí với

Trang 27

đầu dò ECD và MS”[12] Các thuốc trừ sâu được được phân tích trong phương pháp

này gồm có cypermethrin, fluvalinat, permethrin, alpha-cypermethrin, cyfluthrin, fenvalerat, deltamethrin, lambda–cyhalothrin, cyhalothrin, tefluthrin, bifenthrin, fenpropathrin, flucythrinat Dư lượng thuốc trừ sâu được chiết bằng aceton với sự trợ giúp của máy siêu âm Hút chính xác 40 ml dịch chiết, thêm vào 7 g NaCl, trộn trong

2 phút với máy siêu âm Ultra-Turrax Sau đó thêm chính xác 20 ml hỗn hợp ethyl acetat – cyclohexan (50:50) và tiếp tục siêu âm trong 1 phút Đồng nhất hỗn hợp và tiếp tục siêu âm trong 15 phút Hút lớp dịch chiết hữu cơ, cho qua bộ lọc bông thủy tinh có chứa 20 g natri sulfat đã được hoạt hóa với 15 ml ethyl acetat – cyclohexan (50:50), rửa lọc với 15 ml ethyl acetat – cyclohexan (50:50), hứng toàn bộ dịch rửa giải, thêm hỗn hợp dung môi ethyl acetat – cyclohexan (50:50) vừa đủ 100 ml, cô quay tới cắn ở nhiệt độ 300C, hòa cắn với 10 ml hexan, cho qua cột SPE Florisil đã

được hoạt hóa với 5 ml ethyl acetat – n-hexan (5:95) và 5 ml n-hexan, rửa giải với 5

ml ethyl acetat – n-hexan (5:95) và 5 ml n-hexan Dịch rửa giải được cô quay tới cắn

ở 300C, hòa cắn với 200 µl n-hexan rồi tiến hành phân tích trên GC – ECD hay MS Hiệu suất thu hồi của phương pháp từ 70% – 96 % Điều kiện sắc ký: Cột mao quản Hewlett-Packard 5890, chiều dài 30 m, đường kính trong 0,32 mm, bề dày lớp phim 0,25 µm Nhiệt độ buồng tiêm: 250oC Lưu lượng khí mang N2: 1,5 ml/phút Lò cột: chương trình nhiệt: 800

Tên theo IUPAC: hỗn hợp racemic gồm (R)-α-cyano-3-phenoxybenzyl (2,2-dichlorovinyl)-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylate and (S)-α-cyano-3-phenoxybenzyl (1R)-cis-3-(2,2-dichlorovinyl)-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylate

(1S)-cis-3-Nóng chảy ở 81,5oC, tan trong nước (0,004 mg/l ở 20oC), tan trong toluen (596 g/l), tan trong methanol (21,3 g/l), tan trong ethyl acetat (584 g/l)

Trang 28

ADI: 0 – 0,02 mg/kg Độc tính cấp đường uống: LD50 chuột 57 mg/kg Xếp loại độc tính cấp 2 theo WHO

1.5.2.2 Cyfluthrin [21]

Công thức hoa học: C22H18C12FNO3

Khối lượng phân tử: 434,288

Tên theo IUPAC: (RS)-α-cyano-4-fluoro-3-phenoxybenzyl (2,2-dichlorovinyl)-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylate

(1RS,3RS;1RS,3SR)-3-Cyfluthrin tồn tại ở dạng tinh thể không màu ở nhiệt độ phòng, dạng thương mại sệt màu vàng Tan trong nước (0,002 mg/ml ở 20oC), tan trong dicloromethan và toluen

(trên 200 g/l), tan trong hexan (10-20 g/l), tan trong propan-2-ol (10-50 g/l)

ADI: 0 – 0,02 mg/kg Độc tính cấp đường uống: LD50 chuột 16 mg/kg, LD50 thỏ 250 mg/kg Xếp loại độc tính cấp 2 theo WHO

1.5.2.3 Deltamethrin [41]

Công thức hoa học: C22H19Br2NO3

Khối lượng phân tử: 505.2

Tên theo IUPAC: (S)- α-cyano-3-pehoxybenzyl(1R)-cis-3-(2,2- dimethylcyclopropane carboxylate

dibromovinyl)-2,2-Deltamethrin tồn tại ở dạng tinh thể không màu, không mùi, rất bền vững, không bị phân hủy ở 400C trong 2 năm Nóng chảy ở 98 - 101oC, hóa hơi ở 25°C và áp suất 1,9996 x 10-9 kPa (1,5 x 10-8 mmHg) Tan trong nước (2 μg/l ở 20oC), tan trong

aceton, ethanol, dioxan

Độc tính cấp đường uống: LD50 chuột 30–140 mg/kg Xếp loại độc tính cấp 2 theo WHO

1.5.2.4 Fenvalerat [42]

Công thức hoa học: C25H22C1NO3

Trang 29

Tên theo IUPAC: (RS)-alpha-cyano-3-phenoxybenzyl methylbutyrate

(RS)-2-(4-chlorophenyl)-3-Fenvalerat tồn tại ở dạng chất lỏng sệt màu vàng nâu, có thể một phần kết tinh ở nhiệt

độ thường và có mùi đặc biệt Điểm sôi 300oC (37 mmHg), hóa hơi ở 25o

C và áp suất 0,037 mPa Tan trong nước (2 μg/l), tan trong aceton, cloroform, cyclohexanon, ethanol, methanol, xylen (> 500 g/l) và hexan (134 g/l)

Độc tính cấp đường uống: LD50 có giá trị khác nhau từ 82 đến trên 3000 mg/kg, có độc tính cao với cá và ong mật Xếp loại độc tính cấp 2 theo WHO

1.5.2.5 Lambda-cyhalothrin [41]

Công thức hoa học: C23H19ClF3NO3

Tên theo IUPAC: sản phẩm phản ứng bao gồm số lượng bằng nhau của 3-phenoxybenzyl(1S,3S)-3-[(Z)-2-chloro-3,3,3-trifluoropropenyl]-2,2-

(R)-α-cyano-dimethylcyclopropanecarboxylate và (S)-α-cyano-3-phenoxybenzyl chloro-3,3,3-trifluoropropenyl]-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylate hoặc của

(1R,3R)-3-[(Z)-2-(R)-α-cyano-3-phenoxybenzyl dimethylcyclopropanecarboxylate và (S)-α-cyano-3-phenoxybenzyl (1R)-cis-3-[(Z)-2-chloro-3,3,3-trifluoropropenyl]-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylate

(1S)-cis-3-[(Z)-2-chloro-3,3,3-trifluoropropenyl]-2,2-Lambda–cyhalothrin tồn tại ở dạng rắn màu be, mùi thơm nhẹ, tan trong nước (0,005 mg/l ở 200C), tan trong aceton, methanol, toluen, hexan Nhiệt độ nóng chảy 49,2oC; nhiệt độ hóa hơi 2300C

Độc tính cấp đường uống: LD50 chuột 20mg/kg Xếp loại độc tính cấp 2 theo WHO

1.6 Nhóm thuốc clor hữu cơ [7]

Hiện nay bị cấm sử dụng trong nông nghiệp Các thuốc trong nhóm này là DDT, dicofol, dieldrin,

Trang 30

Các thuốc trừ sâu nhóm clor hữu cơ là những chất độc với tế bào thần kinh Các chất này liên kết với các chất thành phần của màng sợi trục thần kinh (là protein và lipid),

cản trở sự vận chuyển của ion (chủ yếu là Na+ và K+) qua màng, làm mất điện thế tạo nên sự dẫn truyền xung động thần kinh, dẫn đến thần kinh bị tê liệt, sâu chết

Các thuốc trừ sâu clor hữu cơ còn ức chế hoạt tính của men adenosin triphosphatase

và một số men khác, làm các tế bào thần kinh bị nhiễm độc Thuốc còn ức chế phân chia tế bào ở trung kỳ, dẫn đến hiện tượng đa bội thể, làm xuất hiện những tế bào nhiều nhân không đồng nhất Côn trùng bị nhiễm độc thần kinh, lúc đầu có biểu hiện kích động, sau đó co giật do kích động mạnh lên và cuối cùng là tê liệt rồi chết

1.7 Tiêu chuẩn rau an toàn

1.7.1 Khái niệm rau an toàn

Thuật ngữ “Rau an toàn” đã được phổ biến trên các phương tiện truyền thông đại chúng Chính phủ cũng đã có văn bản qui định về quản lý sản xuất và kinh doanh rau

an toàn Theo Quyết định 99/2008/QĐ-BNN ban hành ngày 15 tháng 10 năm 2008

qui định về quản lý sản xuất, kinh doanh rau, quả và chè an toàn với các tiêu chí dư lượng, độc chất trong rau, quả bao gồm:

- Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật tối đa cho phép

- Dư lượng nitrat cho phép

- Tồn dư kim loại nặng

- Hàm lượng vi sinh vật cho phép

1.7.2 Dư lượng tối đa cho phép (MRLs) của một số thuốc trừ sâu

Mức dư lượng cho phép của các thuốc trừ sâu (trên đối tượng là rau ăn lá) đã được qui định rõ theo quyết định 46/2007/QĐ-BYT của Bộ y tế ngày 19 tháng 12 năm 2007 [4] Một số thuốc trừ sâu không có quy định trên rau sẽ được dựa theo theo tiêu chuẩn của

Đài loan (Taiwan Agricultural Chemicals and Toxic Substances Research Institute

"Guide to Pesticdes Tolerances on Crops in Taiwan" March 1997) [35] Tiêu chuẩn

này đang được áp dụng tại Chi cục BVTV TPHCM và Trung tâm Kiểm định và khảo nghiệm thuốc BVTV phía Nam

Bảng 1.1: Mức dư lượng cho phép của một số thuốc trừ sâu trên rau ăn lá

Thuốc trừ

sâu

MRLs của

Bộ Y tế (mg/kg)

MRLs của Đài Loan (mg/kg)

Thuốc trừ sâu MRLs của

Bộ Y tế (mg/kg)

MRLs của Đài Loan (mg/kg)

Trang 31

Các carbamat sau khi ra khỏi cột sắc ký, sẽ hòa tiếp vào dung dịch NaOH loãng, thực hiện phản ứng phân hủy sinh ra methylamin Methylamin phản ứng với OPA và cơ chất phát huỳnh quang tạo ra chất có khả năng phát huỳnh quang và được phát hiện bởi đầu dò huỳnh quang

Theo phương pháp EPA 531.1 của Cơ quan quản lý môi trường Hoa Kỳ, nồng độ dung dịch NaOH thích hợp để thực hiện phản ứng phân hủy carbamat khoảng 0,05 mol, nồng độ dung dịch OPA vào khoảng 1 milimol Tốc độ dòng dung dịch NaOH

và OPA từ 0,1-1,0 ml/phút Cơ chất thực hiện phản ứng phát huỳnh quang là mercapto ethanol Nhiệt độ buồng phản ứng khoảng 1000C [37]

2-1.9 Hệ thống sắc ký khí với đầu dò ion hóa ngọn lửa phosphor – nitrogen (NPD)

và đầu dò cộng kết điện tử (ECD)

Trong phân tích thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ bằng sắc ký khí, đầu dò ion hóa ngọn lửa phosphor – nitrogen (NPD) được sử dụng rất phổ biến cho độ nhạy và độ chọn lọc cao Đầu dò NPD phát hiện chọn lọc các hợp chất hữu cơ có nitrogen hoặc (và) phosphor Cấu tạo đầu dò NPD tương tự như đầu dò ion hóa ngọn lửa (FID), điểm khác biệt giữa 2 đầu dò này là đầu dò NPD có thêm một viên muối kiềm (thường là rubidi hoặc cesium) được nối vào điện cực âm Chất phân tích sau khi được rửa giải ra khỏi cột được trộn lẫn với khí hydro và được đốt cháy trong môi trường plasma được tạo ra bởi hỗn hợp hydro và không khí Viên muối kiềm Rb được nung nóng đến

800oC nhờ dòng điện để tạo ra các nguyên tử trơ Rb* Hợp chất hữu cơ có nối C – N

bị phân hủy bởi nhiệt cho ra gốc tự do CN. , phản ứng xảy ra tiếp theo là [34]:

Trang 32

Điện tử sinh ra được hút về điện cực tạo ra dòng điện

Trường hợp hợp chất có P, PO2. được tạo ra trong ngọn lửa và phản ứng với Rb* cho

ra PO2- :

PO2. + Rb* PO2- + Rb+

Rb+ bị hút về viên muối Rb và anion sinh ra phản ứng với OH

PO2- + OH HPO3 + e- Cũng như trên điện tử sinh ra được hút về điện cực tạo ra dòng điện

Trong trường hợp không có hợp chất chứa N, P thì Rb* cũng phản ứng với H.

Trang 33

2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Chất chuẩn, nguyên liệu, hóa chất, dung môi, trang thiết bị

Chất chuẩn

Hàm lượng (kl/kl) Chất chuẩn

Hàm lượng (kl/kl) Nhóm carbamat Nhóm lân hữu cơ Nhóm cúc tổng hợp

Methomyl 99,5% Clorpyrifos 99,5% Alpha-cypermethrin 99,5%

Isoprocarb 98,0% Phenthoat 96,6% Lambda-cyhalothrin 99,0% Fenobucarb 92,0% Profenofos 90,0% Nhóm clor hữu cơ

Fenitrothion 97,5% Dicofol 100 µg/ml

2.1.2 Nguyên liệu, hóa chất, dung môi, trang thiết bị

2.1.2.1 Nguyên liệu

Rau muống thủy canh do Chi cục BVTV TPHCM cung cấp Cây được trồng trong

nhà lưới tại Trạm kiểm dịch thực vật nội địa, xã Phạm Văn Hai, huyện Bình Chánh

Đặc điểm của cây là có thể trồng quanh năm, tốt nhất tháng 3 đến tháng 7 và thu

hoạch liên tục từ tháng 4 đến tháng 9 Thời gian bắt đầu thu hoạch 20-30 ngày sau khi

trồng Có thể thu hoạch trong nhiều đợt

Trồng thủy canh: Là kỹ thuật trồng cây không dùng đất mà trồng trực tiếp vào dung

dịch dinh dưỡng hoặc các giá thể mà không phải là đất Các giá thể có thể là cát, trấu,

vỏ xơ dừa, bột dừa, than bùn, tro trấu Kỹ thuật trồng thủy canh có ưu điểm là cho

năng suất cao, sản phẩm hoàn toàn sạch, phẩm chất tốt Tuy nhiên, giá thành còn cao,

chỉ áp dụng trên rau quả, hoa ngắn ngày

Dịch hại chính của cây rau muống chủ yếu là sâu khoang ăn lá và châu chấu Nếu

trồng trong nhà lưới thì có thể phòng được châu chấu

Hình 2.1: Rau muống được trồng thủy canh trong nhà lưới

Trang 34

Bảng 2.2: Các loại thuốc trừ sâu dùng trong nghiên cứu

Thời gian cách ly (ngày)

Liều sử dụng (kg hoạt chất/ha)

Nhà sản xuất/Nhà đăng ký

300 g/1000 ml

1878/07 SRN 2 năm 7 0,0015

Công ty TNHH Arysta LifeScience Việt Nam

Nhóm cúc tổng hợp

Motox 2.5EC  -Cypermethrin

5% (kl/tt) 992010 2 năm 7 0,060 Công ty CP SX TM

DV Ngọc Tùng Decis Repel

2.5 EC

Deltamethrin 25g/l BTL0100DEC-08 2 năm 3 0,030 Công ty Bayer VN Fenbis 25EC Fenvalerat 3,5%

(kl/tt) SPC 9/2010

1,5

Công ty BVTV Sài Gòn

Karate 2.5EC  -Cyhalothrin

25g/l VN4040602 2 năm 3 0,030 Công ty TNHH

Syngenta Việt Nam 2.1.2.2 Hóa chất, dung môi

- Acetonitril, methanol đạt tiêu chuẩn dùng trong sắc ký lỏng (Merck, Đức)

- O-phthaldehyd, 2-mercapto ethanol, dinatri tetraborat decahydrat, natri sulfat khan,

natri clorid, natri hydroxyd, ethyl acetat, acetonitril, dicloromethan, toluen, aceton,

diethyl ether, n-hexan đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck, Đức)

2.1.2.3 Trang thiết bị

- Máy HPLC Alliance 2695, đầu dò PDA 2996 (Waters, Mỹ)

- Máy HPLC Shimadzu LC 20AD (Nhật), kết nối với bộ tạo dẫn xuất gồm 2 bơm

NaOH và OPA và buồng phản ứng sau cột Đầu dò huỳnh quang RL- 10X

- Cột sắc ký: Purospher - Star C8 (75×4,6 mm; 3µm) (Merck, Đức)

- Máy sắc ký khí Clarus 500, đầu dò NPD (Perkin Elmer, Mỹ)

- Cột mao quản OV-1: 100% dimethyl polysiloxan, chiều dài 30 m, đường kính

trong 0,25 mm, bề dày lớp phim 0,25 µm (Ohio Valley, Mỹ)

Trang 35

- Cột chiết pha rắn Florisil 12 ml và C18 12 ml (Strata, Mỹ), cột Envi-carb Super Clean 12 ml (Supelco, Mỹ)

- Một số thiết bị thí nghiệm khác như cân phân tích Sartorius (Đức), máy cô quay (Buchi, Thụy Sĩ), máy siêu âm (Elma, Đức), máy đồng hóa tốc độ cao IKA, máy xay mẫu chuyên dụng IKA, máy cô quay IKA (IKA, Đức),…

Hình 2.2: Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh

quang kết nối với bộ tạo dẫn xuất sau cột

là cơ sở để tạo mẫu giả định trong phòng thí nghiệm và xây dựng quy trình phân tích

dư lượng thuốc trừ sâu sau này Đồng thời danh mục này cũng là cơ sở để đối chiếu với danh mục thuốc BVTV được phép sử dụng, hạn chế sử dụng, cấm sử dụng ở Việt Nam theo Quyết định số 49/2008/QĐ-BNN của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn ban hành ngày 27 tháng 3 năm 2008 và theo Thông tư số 36/2011/TT-BNNPTNT của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn ban hành ngày 20 tháng 5 năm 2011

2.3 Thiết lập cách thức tạo mẫu giả định trong phòng thí nghiệm

Mục đích: Tạo ra mẫu rau nhiễm các thuốc trừ sâu theo từng nhóm thuốc ở mức dư lượng cho phép, phục vụ cho việc xây dựng quy trình chiết, xử lý loại tạp và phân tích mẫu

Trang 36

Cách tiến hành: Sử dụng rau muống thủy canh (không nhiễm thuốc trừ sâu), đồng nhất hóa bằng cách cắt và xay nhuyễn bằng cối xay Sau đó cho vào một lượng hỗn hợp các thuốc trừ sâu ở mức dư lượng của từng thuốc, trộn đều, để qua đêm cho bay hơi dung môi và thuốc ngấm vào trong rau hoàn toàn

2.4 Xây dựng quy trình xác định dư lượng thuốc trừ sâu nhóm carbamat thường

sử dụng trên rau bằng phương pháp HPLC với đầu dò huỳnh quang

Hiện nay, các điều kiện để phân tích thuốc trừ sâu nhóm carbamat trên GC vẫn còn rất hạn chế do nhóm thuốc này dễ bị phân hủy bởi nhiệt độ và đòi hỏi trang thiết bị kỹ thuật cao như đầu dò MS Thiết bị HPLC với đầu dò huỳnh quang hay UV-Vis hầu như đã được trang bị cho các phòng thí nghiệm tại các Chi cục BVTV các tỉnh phía Nam Do đó, phương pháp HPLC với đầu dò UV-Vis hoặc huỳnh quang là sự lựa chọn phù hợp cho việc nghiên cứu và xây dựng quy trình phân tích thuốc trừ sâu nhóm carbamat

2.4.1 Xác định điều kiện phân tích đồng thời các thuốc trừ sâu nhóm carbamat

Thăm dò một số hệ dung môi pha động với chương trình dung môi đẳng dòng hay gradient để tách hoàn toàn các thuốc trừ sâu carbamat khảo sát trong hỗn hợp chuẩn ở mức dư lượng cho phép Khảo sát trên 2 loại đầu dò PDA và huỳnh quang Đánh giá hai thông số sắc ký chính là độ phân giải và hệ số đối xứng

Điều kiện sắc ký tìm được cũng phải tách được hoàn toàn các thuốc trừ sâu carbamat trong dịch chiết từ mẫu giả định

2.4.2 Xây dựng quy trình chiết và làm sạch mẫu

Dựa theo một số tài liệu tham khảo, tiến hành chiết các mẫu rau với một số dung môi như methanol, ethyl acetat, acetonitril Loại tạp bằng cách cho qua cột SPE, sau đó rửa giải bằng các dung môi hay hỗn hợp các dung môi như nước, methanol, acetonitril, toluen, n-hexan [26],[30],[33]

Dịch chiết thu được sẽ được phân tích bằng HPLC với đầu dò PDA để đánh giá sơ bộ

về hiệu suất thu hồi cũng như khả năng loại tạp So sánh diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn để khảo sát hiệu suất thu hồi Từ đó định hướng được quy trình chiết và làm sạch mẫu thích hợp

Chiết mẫu rau theo quy trình được đề nghị ở trên Chọn các thông số cho bộ phản ứng sau cột, bước sóng kích thích cũng như phát xạ…Sau đó, phân tích mẫu trên thiết bị HPLC với đầu dò huỳnh quang Đánh giá hiệu suất thu hồi và ảnh hưởng của tạp chất lên quá trình phân tích

Theo BP 2007 (Appendix XI) và USP 30 (General test and assay- Article 561- General method for pesticide residue analysis), phương pháp chiết được chấp nhận với hiệu suất thu hồi từ 70% - 110% Hiệu suất thu hồi phải ổn định với RSD ≤ 11% [28]

2.4.3 Thẩm định quy trình

2.4.3.1 Xác định tính phù hợp của hệ thống

Trang 37

Chiết mẫu rau nhiễm hỗn hợp thuốc trừ sâu ở mức dư lượng cho phép theo quy trình, chuẩn bị một mẫu chuẩn có nồng độ tương đương Tiến hành sắc ký mỗi mẫu 6 lần Tính phù hợp của hệ thống được đánh giá trên thông số sắc ký: thời gian lưu (tR), diện tích pic (S), hệ số đối xứng (As) và độ phân giải (Rs)

Yêu cầu: quy trình phân tích đạt tính phù hợp của hệ thống khi độ phân giải Rs ≥ 1,5;

hệ số đối xứng nằm trong khoảng 0,8 – 1,5; RSD của thông số diện tích pic và thời gian lưu ≤ 2% [3], [25],[38]

2.4.3.3 Khoảng tuyến tính

Chuẩn bị 5 mẫu chuẩn ở 5 mức nồng độ khác nhau của mỗi loại thuốc trừ sâu, sao cho mức ở giữa là mức dư lượng cho phép Tiến hành sắc ký mỗi mẫu 2 lần, tính diện tích pic các chất Tính hệ số tương quan R và thiết lập phương trình hồi quy giữa diện tích pic và nồng độ

- Sử dụng trắc nghiệm t (t test, phân phối Student) để kiểm tra ý nghĩa của các hệ số

trong phương trình hồi quy

1 i i 2

i

B

N / XX

SS

N: cỡ mẫu

t0,05 = TINV (0,05; ) với  = N - 2

Biện luận:

Nếu t < t 0,05 (0,05; )  chấp nhận giả thuyết H0

Nếu t > t 0,05 (0,05; )  chấp nhận giả thuyết HA

- Sử dụng trắc nghiệm F (F test, phân phối Fischer) để đánh giá tính tương thích

của phương trình hồi quy

Giả thuyết:

H0 : Bj = 0 “Phương trình hồi quy không tương thích”

HA : Bj 0 “Phương trình hồi quy tương thích”

Trang 38

k R F

F 0,05 = FINV (0,05; 1; 2)

Với 1 = 1 ; 2= N – 2

Biện luận:

Nếu F < F 0,05  chấp nhận giả thuyết H0

Nếu F > F 0,05  chấp nhận giả thuyết HA

Yêu cầu: Hệ số tương quan R giữa nồng độ và diện tích pic phải lớn hơn 0,99 [32]

2.4.3.4 Độ đúng – độ chính xác

Chuẩn bị 18 mẫu rau nhiễm, trong đó 6 mẫu nhiễm ở nồng độ 80%, 6 mẫu nhiễm ở nồng độ 100% và 6 mẫu nhiễm ở nồng độ 120% so với mức dư lượng cho phép Chiết các mẫu theo quy trình, tiến hành sắc ký mỗi mẫu 1 lần Ở mỗi nồng độ, tính tỷ lệ phục hồi của mỗi chất và xác định RSD của tỷ lệ phục hồi

Yêu cầu: ở mỗi nồng độ, tỷ lệ phục hồi của tất cả các chất phải nằm trong khoảng 70% - 110% với giá trị RSD của tỷ lệ phục hồi không quá 18% [13]

2.4.3.5 Giới hạn định lượng (LOQ), giới hạn phát hiện (LOD)

Chuẩn bị mẫu rau nhiễm ở mức dư lượng cho phép Pha loãng mẫu 10 lần, 20 lần, 100 lần, …Tiến hành sắc ký các mẫu cho đến khi thu được tỉ số chiều cao pic trên chiều cao nhiễu đường nền (S/N) là 5 thì nồng độ tại đó là giới hạn định lượng và là 3 thì nồng độ tại đó là giới hạn phát hiện

2.5 Xây dựng quy trình xác định dư lượng thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ thường sử dụng trên rau bằng phương pháp GC với đầu dò NPD

Các thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ có tính chất hóa hơi ở nhiệt độ cao mà không bị phân hủy nên phương pháp phân tích bằng sắc ký khí được lựa chọn Đầu dò NPD được sử dụng do tính chọn lọc và độ nhạy cao đối với các thuốc trừ sâu nhóm lân hữu

cơ Phương pháp chuẩn nội được áp dụng để đảm bảo độ đúng và độ chính xác của quy trình Vì điều kiện phân tích chung áp dụng cho các thuốc trừ sâu nên một trong

số các chất sẽ làm chuẩn nội cho các chất còn lại

2.5.1 Xác định điều kiện phân tích đồng thời các thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ

Dựa vào các tài liệu phân tích thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ bằng sắc ký khí với đầu

dò NPD đã công bố [3],[14],[11],[19], tiến hành khảo sát một số điều kiện sắc ký như: thể tích tiêm mẫu, chế độ tiêm mẫu (chia dòng hoặc không chia dòng), nhiệt độ buồng tiêm, lưu lượng khí mang, chương trình nhiệt, nhiệt độ đầu dò NPD, lưu lượng khí hydro và không khí nén cho đầu dò NPD Đánh giá hai thông số sắc ký chính là độ phân giải và hệ số đối xứng Điều kiện sắc ký tìm được phải tách được hoàn toàn các thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ trong dịch chiết từ mẫu giả định

Trang 39

Dựa vào các tài liệu tham khảo [6],[16],[25],[31], quy trình chiết được xây dựng dựa trên các thử nghiệm với hai dung môi chiết là ACN và ethyl acetat Quá trình làm sạch mẫu được khảo sát trên cột SPE Envi-carb Super Clean với hai hệ dung môi rửa giải gồm acetonitril – toluen (3:1) và dicloromethan – ethyl acetat (7:3) Dịch rửa giải thu được sẽ được phân tích trên máy sắc ký khí với đầu dò NPD để đánh giá về hiệu suất thu hồi và khả năng loại tạp, từ đó chọn được quy trình chiết và làm sạch mẫu thích hợp

Yêu cầu về hiệu suất thu hồi và độ ổn định của quy trình chiết giống mục 2.4.2

Quy trình được kiểm tra tính phù hợp của hệ thống trên mẫu giả định với 6 lần tiêm mẫu liên tiếp và được thẩm định trên các chỉ tiêu như tính đặc hiệu, độ chính xác, độ đúng, tính tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) Yêu cầu khi thẩm định quy trình giống mục 2.4.3

2.6 Xây dựng quy trình xác định dư lượng thuốc trừ sâu nhóm cúc tổng hợp và clor hữu cơ thường sử dụng trên rau bằng phương pháp GC với đầu dò ECD

Các thuốc trừ sâu nhóm cúc tổng hợp và clor hữu cơ có tính chất hóa hơi ở nhiệt độ cao mà không bị phân hủy nên phương pháp phân tích bằng sắc ký khí được lựa chọn Đầu dò ECD được sử dụng do tính chọn lọc và độ nhạy cao đối với các hợp chất hữu

cơ có chứa halogen Phương pháp chuẩn nội được áp dụng để đảm bảo độ đúng và độ chính xác của quy trình Vì điều kiện phân tích chung áp dụng cho các thuốc trừ sâu

nên một trong số các chất sẽ làm chuẩn nội cho các chất còn lại

2.6.1 Xác định điều kiện phân tích đồng thời các thuốc trừ sâu nhóm cúc tổng hợp

và clor hữu cơ

Từ điều kiện phân tích đồng thời các thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ, tiến hành thay đổi chương trình nhiệt và sử dụng chế độ tiêm mẫu không chia dòng Đánh giá hai thông số sắc ký chính là độ phân giải và hệ số đối xứng Điều kiện sắc ký tìm được phải tách được hoàn toàn các thuốc trừ sâu trong dịch chiết từ mẫu giả định

Dựa vào các tài liệu tham khảo [9],[12],[6],[16],[25], quy trình chiết thuốc trừ sâu nhóm cúc tổng hợp và clor hữu cơ được xây dựng dựa trên các thử nghiệm với hai dung môi chiết là acetonitril và aceton Quá trình làm sạch mẫu được khảo sát trên cột SPE Envi-carb Super Clean với hệ dung môi rửa giải là acetonitril – toluen (3:1) và cột Florisil với hệ dung môi rửa giải là n-hexan – diethyl ether (5:1) Dịch rửa giải thu được sẽ được phân tích trên máy sắc ký khí với đầu dò ECD để đánh giá về hiệu suất thu hồi và khả năng loại tạp, từ đó chọn được quy trình chiết và làm sạch mẫu thích hợp

Yêu cầu về hiệu suất thu hồi và độ ổn định của quy trình chiết giống mục 2.4.2

Trang 40

Quy trình được kiểm tra tính phù hợp của hệ thống trên mẫu giả định với 6 lần tiêm mẫu liên tiếp và được thẩm định trên các chỉ tiêu như tính đặc hiệu, độ chính xác, độ đúng, tính tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) Yêu cầu khi thẩm định quy trình giống mục 2.4.3

2.7 Ứng dụng các quy trình xác định dư lượng thuốc trừ sâu nhóm carbamat, lân hữu cơ, cúc tổng hợp thường phun trên rau - So sánh kết quả phân tích với các phòng thí nghiệm đạt ISO/IEC 17025 tại TPHCM

Mỗi loại thuốc trừ sâu sẽ được bố trí một nghiệm thức rau để phun thuốc Mỗi một nghiệm thức là một luống rau muống thủy canh, diện tích 1 m2, cách nhau 0,5 m Luống rau để bố trí nghiệm thức là rau muống đã được trồng 20 ngày tại Trạm kiểm dịch thực vật nội địa, ấp 4, xã Phạm Văn Hai, huyện Bình Chánh, TPHCM Các mẫu rau được lấy từ mỗi nghiệm thức trong khoảng thời gian 2 – 3 ngày sau khi phun thuốc Mỗi mẫu lấy ít nhất 5 cây tại 5 điểm trên đường chéo và 4 góc, trộn lại với nhau [1] Các mẫu sẽ được phân tích tại Chi cục BVTV TPHCM và đồng thời được gửi đến các phòng thí nghiệm đạt ISO/IEC 17025 tại TPHCM với mục đích để kiểm tra xem có phát hiện dư lượng các thuốc trừ sâu trong rau sau khi phun hay không Các nơi gởi mẫu là Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm Hoàn Vũ, Trung tâm Kiểm định thuốc và khảo nghiệm thuốc BVTV phía Nam, Trung tâm Kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường 3 Mỗi mẫu sẽ được phân tích 4 lần

Ngoài ra, các quy trình cũng được ứng dụng để xác đ ịnh dư lươ ̣ng thu ốc trừ sâu thường sử dụng trên các mẫu rau quả tại các chợ đầu mối trên địa bàn TPHCM (Thủ Đức, Bình Điền, Hóc Môn, )

Tiêu đề	Xây dựng và ứng dụng các quy trình xác định dư lượng thuốc trừ sâu thuộc các nhóm clo hữu cơ, lân hữu cơ, cúc tổng hợp và carbamat thường sử dụng trên rau bằng phương pháp hplc và gc
Tác giả	ThS. Nguyễn Văn Đức Tiến
Người hướng dẫn	PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn
Trường học	Thành phố Hồ Chí Minh
Thể loại	Báo cáo
Năm xuất bản	2011
Thành phố	Thành phố Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	155
Dung lượng	3,69 MB