THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI
Đề tài nghiên cứu "Xây dựng quy trình phát hiện Cucumber mosaic virus, Tomato mosaic virus, Potato virus X và Potato virus Y bằng kỹ thuật RT-PCR" nhằm phục vụ công tác tầm soát bệnh virus trên dưa leo, cà chua và khoai tây (Mã số: TV02/14-15) Nghiên cứu này sẽ giúp cải thiện khả năng phát hiện và quản lý các loại virus gây hại cho cây trồng, từ đó nâng cao năng suất và chất lượng nông sản Việc áp dụng kỹ thuật RT-PCR hứa hẹn mang lại hiệu quả cao trong việc phát hiện sớm và chính xác các virus này.
2 Cơ quan quản lý: Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM
3 Đơn vị chủ trì: Phòng Công nghệ Sinh học Thực vật
4 Cơ quan phối hợp chính: (nếu có)
5 Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Xuân Dũng
6 Cán bộ/Nhóm thực hiện: KS Nguyễn Thị Hồng Trâm, ThS Phạm Văn Hiểu, ThS Nguyễn Xuân Dũng
7 Thời gian thực hiện: 24 tháng (Từ 01/2014 đến 12/2015)
8 Kinh phí được duyệt: 250.000.000 VNĐ
9 Kinh phí đã sử dụng: 250.000.000 VNĐ
10 Mục tiêu của đề tài:
Quy trình phát hiện virus Cucumber mosaic virus, Tomato mosaic virus, Potato virus X và Potato virus Y đã được xây dựng nhằm phục vụ công tác tầm soát bệnh virus trên các cây trồng như dưa leo, cà chua và khoai tây.
- Thu thập nguồn mẫu thực vật nhiễm virus
- Ly trích RNA virus từ mẫu nhiễm bệnh
- Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho việc phát hiện virus
- Khuếch đại đoạn gen virus bằng phản ứng RT-PCR
- Xác định được trình tự của đoạn gen sau khuếch đại
11 Các nội dung nghiên cứu đã thực hiện được so với đề cương đăng ký
STT Nội dung đăng ký Thời gian (bắt đầu – kết thúc) Kết quả thực hiện Đánh giá Các nội dung đã thực hiện theo đề cương đăng kí
1 Thu thập nguồn mẫu nhiễm bệnh virus
Thu được các mẫu có biểu hiện triệu chứng nhiễm virus Đạt
Thiết kế mồi đặc hiệu cho việc phát hiện virus
Mỗi loại virus có 2 cặp mồi đặc hiệu Đạt
Ly trích RNA virus từ các mẫu lá, mẫu củ nhiễm bệnh
Thu nhận RNA virus từ mẫu bệnh bằng quy trình ly trích hoàn chỉnh Đạt
RT-PCR khuếch đại gen virus
Xác định cặp mồi và nhiệt độ bắt cặp mồi thích hợp cho từng loại virus Đạt
Dòng hóa và kiểm tra trình tự gen sau khi khuếch đại
Dòng hóa và xác định được trình tự gen của 4 loại virus Đạt
Tối ưu hóa phản ứng
RT-PCR phát hiện virus
Tối ưu hóa các thành phần phản ứng RT- PCR Đạt
Thực hiện phản ứng multiplex phát hiện đồng thời 2, 3 hay 4 loại virus trong cùng một 1 phản ứng Đạt
Xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng
PCR thường và multiplex PCR Đạt
Các nội dung thực hiện thêm ngoài những nội dung đã đăng kí
Real-time RT-PCR định lượng xác định nhiệt độ nóng chảy đặc trưng sản phẩm khuếch đại 4 loại virus
Thực hiện Real-time RT-PCR định lượng xác định nhiệt độ nóng chảy đặc trưng sản phẩm khuếch đại 4 loại virus PVX, PVY, ToMV và CMV
8 Xây dựng đường chuẩn 2016 Đã xây dựng đường chuẩn cho 2 loại virus PVY và ToMV Tiếp tục xây dựng cho 2 loại còn lại
9 Định lượng số bản sao virus 2016
Xác định số bản sao virus dựa trên đường chuẩn
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
- Cây khoai tây in vitro nhiễm virus PVX do Học viện Nông nghiệp Việt Nam cung cấp
- Củ khoai tây nghi nhiễm virus PVY thu thập tại chợ rau củ
- Mẫu lá dưa leo, cà chua nghi nhiễm lần lượt các loại virus CuMV, ToMV được thu thập tại các vườn và đồng ruộng
- Hóa chất dùng ly trích RNA, các hóa chất dùng PCR, vector pJET1.2, chủng vi khuẩn
E.coli phục vụ việc tách dòng gen, hóa chất dùng trong điện di DNA, mồi phát hiện virus và các thiết bị: máy PCR Gradient nhiệt độ (Thermo scientific) (khuếch đại đoạn gen),
Trang 22 máy ly tâm (ly trích RNA virus), bồn điện di (điện di sản phẩm sau khuếch đại), bồn ủ nhiệt, máy đọc gel (phân tích, chụp ảnh kết quả sau điện di), micropipett (hút các loại hóa chất) được cung cấp bởi phòng Công nghệ Sinh học Thực vật, Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh.
Phương pháp nghiên cứu
IV.2.1 Thu thập nguồn mẫu nhiễm virus
Dựa trên các triệu chứng đặc trưng của bệnh do virus Cucumber mosaic, Tomato mosaic và Potatovirus X(Y) gây ra trên dưa leo, cà chua và khoai tây, chúng tôi tiến hành thu thập mẫu nhiễm virus (bao gồm lá, trái, củ) tại các địa điểm trong Thành phố.
Hồ Chí Minh, Bình Dương, Tây Ninh, Long An và Lâm Đồng đã tiếp nhận 50 mẫu virus khác nhau Bên cạnh đó, mẫu khoai tây invitro nhiễm PVX cũng được sử dụng làm đối chứng dương.
Các mẫu sau khi thu thập sẽ được rửa sạch và bảo quản ở nhiệt độ -80 độ C để phục vụ cho việc ly trích RNA virus Ngoài ra, một số mẫu không có triệu chứng virus rõ ràng cũng được thu thập nhằm chứng minh hiệu quả vượt trội của phương pháp RT-PCR so với các phương pháp phát hiện khác.
IV.2.2 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho việc phát hiện virus
Tìm hiểu trình tự bộ gen của bốn loại virus CMV, ToMV, PVX và PVY trên ngân hàng gen NCBI Thu thập và so sánh các trình tự gen bằng phần mềm Clustal w2 để xác định các vùng gen có trình tự tương đồng Dựa trên các trình tự đã chọn, thiết kế cặp mồi đặc hiệu để phát hiện virus bằng phần mềm Primer 3 Cuối cùng, kiểm tra khả năng tự bắp cặp và tạo vòng của cặp mồi thông qua phần mềm Anhyb, với các tiêu chí lựa chọn cụ thể.
- Có chiều dài từ 18 -28 nucleotid
- Trình tự ở đầu 3’ có các base liên kết mạnh (C hoặc G) nhưng không quá 3
- Chỉ chọn các mồi không có khả năng tự bắt cặp và tạo vòng hay có nhưng ở mức độ thấp
Mỗi loại virus sẽ thiết kế 2 cặp mồi khác nhau, và tổng số mồi cần thiết kế là 8 cặp mồi
IV.2.3 Ly trích virus (RNA virus) từ mẫu nhiễm bệnh
Từ các mẫu lá và mẫu củ nhiễm virus, sử dụng 25-50 mg mẫu để ly trích RNA virus Tiến hành hành ly trích theo hai cách:
1/ Ly trích dùng bộ kit EZ-10 Spin Column Plant RNA Minipreps (Biobasic, Canada), các bước thực hiện theo hướng dẫn (phụ lục 1)
2/ Ly trích theo phương pháp Sucrose (Bendenzen và cs, 2005), tiến hành như sau: Mẫu lá được nghiền với dung dịch sucrose; đun nóng ở nhiệt độ 100 o C trong 15 phút; sau đó làm lạnh nhanh trên đá trong vòng 5 phút; sau cùng ly tâm ở 13.000 vòng/phút để loại bỏ cặn, thu phần dịch trích (có chứa RNA virus)
Sản phẩm thu được sau khi ly trích sẽ được lưu trữ ở nhiệt độ - 80 o C để sử dụng cho phản ứng RT-PCR
IV.2.4 Thực hiện phản ứng RT-PCR khuếch đại đoạn gen virus
Sử dụng các cặp mồi thiết kế để thực hiện phản ứng RT-PCR nhằm khuếch đại đoạn gen virus Từ hai cặp mồi cho mỗi loại virus, tiến hành phản ứng RT-PCR để chọn cặp mồi phù hợp Tiếp theo, thực hiện phản ứng RT-PCR ở các nhiệt độ bắt cặp khác nhau (từ 6 đến 10 điểm nhiệt độ) bằng chương trình gradient nhiệt với từng cặp mồi đã chọn Qua đó, xác định nhiệt độ tối ưu cho sản phẩm đặc hiệu Phản ứng RT-PCR sử dụng bộ mastermix MyTaq One-Step RT-PCR kit (Bioline, Anh), với các thành phần được liệt kê trong bảng 1.
Bảng 1 Các thành phần phản ứng RT-PCR
TT Hóa chất Thể tích phản ứng
Quá trình phản ứng diễn ra qua 4 chu kỳ, bắt đầu với chu kỳ đầu tiên là tổng hợp cDNA, tiếp theo là các chu kỳ khuyếch đại cDNA đã tổng hợp hoặc DNA có trong mẫu.
Bảng 2 Chu kỳ nhiệt của phản ứng RT-PCR
Chu kỳ 1 Chu kỳ 2 Chu kỳ 3
(lặp lại 35 lần) Chu kỳ 4
Kết quả phản ứng được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,5% với điện áp 100 volt trong 30 phút Sau khi điện di, gel được nhuộm với Ethidium bromide để quan sát sự hiện diện của các băng DNA, sử dụng máy đọc gel Geldoc.
Các mẫu có kết quả dương tính trong phản ứng RT-PCR sẽ được tiếp tục dòng hóa và giải trình tự để xác nhận chính xác đoạn gen của virus đã được khuếch đại.
IV.2.5 Dòng hóa và ki ểm tra trình tự của đoạn gen sau khi khuếch đại
IV.2.5.1 Gắn đoạn gen mục tiêu vào vector nhân dòng
Trước khi gắn gen mục tiêu vào vector pJET1.2/blunt, cần tạo sản phẩm đầu bằng từ quá trình khuếch đại RT-PCR Đoạn gen sau đó được gắn vào vector bằng bộ kit CloneJET T M PCR Cloning Kit (Fermentas) Phản ứng gắn diễn ra trong tổng thể tích 20 µl, bao gồm 10 µl 2X Reaction Buffer, 2 µl sản phẩm PCR, 1 µl vector pJET1.2/blunt (50 ng/µl), 19 µl nước nuclease free và 1 µl T4 DNA Ligase Sau khi thêm đủ các thành phần, tiến hành vortex nhanh, ly tâm trong 3-5 giây, và ủ ở nhiệt độ phòng (22°C) trong 15 phút.
IV.2.5.2 Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E coli bằng phương pháp sốc nhiệt
Sau khi gắn gen mục tiêu vào vector pJET1.2/blunt, plasmid được sử dụng để biến nạp vào chủng vi khuẩn E.coli DH5α Quy trình biến nạp này được thực hiện nhằm tạo ra các dòng vi khuẩn mang gen mục tiêu.
Trang 25 bằng cỏch cho 5 àl plasmid vào ống tế bào khả biến (50 - 100 àl), ủ trong đỏ lạnh 30 phút; tiếp theo tiến hành xử lý sốc nhiệt ở 42 0 C trong 90 giây, sau đó ủ lại vào đá lạnh trong 1-2 phút Sau cùng, cho toàn bộ dung dịch chứa tế bào đã được biến nạp vào môi trường LB lỏng (250 àl) và nuụi ở 37 0 C trong 2 giờ
IV.2.5.3 Sàng lọc dòng tế bào có mang plasmid tái tổ hợp
Sau khi nuôi cấy tế bào trong môi trường LB lỏng, các tế bào được dựng 100 µl lên đĩa petri có chứa môi trường LB bổ sung 50 µg/ml ampicillin và nuôi cấy ở 37°C Các dòng tế bào vi khuẩn phát triển trong môi trường kháng sinh sẽ được sử dụng để kiểm tra đoạn gen nhân dòng.
IV.2.5.4 Chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp
Khuẩn lạc tế bào được phát triển trên môi trường kháng sinh đã được chọn lọc để thực hiện phản ứng PCR nhằm kiểm tra đoạn gen gắn vào plasmid Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi pJET1.2 của plasmid và được thực hiện theo thành phần và chu trình nhiệt đã được quy định.
Các dòng vi khuẩn mang gen mục tiêu được nuôi cấy để tăng sinh khối, phục vụ cho quá trình tách plasmid tiếp theo Đồng thời, các dòng chứa gen quan tâm cũng được bảo quản trong glycerol 25% ở nhiệt độ -80°C để sử dụng cho các thí nghiệm sau này.
IV.2.5.5 Tách plasmid từ tế bào vi khuẩn E.coli và giải trình tự
2.6.4.1 Thực hiện phản ứng
Phản ứng Real-time RT-PCR được thực hiện nhằm phát triển khả năng định lượng virus, thay thế cho phản ứng RT-PCR trong quy trình phát hiện virus.
The optimal bait pairs for the monoplex assays targeting PVY, ToMV, CMV, and PVX are utilized for quantitative Real-time RT-PCR reactions using the SensiFAST T M SYBR ® & Fluorescein One-Step Kit (Bioline) The reaction components are detailed in Table 3.
Bảng 3 Các thành phần phản ứng trong phản ứng Real-time RT-PCR
TT Hóa chất Thể tích phản ứng
Phản ứng RT-PCR được thực hiện theo quy trình tương tự như trong bảng 2, với sự bổ sung của quá trình phân tích melt-curve nhằm xác định nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm khuyếch đại, như trình bày trong bảng 4.
Bảng 4 Chu kỳ nhiệt của phản ứng Real-time RT-PCR
Chu kỳ 3 (lặp lại 35 lần) Chu kỳ 4
Chu kỳ 5 (lăp lại 81 lần)
55 0 C / 30 giây (nhiệt độ thay đổi 0,5 0 C/ chu kỳ)
Phản ứng được thực hiện trên máy Real-time PCR thay vì máy PCR thông thường, cho phép phân tích kết quả trực tiếp trên biểu đồ khuyếch đại dựa vào hiệu số.
Trang 28 tín hiệu huỳnh quang và biểu đồ phân tích melt-curve sản phẩm khuyếch đại, không cần qua bước điện di trên gel agarose
IV.2.6.4.2 Phân tích Melt curve
Phân tích Melt curve được thực hiện sau khi hoàn tất quá trình khuyếch đại, bằng cách gia nhiệt từ 55°C đến 95°C, với mỗi lần gia nhiệt tăng 0,5°C trong 30 giây Kết quả phản ứng được phân tích trực tiếp trên máy Real-time IQ T M 5 của Biorad.
IV.2.6.4.3 Xây dựng đường chuẩn
Plasmid từ các virus PVX, PVY, ToMV, CMV được khuếch đại trong E.coli thông qua phản ứng PCR monoplex hoặc multiplex Hàm lượng plasmid sau đó được xác định bằng máy Nanodrop, từ đó tính toán số bản sao trong 1 μl sản phẩm DNA plasmid được pha loãng theo hệ số bậc 10 từ số lượng ban đầu đến 10^0 bản sao/μl Đường chuẩn được xây dựng bằng cách thực hiện phản ứng với các mẫu chuẩn có nồng độ pha loãng từ 10^6 đến 10^0 bản sao/μl.
6 1 Kết quả tối ưu hóa các thành phần của phản ứng RT-PCR
Kết quả xác định ngưỡng phát hiện của phản ứng PCR thường, multiplex PCR
Phản ứng PCR được thực hiện trên 10 mẫu với nồng độ virus từ 10^10 đến 10^1 bản sao/µl, tương ứng với mức 10 triệu đến 10 bản sao/µl Kết quả cho thấy phản ứng có thể phát hiện được mẫu có nồng độ 10^2, tương ứng 100 bản sao/µl Kết quả này hoàn toàn phù hợp với công bố của Decai Tuo và cộng sự.
Hình 39 trình bày kết quả điện di sản phẩm khuếch đại nhằm kiểm tra ngưỡng phát hiện của phản ứng PCR trên mẫu DNA virus PVX tại các nồng độ khác nhau Kết quả cho thấy chứng âm ở nồng độ 1 và thang DNA 100 bp.
1000 bp), 3: mẫu plasmid ban đầu, 4-13: mẫu plasmid cú nồng độ từ 10 10 - 10 1 (ng/àl), theo thứ tự pha loãng bậc 10
Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại kiểm tra ngưỡng phát hiện của phản ứng PCR trên mẫu DNA virus CMV cho thấy các nồng độ khác nhau, với mẫu chứng âm ở vị trí 1 và thang DNA 100 bp ở vị trí 2.
1000 bp), 3-13: mẫu plasmid cú nồng độ từ 10 10 – 10 0 (ng/àl), theo thứ tự pha loóng bậc
Hình 41 hiển thị kết quả điện di sản phẩm khuếch đại nhằm kiểm tra ngưỡng phát hiện của phản ứng PCR trên mẫu DNA virus ToMV ở các nồng độ khác nhau Kết quả cho thấy chứng âm ở mẫu 1 và thang DNA với kích thước 100 bp.
1000 bp), 3-13: mẫu plasmid cú nồng độ từ 10 10 – 10 0 (ng/àl), theo thứ tự pha loóng bậc
Phản ứng multiplex PCR cho hai virus PVX và PVY đã được thực hiện trên 10 mẫu có nồng độ virus từ 10^10 đến 10^1 bản sao/µl, tương ứng với mức 10 triệu đến 10 bản sao/µl Kết quả cho thấy phương pháp này có khả năng phát hiện mẫu với nồng độ thấp nhất là 10^4, tương đương 10.000 bản sao/µl.
Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại từ phản ứng multiplex PCR (35 chu kỳ) cho thấy khả năng phát hiện DNA virus PVX và PVY ở các nồng độ khác nhau Mẫu chứng âm được sử dụng để đối chiếu, trong khi thang DNA và mẫu plasmid ban đầu cung cấp thông tin về nồng độ Các mẫu DNA plasmid có nồng độ từ 10^10 cho thấy sự hiện diện rõ ràng của virus, chứng minh hiệu quả của phương pháp PCR trong việc phát hiện virus.
- 10 1 (ng/àl), theo thứ tự pha loóng bậc 10
Theo kết quả trước đây, phản ứng multiplex RT-PCR có khả năng phát hiện ở mức 1000 bản sao/µl (Decai Tuo và cs, 2014) Tuy nhiên, trong trường hợp này, phản ứng chỉ phát hiện được ở mức 10000 bản sao/µl, thấp hơn so với dự kiến Để cải thiện ngưỡng phát hiện, số chu kỳ khuếch đại của phản ứng RT-PCR đã được nâng lên.
35 chu kì trong trường hợp nêu trên thành 39 chu kỳ
Kết quả phản ứng cho thấy sản phẩm khuếch đại tạo ra hai phân đoạn DNA, một ở vị trí giữa 300 bp và 400 bp, và một ở gần 500 bp Kích thước sản phẩm hoàn toàn phù hợp với dự kiến (332 bp cho virus PVX và 469 bp cho virus PVY) Sản phẩm khuếch đại xuất hiện ở tất cả các mẫu PVY, nhưng chỉ ở các mẫu có nồng độ từ 10^10 đến 10^3 bản sao/µl đối với PVX Sự hiện diện đồng thời của cả hai phân đoạn chỉ xảy ra ở nồng độ từ 10^10 đến 10^3 bản sao/µl, cho thấy phản ứng multiplex có thể đạt ngưỡng phát hiện 10^3 bản sao/µl (tương đương 1000 bản sao/µl) Khi thực hiện phản ứng triplex với ba cặp mồi trong cùng một phản ứng, ngưỡng phát hiện đạt 10^4 bản sao/µl.
Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại từ phản ứng multiplex PCR (39 chu kỳ) cho thấy khả năng phát hiện virus PVX và PVY ở các nồng độ khác nhau Mẫu chứng âm được sử dụng để xác định độ chính xác, trong khi thang DNA giúp định lượng Mẫu ban đầu và các mẫu DNA plasmid có nồng độ từ 10^10 cho thấy sự khác biệt rõ rệt trong khả năng phát hiện.
10 1 (ng/àl), theo thứ tự pha loóng bậc 10
Kết quả điện di sản phẩm từ phản ứng triplex PCR (39 chu kỳ) cho thấy khả năng phát hiện virus PVX, PVY và ToMV ở các nồng độ khác nhau Mẫu DNA được kiểm tra với các nồng độ từ 10^10 đến 10^0 (ng/µl), với chứng âm và thang DNA được sử dụng làm đối chứng Các mẫu DNA plasmid được pha loãng theo thứ tự bậc 10 từ 10^10 đến 10^0.
Kết quả phản ứng Real-time RT-PCR
Sản phẩm khuyếch đại được thể hiện qua đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang, cho thấy mẫu lá chứa virus và mẫu chứng dương đều có tín hiệu vượt trội so với nền Chu kỳ ngưỡng của các mẫu lần lượt là 21,49; 21,22; 22,45; 31,84 cho PVX, PVY, CMV và 15,13; 14,00; 15,63; 20,47 cho chứng dương.
Biểu đồ khuyếch đại tín hiệu huỳnh quang cho các virus PVX, PVY, CMV và ToMV được trình bày với trục y biểu thị tín hiệu và trục x thể hiện chu kỳ ngưỡng Trong đó, 1 là chứng dương (plasmid của mỗi loại virus), 2 là mẫu lá, và 3 là chứng âm song song với trục X.
V.6.4.2 Phân tích Melt curve (đi ểm nóng chảy)
Sản phẩm khuyếch đại có điểm nóng chảy (thể hiện bởi một đỉnh xuất hiện trên biểu đồ) ở 86,0 0 C cho PVX; 84,0 0 C cho PVY; 86,0 0 C cho CMV và 83,0 0 C cho ToMV.
Biểu đồ phân tích điểm nóng chảy của sản phẩm khuyếch đại cho các loại virus PVX, PVY, CMV và ToMV cho thấy đỉnh cao tương ứng với chứng dương (plasmid của mỗi loại virus), trong khi đỉnh thấp đại diện cho mẫu lá Đường song song với trục x thể hiện chứng âm.
Trong cả bốn trường hợp, nhiệt độ nóng chảy của chứng dương và mẫu đều tương đồng, điều này chứng tỏ rằng sản phẩm được khuyếch đại trong phản ứng chính là đoạn gen của các virus PVX, PVY, CMV và ToMV.
Các mẫu pha loãng từ 10^6 đến 10^2 bản sao/μl cho thấy số chu kỳ ngưỡng (Ct) tăng tuyến tính theo nồng độ pha loãng đối với PVY và ToMV Ngược lại, mẫu 10^0 và 10^1 bản sao/μl không cho kết quả tăng tuyến tính Do đó, đường chuẩn chỉ được xây dựng với nồng độ từ 10^6 đến 10^2 bản sao Hệ số tương quan R^2 lần lượt là 0,982 cho PVY và 0,990 cho ToMV Phương trình khuyếch đại được xác định là y = -3,587x + 17,019 cho PVY và y = -4,010x + 43,499 cho ToMV.
Hình 47 Đường chuẩn thể hiện mối liên hệ giữa chu kì ngưỡng (Ct) (trục y) và độ pha loãng mẫu theo bậc 10 (trục x) cho PVY (B) và ToMV (D).
