Xây dựng quy trình nhân giống thu sinh khối in vitro và bước đầu kiểm tra hàm lượng một số hoạt chất sinh học của cây sâm cau curculigo orchioides gaertn

THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI

Đề tài nghiên cứu "Xây dựng quy trình nhân giống, thu sinh khối in vitro và bước đầu kiểm tra hàm lượng một số hoạt chất sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn)" (Mã số: TV03/15-16) tập trung vào việc phát triển phương pháp nhân giống cây Sâm cau thông qua kỹ thuật in vitro Nghiên cứu này không chỉ nhằm thu được sinh khối mà còn tiến hành kiểm tra hàm lượng các hoạt chất sinh học quan trọng, góp phần nâng cao giá trị dược liệu của cây Sâm cau.

2 Cơ quan quản lý: Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp Hồ Chí Minh Địa chỉ: 2374 QL1, P Trung Mỹ Tây, Q 12, Tp Hồ Chí Minh Điện thoại: 028-37153792

Phòng CNSH Thực Vật thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp Hồ Chí Minh là đơn vị chủ trì, có địa chỉ tại 2374 QL1, P Trung Mỹ Tây, Q 12, Tp Hồ Chí Minh Để biết thêm thông tin, bạn có thể liên hệ qua số điện thoại 028-37157631.

4 Chủ nhiệm đề tài: KS Nguyễn Thị Thanh Thảo

5 Nhóm thực hiện: ThS Đinh Thị Sáu

6 Thời gian thực hiện: 24 tháng (từ 1/2015- 12/2016)

- Tổng kinh phí: 300 triệu VNĐ

- Kinh phí đã sử dụng: 300 triệu VNĐ

- Xây dựng quy trình nhân giống cây Sâm cau in vitro

- Ứng dụng hệ thống ngập chìm tạm thời nhân nhanh sinh khối cây Sâm cau

- Kiểm tra hàm lượng một số hoạt chất sinh học của cây Sâm cau in vitro so với cây ngoài tự nhiên

9 Các nội dung nghiên cứu đã thực hiện được so với đề cương đăng ký

STT Nội dung đăng ký Thời gian (bắt đầu – kết thúc) Kết quả thực hiện Đánh giá

- Đã sưu tập được 275 cây từ vườn dược liệu

An Giang và 360 cây từ Đăk Lăk Đạt

Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Sâm cau:

4/2015 - 6/2016 Đã xây dựng được quy trình nhân giống cây Sâm cau in vitro:

- Mẫu thân củ được khử Đạt

- Khảo sát môi trường tạo chồi và nhân nhanh chồi

- Khảo sát môi trường tạo rễ

- Khảo sát môi trường cảm ứng mô sẹo từ mô là in vitro

- Khảo sát môi trường tạo phôi sinh dưỡng trùng bằng phương pháp NaOCl 6% kết hợp với CuSO 4 5% hoặc HgCl 2 0,1% trong 13 phút

BA thích hợp tạo chồi từ mẫu thân củ cây Sâm cau; môi trường MS thích hợp cho tạo cụm chồi bằng phương pháp hủy đỉnh sinh trưởng

- Môi trường MS không bổ sung chất điều hòa thích hợp tạo rễ từ chồi

- Môi trường MS + 0.5 mg/l BA + 1.0 mg/l 2,4D thích hợp tạo mô sẹo

- Môi trường MS + 0.5 mg/l 2,4–D + 2.0 mg/l

BA thích hợp cho sự tạo phôi từ mô lá

3 Ứng dụng hệ thống ngập chìm tạm thời -

TIS trong việc tăng trưởng cây Sâm cau

- Môi trường MS + 2,0 mg/l BA thích hợp cho sự tăng trưởng cây Sâm cau từ phôi trên hệ thống ngập chìm tạm thời Đạt

Bước đầu khảo sát một số hợp chất thứ cấp trong các mẫu sinh khối in vitro

(Curculigoside, hàm lượng phenol tổng số, hàm lượng flavonoid tổng số)

9/2016 - 12/2016 Đã xác định được sự hiện diện của các hợp chất Curculigoside, hàm lượng phenol tổng và flavonoid tổng trong cây Sâm cau in vitro Đạt

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nội dung 1: Chọn lọc cây Sâm cau làm nguồn mẫu sử dụng trong nhân giống in vitro

Nội dung 2: Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Sâm cau

- Khử trùng mẫu cấy để tạo mẫu cấy vô trùng

- Khảo sát môi trường thích hợp cho sự tạo cụm chồi

- Khảo sát môi trường thích hợp cho sự tạo rễ

Nội dung 3: Khảo sát môi trường thích hợp cảm ứng tạo phôi sinh dưỡng từ mô lá

- Khảo sát môi trường thích hợp cho sự cảm ứng tạo phôi trực tiếp từ mô lá in vitro

- Khảo sát môi trường thích hợp cho cảm ứng mô sẹo từ mô lá in vitro

- Khảo sát môi trường thích hợp cho cảm ứng tạo phôi sinh dưỡng từ mô sẹo

Nội dung 4: Tăng trưởng cây Sâm cau từ cụm phôi bằng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời

Nội dung 5: Kiểm tra hàm lượng một số hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học trong sinh khối Sâm cau in vitro

VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu

- Cây Sâm cau (Curculigo orchiodes

Garetn) được trồng tại vườn ươm Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp Hồ Chí Minh

- Cây Sâm cau in vitro

Hình 5 Cây Sâm cau ngoài tự nhiên sử dụng làm vật liệu nghiên cứu

( a: lá, b: bẹ lá, c: thân rễ, d: rễ)

Phương pháp nghiên c ứu

5.2.1 Khử trùng thân rễ tạo nguồn mẫu nuôi cấy in vitro

Mẫu thân rễ của cây Sâm cau trưởng thành được chuẩn bị bằng cách loại bỏ lá và rễ, sau đó rửa sạch với xà phòng loãng Các đoạn mẫu dài 3 cm được lắc với dung dịch xà phòng trong 30 phút và tiếp tục khử trùng bằng hai phương pháp: xử lý với dung dịch NaOCl 6% trong 50 phút kết hợp với dung dịch CuSO4 ở các nồng độ 3, 4, 5, 6% trong 20 phút, hoặc xử lý với HgCl2 0,1% trong 10, 13 và 15 phút Sau khi loại bỏ các phần bị hoại tử, mẫu được cấy vào môi trường MS Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp, mỗi lần 15 mẫu, và được nuôi trong điều kiện nhiệt độ 25 ± 2°C, độ ẩm 55 ± 5%, cường độ ánh sáng 2.500 ± 500 lux.

12 giờ/ngày Quan sát và ghi nhận tỷ lệ mẫu sống vô trùng (%) sau 2 tuần nuôi cấy

5.2.2 Tăng trưởng chồi ngủ từ thân rễ

Các mẫu thân rễ vô trùng được cấy vào môi trường MS có bổ sung BA với các nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 và 4,0 mg/l Thí nghiệm được thiết kế theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiên, thực hiện lặp lại 3 lần, mỗi lần gồm 5 mẫu.

Trong nghiên cứu này, 22 mẫu được nuôi trong điều kiện nhiệt độ 25 ± 2 o C, độ ẩm 55 ± 5%, cường độ ánh sáng 2.500 ± 500 lux và thời gian chiếu sáng 12 giờ mỗi ngày Sau 8 tuần cấy, chúng tôi đã quan sát và ghi nhận tỷ lệ tạo chồi (%) và số chồi/mẫu.

5.2.3 Tạo cụm chồi bằng phương pháp hủy đỉnh sinh trưởng

Chồi Sâm cau khi đạt từ 5 - 6 lá sẽ được cắt bỏ lá và tách bẹ lá từ ngoài vào trong đến đỉnh sinh trưởng Sau đó, dùng dao cấy cắt ngang vùng đỉnh và cấy vào môi trường MS bổ sung BA với các nồng độ 0,25; 0,5; 1,0 và 2,0 mg/l Thí nghiệm được thiết kế ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần với 5 mẫu mỗi lần, nuôi trong điều kiện 25 ± 2 o C, độ ẩm 55 ± 5%, ánh sáng 2.500 ± 500 lux và thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày Sau 8 tuần nuôi cấy, tỷ lệ mẫu tạo chồi và số chồi/mẫu sẽ được quan sát và ghi nhận.

5.2.4 Cảm ứng tạo rễ và tạo cây hoàn chỉnh

Chồi Sâm cau in vitro có chiều cao từ 3 – 4 cm và có 4 – 5 lá Để chuẩn bị mẫu chồi, cần sử dụng dao cấy để loại bỏ các phần rễ dư thừa Sau đó, mẫu chồi được cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA với các nồng độ khác nhau từ 0,1 đến 0,6 mg/l.

Các nghiệm thức bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần

Mẫu được nuôi trong điều kiện nhiệt độ 25 ± 2 o C, độ ẩm 55 ± 5%, ánh sáng 2.500 ± 500 lux và thời gian chiếu sáng 12 giờ mỗi ngày Sau 4 tuần nuôi cấy, tiến hành quan sát và ghi nhận kết quả tạo chồi, bao gồm tỷ lệ chồi tạo rễ, số lượng rễ trên mỗi chồi và chiều dài rễ.

5.2.5 Cảm ứng tạo phôi từ mô lá in vitro

Lá cây Sâm cau in vitro, cao khoảng 15 cm với 4 – 6 lá, được sử dụng làm vật liệu cảm ứng tạo chồi Các lá ở vị trí thứ 3, 4 và 5 từ ngọn được tách ra, cắt bỏ cuống và đầu lá, sau đó cắt thành các mảnh nhỏ kích thước khoảng 1×1 cm Những mảnh lá này được cấy úp mặt lá trên môi trường MS bổ sung 2,4-D 0,5 mg/l kết hợp với BA ở các nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 và 2,5 mg/l.

Thí nghiệm được thiết kế ngẫu nhiên hoàn toàn, với 3 lần lặp lại và mỗi lần có 5 mẫu Các mẫu cấy được nuôi trong điều kiện nhiệt độ 25 ± 2°C, độ ẩm 55 ± 5%, cường độ ánh sáng 2.500 ± 500 lux và thời gian chiếu sáng 12 giờ mỗi ngày Số lượng chồi và phôi trên mỗi mẫu được quan sát và ghi nhận sau 6 và 10 tuần nuôi cấy.

5.2.6 Cảm ứng tạo mô sẹo từ mô lá in vitro

Lá của cây Sâm cau in vitro, cao khoảng 15 cm và có 4 – 6 lá, được sử dụng làm vật liệu cảm ứng tạo mô sẹo Các lá ở vị trí thứ 3, 4 và 5 từ ngọn được tách ra, cắt bỏ cuống và đầu lá, sau đó cắt thành mảnh nhỏ khoảng 1×1 cm Những mảnh lá này được cấy trên môi trường MS bổ sung BA 0,5 mg/l, kết hợp với NAA ở các nồng độ 1,0; 2,0; 3,0 và 4,0 mg/l, hoặc 2,4-D ở các nồng độ 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 mg/l.

Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần gồm 5 mẫu Các mẫu được nuôi trong điều kiện tối, với nhiệt độ duy trì ở 25 ± 2 o C và độ ẩm 55 ± 5% Sau 10 tuần nuôi cấy, tỉ lệ (%) số mẫu cảm ứng tạo mô sẹo, cùng với hình thái như màu sắc và độ đặc, cũng như sự sinh trưởng của mô sẹo được quan sát và ghi nhận.

5.2.7 Cảm ứng tạo phôi từ mô sẹo

Các cụm mô sẹo có đường kính khoảng 1,0 cm được cấy trên môi trường MS với 2,4-D 0,5 mg/l kết hợp với các nồng độ BA từ 0,5 đến 2,5 mg/l Thí nghiệm được thực hiện theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần với mỗi lần 5 mẫu Mẫu được nuôi trong điều kiện nhiệt độ 25 ± 2 o C, độ ẩm 55 ± 5%, ánh sáng 2.500 ± 500 lux và thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày Số lượng chồi/mẫu được quan sát và ghi nhận sau 6 và 10 tuần nuôi cấy.

5.2.8 Tăng trưởng cây bằng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời

Lá cảm ứng tạo phôi 4 tuần tuổi được nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung BA với các nồng độ 0,5; 1,0 và 2,0 mg/l, được thực hiện dưới hai điều kiện: môi trường lỏng sử dụng hệ thống ngập chìm tạm thời (TIS) và môi trường rắn với phytoagar.

Mẫu đặt trên hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời được thiết kế với chu kỳ bơm 7 giờ/lần và thời gian ngập chìm 4 phút/lần bơm Mỗi bình nuôi cấy có thể tích môi trường là 250 ml, và điều kiện nuôi cấy được duy trì ở nhiệt độ 25 ±.

Nghiên cứu được thực hiện trong điều kiện 5 độ C, độ ẩm 55 ± 5%, với thời gian chiếu sáng 12 giờ mỗi ngày và cường độ ánh sáng đạt 2.500 ± 500 lux Các nghiệm thức được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên và mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.

5.2.9 Xác định sự hiện diện và đo hàm lượng một số hoạt chất của cây Sâm cau a Xác định sự hiện diện của Curculigoside (Dược điển Trung Quốc, 2010)

Sinh khối thu nhận từ cây Sâm cau, bao gồm thân rễ và lá trong điều kiện tự nhiên cũng như rễ, lá và mô sẹo trong nuôi cấy in vitro, được sấy khô ở nhiệt độ 60 độ C trong 72 giờ Sau đó, mẫu sinh khối khô (0,1 g) được nghiền trong 10 ml cồn 70 độ, lọc và thu lấy dịch chiết Dịch chiết này được cô cạn cho tới 0,5 - 1 ml và sẽ được sử dụng trong thí nghiệm xác định sự hiện diện của Curculigoside bằng phương pháp sắc ký bản mỏng, với chất chuẩn Curculigoside được sử dụng làm đối chứng.

(Aktin Chemicals, Inc.) 1 mg được hòa tan trong 1 ml cồn 70 o , bảo quản trong tối ở nhiệt độ phòng

KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

Khử trùng thân rễ tạo nguồn mẫu nuôi cấy in vitro

- Trường hợp xử lý mẫu bằng CuSO 4 kết hợp với NaOCl

Sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS, tỉ lệ sống vô trùng đạt mức cao nhất là 38,89% trong sự kết hợp của NaOCl 6% và CuSO 4 5%, tiếp theo là 21,11% trong nghiệm thức có NaOCl 6% kết hợp với CuSO 4 6% Các nghiệm thức khác có tỉ lệ sống vô trùng thấp (dưới 20%) Nhìn chung, tỉ lệ sống vô trùng tăng tỉ lệ thuận với nồng độ CuSO 4 từ 3,

4, 5% sau đó giảm ở nồng độ 6% Như vậy, khi kết hợp NaOCl và CuSO 4 thì hàm lượng thích hợp nhất là NaOCl 6% và CuSO 4 5% (bảng 3)

Bảng 3 Tỉ lệ mẫu sống vô trùng khi được xử lý bằng CuSO 4 kết hợp với NaOCl

Nghiệm thức Nồng độ NaOCl

% Tỉ lệ sống vô trùng

* Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 0.05

- Trường hợp xử lý mẫu bằng HgCl 2 0,1%

Sau một tuần nuôi cấy, tỷ lệ mẫu sống vô trùng đạt được là 57,22%; 73,74% và 57,22% tương ứng với thời gian khử trùng 10, 13, và 15 phút, cho thấy hiệu quả cao hơn so với các thí nghiệm trước đây với các chất khử trùng khác Sau hai tuần nuôi cấy, tỷ lệ này giảm xuống còn 34,55%; 53,39% và 30%, nhưng vẫn duy trì ở mức tương đối cao.

Bảng 4 Tỉ lệ mẫu sống vô trùng khi được xử lý bằng HgCl 2

Nồng độ HgCl 2 (%) Tỉ lệ sống vô trùng

Môi trường nuôi cấy mô thực vật có nồng độ cao các chất dinh dưỡng như đường, muối khoáng và vitamin, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nấm và vi khuẩn Tốc độ sinh trưởng của nấm và vi khuẩn nhanh hơn tế bào thực vật, do đó, nhiễm khuẩn sẽ ảnh hưởng tiêu cực đến sự phát triển của mẫu Vì vậy, khử trùng là bước quan trọng để đảm bảo vật liệu sạch trong nuôi cấy in vitro.

Thủy ngân là một chất khử trùng mạnh nhưng ít được sử dụng do nguy cơ ảnh hưởng đến sức khỏe con người qua đường hô hấp, tiêu hóa và tiếp xúc da Chỉ được áp dụng trong các nghiên cứu vô trùng khi các biện pháp khác không hiệu quả, thủy ngân clorua thường được dùng với nồng độ thấp khoảng 0,1% Hiệu quả khử trùng phụ thuộc vào thời gian xử lý mẫu; thời gian ngắn dẫn đến tỷ lệ vô trùng thấp, trong khi thời gian dài có thể làm giảm khả năng sống sót của mẫu Thời gian khử trùng lý tưởng cần đảm bảo vừa đủ để vô trùng mà không làm oxy hóa mẫu quá mức, ảnh hưởng đến khả năng sống và phát sinh chồi Kết quả cho thấy tỷ lệ sống vô trùng cao và có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 0,05, với 13 phút là thời gian khử trùng tối ưu nhất.

Hình 6 Mẫu Sâm cau vô trùng

A, B: sau 2 tuần nuôi cấy; C, D: sau 3 tuần nuôi cấy; E: sau 5 tuần nuôi cấy

Trong nghiên cứu về phương pháp khử trùng, HgCl 2 0,1% đã cho tỉ lệ sống vô trùng cao nhất sau 2 tuần nuôi cấy, cho thấy đây là chất khử trùng tối ưu cho củ cây sâm cau Tuy nhiên, do độc tính của thủy ngân, CuSO 4 5% và NaOCl 6% có thể được sử dụng như các chất khử trùng thay thế, mang lại tỉ lệ sống vô trùng là 38,89%.

Tăng trưởng chồi ngủ từ thân rễ

Sau 4 tuần nuôi cấy, hầu hết các môi trường đều cho tỉ lệ cảm ứng tạo chồi tương đối cao, đạt từ 33,33% đối với môi trường MS có bổ sung BA 4,0 mg/l và đạt cao nhất ở 86,67% đối với môi trường MS có bổ sung BA 2,0 mg/l Nhìn chung, tỉ lệ tạo chồi có xu hướng tăng khi tăng nồng độ BA và đạt cao nhất ở nồng độ BA 2,0 mg/l sau đó giảm dần, khi nồng độ BA đạt mức 4,0 mg/l tỉ lệ tạo chồi là thấp nhất Môi trường MS không bổ sung chất điều hòa và môi trường có bổ sung BA 2,0 mg/l có tỉ lệ cảm ứng chồi thì không có sự khác biệt có ý nghĩa, tuy nhiên ở môi trường có bổ sung BA 2,0 mg/l có số chồi/mẫu cao hơn hẳn (Bảng 5) Do đó, trong thí nghiệm này môi trường MS bổ sung BA 2,0 mg/l là thích hợp nhất cho sự cảm ứng chồi từ thân củ cây Sâm cau

Bảng 5 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự tăng trưởng chồi từ thân rễ Sâm cau

(%) Số chồi Chiều cao chồi

* Các chữ các khau nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 0 ,05

Hình 7 Sự phát sinh chồi từ thân rễ cây Sâm cau sau 4 tuần cấy

( A Môi trường MS; B, C, D, E, F, G, H, I: Môi trường MS bổ sung BA với các nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 mg/l)

BA là một loại cytokinin có khả năng kích thích mạnh mẽ sự phân chia tế bào ở thực vật, mặc dù cơ chế hoạt động của nó chưa được chứng minh rõ ràng BA hoạt hóa sự tổng hợp nucleic acid và protein, ảnh hưởng đáng kể đến sự phân hóa cơ quan, đặc biệt là hình thành chồi Thí nghiệm cho thấy nồng độ BA thấp tạo ra ít chồi, trong khi nồng độ quá cao (> 2,0 mg/l) lại làm giảm số lượng chồi, thay vào đó tăng sự hình thành sẹo Kết quả cho thấy chồi hình thành sau quá trình phát sinh sẹo, chứng tỏ rằng nồng độ BA thích hợp kích thích phân chia tế bào và biệt hóa chồi, trong khi nồng độ quá cao chỉ dẫn đến sự phân chia tế bào mạnh mẽ để tạo sẹo, ức chế quá trình tạo chồi.

Nghiên cứu về cây Sâm cau đã chỉ ra rằng các tác giả trước đây sử dụng BA để tạo chồi từ thân rễ Cụ thể, vào năm 2003, Bhavisha và Yogesh đã thành công trong việc tái sinh chồi trong môi trường MS với nồng độ 0,44 M BA Ngoài ra, Salema (2007) cũng đã chứng minh rằng môi trường MS bổ sung 2,0 mg/l có hiệu quả trong quá trình này.

BA kết hợp 0,25 mg/l IBA cho kết quả tạo chồi tốt nhất, Shende (2012) sử dụng môi trường MS bổ sung BA nhưng với nồng độ thấp hơn là 0,25 mg/l

Tạo cụm chồi bằng phương pháp hủy đỉnh sinh trưởng

Sau 4 tuần nuôi cấy, mẫu hủy đỉnh sinh trưởng của cây Sâm cau cảm ứng tạo chồi trên tất cả các môi trường, tuy nhiên, số lượng chồi/mẫu lại có xu hướng giảm dần khi tăng nồng độ BA Số lượng chồi đạt mức cao nhất (4,8 chồi/mẫu) trên môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng sau đó giảm dần khi tăng nồng độ BA Chiều cao chồi cũng giảm mạnh khi tăng hàm lượng BA, mẫu cấy có xu hướng tạo mô sẹo trước sau đó mới phát sinh chồi từ mô sẹo (Bảng 6)

Bảng 6 Ảnh hưởng của nồng độ BA đến sự nhân nhanh chồi bằng phương pháp hủy đỉnh sinh trưởng

Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Số chồi Chiều cao chồi (cm)

* Các chữhác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 0,05

Hình 8 Nhân chồi bằng phương pháp hủy đỉnh sinh trưởng

Môi trường MS bổ sung BA 0; 0,25; 0,5; 1,0; 2,0 mg/l)

32 Để cảm ứng sự tạo chồi cây Sâm cau trong các thí nghiệm trước cần một hàm lượng

Mặc dù nồng độ BA cao (2,0 mg/l) trong thí nghiệm, nhưng việc tăng nồng độ này lại dẫn đến sự giảm mạnh số lượng chồi tạo thành Nguyên nhân có thể là do Sâm cau tích lũy một lượng lớn auxin Khi hủy đỉnh sinh trưởng, hàm lượng auxin nội sinh giảm, nhưng hàm lượng cytokinin nội sinh trong cây Sâm cau vẫn đủ để kích thích sự nhân chồi Do đó, việc bổ sung BA không cần thiết và thậm chí ở nồng độ cao, BA có thể ức chế sự tạo chồi và dẫn đến xu hướng tạo mô sẹo.

Cảm ứng tạo rễ và tạo cây hoàn chỉnh

Khi nồng độ NAA tăng, tỉ lệ tạo rễ của chồi Sâm cau có xu hướng giảm Ở môi trường MS bổ sung NAA 0,1 mg/l và 0,2 mg/l, tỉ lệ tạo rễ đạt 100%, với số lượng rễ tối đa là 16,29 rễ/chồi, nhưng sau đó giảm ở các nồng độ cao hơn Mặc dù số lượng rễ trên các môi trường MS bổ sung NAA 0,1, 0,2, 0,3 và 0,4 mg/l cao hơn so với môi trường không bổ sung NAA, nhưng rễ thường ngắn, chậm phát triển và dễ hóa nâu Do đó, môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng là phù hợp nhất cho việc tạo rễ.

Bảng 7 Ảnh hưởng của NAA tới sự tạo rễ cây Sâm cau

(%) Số rễ Chiều dài rễ (cm) Hình thái

1 0,0 100 a ± 0,00 7,29 bc ± 0,20 9,29 a ± 0,20 Rễ dài, nhiều rễ tơ

2 0,1 100 a ± 0,00 15,87 a ± 1,18 0,59 b ± 0,05 Rễ ngắn, màu nâu, dễ tách rời khỏi chồi

5 0,4 66,67 b ± 6,67 9,78 b ± 1,87 0,30 cd ± 0,04 Rễ ngắn, nâu, phần bẹ lá dễ bị hoại tử

* Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 0 ,05

Hình 9 Sự hình thành rễ cây Sâm cau trên các môi trường khác nhau

A: chồi Sâm cau ở tuần 0; B, C, D, E, F, G, H: môi trường MS bổ sung NAA ở các nồng độ 0,1 – 0,6 mg/l

Hình 10 Sự phát sinh hình thái rễ cây Sâm cau trên môi trường MS (100X)

A: Sự hình thành tế bào hoạt hóa; B: Sự hình thành vùng tế bào mô phân sinh ngọn rễ; C: Sự hình thành sơ khởi rễ; D, E: Sự kéo dài rễ

Vùng tế bào hoạt hóa Mô phân sinh ngọn rễ

Kết quả cắt giải phẫu cho thấy sự hình thành rễ từ thân rễ Sâm cau diễn ra qua bốn giai đoạn dưới kính hiển vi: hoạt hóa tế bào, hình thành vùng trung tâm mô phân sinh ngọn rễ, tạo sơ khởi rễ và kéo dài sơ khởi rễ Đầu tiên, các tế bào nhu mô lõi dưới tác động của auxin sẽ phản phân hóa thành các tế bào mô phân sinh cấp hai, có khả năng hình thành cơ quan Lục lạp mất sắc tố và phân chia mạnh mẽ cùng với ti thể, trở thành các bóng màng nhỏ hơn, khó phân biệt Tiếp theo, các tế bào này chuyển đổi thành tế bào mô phân sinh cấp một với khả năng phát sinh cơ quan, có sự phân chia mạnh, tế bào chất đậm đặc, không bào nhỏ và nhân lớn Sau đó, sự hình thành sơ khởi rễ diễn ra, và cuối cùng, các sơ khởi rễ phát triển thành rễ hoàn chỉnh với đầy đủ các phần: vùng mô phân sinh ngọn rễ, vùng kéo dài và vùng trưởng thành.

Cảm ứng tạo phôi sinh dưỡng từ mô lá in vitro

Sự phát sinh phôi sinh dưỡng của cây Sâm cau thể hiện rõ đặc trưng của phôi thực vật một lá mầm, bao gồm các giai đoạn: phôi hình cầu sau 3 tuần, hình thành phôi núi lửa sau 5 tuần và phôi kim tự tháp sau 6 tuần.

Sau 6 tuần nuôi cấy, môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D kết hợp với 2,0 mg/l BA đạt trung bình 11,2 phôi/mẫu, trong khi môi trường với 0,5 mg/l 2,4-D và 1,0 mg/l BA đạt 10,13 phôi/mẫu, không có sự khác biệt đáng kể về số lượng phôi Tuy nhiên, sau 10 tuần, môi trường có 0,5 mg/l 2,4-D và 2,0 mg/l BA cho tỷ lệ tạo chồi cao hơn, đạt 3,86 chồi/mẫu, so với 1,8 chồi/mẫu ở môi trường có 0,5 mg/l 2,4-D và 1,0 mg/l BA.

Bảng 8 Ảnh hưởng của nồng độ BA và 2,4-D đến khả năng tái sinh chồi từ mẫu lá in vitro

2,4-D (mg/l) BA (mg/l) Số phôi/mẫu

Số chồi/mẫu (tuần 10) Sinh trưởng

Ghi chú:+ : mức độ sinh trưởng của chồi

Hình 11 Các giai đoạn phát triển của phôi sinh dưỡng Sâm cau

A: phôi cầu (ge); B: phôi phôi núi lửa (ve); C: phôi kim tự tháp (pe); D: phôi hình thành phát thể lá (ce); E,F: giai đoạn phôi phát triển và kéo dài thành chồi

A ge ge ve pe ce cs

Hình 12 Chồi phát triển từ phôi mô lá Sâm cau trên các môi trường khác nhau

(A: MS đối chứng; B, C, D, E, F: môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D kết hợp BA có nồng độ lần lượt là 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 mg/l)

Môi trường có bổ sung 0,5 mg/l 2,4D và 2,0 mg/l BA không chỉ hỗ trợ phôi phát triển thành chồi hoàn chỉnh mà còn cải thiện sự phát triển của cơ quan rễ so với các môi trường khác.

Cảm ứng tạo mô sẹo từ mô lá in vitro

Các mẫu lá cấy trên môi trường MS bổ sung BA kết hợp 2,4-D cho tỉ lệ tạo sẹo cao hơn so với môi trường bổ sung NAA, với sự khác biệt rõ rệt trong tỉ lệ tạo mô sẹo và mức độ sinh trưởng (Bảng 9) 2,4-D, một auxin mạnh, thường được sử dụng trong thí nghiệm tạo mô sẹo, trong khi NAA chủ yếu kích thích quá trình tạo rễ (Bùi Trang Việt, 2004) Tỉ lệ tạo mô sẹo cao nhất đạt được khi mẫu lá được cấy trên môi trường MS với 0,5 mg/l BA kết hợp 1,0 mg/l 2,4-D (86,67 %) hoặc 1,5 mg/l 2,4-D (93,33 %), và sự khác biệt giữa hai nghiệm thức này không có ý nghĩa thống kê (Bảng 9).

Trong nghiên cứu, 37 trường hợp đã sử dụng môi trường bổ sung 0,5 mg/l BA kết hợp 1,0 mg/l 2,4-D, cho thấy mô sẹo phát triển nhanh chóng và ổn định Sau 10 tuần nuôi cấy, tỉ lệ tạo phôi đạt rất cao.

Bảng 9 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng tới khả năng tạo mô sẹo từ mẫu lá in vitro

(mg/l) Tỉ lệ tạo sẹo

(%) Hình thái Khả năng tạo phôi

(sau 10 tuần) Sinh trưởng của mô sẹo

2,0 - 13,33 de ± 8,09 Sẹo xốp, nâu Tạo phôi ít + 3,0 - 53,33 b ± 8,09 Sẹo đặc, trắng Tạo phôi nhiều ++ 4,0 - 20,00 cd ± 0,00 Sẹo xốp, nâu Tạo phôi ít +

- 1,0 86,67 a ± 8,09 Sẹo đặc, trắng Tạo phôi rất nhiều ++++

- 1,5 93,33 a ± 8,09 Sẹo đặc, trắng Tạo phôi nhiều +++

- 2,0 33,33 c ± 8,09 Sẹo xốp, nâu Tạo phôi ít ++

Ghi chú: +: Mức độ sinh trưởng của mô sẹo

Sau 8 tuần nuôi cấy, nghiệm thức MS bổ sung 1,5 mg/l 2,4-D cho thấy khả năng tích lũy sinh khối cao nhất ở mô sẹo, với trọng lượng tươi đạt 0,495 g, trọng lượng khô 0,129 g, và năng suất sinh khối 26,18% Kết quả này có sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức khác.

Hình 13 Sự hình thành mô sẹo từ mô lá cây Sâm cau trên các môi trường

(A, B, C: môi trường MS bổ sung BA 0.5 mg/l và NAA các nồng độ 2; 3; 4 mg/l

D, E, F: môi trường MS bổ sung BA 0.5 mg/l và 2,4D các nồng độ 1; 1.5; 2 mg/l)

Bảng 10 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng tới sự tăng sinh khối mô sẹo từ lá

1,0 - 0,182 ef ± 0,039 0,028 cd ± 0,007 15,57 c ± 2,36 2,0 - 0,226 cde ± 0,046 0,026 de ± 0,003 11,65 d ± 1,12 3,0 - 0,294 bc ± 0,029 0,068 b ± 0,008 23,02 b ± 1,08 4,0 - 0,153 f ± 0,031 0,017 de ± 0,004 11,13 d ± 0,27

Hình 14 Phát sinh hình thái mô sẹo từ lá cây Sâm cau được quan sát dưới KHV

Phẫu thức cắt ngang lá Sâm cau đối chứng cho thấy sự khác biệt rõ rệt so với phẫu thức cắt ngang lá Sâm cau được nuôi trong môi trường MS kết hợp với BA 0.5 mg/l và 2,4-D 1.0 mg/l Vùng phân hóa tế bào hình thành mô sẹo được ghi chú rõ ràng, cho thấy sự ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến quá trình phát triển mô của Sâm cau.

Dưới kính hiển vi, các đám mô sẹo ở Sâm cau hình thành từ sự phân chia tế bào vùng nhu mô lá Các tế bào này dễ bị phản phân hóa thành vùng mô phân sinh sẹo khi chịu tác động từ môi trường, đặc biệt là trong nền môi trường có chứa auxin mạnh với nồng độ cao.

Cảm ứng tạo phôi từ mô sẹo

Sau 6 tuần nuôi cấy, số phôi phân hóa từ mô sẹo tăng dần khi tăng nồng độ BA bổ sung vào môi trường nuôi cấy, cao nhất ở các môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D kết hợp 1,5 mg/l BA (35,93 phôi/mẫu) hoặc kết hợp với 2,0 mg/l BA (32,53 phôi/mẫu) Tuy nhiên sau 10 tuần nuôi cấy, số chồi phát triển từ các cụm phôi trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D kết hợp 2,0 mg/l BA cho số chồi cao nhất (7,67 chồi/mẫu) so với các nghiệm thức còn lại (Bảng 11)

Bảng 11 Ảnh hưởng của BA và 2,4-D tới sự tái sinh chồi từ mô sẹo

(mg/l) BA (mg/l) Số phôi/mẫu

Số chồi/mẫu (tuần 10) Sinh trưởng

Ghi chú: +: mức độ sinh trưởng của chồi

Trong giai đoạn phát sinh phôi, việc sử dụng auxin mạnh, riêng lẻ hoặc kết hợp với cytokinin là cần thiết, trong khi ở giai đoạn phát triển phôi sinh dưỡng, cần giảm hoặc loại bỏ auxin trong môi trường nuôi cấy (Komamine và cs, 1997) Cytokinin như BA đóng vai trò quan trọng trong việc kích hoạt protein kinase, thúc đẩy con đường truyền tín hiệu và các quá trình phiên mã, từ đó kích thích tổng hợp protein và enzyme đặc hiệu, làm tăng mật độ bào quan trong tế bào chất, đặc biệt là ti thể, hỗ trợ trực tiếp vào quá trình phân bào (Litwack, 2005; Osborne và cs, 2005).

Hình 15 Sự hình thành phôi từ mô sẹo trên các môi trường khác nhau ve ge pe

A: môi trường MS; B, C, D, E: môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA và 2,4-D ở các nồng độ 0,5; 1; 1,5; 2 mg/l; F: các giai đoạn hình thành phôi vô tính; G: giai đoạn phát triển thành chồi trên MS bổ sung 0,5 mg/l BA và 2,0 mg/l 2,4-D

Tăng trưởng cây bằng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời

Hệ thống ngập chìm tạm thời (TIS) đã chứng minh hiệu quả cao trong việc tạo phôi cho cây Sâm cau so với môi trường bán rắn, nhờ vào việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy in vitro Tuy nhiên, do chứa nhiều hợp chất phenol, các mẫu Sâm cau thường tiết phenol ra môi trường, gây ức chế sự phát triển của rễ, ảnh hưởng đến khả năng hấp thu nước và dinh dưỡng, dẫn đến cây phát triển chậm và dễ lão hóa Để khắc phục tình trạng này, cần pha môi trường và thực hiện cấy truyền liên tục Bên cạnh đó, sự hạn chế trong lưu thông không khí và độ ẩm cũng làm chậm quá trình sinh trưởng, trong khi việc chuyển mẫu sang môi trường mới có thể gây tổn thương do thao tác không cẩn thận Điều này không chỉ tốn thời gian mà còn lãng phí nguồn lực và môi trường nuôi cấy.

Bảng 12 Khả năng tăng trưởng cây Sâm cau trên môi trường bán rắn và hệ thống TIS

Nghiệm thức Điều kiện môi trường

5 Hệ thống ngập chìm tạm thời

* Các chữ cái khác nhau thể hiện cho sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 0 ,05

Ghi chú: +: mức độ sinh trưởng của chồi

Hình 16 Cây Sâm cau nuôi cấy trên các điều kiện môi trường khác nhau

A: Nuôi cấy trên hệ thống TIS; B: Nuôi cấy trên nền thạch agar Để khắc phục các nhược điểm trên, hệ thống ngập chìm tạm thời được cải tiến để nhằm tối ưu hóa sự phát triển của mẫu thí nghiệm Có thể thấy các cây Sâm cau trên hệ thống TIS phát triển tốt hơn so với mẫu thí nghiệm ở trên môi trường bán rắn Hệ thống TIS có bộ phận ngăn sự tiếp xúc trực tiếp giữa mẫu thí nghiệm với môi trường nuôi cấy nên mẫu ít bị ảnh hưởng bởi yếu tố phenol ngoại tiết từ chính mẫu thí nghiệm, môi trường có độ thoáng khí cao, không gian sinh trưởng rộng nên mẫu sẽ phát triển tối ưu hơn Vì

Tần suất cấy truyền trong môi trường lỏng thấp hơn, dẫn đến mẫu sinh trưởng ổn định và giảm lượng môi trường sử dụng so với cấy mẫu trên môi trường bán rắn (Paula, 2012).

Trong nghiên cứu về nồng độ BA trong môi trường nuôi cấy, môi trường MS bổ sung BA 2,0 mg/l đã cho kết quả cao nhất về số lượng chồi, đạt 5,27 chồi/mẫu sau 10 tuần nuôi cấy Ngược lại, khi xem xét sự tạo rễ, môi trường MS không bổ sung chất điều hòa lại cho số lượng rễ hình thành cao nhất, đạt 6,13 rễ/chồi sau 10 tuần nuôi cấy.

Xác định sự hiện diện và đo hàm lượng một số hoạt chất của cây Sâm cau

6.9.1 Xác định sự hiện diện của Curculigoside

Kết quả thử nghiệm với thuốc thử FeCl3 cho thấy tất cả các mẫu sinh khối cây Sâm cau đều chứa Curculigoside, với chỉ số Rf dao động từ 0,74 đến 0,76.

Bảng 13 Giá trị Rf và phản ứng tạo màu với thuốc thử FeCl 3 : K 3 [Fe(CN) 6 ]

Phản ứng tạo màu với FeCl 3 :

Chú thích: +: mức độ phản ứng hiện màu của curculigoside

Khi phân tích bảng sắc ký, curculigoside được phát hiện ở hầu hết các cơ quan của cây Sâm cau, với mức độ đậm nhạt của các vạch màu mục tiêu cho thấy hàm lượng curculigoside tương đối Cụ thể, hàm lượng curculigoside cao nhất được tìm thấy ở thân rễ Sâm cau trồng tự nhiên, tiếp theo là rễ trong điều kiện in vitro, và mẫu lá Sâm cau tự nhiên (đối chứng) Ngược lại, hàm lượng curculigoside thấp nhất xuất hiện ở mẫu lá in vitro và mô sẹo in vitro.

Bản sắc ký lớp mỏng curculigoside được thực hiện từ các mẫu sinh khối Sâm cau, bao gồm các chất chuẩn curculigoside, thân rễ tự nhiên, lá tự nhiên, và sinh khối mô sẹo, lá, rễ in vitro sau 10 tuần nuôi cấy.

Hàm lượng curculigoside cao nhất được tìm thấy ở thân rễ Sâm cau trồng tự nhiên, nơi có vai trò dự trữ và tích lũy chất dinh dưỡng Thân rễ phát triển trong môi trường có nhiều tác nhân bất lợi, kích thích hoạt động biến dưỡng thứ cấp để sản xuất các hợp chất có khả năng chống lại các tác nhân gây hại Ngược lại, mô sẹo in vitro có hàm lượng curculigoside thấp nhất do đây là giai đoạn biệt hóa và phân chia tế bào chủ yếu thực hiện các hoạt động biến dưỡng sơ cấp để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng Trong điều kiện nuôi cấy in vitro, rễ của cây 5 tháng tuổi là nơi tích lũy curculigoside cao, vì rễ không chỉ hấp thụ nước và muối khoáng mà còn dễ bị tổn thương bởi môi trường, dẫn đến tích lũy các hợp chất biến dưỡng thứ cấp để phòng vệ.

Hàm lượng curculigoside cao ở cơ quan rễ cho thấy vai trò quan trọng của nó trong việc bảo vệ các tế bào rễ khỏi những điều kiện bất lợi của môi trường.

Curculigoside được chứng minh có hoạt tính kháng oxi hóa mạnh mẽ, giúp trung hòa các gốc oxy hóa tự do có hại cho thực vật Bên cạnh đó, curculigoside cũng đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành các tín hiệu ROS, kích hoạt các con đường kháng stress ở Sâm cau để đối phó với các yếu tố môi trường bất lợi như khô hạn và sự tấn công của côn trùng.

6.9.2 Định lượng phenol tổng số bằng phương pháp đo quang

Kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ acid gallic có mối tương quan chặt chẽ với độ hấp thu ở bước sóng 765 nm, với hệ số tương quan R² ≥ 0,9985 Phương trình hồi quy tuyến tính y = 0,0137x - 0,0024 (Biểu đồ 1) được sử dụng để xác định hàm lượng phenol tổng số trong các mẫu sinh khối Cụ thể, giá trị OD 765nm càng cao thì hàm lượng phenol tổng số trong mẫu càng lớn Hàm lượng phenol phụ thuộc vào nhiều yếu tố như độ tuổi mẫu, cơ quan thu nhận, quá trình sinh lý và điều kiện sống của mẫu phân tích Thông tin chi tiết về giá trị OD 765nm và hàm lượng phenol tổng số của các mẫu sinh khối được trình bày trong bảng 14.

Biểu đồ 1 Đường chuẩn acid gallic ở bước sóng 765 nm

Nồng độ acid gallic (ppm)

Bảng 14 Hàm lượng phenol tổng ở một số mẫu Sâm cau

NT Mẫu thí nghiệm Giá trị OD 765nm trung bình

Hàm lượng phenol tổng (mg/g)

3 Mô sẹo in vitro (Rắn) 0,084 12,66 f ±2,85

5 Rễ in vitro (Rắn) 0,584 85,56 bc ±2,69

* Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 0,05

Kết quả thí nghiệm cho thấy hàm lượng phenol tổng ở mẫu thân rễ Sâm cau cao nhất (156,75 mg/g), gần gấp đôi so với mẫu lá tự nhiên (81,08 mg/g) và mẫu rễ in vitro trên hệ thống TIS (90,52 mg/g) Mẫu mô sẹo Sâm cau có hàm lượng phenol tổng số thấp nhất (12,66 mg/g) Sự khác biệt này có thể được giải thích bởi thân rễ Sâm cau trong tự nhiên có tuổi sinh lý cao, đã trưởng thành, đóng vai trò tích lũy và dự trữ, đồng thời dễ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố bất lợi từ môi trường do tiếp xúc với đất.

Mẫu rễ từ cây in vitro 5 tháng tuổi nuôi cấy trên hệ thống TIS có hàm lượng phenol tổng cao nhất, đạt 90,52 mg/g, vượt trội hơn so với mẫu rễ cùng tuổi được nuôi trên môi trường bán rắn.

Nghiên cứu cho thấy hàm lượng chất dinh dưỡng trong mẫu lá in vitro 5 tháng tuổi nuôi cấy trên hệ thống TIS đạt 85,56 mg/g, gấp đôi so với mẫu lá in vitro cùng tuổi nuôi trên môi trường bán rắn, chỉ đạt 31,98 mg/g Điều này cho thấy sự khác biệt rõ rệt trong hiệu quả của hai phương pháp nuôi cấy.

Cơ quan rễ tích lũy hợp chất phenol cao hơn so với lá và mô sẹo, do mô sẹo vẫn là các tế bào chưa biệt hóa chuyên sâu, đang trong giai đoạn tăng sinh Rễ và lá là các cơ quan trưởng thành, đã được biệt hóa cho một chức năng cụ thể, với tế bào trong chu kỳ ổn định Sự phân hóa hình thái là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến việc sản xuất các chất thứ cấp từ tế bào thực vật.

Trong quá trình phân hóa tế bào, có 47 chất thứ cấp được sản xuất, thường xuất hiện trong các mô đặc trưng như rễ, lá và hoa.

6.9.3 Định lượng flavonoid tổng số bằng phương pháp đo quang

Kết quả nghiên cứu cho thấy có mối tương quan chặt chẽ giữa nồng độ rutin và độ hấp thu ở bước sóng 257 nm, với hệ số tương quan R² ≥ 0,9952 Phương trình hồi quy tuyến tính giữa nồng độ rutin và giá trị OD 257 nm được xác định là y = 0,0384x - 0,0027, như thể hiện trong Biểu đồ 2 Phương trình này được áp dụng để xác định hàm lượng flavonoid tổng số trong các mẫu sinh khối Thông tin chi tiết về giá trị OD ở bước sóng 257 nm và hàm lượng flavonoid tổng số của các mẫu sinh khối được trình bày trong bảng 15.

Biểu đồ 2 Đường chuẩn rutin ở bước sóng 257 nm

Bảng 15 Hàm lượng flavonoid tổng ở một số mẫu Sâm cau

* Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 0,05

NT Mẫu thí nghiệm Giá trị OD 257nm trung bình

Hàm lượng flavonoid tổng (mg/g)

3 Mô sẹo in vitro (Rắn) 0,063 1,70 e ±0,38

7 Rễ in vitro (TIS) 0,464 12,16 cd ±0,84

Trong nghiên cứu về hàm lượng flavonoid, cơ quan thân rễ tự nhiên có hàm lượng cao nhất (34,47 mg/g), tiếp theo là mẫu lá tự nhiên (16,09 mg/g) Trong điều kiện in vitro, lá 5 tháng tuổi từ hệ thống TIS đạt 13,65 mg/g flavonoid, trong khi rễ in vitro 5 tháng tuổi từ hệ thống TIS và bán rắn lần lượt là 12,16 mg/g và 12,47 mg/g, thấp hơn một chút so với lá Tuy nhiên, cây in vitro trên hệ thống TIS tích lũy flavonoid tổng số cao hơn (25,81 mg/g) so với cây nuôi trong điều kiện bán rắn (22,74 mg/g) Do đó, việc sử dụng hệ thống ngập chìm tạm thời – TIS là phương pháp hiệu quả để thu nhận flavonoid trong nuôi cấy in vitro.

SẢN P HẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

STT Tên sản phẩm Số lượng Kết quả thu được Đánh giá Ghi chú

Quy trình nhân giống cây Sâm cau in vitro

Quy trình nhân giống cây Sâm cau in vitro đã xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng phù hợp, giúp cây phát triển tốt ở từng giai đoạn Phương pháp này có khả năng ứng dụng rộng rãi và mang lại hiệu quả cao, đạt tiêu chuẩn Phụ lục số 12.

Xác định được vật liệu in vitro

(mô sẹo, chồi hay rễ) chứa hàm lượng hoạt chất sinh học

Rễ in vitro có khả năng tích lũy cao các hợp chất thứ cấp, đặc biệt là curculigoside và hợp chất phenol Bên cạnh đó, lá in vitro cũng cho thấy tiềm năng lớn trong việc thu nhận các hợp chất flavonoid.

3 Giống Sâm cau in vitro 1500 cây

Mang các đặc tính của giống ban đầu trong tự nhiên, cây sinh trưởng tốt, đồng đều về chất lượng Đạt

Bài báo khoa học công bố trên tạp chí chuyên ngành

5 Hướng dẫn làm đề tài 2 người Đào tạo được 1 Thạc sỹ và 1 kỹ sư Đạt Phụ lục số 13

TÀI LIỆU HAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1 Lê Huy Bá, (2008) Độc học môi trường cơ bản, Tp HCM, NXB Đại học Quốc gia

2 Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn, (2004) Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam -

Tập II Nhà Xuất Bản Khoa Học và Kỹ Thuật, 693-696

3 Đỗ Huy Bích, (2014) Sâm cau - Cây thuốc quý Tạp chí Cây thuốc quý

4 Ngô Thị Cúc, (2010) Giáo trình hình thái giải phẫu học thực vật, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội

5 Trần Thanh Hương, (2013) Thực Tập Chuyên Đề Phát Sinh Hình Thái Thực Vật in vitro NXB Đại Học Quốc Gia TP.Hồ Chí Minh

6 Phạm Cao Khải, Trần Văn Minh, (2013) Nhân nhanh Protocorm và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng hoa lan, cà phê vối, lát hoa Côn Đảo bằng bioreactor bán chìm ngập quãng, Báo cáo khoa học Hội nghị Khoa học Công nghê Sinh học toàn quốc, Quyển 2, 878 – 882

7 Dương Công Kiên, (2002) Nuôi cấy mô thực vật, NXB Đại học Quốc gia TP.HCM

8 Nguyễn Bá Lộc, Trương Văn Lung, Lê Thị Trĩ, Lê Thị Hoa, Lê Thị Mai Hương,

(2005) Sinh lý học thực vật, NXB Nông nghiệp

9 Võ Thị Bạch Mai, (2002) Sự Phát Sinh Chồi Và Rễ Ở Thực Vật NXB Đại Học Quốc Gia TP.Hồ Chí Minh

10 Lê Ngọc Thạch, (2009) Giáo trình Tinh dầu học, NXB Đại học Quốc gia Thành phố

11 Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch, Vũ Quang Sáng, (2006) Giáo trình sinh lý thực vật, trường đại học Nông nghiệp I Hà Nội

12 TCVN 9745-1:2013, ISO 14502-1:2005, (2013) Xác định các chất đặc trưng của chè xanh và chè đen - phần 1: hàm lượng polyphenol tổng số trong chè - phương pháp đo màu dùng thuốc thử Folin-ciocalteu

13 Võ Châu Tuấn, Nguyễn Thị Út, Trần Quang Dần, (2011) Nhân giống in vitro cây Sâm cau Curculigo orchiodes Gaertn - Một loài cây thuốc quý Tạp chí Khoa hoc và Công nghệ Đại học Đà Nẵng 6(47), 163-169

14 Bùi Trang Việt, (2009) Giáo trình Sinh lý học Thực vật, Phần 2: Phát triển, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh

15 Nguyễn Thị Út, Nguyễn Thị Xuân Tâm, Từ Thị Tú, (2010) Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây Sâm cau Tuyển tập báo cáo hội nghị sinh viên nghiên cứu khoa học- Đại học Đà Nẵng, 525-527.

Tài liệu tiếng Anh

1 Agrahari A.K., Panda S.K., Meher A., and Padhan A.R., (2010) Screening of wound healing activity of Curculigo Orchioides International Journal of Pharmaceutical and Applied Sciences 1(1), 91-95

2 Anna B., Bozena P., (2003) Somatic embryogenesis in gentiana pneumonanthe L., ACTA Biologica Cracoviensia, Series Botanica, Vol 45(2), 79 – 86

3 Arnason J.T., Mata R., Romeo J.T., (1995) Phytochemistry of medicinal plants, Plenum Press, New York, 13 – 59

4 Augustine A.C., Nivas S., and Souza L., (2008) Induction of embryos and plantlets from anthers of Curculigo Orchioides Gaetn Indian Journal of Biotechnology 7, 536-

5 Bafna A.R., and Mishra S.H., (2006) Immunostimulatory effect of methanol extract of Curculigo Orchioides on immunosuppressed mice Journal of Ethnopharmacology

6 Bhavisha B.W., and Yogesh T.J., (2003) Micropropagation of an Endangered Medicinal Plant Plant Tissue Cult 13, 13-19

7 Borkow and Jeffrey, (2009) Copper, an ancient remedy returning to fight microbial, fungal and viral infections Current chemical biology, 3, 272 – 278

8 Cao D.P., Zheng Y.N., Qin L.P., Han T., Zhang H., Rahman K., and Zhang Q.Y.,

(2008) Curculigo Orchioides, a traditional Chinese medicinal plant, prevents bone loss in ovariectomized rats Maturitas 59, 373-380

9 Chauhan N.S., Dixit V.K., (2007) Antihyperglycemic activity of the ethanolic extract of Curculigo Orchioides Gaertn Pharmacognosy Magazine 3, 237-240

10 Chauhan N.S., and Dixit V.K., (2008) Spermatogenic activity of rhizomes of

Curculigo Orchioides Gaertn on male rats International Journal of Applied Research in Natural Products 1(2) 26-31

11 Chauhan N.S., Rao C.V., and Dixit V.K., (2007) Effect of Curculigo Orchioides rhizomes on sexual behaviour of male rats Fitoterapia 78, 530-534

12 Chauhan N.S., Shrma V., Thankur M., and Dixit V.K., (2010) Curculigo orchioides:

53 the black gold with numerous health benefits Journal of Chinese Integrative Medicine

13 De Klerk G J (2002) Rooting of microcuttings: theory and practice In Vitro Cellular

14 Dhenuka S., Balakrishna P., and Ajith A., (1999) Indirect Organogenesis from the Leaf Explants of Medicinally Journal Plant Biochemistry & Biotechnology 8, 113-

15 Francis S.V., Senapati S.K., and Rout G.R., (2007) Rapid clonal propagation of

Curculigo Orchioides Gaertn., an endangered medicinal plant In vitro Cellular & Developmental Biology - Plant 43, 140-143

16 Fleming A J (2005) Formation of primordia and phyllotaxy Current opinion in plant biology, 8(1), 53-58

17 Fu D.X., Lei G.Q., Xiao W.C., Chen, J.K., and Zhou T.S., (2004) Curculigoside C, A new phenolic glucoside from Rhizomes of Curculigo Orchioides Acta Botanica Sinica 46, 621-624

18 Guirip F.A., (2006) Medicinal plants: tradition of yesterday and drugs of tomorrow, Mol Aspects Med 27(1), 1 – 93

19 Gupta M., Achari B., and Pal B.C., (2005) Glucosides from Curculigo Orchioides Phytochemistry 66, 659-663

20 Hvoslef-Eide A.K., and Preil W., (2005) Liquid culture systems for in vitro plant propagation Springer

21 Joy P.P., Thomas J., Mathew S., and Skaria B.P., (1998) Medicinal Plants 162-163

22 Komamine A., Ito M., Kawahara R., (1997) Cell culture systems as useful mechanisms of the cell cycle and differentiation to maturity, Botanical Bulletin of Academia Sinica, 69 – 85

23 Kubo M., Namba K., Nagamoto N., Nagao T., Nakanishi J., Uno H., and Nishimura H., (1983) A New Phenolic Glucoside, Curculigoside from Rhizomes of Curculigo orchioides Planta medica, 47(1), 52-55

24 Lakshmi N., Kumari S., Yogeshwar S., and Nirmal S., (2004) New Phytoconstituents from the Rhizomes of Curculigo Orchioides Pharmaceutical Biology 42, 131-134

25 Lei J., Da-Peng C., Lu-Ping Q., Ting H., Qiao-Yan Z., Zheng Z., and Fei, Y., (2009) Antiosteoporotic activity of phenolic compounds from Curculigo Orchioides

26 Loyola-Vargas V M., and Vázquez-Flota F., (2005) Plant cell culture protocols- Second edition Methods in Molecular Biology, 318

27 Misra T N., Singh R S., Upadhyay J., Tripathi D N M., (1984) Aliphatic hydroxy- ketones from Curculigo Orchioides rhizomes Phytochemistry, 23(8), 1643-1645

28 Misra T N., Singh R S., Tripathi D M., (1984) Aliphatic compounds from

29 Misawa M., (1994) Plant tissue culture: An alternative for production of useful metabolite, FAO Agriculture Services Bullentin

30 Nagesh K.S., Shanthamma C., and Pullaiah T., (2010) Somatic embryogenesis and plant regeneration from callus cultures of Curculigo Orchioides Gaertn Indian Journal of Biotechnology 9, 408-413

31 Osborne D J., & McManus M T (2005) Hormones, signals and target cells in plant development (Vol 41) Cambridge University Press

32 Pandey A.K., Kumar S., (2013) Chemistry and Biological Activities of Flavonoids:

An Overview, ScientificWorldJournal, NCBI, PMCID: PMC3891543

33 Paula W.M., (2012) The status of temporary immersion system (TIS) technology for plant micropropagation, African Journal of Biotechnology, Vol 11(76), 14025 - 14035.Salema V.F., Sunil K.S., Gyana R.R., (2007) Rapid clonal propagation of

Curculigo orchioides Gaertn., an endangered medicinal plant In vitro Cellular and Developmental Biology - Plant, 43(2):140-143

34 Sarabjeet S.S., Dilip K.A., and Kishan G.R., (2000) A method for large -scale multiplication of Curculigo Orchioides through bulbil formation from leaf explant in shake flask culture Indian Journal of Experimental Biology 38, 145-148

35 Shende C.B., Undal V.S., Chaudhari U.S., (2012) In vitro propagation of Curculago orchioides from rhizome bud Journal of Agricultural Technology 8(1), 353-362

36 Taiz L., Zeiger E., (2006) Plant Physiology, Sinauer Associates, Inc Publishers, Massachusetts, 315 – 344

37 Tong H.K., Bin N.H., Su Y.J., Jeong H.L., and Raekil P., (2013) Curculigo Orchioides protects cisplatin-Induced cell damage The American Journal of Chinese Medicine 41

38 Venkatesh P., Mukherjee P K., Nema N K., Bandyopadhyay A., Fukui, H.,

Mizuguchi H., (2009) Mast cell stabilization and antihistaminic potentials of

Curculigo Orchioides rhizomes Journal of ethnopharmacology, 126(3), 434-436

39 Yeung E.C., Rahman M.H., Thorpe T.A., (1996) Comparative development of zygotic and microscope derived embyos in Brassica napus, Int J Plant science, 27 – 39

40 Wink M., (1999) Biochemistry of plant secondary metabolism Annual plant reviews, vol 2, Sheffield Academic Press, 113-120

41 Wu Q., Da-Xu F., Jun H.A., Qing L.G., Jun L.Z., Chen J.-K., and Tong-Shui Z.,

(2005) Antioxidative Phenols and Phenolic Glycosides from Curculigo Orchioides Chemical and Pharmaceutical Bulletin 53(8), 1065-1067

42 Wu X.Y., Li J.Z., Guo J.Z., Hou B.Y., (2012) Ameliorative Effects of Curculigoside from Curculigo Orchioides Gaertn on Learning and Memory in Aged Rats Molecules

………, ngày tháng năm 2017 ………, ngày tháng năm 2017 Đơn vị chủ trì thực hiện

KS Nguyễn Thị Thanh Thảo

………, ngày tháng năm 2017 ………, ngày tháng năm 2017

Phó Giám đốc phụ trách

Count Average Standard deviation Coeff of variation Standard error Minimum Maximum Range

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

2 Tái sinh chồi từ thân củ

Tỷ lệ mẫu tạo chồi

Count Average Standard deviation Coeff of variation Standard error Minimum Maximum Range

Count Average Standard deviation Standard error Range

Tỷ lệ mẫu tạo chồi

Chiều cao chồi cao nhất

Số lá chồi cao nhất

4 Tạo chồi bằng phương pháp hủy đỉnh

Tỷ lệ mẫu tạo rễ

Nghiem thuc Count Average Variance Standard deviation

7 Thí nghiệm cảm ứng tạo mô sẹo

Trọng lượng tươi mô sẹo

8 Tái sinh chồi từ mô sẹo

9 Thí nghiệm nhân chồi bằng hệ thống TIS

10 Hàm lượng phenol tổng số

Source Sum of Squares Df Mean quare F-Ratio P-Value

11 Hàm lượng flavonoid tổng số

Source Sum of Squares Df Mean quare F-Ratio P-Value

12 Quy trình nhân giống cây Sâm cau

Vật liệu: Thân rễ Sâm cau thu thập trong tự nhiên

Quy trình nhân giống cây Sâm cau được thực hiện theo các bước như sau:

+ Công đoạn 1: Khử trùng mẫu thân rễ để tạo nguồn vật liệu nuôi cấy in vitro:

 Chọn lọc các cây Sâm cau khỏe mạnh, đường kính thân rễ khoảng 1cm, loại bỏ lá, rễ

* Xử lý ngoài tủ cấy gồm 3 bước:

 Bước 1: Rửa sạch mẫu thân rễ với xà phòng loãng

 Bước 2: Cắt mẫu thành các đoạn nhỏ khoảng 3 cm, lắc với dung dịch xà phòng loãng trong 30 phút

 Bước 3: Rửa sạch mẫu với nước từ 3-5 lần

* Xử lý trong tủ cấy gồm 6 bước:

 Bước 1: Chuyển mẫu sang bình tam giác đã hấp khử trùng

 Bước 2: Xử lý mẫu với NaOCl 6% trong 50 phút, rửa với nước cất vô trùng 3 lần

 Bước 3: Xử lý mẫu với CuSO 4 5% trong 20 phút, rửa với nước cất vô trùng 3 lần

 Bước 4: Loại bỏ phần hoại tử, cấy mẫu vào môi trường MS

 Bước 5: Đặt ống nghiệm chứa mẫu ở điều kiện phòng nuôi trong 14 ngày để thu nhận mẫu sống và vô trùng

* Thời gian thực hiện: 8 tuần

+ Công đoạn 2: Tạo nguồn mẫu cây in vitro gồm 2 bước:

 Bước 1: Các chồi ngủ trưởng thành (có 5 – 6 lá), tách bỏ lá và bẹ lá

 Bước 2: Dùng dao cấy hủy đỉnh sinh trưởng và cấy trên môi trường MS

*Thời gian thực hiện: 8 tuần

* Hệ số nhân chồi: 2,08 chồi

+ Công đoạn 3: Tạo cụm chồi bằng phương pháp hủy đỉnh sinh trưởng gồm 4 bước:

 Bước 1: Sử dụng cây Sâm cau in vitro (có 5-6 lá)

 Bước 2: Tách bỏ các bẹ lá từ ngoài vào trong cho tới vùng đỉnh sinh trưởng

 Bước 3: Dùng dao cấy cắt ngang vùng đỉnh sinh trưởng

 Bước 4: Cấy mẫu trên môi trường MS

+ Công đoạn 4: Cảm ứng tạo rễ và tạo cây hoàn chỉnh

 Bước 1: Sử dụng chồi in vitro đạt chiều cao từ 3 – 4 cm với 4 – 5 lá

 Bước 2: Cấy trên môi trường MS

+ Công đoạn 5: Tạo mô sẹo từ lá in vitro gồm 4 bước:

 Bước 1: Sử dụng cây Sâm cau in vitro (cao khoảng 10 cm, có 4 – 6 lá)

 Bước 2: Lá được tách khỏi thân, cắt bỏ cuống và đầu lá

 Bước 3: Cắt lá thành các mảnh nhỏ (kích thước khoảng 1×1 cm)

 Bước 4: Cấy trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L BA kết hợp 1,0 mg/L 2,4 –

 Đặt mẫu trong điều kiện không có ánh sáng

+ Công đoạn 6: Tạo cụm phôi soma từ mô sẹo gồm 2 bước:

 Bước 1: Tách mô sẹo thành các cụm nhỏ (đường kính 1 cm)

 Bước 2: Cấy trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L 2,4 - D kết hợp 2,0 mg/L

+ Công đoạn 7: Tăng trưởng cây trên hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời - TIS, bao gồm 3 bước:

 Bước 1: Chọn các khối mô sẹo đã tạo phôi 4 tuần tuổi

 Bước 2: Cấy vào hộp TIS có chứa 250 ml môi trường MS bổ sung 2 mg/l BA

Để cài đặt hệ thống TIS, cần thiết lập các thông số sau: chu kỳ bơm là 7 giờ/lần và thời gian ngập chìm là 4 phút cho mỗi chu kỳ ngập chìm.

* Điều kiện phòng nuôi: Chiếu sáng 12 giờ/ngày, cường độ ánh sáng 2.500  500 lux, nhiệt độ 25  2 o C, ẩm độ 55  5%

+ Công đoạn 7: Quy trình trồng cây ra vườn ươm:

 Bước 1: Sử dụng cây in vitro có chiều cao 15 cm, đầy đủ lá và rễ

 Bước 2: Rửa sạch môi trường bám trên cây bằng nước có bổ sung vài giọt Iot

 Bước 3: Trồng trong giá thể gồm đất sạch, tro, vụn xơ dừa theo tỉ lệ 8:1:1 Bước 4: Chế độ tưới 2 lần/ngày, phân bón NPK (30-10-10) phun lên lá 1 lần/tuần.

13 Các đề tài hướng dẫn

STT Người thực hiện Tên đề tài Cán bộ hướng dẫn Ghi chú

Khảo sát sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự tạo phôi vô tính ở Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.)

TS Dương Hoa Xô ThS Nguyễn Xuân

Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Sâm cau (Curculigo orchioides

KS Nguyễn Thị Thanh Thảo

14 Công trình công bố khoa học

Tiêu đề	Xây dựng quy trình nhân giống, thu sinh khối in vitro và bước đầu kiểm tra hàm lượng một số hoạt chất sinh học của cây sâm cau (curculigo orchioides gaertn.)
Tác giả	KS. Nguyễn Thị Thanh Thảo, ThS. Đinh Thị Sáu, CN. Nguyễn Văn Long
Trường học	Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học
Thể loại	Báo cáo nghiệm thu nhiệm vụ khoa học & công nghệ
Năm xuất bản	2017
Thành phố	Thành phố Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	80
Dung lượng	1,49 MB