Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây thuốc quý cốt khí củ polygonum cuspidatum siebet zucc

ii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP lên khả năng tái sinh chồi từ chồi ngủ trên đoạn thân cây Cốt khí củ 15 Bảng 2.2 Ảnh hưởng của chất điều h

Trang 1

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.HCM

TRUNG TÂM ƯƠM TẠO DOANH NGHIỆP NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO

BÁO CÁO NGHIỆM THU (GIAI ĐOẠN 1) NHIỆM VỤ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ 2017

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO

CÂY CỐT KHÍ CỦ

(Polygocum cuspidatum Sieb et Zucc.)

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/2017

Trang 2

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.HCM

TRUNG TÂM ƯƠM TẠO DOANH NGHIỆP NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO

BÁO CÁO NGHIỆM THU (GIAI ĐOẠN 1) NHIỆM VỤ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ 2017

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO

Trang 3

ii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP lên khả năng tái sinh chồi từ chồi ngủ trên đoạn thân cây Cốt khí củ 15 Bảng 2.2 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP lên khả năng tái

Bảng 2.3 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật Kinetin lên khả năng tái sinh chồi từ chồi ngủ trên đoạn thân cây Cốt khí củ 17 Bảng 2.4 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật Kinetin lên khả năng

Bảng 2.5 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP kết hợp với NAA

Bảng 2.6 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP kết hợp với IBA

Bảng 2.7 Ảnh hưởng của môi trường khoáng MS biến đổi lên khả năng nhân

Trang 4

ii

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP lên khả năng tái sinh chồi từ mẫu lá non cây Cốt khí củ 21 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật Kinetin lên khả năng tái sinh chồi từ chồi ngủ trên đoạn thân cây Cốt khí củ 23 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật Kinetin lên khả năng tái sinh chồi từ mẫu lá non cây Cốt khí củ 25 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP kết hợp với NAA lên khả năng nhân chồi cây Cốt khí củ 27 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP kết hợp với IBA lên khả năng nhân chồi cây Cốt khí củ 31

Trang 5

i

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 Các bộ phận cây Cốt khí củ (Lá, hoa và củ) 9 Hình 3.1 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP lên khả năng tái sinh chồi từ chồi ngủ trên đoạn thân cây Cốt khí củ 32 Hình 3.2 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP lên khả năng tái sinh chồi từ mẫu lá non cây Cốt khí củ 33 Hình 3.3 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật Kinetin lên khả năng tái sinh chồi từ chồi ngủ trên đoạn thân cây Cốt khí củ 36 Hình 3.4 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật Kinetin lên khả năng tái sinh chồi từ mẫu lá non cây Cốt khí củ 37 Hình 3.5 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP kết hợp với NAA lên khả năng nhân chồi cây Cốt khí củ 40

Trang 6

1.1 Giới thiệu về cây Cốt khí củ 9 1.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu 11 CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

Nội dung 1: Ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật (BAP,

Kinetin) lên khả năng tái sinh chồi từ chồi ngủ và lá non cây Cốt khí củ 14 Nội dung 2: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP kết hợp

với NAA và IBA lên khả năng nhân chồi cây Cốt khí củ 14 Nội dung 3: Ảnh hưởng của môi trường khoáng MS biến đổi, nồng độ đường

sucrose lên khả năng nhân chồi cây Cốt khí củ 14 Nội dung 4: Ảnh hưởng của các chế độ nuôi cấy (Thời gian ngập chìm, số lần

ngập chìm và thể tích môi trường nuôi cấy) lên khả năng nhân chồi cây Cốt khí

củ trên hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời 14 Nội dung 5: Ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật IBA

lên khả năng tạo cây hoàn chỉnh cây Cốt khí củ trên môi trường bán rắn 14

Trang 7

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 15

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật (BAP, Kinetin)

lên khả năng tái sinh chồi từ chồi ngủ và lá non cây Cốt khí củ 30

3.1.1 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP đến khả năng tái

sinh chồi từ chồi ngủ trên đoạn thân cây Cốt khí củ 30

3.1.2 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP đến khả năng tái

sinh chồi từ mẫu lá non cây Cốt khí củ 33

3.1.3 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật Kinetin đến khả năng

tái sinh chồi từ chồi ngủ trên đoạn thân cây Cốt khí củ 23

3.1.4 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật Kinetin đến khả năng

tái sinh chồi từ mẫu lá non cây Cốt khí củ 37

3.2 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP kết hợp với NAA

và IBA lên khả năng nhân chồi cây Cốt khí củ 38

3.2.1 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP kết hợp với NAA

đến khả năng nhân chồi cây Cốt khí củ 38

Thí nghiệm 2.2: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP kết

hợp với IBA đến khả năng nhân chồi cây Cốt khí củ 41

Trang 8

1

THÔNG TIN CHUNG

1 Tên nhiệm vụ: Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Cốt khí củ

(Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc.) (Giai đoạn 1: Xác định môi trường và hệ

số nhân chồi cây Cốt khí củ; Giai đoạn 2: Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời để nhân nhanh chồi và tạo cây hoàn chỉnh trên môi trường bán

rắn)

Chủ nhiệm nhiệm vụ

Họ và tên: Nguyễn Cửu Thành Nhân

Năm sinh: 19/01/1983 Nam/Nữ: Nam

Học vị: Thạc sĩ Chuyên ngành: Sinh lý Thực vật

Năm đạt học vị: 2010

Chức vụ (nếu có): Phó Trưởng phòng Hỗ trợ Công nghệ Tế bào Thực vật

Tên cơ quan đang công tác: Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao TPHCM

Địa chỉ cơ quan: Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, TP HCM

Điện thoại cơ quan: 08 62646103 Fax: 08 62646104

Địa chỉ nhà riêng: 12/25/9 Đông Hưng Thuận 31, Phường Tân Hưng Thuận, Quận 12, TPHCM

Điện thoại nhà riêng: ĐTDĐ: 0989.639.007

E-mail: nhannguyenttut@gmail.com

Cơ quan chủ trì: Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ

cao

Thời gian thực hiện: 2 năm (Từ tháng 3/2017 đến tháng 12/2018)

Kính phí được duyệt: năm 2017 là 122,000,000 đ

2 Nội dung

Giai đoạn 1: năm 2017

Nội dung 1: Ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật (BAP,

Kinetin) đến khả năng tái sinh chồi từ chồi ngủ và mẫu lá non cây Cốt khí củ

Trang 9

2

Thí nghiệm 1.1: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP đến

khả năng tái sinh chồi từ chồi ngủ trên đoạn thân cây Cốt khí củ

Thí nghiệm 1.2: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP đến

khả năng tái sinh chồi từ mẫu lá non cây Cốt khí củ

Thí nghiệm 1.3: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật Kinetin

đến khả năng tái sinh chồi từ chồi ngủ trên đoạn thân cây Cốt khí củ

Thí nghiệm 1.4: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật Kinetin

đến khả năng tái sinh chồi từ mẫu lá non cây Cốt khí củ

Nội dung 2: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP kết hợp với

NAA và IBA đến khả năng nhân chồi cây Cốt khí củ

Thí nghiệm 2.1: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP kết

hợp với NAA đến khả năng nhân chồi cây Cốt khí củ

Thí nghiệm 2.2: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP kết

hợp với IBA đến khả năng nhân chồi cây Cốt khí củ

Giai đoạn 2: năm 2018

Nội dung 3: Ảnh hưởng của môi trường khoáng MS biến đổi, nồng độ đường

sucrose đến khả năng nhân chồi cây Cốt khí củ

Thí nghiệm 3.1: Ảnh hưởng của môi trường khoáng biến đổi đến khả năng

nhân chồi cây Cốt khí củ

Thí nghiệm 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose đến khả năng nhân

chồi cây Cốt khí củ

Nội dung 4: Ảnh hưởng của các chế độ nuôi cấy (Thời gian ngập chìm, số lần

ngập chìm và thể tích) đến khả năng nhân chồi cây Cốt khí củ trên hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời

Thí nghiệm 4.1: Ảnh hưởng của thời gian ngập chìm đến khả năng nhân chồi

cây Cốt khí củ

Thí nghiệm 4.2: Ảnh hưởng của số lần ngập chìm đến khả năng nhân chồi

Trang 10

3

Thí nghiệm 4.3: Ảnh hưởng của thể tích môi trường nuôi cấy đến khả năng

Nội dung 5: Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng tạo cây hoàn chỉnh cây

Cốt khí củ trên môi trường bán rắn

Thí nghiệm 5.1: Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng tạo cây hoàn

chỉnh cây Cốt khí củ trên môi trường bán rắn

3 Sản phẩm

Giai đoạn 1: thực hiện trong năm 2017

- Báo cáo khoa học: Báo cáo được trình bày khoa học, các số liệu được phân tích bằng các phần mềm xử lý thống kê và được hội đồng thông qua

- 50 bình chồi cây Cốt khí củ với tiêu chuẩn: Mỗi bình có khoảng 10 chồi, chiều cao chồi trung bình 3 cm, có 4-5 lá, chồi khỏe mạnh, không bị dị dạng

Giai đoạn 2: thực hiện trong năm 2018

- Báo cáo khoa học: Báo cáo được trình bày khoa học, các số liệu được phân tích bằng các phần mềm xử lý thống kê và được hội đồng thông qua

- Quy trình nhân giống cây Cốt khí củ

- 500 cây Cốt khí củ in vitro có tiêu chuẩn: chiều cao 4-5 cm, có 5-6 lá, có 3-4 rễ, cây con khỏe mạnh, phát triển tốt

BẢNG TIẾN ĐỘ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ

thực hiện

Thời gian thực hiện Giai đoạn 1 (2017)

Kinetin) đến khả năng tái sinh chồi từ chồi ngủ cây Cốt khí củ

1

Thí nghiệm 1.1: Ảnh hưởng

của chất điều hòa sinh trưởng

thực vật BAP đến khả năng tái

sinh chồi từ chồi ngủ trên

Hoàn thành 100%

Nguyễn Cửu Thành Nhân

03/2017 – 06/2017

Trang 11

4

đoạn thân cây Cốt khí củ

2

thực vật BAP đến khả năng tái

sinh chồi từ mẫu lá non cây

Cốt khí củ

Hoàn thành 100%

03/2017 – 06/2017

3

thực vật Kinetin đến khả năng

tái sinh chồi từ chồi ngủ trên

đoạn thân cây Cốt khí củ

Hoàn thành 100%

03/2017 – 06/2017

Nội dung 2: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP kết hợp với NAA và IBA đến khả năng nhân chồi cây Cốt khí củ

Nguyễn Cửu Thành Nhân, Vũ Thị Thúy Hằng

07/2017 – 11/2017

Trang 12

5

7 Tổng hợp tài liệu và viết báo

cáo nghiệm thu (giai đoạn 1)

Hoàn thành 100%

11/11/2017 – 29/11/2017

của môi trường khoáng MS

biến đổi đến khả năng nhân

chồi cây Cốt khí củ

Chưa thực hiện

01/2018 – 03/2018

9

của nồng độ đường sucrose

đến khả năng nhân chồi cây

Cốt khí củ

Chưa thực hiện

01/2018 – 03/2018

ngập chìm và thể tích môi trường nuôi cấy) đến khả năng nhân chồi cây Cốt khí

củ trên hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời

10

của thời gian ngập chìm đến

khả năng nhân chồi cây Cốt

khí củ

Chưa thực hiện

04/2018 – 05/2018

06/2018 – 07/2018

Trang 13

6

của thể tích nuôi cấy đến khả

năng nhân chồi cây Cốt khí

củ

hiện Cửu Thành

Nhân

09/2018

Nội dung 5: Ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật IBA đến

khả năng tạo cây hoàn chỉnh cây Cốt khí củ trên môi trường bán rắn

14

của nồng độ IBA đến khả

năng tạo cây hoàn chỉnh cây

Cốt khí củ trên môi trường

bán rắn

Chưa thực hiện

10/2018 – 11/2018

15 Tổng hợp tài liệu và viết báo

cáo nghiệm thu (giai đoạn 1)

Chưa thực hiện

12/2018

Trang 14

(Polygonum cuspidatum extract) từ thân rễ khô và gốc rễ của cây Cốt khí củ

được sử dụng trong điều trị chống viêm, xơ vữa động mạch và các mục đích trị liệu khác (Zhang và cộng sự, 2003; Jie và Hu, 2000); Nghiên cứu của Chang JS (2005) về dịch chiết cây Cốt khí củ bước đầu cho thấy khả năng chống lại HBV (virus viêm gan B) là một bệnh mãn tính ở khu vực các nước châu Á (Chang và cộng sự, 2005) Tại Việt Nam, Cốt khí củ được sử dụng trong các bài thuốc đông y để điều trị một số bệnh như: phong thấp, khớp, viêm gan cấp tính Việc khai thác rừng để tìm kiếm nguồn dược liệu đã làm cho trữ lượng các cây dược liệu nói chung cũng như cây Cốt khí củ nói riêng ngày một giảm Phương pháp nhân giống truyền thống còn nhiều hạn chế như: hệ số nhân thấp, việc giâm cành phụ thuộc vào mùa để chọn các cành giâm đạt tiêu chuẩn…

Phương pháp nhân giống in vitro với có ưu điểm như: tốc độ nhân nhanh,

chọn lọc được các giống sạch bệnh, cung cấp được số lượng cây lớn và đồng đều về mặt di truyền Xuất phát từ thực tiễn nêu trên nhiệm vụ khoa học cấp cơ

sở:“Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Cốt khí củ (Polygonum

cuspidatum Sieb et Zucc.)” được thực hiện là cần thiết

Mục tiêu

Xây dựng được quy trình vi nhân giống cây Cốt khí củ (Polygonum

cuspidatum Sieb et Zucc.)

Giới hạn nghiên cứu

Trang 15

8

- Đối tượng nghiên cứu là cây Cốt khí củ được thu thập tại Trung tâm Sâm và dược liệu thành phố Hồ Chí Minh, các nghiên cứu về vi nhân giống được thực hiện tại phòng thí nghiệm tế bào thực vật thuộc Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao – TPHCM

- Thời gian thực hiện nghiên cứu gồm 2 giai đoạn: giai đoạn 1 (năm 2017) khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến khả năng tái sinh chồi và nhân chồi cây Cốt khí củ, giai đoạn 2 ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời để nhân nhanh chồi cây Cốt khí củ và nuôi cấy ra rễ tạo cây hoàn chỉnh trên môi trường bán rắn

Trang 16

9

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về cây Cốt khí củ

Phân loại khoa học:

(Không phân hạng): Thực vật có hoa (Angiospermae)

(Không phân hạng): Hai lá mầm (Eudicots)

(Không phân hạng): Core eudicots

Bộ: Cẩm chướng (Caryophyllales)

Họ: Rau răm (Polygonaceae)

Loài: Fallopia japonica

Danh pháp đồng nghĩa: Reynoutria japonica, Polygonum cuspidatum Sieb et

Zucc

Tên Việt Nam: Cốt khí củ

Hình 1.1 Các bộ phận cây Cốt khí củ (Lá, hoa và củ)

Trang 17

10

Cốt khí củ – một loài dược liệu quý hiếm hiện vẫn còn chưa được nghiên cứu nhiều do tính mới, cũng như tính khó khi nghiên cứu bảo tồn loài này Cốt khí củ còn gọi là hoạt huyết đan, tử kim long, ban trượng căn, hổ trượng căn,

điền thất (miền nam) Cốt khí củ có tên khoa học là Polygonum cuspidatum

Sieb et Zucc, thuộc họ rau răm Polygonaceae

Trong dân gian Cốt khí củ là một vị thuốc dùng chữa tê hấp, chấn thương

và còn là một vị thuốc cầm máu (http://tuelinh.vn/cot-khi-cu-386)

Cốt khí củ là một loại cây nhỏ sống lâu năm, thân mọc thẳng, thường cao 0,5-1m nhưng đặc biệt có nơi cao tới 2 m Thân không có lông, trên thân và cành thường có những đốm màu tím hồng Lá mọc so le có cuống ngắn Phiến lá hình trứng, rộng, đầu trên hơi thắt nhọn, phía cuống hoặc hơi phẳng hoặc hơi dẹp lại, mép nguyên, dài 5-12 cm, rộng 3,5-8 cm, mặt trên màu xanh nâu đậm mặt dưới màu nhạt hơn Cuống dài 1-3 cm, bẹ chìa ngắn Hoa mọc thành chùm

ở kẽ lá, mang rất nhiều hoa nhỏ Cánh hoa màu trắng, hoa khác gốc, hoa đực có

8 nhị hoa cái có bầu hình trứng với 3 cạnh, 3 núm, quả khô, 3 cạnh, màu nâu đỏ Phân bố, thu hái và chế biến: cây cốt khí củ mọc hoang ở nhiều nơi, ở đồi núi hoặc ven đường, miền đồng bằng và được trồng để lấy củ làm thuốc Trồng bằng củ, rất dễ mọc Còn thấy ở Trung Quốc (Giang Tô, Triết Giang)

Cây ra hoa vào các tháng 8-9, ra quả vào các tháng 9-10

Mùa thu hoạch quanh năm, nhưng tốt nhất vào mùa thu (tháng 8-9), có nơi thu hái vào các tháng 2-3 Đào về, cắt bỏ rễ con, rửa sạch đất cắt thành từng mẩu ngắn dài không đều hoặc thái mỏng, phơi hay sấy khô Kích thước các đốt dài ngắn không đều thường dài 1-8cm, đường kính 0,6-2cm, mặt ngoài màu nâu vàng, khi bẻ hay cắt ngang có màu vàng, mùi không rõ, vị hơi đắng (http://caythuocthiennhien.com/cu-cot-khi-6862404.html)

Một số bài thuốc đông y có sử dụng cây Cốt khí củ:

- Phong thấp, viêm khớp, đầu gối và mu bàn chân sưng đỏ đau nhức: củ Cốt khí, Gối hạc, lá Bìm bìm, Mộc thông, mỗi vị 15-20 g sắc uống

Trang 18

11

- Viêm gan cấp tính, sưng gan: Cốt khí củ, Lá móng, Chút chít, mỗi vị

15-20 g sắc uống Hoặc dùng Cốt khí với Nhân trần, mỗi vị 30 g, sắc uống

- Thương tích, ứ máu, đau bụng: Cốt khí củ 20 g, Lá móng 30 g, nước 300

ml, sắc còn 150 ml, hoà thêm 20 ml rượu, chia 2 lần uống trong ngày

Giá bán hiện nay (Nhà thuốc Y học cổ truyền An Quốc Thái) là 1,000,000 đ/kg củ khô và nhu cầu nguồn nguyên liệu của nhà thuốc hằng năm từ: 50 đến

100 tấn

1.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu

Tình hình nghiên cứu trong nước

Hiện tại trong nước chưa có công trình nghiên cứu nhân giống in vitro nào

về cây Cốt khí củ được công bố (Theo phiếu khảo sát thông tin CESTI số: 138/2016 của Trung tâm thông tin Khoa học và Công nghệ TPHCM ngày: 15/12/2016)

Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

Trong rễ cây Cốt khí củ chứa nhóm chất antraglucozit chủ yếu là emodin hay rheum emodin C15H10O5 dưới dạng tự do và kết hợp Ngoài ra còn có chất polygonin C12H20O10 và tanin Emodin được phát hiện có khả năng điều trị dòng

virus CVB4 kháng thuốc (Zhang và cộng sự, 2006)

Chiết xuất PCE (Polygonum cuspidatum extract) từ thân rễ khô và gốc rễ

của cây Cốt khí củ là bài thuốc y học cổ truyền Trung Quốc được sử dụng trong điều trị chống viêm, xơ vữa động mạch và các mục đích trị liệu khác (Zhang và cộng sự, 2003; Jie và Hu, 2000), PCE đã được ghi nhận ở trung tâm dự trữ dược phẩm Trung Quốc (CP) Resveratrol (3,4’,5-trihydrohydroxystilbene) là một trong những thành phần hoạt động của nó (Donggeng Wang, 2008)

Nghiên cứu của Chang JS (2005) về dịch chiết cây Cốt khí củ bước đầu cho thấy khả năng chống lại HBV (virus viêm gan B) là một bệnh mãn tính ở khu vực các nước châu Á (Chang và cộng sự, 2005)

Bằng phương pháp phân tích HSCCC (High-speed counter-current chromatography) các hợp chất trong dịch chiết cây Cốt khí củ đã được tinh chế

Trang 19

12

với 5 hợp chất: piceid, anthraglycoside B, resveratrol, emodin và physcion (Hegde và công sự, 2004)

Nghiên cứu của Lin RuoZhou (2011) về nuôi cấy tạo mô sẹo cây Cốt khí củ

từ mẫu lá: môi trường nuôi cấy bao gồm khoáng cơ bản MS bổ sung 0,2 mg/l 2,4D và 1,0 mg/l BAP, được nuôi cấy trong điều kiện tối hoàn toàn, sau thời gian nuôi cấy 3 tuần, mẫu mô sẹo được thu nhận để phân tích thành phần resveratrol (Lin RuoZhou, 2011)

Nghiên cứu của Yi Aiqin và cộng sự (2007) về nhân giống in vitro cây Cốt

khí củ: môi trường nhân chồi bao gồm khoáng cơ bản MS có bổ sung 2,0 mg/l BAP, 0,2 mg/l IBA, 3% đường sucrose, 0,7% agar cho hệ số nhân chồi 3,4 lần sau 30 ngày nuôi cấy, môi trường nuôi cấy tạo rễ gồm khoáng cơ bản 1/2MS có

bổ sung 0,5 mg/l IBA, 3% đường sucrosr và 0,7% agar cho kết quả 100% ra rễ, chiều dài rễ trung bình 2 cm, chiều cao cây trung bình 3,5 cm và tỷ lệ đưa ra vườn ươm sống sót 96,25% (Yi Aiqin và cộng sự 2007)

Một nghiên cứu của Zhan Li-Ping và cộng sự (2012) cũng cho kết quả tương tự nghiên cứu của YI Aiqin và cộng sự (2007) với cùng các thành phần môi trường nuôi cấy nhân chồi cho kết quả hệ số nhân chồi là 3,6 lần so với 3.4 lần, với cùng các thành phần môi trường nuôi cấy tạo rễ cho tỷ lệ ra rễ 100% (Zhan Li-Ping và cộng sự 2012)

Một nghiên cứu về tái sinh chồi từ mẫu gân và cuống lá cây Kiều mạch

(Fagopyrum esculentum) thuộc họ rau răm (Polygonaceae) cho thấy sự tái sinh

chồi cao nhất trên môi trường nuôi cấy MS chứa các thành phần vitamin Gamborg, 1 mg/l 6-benzylaminopurine (BAP), 1 mg/l 6-(γ,γ-Dimethylallylamino) purine (2iP), 1 mg/l 2,3,5-triiodobenzoic acid (TIBA) và

30 g/l đường sucrose Tỷ lệ tái sinh chồi đạt 98% (Jolanta Slawinska và cộng sự, 2009)

Sabreena Rashid và cộng sự (2014) nghiên cứu trên cây Rheum webbianum Royle, là một cây thuốc quý cùng họ rau răm (Polygonaceae) đang phát triển ở Kashmir Himalaya Nó có chức năng bảo vệ gan, giảm co thắt,

Trang 20

13

chống cholesterol, kháng thể, khử trùng, chống nấm, chống vi khuẩn, chống Parkinson, chống tăng sinh, tăng cường miễn dịch, kháng vi rút tính chất chống oxy hóa Nghiên cứu này, mới mục đích chuẩn hóa quy trình nhân giống nhằm bảo tồn và nhân rộng loài thực vật đang bị đe dọa này Mô sẹo thu được khi các thân rễ đã được nuôi cấy trên môi trường MS có chứa auxins độc lập hoặc kết hợp 2, 4-D ở nồng độ 0,5 mg/l cho thấy hiệu quả tăng sinh khối mô sẹo trong một khoảng thời gian là 30 ngày Mô sẹo hình thành từ thân rễ có sự khác biệt trên các môi trường nuôi cấy MS bổ sung với nồng độ khác nhau của auxins (IAA, IBA) và (BAP) Số lượng chồi tối đa (2,8 ± 0,2) được tái sinh trên môi trường MS bổ sung BAP (5,0 mg/l) và IAA (2,0 mg/l) sau 16 ngày

Du Quan và cộng sự (1998) nghiên cứu về sự hình thành và tăng sinh mô

sẹo đối với cây Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum, một chi thuộc ho rau răm)

bởi ảnh hưởng của các đơn và đa yếu tố các chất điều hòa sinh trưởng thực vật: 2,4-D, BAP và IBA cho thấy môi trường nuôi cấy cho sự hình thành và tăng sinh mô sẹo tốt nhất có bổ sung các thành phần kết hợp: mô trường cơ bản MS + 2,4-D 1 mg/l + BAP 1 mg/l và IBA 0,5 mg/l Tỷ lệ hình thành mô sẹo đạt 95% sau 12 ngày nuôi cấy (Du Quan và cộng sự, 1998)

Cốt khí củ là một cây dược liệu quý, được các nhà nghiên cứu trên thế giới nghiên cứu về tác dụng dược lý của các thành phần hoạt chất được chiết xuất từ cây Cốt khí củ Cốt khí củ là một đối tượng nghiên cứu mới, có tính khó Tuy nhiên, những nghiên cứu về vi nhân giống thì còn rất ít, do đó quá trình nghiên cứu về vi nhân giống đối tượng này cần tìm hiểu thêm các tài liệu nghiên cứu về

vi nhân giống các cây cùng chi và cùng họ, để làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu về đối tượng này

Trang 21

14

CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

Kinetin) đến khả năng tái sinh chồi từ chồi ngủ và lá non cây Cốt khí củ

Nội dung 2: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP kết hợp với

NAA và IBA đến khả năng nhân chồi cây Cốt khí củ

Nội dung 3: Ảnh hưởng của môi trường khoáng MS biến đổi, nồng độ đường

sucrose lên khả năng nhân chồi cây Cốt khí củ

ngập chìm và thể tích môi trường nuôi cấy) lên khả năng nhân chồi cây Cốt khí

củ trên hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời

Nội dung 5: Ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thực vật IBA lên

khả năng tạo cây hoàn chỉnh cây Cốt khí củ trên môi trường bán rắn

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Địa điểm: Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao - Ấp

1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh

Thời gian: Từ tháng 3/2017 đến tháng 12/2017

2.3 Vật liệu nghiên cứu

- Cây Cốt khí củ được lấy từ Trung tâm Sâm và dược liệu Thành phố Hồ Chí Minh

Trang 22

15

4 Phương pháp nghiên cứu

Thí nghiệm 1.1: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP lên khả

năng tái sinh chồi từ chồi ngủ trên đoạn thân cây Cốt khí củ

Đối tượng thí nghiệm: Đoạn thân cây Cốt khí củ có chiều dài 3-4 cm có

mang chồi ngủ đã được khử trùng Đoạn thân sau khi khử trùng được nuôi cấy trên môi trường: khoáng cơ bản MS + 30 g/l đường sucrose có bổ sung BAP với các nồng độ khác nhau với thời gian nuôi cấy 8 tuần tại phòng Hỗ trợ Công nghệ

Tế bào Thực vật thuộc Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao

Phương pháp thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu

nhiên 1 yếu tố (CRD) với bốn lần lặp lại Mỗi nghiệm thức có 10 bình, mỗi bình

có 3 đốt thân mang chồi ngủ, thể tích môi trường 40 ml, bình thủy tinh nuôi cấy

250 ml Tổng số mẫu của thí nghiệm là 480

Bảng 2.1 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP lên khả năng

tái sinh chồi từ chồi ngủ trên đoạn thân cây Cốt khí củ

STT Kí hiệu công thức Nồng độ BAP (mg/l)

Chỉ tiêu theo dõi:

- Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (%)

Thời gian theo dõi: 8 tuần

Điều kiện nuôi cấy:

- Nhiệt độ: 25±2oC

- Thời gian chiếu sáng: 12h/ngày

- Cường độ chiếu sáng: 2000 lux

Thời gian thực hiện: Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 03/2017 –

06/2017

Trang 23

16

Thí nghiệm 1.2: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP lên khả

năng tái sinh chồi từ mẫu lá non cây Cốt khí củ

Đối tượng thí nghiệm: Mẫu lá non 7 ngày tuổi cây Cốt khí củ có chiều dài

4-5 cm đã được khử trùng Mẫu lá non sau khi đã khử trùng được cắt ngang với chiều rộng 0,5-1,0 cm được nuôi cấy trên môi trường: khoáng cơ bản MS + 30 g/l đường sucrose có bổ sung BAP với các nồng độ khác nhau với thời gian nuôi cấy 8 tuần tại phòng Hỗ trợ Công nghệ Tế bào Thực vật thuộc Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao

có 3 mẫu lá, thể tích môi trường 40 ml, bình thủy tinh nuôi cấy 250 ml Tổng số mẫu của thí nghiệm là 480

Bảng 2.2 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP lên khả năng

tái sinh chồi từ mẫu lá non cây Cốt khí củ

STT Kí hiệu công thức Nồng độ BAP (mg/l)

06/2017

Trang 24

17

Thí nghiệm 1.3: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật Kinetin

lên khả năng tái sinh chồi từ chồi ngủ trên đoạn thân cây Cốt khí củ

Đối tượng thí nghiệm: Đoạn thân cây Cốt khí củ có chiều dài 3-4 cm có

mang chồi ngủ đã được khử trùng từ thí nghiệm Đoạn thân sau khi khử trùng được nuôi cấy trên môi trường: khoáng cơ bản MS + 30 g/l đường sucrose có bổ sung Kinetin với các nồng độ khác nhau với thời gian nuôi cấy 8 tuần tại phòng

Hỗ trợ Công nghệ Tế bào Thực vật thuộc Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao

có 3 đốt thân mang chồi ngủ, thể tích môi trường 40 ml, bình thủy tinh nuôi cấy

250 ml Tổng số mẫu của thí nghiệm là 480

Bảng 2.3 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật Kinetin lên khả

năng tái sinh chồi từ chồi ngủ trên đoạn thân cây Cốt khí củ

STT Kí hiệu công thức Nồng độ Kinetin (mg/l)

06/2017

Trang 25

18

Thí nghiệm 1.4: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật Kinetin

lên khả năng tái sinh chồi từ mẫu lá non cây Cốt khí củ

Đối tượng thí nghiệm: Mẫu lá non 7 ngày tuổi cây Cốt khí củ có chiều dài

4-5 cm đã được khử trùng Mẫu lá non sau khi đã khử trùng được cắt ngang với chiều rộng 0,5-1,0 cm được nuôi cấy trên môi trường: khoáng cơ bản MS + 30 g/l đường sucrose có bổ sung Kinetin với các nồng độ khác nhau với thời gian nuôi cấy 8 tuần tại phòng Hỗ trợ Công nghệ Tế bào Thực vật thuộc Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao

có 3 mẫu lá, thể tích môi trường 40 ml, bình thủy tinh nuôi cấy 250 ml Tổng số mẫu của thí nghiệm là 480

Bảng 2.4 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật Kinetin lên khả

năng tái sinh chồi từ mẫu lá non cây Cốt khí củ

STT Kí hiệu công thức Nồng độ Kinetin (mg/l)

06/2017

Trang 26

19

Thí nghiệm 2.1: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP

kết hợp với NAA lên khả năng nhân chồi cây Cốt khí củ

Đối tượng thí nghiệm: Chồi cây Cốt khí củ có chiều dài 2-3 cm từ thí

nghiệm 1.1, 1.2, 1.3 và 1.4 được sử dụng cho thí nghiệm này Chồi cây Cốt khí

củ được nuôi cấy trên môi trường: khoáng cơ bản MS + 30 g/l đường sucrose có

bổ sung BAP kết hợp với NAA với các nồng độ khác nhau, thời gian nuôi cấy 8 tuần tại phòng Hỗ trợ Công nghệ Tế bào Thực vật thuộc Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao

có 3 mẫu chồi, thể tích môi trường 40 ml, bình thủy tinh nuôi cấy 250 ml Tổng

số mẫu của thí nghiệm là 432 mẫu

Bảng 2.5 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP kết hợp với

NAA lên khả năng nhân chồi cây Cốt khí củ

Trang 27

20

- Tỷ lệ nhân chồi (%)

- Hệ số nhân chồi (lần)

11/2017

Thí nghiệm 2.2: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP

kết hợp với IBA lên khả năng nhân chồi cây Cốt khí củ

Đối tượng thí nghiệm: Chồi cây Cốt khí củ có chiều dài 2-3 cm từ thí

nghiệm 1.1, 1.2, 1.3 và 1.4 được sử dụng cho thí nghiệm này Chồi cây Cốt khí

củ được nuôi cấy trên môi trường: khoáng cơ bản MS + 30 g/l đường sucrose có

bổ sung BAP kết hợp với IBA với các nồng độ khác nhau, thời gian nuôi cấy 8 tuần tại phòng Hỗ trợ Công nghệ Tế bào Thực vật thuộc Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao

có 3 mẫu chồi, thể tích môi trường 40 ml, bình thủy tinh nuôi cấy 250 ml Tổng

số mẫu của thí nghiệm là 432 mẫu

Bảng 2.6 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP kết hợp với

IBA lên khả năng nhân chồi cây Cốt khí củ

Trang 28

11/2017

Thí nghiệm 3.1: Ảnh hưởng của môi trường khoáng MS biến đổi lên khả năng

Đối tượng thí nghiệm: Cụm chồi cây Cốt khí củ có kích thước đường kính 2-3 cm

ở các thí nghiệm trong nội dung 2 được sử dụng trong thí nghiệm này Cụm chồi được tách nhỏ các kích thước đường kính 1 cm và nuôi cấy trên môi trường: với nồng độ BAP tốt nhất ở các thí nghiệm nội dung 2, bổ sung 30 g/l đường sucrose, thành phần môi trường khoáng MS được bố trí theo bảng với thời gian nuôi cấy 8 tuần tại phòng

Trang 29

22

Phương pháp thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên

1 yếu tố (CRD) với bốn lần lặp lại Mỗi nghiệm thức có 10 bình, mỗi bình có 3 chồi, thể tích môi trường 40 ml, bình thủy tinh nuôi cấy 250 ml Tổng số mẫu của thí nghiệm là 480

Bảng 2.7 Ảnh hưởng của môi trường khoáng MS biến đổi lên khả năng nhân chồi cây

- Nhiệt độ: 25±2 o C

Thời gian thực hiện: Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 01/2018 – 03/2018

Thí nghiệm 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose lên khả năng nhân chồi

ở các thí nghiệm trong nội dung 2 được sử dụng trong thí nghiệm này Cụm chồi được tách nhỏ các kích thước đường kính 1 cm và nuôi cấy trên môi trường: với nồng độ BAP tốt nhất ở các thí nghiệm nội dung 2, môi trường khoáng MS biến đổi tốt nhất ở

Trang 30

23

thí nghiệm 3.1, và nồng độ đường sucrose theo các nồng độ được bố trí theo bảng với thời gian nuôi cấy 8 tuần tại phòng Hỗ trợ Công nghệ Tế bào Thực vật thuộc Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao

Bảng 2.8 Ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose lên khả năng nhân chồi cây Cốt khí

Thí nghiệm 4.1: Ảnh hưởng của thời gian ngập chìm lên khả năng nhân chồi cây

Cốt khí củ

Trang 31

24

ở các thí nghiệm trong nội dung 2 được sử dụng trong thí nghiệm này Cụm chồi được tách nhỏ các kích thước đường kính 1 cm và nuôi cấy trên hệ thống ngập chìm tạm thời: thành phần môi trường nuôi cấy kế thừa các kết quả ở các nội dung 2 và 3, thời gian ngập chìm mẫu cấy được bố trí theo bảng với thời gian nuôi cấy 8 tuần tại phòng

1 yếu tố (CRD) với ba lần lặp lại Mỗi nghiệm thức có 1 bình, tỷ lệ mẫu cấy 5% trọng lượng môi trường nuôi cấy, thể tích hệ thống nuôi cấy 2 lít, tổng số hệ thống sử dụng

là 9

Bảng 2.9 Ảnh hưởng thời gian ngập chìm lên khả năng nhân chồi cây Cốt khí củ

STT Kí hiệu công thức Thời gian ngập chìm (phút)

Thí nghiệm 4.2: Ảnh hưởng của số lần ngập chìm lên khả năng nhân chồi cây Cốt

khí củ

Trang 32

25

ở các thí nghiệm trong nội dung 2 được sử dụng trong thí nghiệm này Cụm chồi được tách nhỏ các kích thước đường kính 1 cm và nuôi cấy trên hệ thống ngập chìm tạm thời: thành phần môi trường nuôi cấy kế thừa các kết quả ở các nội dung 2 và 3, với thời gian nuôi cấy 8 tuần tại phòng Hỗ trợ Công nghệ Tế bào Thực vật thuộc Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao

Trang 33

26

Thí nghiệm 4.3: Ảnh hưởng của thể tích nuôi cấy lên khả năng nhân chồi cây Cốt

khí củ

ở các thí nghiệm trong nội dung 2 được sử dụng trong thí nghiệm này Cụm chồi được tách nhỏ các kích thước đường kính 1 cm và nuôi cấy trên hệ thống ngập chìm tạm thời: thành phần môi trường nuôi cấy kế thừa các kết quả ở các nội dung 2 và 3, với thời gian nuôi cấy 8 tuần tại phòng Hỗ trợ Công nghệ Tế bào Thực vật thuộc Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao

là 12

Bảng 2.11 Ảnh hưởng số lần ngập chìm lên khả năng nhân chồi cây Cốt khí củ

STT Kí hiệu công thức Thể tích nuôi cấy (ml)

Trang 34

27

Thí nghiệm 5.1: Ảnh hưởng của nồng độ IBA lên khả năng tạo cây hoàn chỉnh

cây Cốt khí củ trên môi trường bán rắn

Đối tượng thí nghiệm: Chồi cây Cốt khí củ có chiều dài 2-3 cm in vitro Chồi được

nuôi cấy trên môi trường: các kết quả tốt nhất ở các nội dung 2,3 có bổ sung IBA với các nồng độ khác nhau với thời gian nuôi cấy 8 tuần tại phòng Hỗ trợ Công nghệ Tế bào Thực vật thuộc Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao

Bảng 2.12 Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật IBA lên khả năng ra rễ

tạo cây hoàn chình cây Cốt khí củ

STT Kí hiệu công thức Nồng độ IBAP (mg/l)

- Chiều cao cây (cm)

- Số lá/cây (số lá)

- Số rễ/cây (số rễ)

Tiêu đề	Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây cốt khí củ (Polygonum Cuspidatum Sieb. Et Zucc.)
Tác giả	Nguyễn Cửu Thành Nhân
Trường học	Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM
Chuyên ngành	Nông nghiệp
Thể loại	Báo cáo nghiệm thu
Năm xuất bản	2017
Thành phố	Thành phố Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	68
Dung lượng	2,26 MB