NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nội dung nghiên cứu
Giai đoạn 1 (đã nghiệm thu năm 2017): Nhân nhanh cụm chồi in vitro cây Cốt Khí Củ
2.1.1 Nội dung 1: Ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật (BAP, Kinetin) lên khả năng tái sinh chồi từ chồi ngủ và lá non cây Cốt khí củ
2.1.2 Nội dung 2: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP kết hợp với NAA và IBA lên khả năng nhân chồi cây Cốt khí củ
Giai đoạn 2 (thực hiện năm 2018): Tạo cây Cốt Khí Củ in vitro hoàn chỉnh
2.1.3 Nội dung 3: Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP kết hợp với IBA lên khả năng nhân chồi cây Cốt khí củ Đối tượng thí nghiệm: Chồi cây Cốt khí củ có chiều cao 2 – 3cm Chồi cây
Cốt khí củ được nuôi cấy trên môi trường: khoáng cơ bản MS + đường sucrose
30 g/L có bổ sung BAP kết hợp với IBA với các nồng độ khác nhau (bảng 2.1)
Hình 2.1Chồi cây Cốt khí củ in vitro
Nghiên cứu được thực hiện thông qua phương pháp thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 yếu tố (CRD) và có bốn lần lặp lại Mỗi nghiệm thức bao gồm 3 bình, với mỗi bình chứa 3 mẫu chồi, tổng thể tích môi trường là 40 mL trong bình thủy tinh nuôi cấy 250 mL Tổng số mẫu được sử dụng trong thí nghiệm là 576 mẫu.
Bảng 2.1 Các nghiệm thức ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với IBA lên khả năng nhân chồi cây Cốt khí củ
IBA BAP 0,1 (mg/L) 0,2 (mg/L) 0,3 (mg/L) 0,4 (mg/L)
2,0 (mg/L) IB1 IB2 IB3 IB4
2,2 (mg/L) IB5 IB6 IB7 IB8
2,4 (mg/L) IB9 IB10 IB11 IB12
2,6 (mg/L) IB13 IB14 IB15 IB16
Chỉ tiêu theo dõi: HSN chồi (lần)
Số chồi TB/mẫu (chồi/mẫu) Chiều cao chồi TB (cm)
Thời gian theo dõi: 8 tuần Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ: 25 ± 2 o C
Thời gian chiếu sáng: 12h/ngày Cường độ chiếu sáng: 2000 lux
Thời gian thực hiện: từ tháng 01/2018 đến 02/2018
2.1.4 Nội dung 4: Ảnh hưởng của môi trường khoáng MS biến đổi, nồng độ đường sucrose lên chất lượng chồi cây Cốt khí củ
Thí nghiệm 4.1 nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường khoáng MS biến đổi đến chất lượng chồi cây Cốt khí củ Đối tượng của thí nghiệm là cụm chồi cây Cốt khí củ có kích thước đường kính nhất định.
Chiều cao 2 – 3cm và kích thước chồi đường kính 1 cm được sử dụng trong thí nghiệm này Các cụm chồi được nuôi cấy trên môi trường với nồng độ BAP và IBA tối ưu, bổ sung 30 g/L đường sucrose, theo thành phần môi trường khoáng MS được trình bày trong bảng 2.2.
Phương pháp thí nghiệm được thực hiện theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố (CRD) với bốn lần lặp lại Mỗi nghiệm thức bao gồm 10 bình, đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả.
13 có 3 chồi, thể tích môi trường 40 mL, bình thủy tinh nuôi cấy 250 mL Tổng số mẫu của thí nghiệm là 480
Bảng 2.2 Các nghiệm thức ảnh hưởng của môi trường khoáng MS biến đổi lên chất lƣợng chồi cây Cốt khí củ
STT Kí hiệu công thức Khoáng MS biến đổi
4 CT3 ẵ tất cả cỏc thành phần MS
Chỉ tiêu theo dõi: HSN chồi (lần)
Số chồi TB/mẫu (chồi/mẫu) Chiều cao chồi TB (cm)
Thời gian theo dõi: 8 tuần Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ: 25 ± 2 o C
Thời gian chiếu sáng: 12h/ngày Cường độ chiếu sáng: 2000 lux
Thời gian thực hiện: từ tháng 03/2018 đến 04/2018
Thí nghiệm 4.2 nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose đến chất lượng chồi cây Cốt khí củ Đối tượng thí nghiệm là cụm chồi cây Cốt khí củ có kích thước đường kính nhất định.
Trong thí nghiệm 3, chiều cao mẫu được duy trì ở mức 2 – 3cm Cụm chồi được tách nhỏ với đường kính 1cm và được nuôi cấy trên môi trường tối ưu tại thí nghiệm 4.1, với nồng độ đường sucrose được bố trí theo bảng 2.3.
Nghiên cứu này sử dụng phương pháp thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố (CRD) với bốn lần lặp lại Mỗi nghiệm thức bao gồm 10 bình, mỗi bình chứa 3 chồi trong môi trường có thể tích 40 mL, sử dụng bình thủy tinh nuôi cấy 250 mL Tổng số mẫu thí nghiệm là 480.
Bảng 2.3 Các nghiệm thức ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose lên chất lƣợng chồi cây Cốt khí củ
STT Kí hiệu công thức Nồng độ đường sucrose (g/L)
Chỉ tiêu theo dõi: HSN chồi (lần)
Số chồi TB/mẫu (chồi/mẫu) Chiều cao chồi TB (cm)
Thời gian theo dõi: 8 tuần Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ: 25 ± 2 o C
Thời gian chiếu sáng: 12h/ngày Cường độ chiếu sáng: 2000 lux
Thời gian thực hiện: từ tháng 05/2018 đến 06/2018
2.1.5 Nội dung 5: Ảnh hưởng của các chế độ nuôi cấy (Thời gian ngập chìm, số lần ngập chìm và thể tích môi trường nuôi cấy) lên khả năng nhân chồi cây Cốt khí củ trên hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời
Thí nghiệm 5.1 nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ngập chìm đến khả năng nhân chồi của cây Cốt khí củ Đối tượng thí nghiệm là cụm chồi cây Cốt khí củ với kích thước đường kính xác định.
Chiều cao của mẫu thí nghiệm là 2 – 3 cm, với các cụm chồi được tách nhỏ có đường kính 1 cm Những cụm chồi này được nuôi cấy trên hệ thống ngập chìm tạm thời, sử dụng thành phần môi trường nuôi cấy dựa trên các kết quả từ nội dung 3 Thời gian ngập chìm cho mẫu cấy được sắp xếp theo bảng 2.4.
Phương pháp thí nghiệm được thực hiện theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố (CRD) với bốn lần lặp lại Mỗi nghiệm thức bao gồm 5 bình, đảm bảo tỷ lệ mẫu chính xác.
15 cấy 5% trọng lượng môi trường nuôi cấy, thể tích hệ thống nuôi cấy 2 lít, tổng số hệ thống sử dụng là 60
Hình 2.2Bố trí thí nghiệm thời gian ngập chìm tạm thời
Bảng 2.4 Các nghiệm thức ảnh hưởng thời gian ngập chìm lên khả năng nhân chồi cây Cốt khí củ
STT Kí hiệu công thức Thời gian ngập chìm (phút)
Chỉ tiêu theo dõi: HSN chồi (lần)
Số chồi TB/mẫu (chồi/mẫu) Chiều cao chồi TB (cm)
Thời gian theo dõi: 8 tuần Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ: 25 ± 2 o C
Thời gian chiếu sáng: 12h/ngày Cường độ chiếu sáng: 2000 lux
Thời gian thực hiện: từ tháng 05/2018 đến 06/2018
Thí nghiệm 5.2 nghiên cứu ảnh hưởng của số lần ngập chìm đến khả năng nhân chồi của cây Cốt khí củ Đối tượng thí nghiệm là cụm chồi cây Cốt khí củ với kích thước đường kính xác định.
2 – 3cm, chiều cao 2 – 3cm ở các thí nghiệm trong nội dung 3 đƣợc sử dụng trong thí nghiệm này Cụm chồi được tách nhỏ các kích thước đường kính 1 cm
Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời được áp dụng với thành phần môi trường kế thừa từ các kết quả ở nội dung 3 Thời gian nuôi cấy ngập chìm tối ưu được xác định từ thí nghiệm 5.1, trong khi số lần ngập chìm mẫu cấy được trình bày theo bảng 2.5.
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm: Trung tâm Ƣơm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao
- Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh
Thời gian: Từ tháng 01/2018 đến tháng 12/2018.
Vật liệu nghiên cứu
Cụm chồi và chồi cây Cốt khí củ in vitro đã hoàn thành giai đoạn 1 nghiên cứu vào năm 2017 và được nghiệm thu kết quả Những kết quả này đã được áp dụng để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo trong giai đoạn 2 vào năm 2018.
Thiết bị và hóa chất sử dụng:
Máy đo pH cầm tay Hanna 90993
Tủ cấy vô trùng – SCBN 1200
Nồi hấp tiệt trùng – HV 110
Hóa chất và các dụng cụ sử dụng cho lĩnh vực Công nghệ Tế bào Thực vật…
Phương pháp thí nghiệm
Phương pháp nhân nhanh chồi
Mẫu chồi Cốt khí củ được cấy vào môi trường cảm ứng nhằm nhân nhanh chồi, với việc bổ sung chất điều hòa sinh trưởng phù hợp với từng nghiệm thức thí nghiệm.
20 sau đó được để trong điều kiện nhiệt độ phòng 25 ± 2 o C, chiếu sáng 12h, cường độ chiếu sáng 2000 lux trong thời gian 2 tháng
Phương pháp nuôi cấy nhân chồi trên hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời
Dựa trên kết quả thí nghiệm trong nội dung 3 và 4, môi trường tối ưu được áp dụng cho hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời Môi trường được đưa vào hộp Plantima qua miệng phía trên, sau đó được đậy kín và hấp khử trùng Mẫu cấy được chuyển vào đĩa giữ mẫu và lắp đặt vào hệ thống cung cấp khí nén với chế độ hẹn giờ để thực hiện các chu kỳ ngập chìm theo cài đặt.
Phương pháp ra rễ tạo cây hoàn chỉnh
Chồi cây Cốt khí củ khỏe mạnh, đang trong trạng thái sinh trưởng bình thường, được cấy vào môi trường ra rễ để tạo ra cây hoàn chỉnh Môi trường ra rễ này được bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật thuộc nhóm auxin hoặc dịch chiết tự nhiên với nồng độ tùy thuộc vào từng thí nghiệm cụ thể.
Phương pháp thu thập, xử lý số liệu và các chỉ tiêu theo dõi
- Số cây trung bình/cụm chồi = TSC/TCC (cây)
Trong đó: TSC là tổng số cây/bình
TCC là tổng số cụm chồi/bình
- Trọng lượng tươi trung bình của cụm chồi = TTL/TCC (g)
Trong đó: TTL là tổng trọng lượng tươi của các cụm chồi/bình
TCC là tổng số chồi/bình
- Tỷ lệ tăng sinh chồi = TTLLS/TTLBD * 100% (%)
Trong đó: TTLLS là tổng trọng lượng tươi của các cụm chồi/bình
TTLBD là tổng trọng lượng tươi của các cụm chồi/bình cấy ban đầu
- Chiều cao cây trung bình = TCCC/SC (cm)
Trong đó: TCCC là tổng chiều cao các cây/bình
SC là tổng số cây/bình
- Số lá trung bình = TSL/TSC (số lá)
Trong đó: TSL là tổng tổng số lá/bình
TSC là tổng số cây/bình
- Số rễ trung bình = TSR/TSC (số rễ)
Trong đó: TSR là tổng số rễ của các cây/bình
TSC là tổng số cây/bình Các số liệu được xử lý theo chương trình Excel và phần mềm thống kê Statghaphics
