TÌNH HÌNH NGHỀ NUÔI ONG MẬT HIỆN NAY Ở NƯỚC TA
Việt Nam với khí hậu nhiệt đới và thảm thực vật phong phú là môi trường lý tưởng cho nghề nuôi ong Nước ta có 5 loài ong mật bản địa và 1 loài nhập ngoại, trong đó chỉ có ong nội (Apis cerana) và ong ngoại (Apis mellifera) có thể thuần hóa và nuôi Ong nội bao gồm hai phân loài: Apis cerana cerana và Apis cerana indica, nhưng sản lượng mật của chúng thấp hơn so với ong ngoại Ong ngoại, hay còn gọi là ong Ý, thích nghi tốt với khí hậu và nguồn thực vật tại Việt Nam, đặc biệt ở Nam Bộ và Tây Nguyên, nơi có nhiều hoa như cao su và cà phê, cho năng suất mật trung bình đạt 30 kg mỗi đàn mỗi năm Tuy nhiên, việc nuôi ong ngoại yêu cầu kỹ thuật chăm sóc cao, chi phí đầu tư lớn và cần có nguồn hoa tập trung.
Hiện nay, cả nước có khoảng 26.000 người nuôi ong tại 54 tỉnh/thành phố, trong đó loài ong nội thích nghi với nguồn hoa rải rác và được nuôi phổ biến ở các vùng rừng núi, đồng bằng và thành phố Ong ngoại như ong Ý (Apis mellifera) cần nguồn hoa lớn và tập trung, chủ yếu được nuôi ở Tây Nguyên và Nam Bộ Gần đây, ong Ý cũng được nuôi nhiều ở một số tỉnh miền Bắc như Sơn La, Hưng Yên, Bắc Giang và Hòa Bình.
Ngành ong hiện nay chủ yếu sản xuất mật ong, bên cạnh các sản phẩm khác như phấn hoa, sữa ong chúa và sáp ong Trên thế giới, nhiều trang trại nuôi ong không chỉ tập trung vào việc thu hoạch mật mà còn chiết xuất nọc ong để làm nguyên liệu cho thuốc và mỹ phẩm Tuy nhiên, ngành ong mật tại Việt Nam vẫn chưa khai thác hết tiềm năng từ nguồn dược liệu quý giá này.
TỔNG QUAN VỀ NỌC ONG
Giới thiệu về nọc ong
Nọc ong mật (Apitoxin) được sản xuất từ hai tuyến liên quan đến bộ phận tiêm của ong thợ Quá trình sản xuất nọc diễn ra mạnh mẽ trong hai tuần đầu của cuộc đời ong thợ trưởng thành, đạt đỉnh điểm khi chúng tham gia vào việc bảo vệ tổ hoặc tấn công kẻ thù Khi ong thợ già đi, lượng nọc sản xuất sẽ giảm dần.
Khi một con ong chích, nó sẽ tiêm khoảng 0,15 – 0,3 mg nọc từ túi nọc của mình Chỉ khi chích vào một vật có da dày như con người, ong mới mất kim tiêm cùng với túi nọc, cơ và một phần hệ thần kinh trung ương Dù vậy, các dây thần kinh và cơ này vẫn tiếp tục bơm nọc ra cho đến khi túi nọc cạn kiệt Việc mất đi những bộ phận quan trọng này gần như là điều không thể tránh khỏi đối với con ong.
Khi một con ong mật thợ chích vào da người, nó không thể rút kim ra vì trên kim có những ngạnh nhỏ Sau lần chích, con ong để lại toàn bộ phần tiêm, bao gồm túi nọc và thần kinh trung ương Đặc điểm này chỉ xuất hiện ở ong mật và không có ở bất kỳ loài côn trùng tiêm nọc nào khác.
Hình 2: Bộ phận tiêm nọc sau khi lìa khỏi cơ thể ong, để lại trên cơ thể nạn nhân
Lượng gây chết người trung bình (LD 50) của nọc ong cho người trưởng thành là 2,8 mg nọc trên 1 kg cân nặng, nghĩa là một người nặng 60 kg có 50% cơ hội sống sót khi bị tiêm tổng cộng 168 mg nọc ong Nếu mỗi con ong tiêm toàn bộ nọc mà không rút kim ra nhanh, với 0,3 mg mỗi phát chích, thì 600 phát chích có thể dẫn đến tử vong Đối với một đứa trẻ nặng 10 kg, chỉ cần 90 phát chích là đủ để gây chết.
Việc rút kim nhanh chóng sau mỗi lần chích là rất quan trọng để tránh các phản ứng dị ứng nghiêm trọng Hầu hết các trường hợp tử vong đều liên quan đến một hoặc vài vết chích, có thể gây ra suy tim hoặc ngạt thở do sưng ở cổ hoặc miệng.
Nọc ong, khi sử dụng với liều lượng nhỏ, có thể mang lại lợi ích trong việc điều trị nhiều bệnh nhẹ Liệu pháp này đã được biết đến từ các nền văn minh cổ đại và hiện nay, nọc ong được áp dụng như một phương thuốc cho cả con người và gia súc.
Tính chất vật lý của nọc ong
Nọc ong là một chất lỏng không màu, chứa từ 50 – 70% nước và dễ tan trong nước cũng như acid loãng, nhưng không tan trong etanol Nọc ong có mùi thơm giống mật ong, với vị cay, đắng, chua và nóng, có độ pH khoảng 4,5 – 5,5.
Các chất này phân hủy khi tiếp xúc trực tiếp với ánh nắng mặt trời và nhiệt độ cao, nhưng lại bền vững ở nhiệt độ thấp Chúng cũng dễ bị phá hủy bởi các chất oxi hóa như KMnO4, K2SO4, cùng với các halogen như clo và brom.
Sau khi sấy khô, nọc ong trở thành bột màu trắng nếu được bảo quản đúng cách, tránh oxy hóa Nếu không, quá trình oxy hóa sẽ làm nọc chuyển từ màu trắng sang màu vàng nâu, ảnh hưởng đến hiệu quả chữa bệnh của nó.
Hình 3: Bột nọc ong ở dạng khô
Thành phần hóa học của nọc ong
Nọc ong chứa nhiều peptide như melittin, apamin, adolapin và các peptide gây giải phóng tế bào mast (MCD peptide), cùng với các enzym như PLA2, histamine, epinephrin, lipid, carbohydrate và amino acid tự do Cả dạng tươi và khô của nọc ong đều có hoạt tính sinh học tương tự, chỉ khác nhau về thành phần.
Bảng 1: Thành phần và hoạt tính sinh học của nọc ong
Phân tử khối Hoạt tính sinh học Peptide
Hoạt động mạnh trên bề mặt màng tế bào lipid Hoạt động giải phóng hemoglobin
Hoạt hoá PLA 2 Hoạt động kháng khuẩn và kháng nấm
Giảm đau và kháng viêm
(2 – 3 %) 2036 Làm bất hoạt bơm canxi ở màng tế bào Độc tố kháng ung thư
Kích hoạt các protein G nhạy cảm với độc tố bệnh ho gà
Kháng viêm và giảm đau
Chống viêm thông qua sự ức chế của cyclooxygenase
Secarpin (0,1 %) Ái lực liên kết lớn các vùng trong não chuột
Cardiopep (< 0,7 %) Tác dụng giải phóng β-ardrenaline
Kháng nguyên và gây dị ứng
Kích hoạt các tế bào thần kinh và các tế bào thần kinh đệm
Tái tạo dây thần kinh
Tạo thuận lợi cho chất dẫn truyền thần kinh phát hành
Enzym thuỷ phân acid hyaluronic
Histamin (1,5 %) 307,14 Chủ vận ở các thụ thể histamin
(0,13 – 1 %) 189,64 Chủ vận ở các thụ thể dopamin
Melittin là một peptide hoạt động như một chất hoạt động bề mặt, có khả năng tan trong nước, được cấu thành từ 26 amino acid và mang 6 điện tích dương Khối lượng phân tử của melittin đạt 2.846,46 g/mol, với công thức phân tử là C131H229N39O31.
Melittin là một hợp chất có hoạt tính huyết học và kháng vi sinh vật mạnh mẽ, giúp giảm đau hiệu quả Nó cũng đóng vai trò là chất khuếch đại hoạt tính phospholipase A2, thể hiện tính kháng viêm, kháng virus và kháng khối u.
Nghiên cứu cho thấy melittin có khả năng liên kết với màng tế bào hồng cầu trong môi trường đẳng trương NaCl ở nhiệt độ phòng, với hằng số phân ly 3 x 10 -8 M và dung lượng liên kết tối đa 1.8 x 10 7 phân tử melittin trên một tế bào Khi khoảng 1% bề mặt tế bào đã liên kết với melittin, hiện tượng phân giải tế bào bắt đầu xảy ra, và khi có khoảng 2 x 10 6 phân tử melittin liên kết, sự phân giải đạt 50% Quá trình ly giải diễn ra nhanh chóng trong vài phút đầu, sau đó chậm lại và ngừng hẳn sau khoảng 1 giờ Trong quá trình này, nồng độ Na trong tế bào tăng và nồng độ K giảm, với sự tích lũy Na và mất K tăng nhanh trong vài phút đầu tiếp xúc với melittin, nhưng dừng lại khi nồng độ Na, K và hemoglobin nội bào đạt trạng thái cân bằng trong giờ đầu tiên.
Apamin là một chất độc thần kinh nhẹ, bao gồm 18 loại acid amin và có cấu trúc với 2 cầu disulfua (-S-S-) Chất này có khả năng ức chế bơm canxi ở màng tế bào, dẫn đến việc làm tê liệt hệ thần kinh và hoạt động cơ Khi tiếp xúc với apamin, có thể xảy ra liệt cơ hô hấp, liệt thần kinh, thậm chí là tử vong.
Phospholipase A2 (PLA2) chiếm 10-12% nọc ong khô và có tác động đáng kể đến chứng viêm sưng và cơn đau Enzym này giải phóng acid béo từ các nhóm carbon thứ hai của glycerol, cho thấy sự tương tác phức tạp với melittin, ảnh hưởng đến khả năng bài tiết hoặc ức chế PLA2 tùy thuộc vào tỷ lệ peptide và phospholipid PLA2 tham gia vào các quá trình đau liên quan đến tế bào hình sao, tế bào thần kinh và tế bào thần kinh đệm Ngoài ra, PLA2 còn đóng vai trò trong tái tạo thần kinh và dẫn truyền thần kinh glutamate trong sừng lưng tủy sống, cũng như các hiệu ứng thần kinh chậm trong ống nghiệm và trong cơ thể.
Tính chất dược lý
Nọc ong được coi là độc dược do chứa nhiều acid formic, và việc bị ong đốt có thể gây ra sưng tấy, đau đớn, hoặc nặng hơn là ngộ độc, dị ứng, thậm chí tử vong Nghiên cứu tại Bệnh viện Bạch Mai cho thấy ong đốt có thể dẫn đến các tình huống nguy hiểm, bao gồm sốc phản vệ, một phản ứng mạnh mẽ của cơ thể Chỉ cần 1-2 vết đốt cũng có thể gây tử vong, đặc biệt nếu đốt vào vùng họng, có thể gây phù vòm họng và khó thở Thông thường, với hơn 10 vết đốt, bệnh nhân có thể bị nhiễm độc nặng, dẫn đến tan máu, vàng da, thiếu máu cấp, và suy thận cấp.
Nọc ong đã được sử dụng trong y học dân gian để điều trị nhiều bệnh, đặc biệt là đau khớp Theo Bản thảo thập di của Trần Tàng Khí, nọc ong có tác dụng tương tự như ong mật, giúp trừ phong, giải độc và sát trùng Nọc ong được dùng để chữa các bệnh như đau đầu, phong tê thấp và phong chẩn Trong Đông y, "phong" được hiểu là những tác nhân từ môi trường như nhiệt độ, gió, độ ẩm, khói bụi và vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể, gây ra bệnh tật hoặc rối loạn chức năng cơ thể.
Theo y học cổ truyền, con ong bầu có khả năng chữa bệnh động kinh, phong ngứa, nhức mỏi và đau khớp Ong đen, còn được gọi là ong vò vẽ, ong bắp cày, ong mướp, ô phong, hùng phong và tượng phong, được sử dụng phổ biến trong đông y và dân gian Tên chính thức trong đông y Trung Quốc của ong đen là trúc phong, với tên khoa học là
Ong đen Xylocoba dissimilis và X phalothorax nhỏ hơn được sử dụng trong y học, nhưng không sử dụng loại có đốm trắng ở đầu Ong đen có vị ngọt chua, tính hàn, không độc, tác động vào hai kinh Vị và Đại trường Nó có công dụng thanh nhiệt, tả hỏa và trừ phong, thường được dùng để điều trị sâu răng, miệng lở loét, đau cổ họng và cho trẻ em bị kinh phong.
Dân gian Việt Nam dùng 100 – 150 con ong vò vẽ, bỏ cánh, ngâm trong rượu 40 –
Rượu ngâm hạt mít 45 độ, sau 100 ngày có thể sử dụng mỗi tối để chữa đau khớp, nhưng cần lưu ý rằng nọc ong độc có trong rượu không phù hợp cho người suy thận Tuy nhiên, phương pháp này có thể gây hại nhiều hơn lợi, vì nọc ong vò vẽ độc hơn nhiều so với nọc ong mật, với tỷ lệ sống sót chỉ 50% cho người trưởng thành nếu bị chích bởi 5 con ong vò vẽ Đặc biệt, nồng độ nọc trong rượu khó kiểm soát và việc bắt ong bằng thuốc diệt muỗi hay thuốc trừ sâu có thể để lại dư lượng độc hại, dẫn đến ngộ độc cho người sử dụng.
Theo nghiên cứu, các tác giả đã sử dụng hỗn hợp liều lượng nhất định của đơn vị ong (Apitoxin: 1ml = 5 đơn vị) kết hợp với novocain hoặc vitamin C để thực hiện thủy châm tại các huyệt chỉ định thuộc kinh mạch, thay vì châm ở những điểm đau Trong suốt 4 năm, 156 bệnh nhân đã được điều trị, và kết quả cho thấy tình trạng đau và sưng của bệnh nhân thấp khớp đã cải thiện đáng kể.
Khi bệnh nhân ít lên cơn, hạ cơn hoặc chỉ gặp cơn nhẹ, chức năng thần kinh ngoại biên bị tê đau liệt có khả năng hồi phục Huyết áp ổn định và người bệnh cảm thấy giảm đau đầu, ngủ ngon hơn.
Nọc ong đã được chứng minh có hiệu quả trong việc hỗ trợ cai nghiện thuốc lá, do nicotin trong thuốc lá gây ra cảm giác thèm thuốc Khi không có nicotin, người nghiện thường cảm thấy khó chịu, nhưng khi hút thuốc, họ lại cảm thấy thoải mái Để cai thuốc lá, người mới nghiện có thể uống hỗn hợp mật ong với chanh hoặc quất và nước, với tỷ lệ 1 thìa cà phê mật ong, 1/2 quả chanh hoặc quất và 5 thìa nước, trước khi có cơn thèm thuốc Sau 10 - 15 ngày, họ có thể giảm dần lượng thuốc lá hút Đối với người nghiện nặng, bên cạnh việc uống mật ong, cần thực hiện liệu pháp châm cứu bằng cách cho ong đốt vào các huyệt Tuy nhiên, liệu pháp này không phù hợp cho người bị tiểu đường.
TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ NỌC ONG
Trong nước
Tại Việt Nam, việc sử dụng nọc ong để điều trị bệnh giảm đau và kháng viêm đã tồn tại lâu đời, đặc biệt phổ biến ở vùng nông thôn Các phương pháp dân gian thường được áp dụng bao gồm việc ngâm ong đất hoặc ong mật trong rượu để xoa lên vùng đau, hoặc cho ong chích vào các huyệt Tuy nhiên, hiện chưa có nghiên cứu khoa học nào công bố về việc chiết xuất và ứng dụng nọc ong trong y học.
Trên thế giới
Nhiều quốc gia như Hàn Quốc, Trung Quốc, Mỹ và Nga đã tiến hành nghiên cứu sâu rộng về phương pháp chiết xuất nọc ong và ứng dụng của nó trong y học và mỹ phẩm Các nghiên cứu chỉ ra rằng nọc ong có nhiều tác dụng sinh học đáng chú ý, bao gồm khả năng kháng viêm khớp, hỗ trợ cai nghiện, chống ung thư và điều trị các bệnh ngoài da.
Phương pháp chiết xuất nọc ong và các nghiên cứu về hoạt tính kháng viêm, giảm đau sẽ được trình bày chi tiết như sau:
I.3.2.1 Phương pháp chiết xuất nọc ong 10
Nguyên tắc chiết xuất nọc ong dựa vào cơ chế sốc điện để kích thích ong thợ tiết ra nọc Thiết bị thu thập nọc ong hoạt động dựa trên dòng điện một chiều, được tích trữ dưới dạng tụ điện trên dây điện.
Trần của bộ phận thu nọc được thiết kế với một tấm kính nhẵn, giúp thu thập nọc ong hiệu quả Các dây điện trên trần không chỉ có chức năng sốc điện mà còn là nơi để ong bám vào và thu mình lại để tiết nọc Tấm kính này không chỉ bảo vệ ong khỏi việc mất kim sau khi tiết nọc mà còn đảm bảo tính mạng cho chúng.
Sau khi máy chiết xuất nọc ong tự tắt hoặc được tắt chủ động, cần để hệ thống yên trong khoảng 5 đến 20 phút mà không rút tấm kiếng ra, giúp ong bay đi và nọc khô Nọc ong thô thường có một ít tạp chất, có thể được loại bỏ trong quá trình cạo nọc Cuối cùng, bước làm khô được thực hiện trong ống nghiệm mở, đặt trong CaCl2 khan.
Hình 5: Lượng nọc ong tương đối sau một lần hoạt động hệ thống
Sản phẩm cuối cùng được giữ trong chai sẫm màu, bảo quản ở nơi khô ráo, tránh ánh sáng trực tiếp (Hình 6)
Hình 6: Nọc ong sau khi cô đông được bảo quản trong ống sẫm màu
Độ ẩm của sản phẩm nọc ong cần phải dưới 10% để đảm bảo chất lượng Nọc ong đã làm khan có thể được bảo quản trong tủ lạnh lên đến 1 năm Để kéo dài thời gian lưu trữ, người ta thường cô đông nọc ong sau khi thu hoạch, cho phép lưu trữ trên 1 năm.
Hệ thống này chỉ thu thập nọc mà không lấy sản phẩm khác Mỗi tổ ong có thể cung cấp từ 0,2 đến 1 gam nọc, với thời điểm thu nọc lý tưởng là vào buổi sáng Quá trình lấy mật diễn ra trong khoảng 30 phút đến 2 giờ mỗi ngày mà không gây hại cho ong.
I.3.2.2 Phương pháp phân tích thành phần nọc ong 11
Để định tính và phân tách các thành phần peptide trong nọc ong, phương pháp phân tích sắc ký HPLC/UV với cột pha đảo C18 thường được sử dụng Hệ dung môi pha động bao gồm acetonitrile, nước và acid trifluoracetic, cùng với đầu dò UV hoạt động ở bước sóng 220 nm.
I.3.2.3 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của nọc ong 9, 12, 13
Nọc ong đã được nghiên cứu và chứng minh có hiệu quả trong việc điều trị viêm thấp khớp, đặc biệt trong khả năng giảm đau và chống viêm Các mô hình nghiên cứu cho thấy nọc ong có tác dụng làm giảm sưng viêm, được xác nhận qua việc kiểm tra số lượng Fos miễn dịch trong tủy sống Viêm thấp khớp làm tăng số lượng tế bào thần kinh FLI trong tủy sống, nhưng việc điều trị bằng nọc ong có khả năng ức chế sự gia tăng này Đặc biệt, tiêm nọc ong vào huyệt Zusanli cho thấy hiệu quả chống viêm và giảm đau mạnh hơn so với tiêm vào vùng khác Phương pháp điều trị bằng nọc ong tại huyệt Zusanli hai lần mỗi tuần trong năm tuần đã làm giảm tỷ lệ mắc bệnh viêm khớp ở chuột thí nghiệm.
Các nhà khoa học Hàn Quốc đã nghiên cứu tác dụng của melittin trên bệnh nhân viêm khớp và phát hiện rằng nó có khả năng ức chế gene gây sưng và đau nhức Nọc ong cũng chứa nhiều khoáng chất, acid hữu cơ dễ bay hơi, acid formic, các hợp chất kháng sinh, enzym phospholipase, cùng với các acid amin giàu sulfur như methionin và cystin Sulfur đóng vai trò quan trọng trong việc loại bỏ hormone cortisol khỏi tuyến thượng thận, giúp bảo vệ cơ thể khỏi nhiễm trùng.
Nọc ong không chỉ có tác dụng giảm đau và chống viêm khớp, mà còn được sử dụng trong điều trị một số bệnh liên quan đến miễn dịch và ung thư Các peptide trong nọc ong, như melittin và phospholipase A2, có khả năng nhắm đến một số loại tế bào ung thư, bao gồm ung thư thận, phổi, gan, tuyến tiền liệt, bàng quang, ung thư vú và ung thư bạch cầu Cơ chế độc tính lên tế bào thông qua việc kích hoạt PLA2 bởi melittin được coi là một yếu tố quan trọng trong việc điều trị.
27 có tính quyết định đến hoạt tính kháng ung thư của nọc ong, đặc biệt là ung thư tuyến tiền liệt và ung thư vú 9
Nọc ong có tác dụng chữa bệnh rõ rệt, như sử dụng cao xoa giảm đau, chống viêm, hoặc đốt trực tiếp vào huyệt trên cơ thể, điều này đã được chứng minh bằng cơ sở khoa học Mặc dù phương pháp này đang được phát triển ở nhiều quốc gia, nhưng ở Việt Nam, nó vẫn chưa phổ biến, với người nuôi ong chủ yếu chỉ khai thác mật và sáp mà chưa tận dụng nọc ong Do đó, nghiên cứu về ứng dụng của nọc ong trong y học là rất cần thiết, không chỉ để khai thác nguồn nọc ong mà còn giúp tăng thu nhập cho các trại nuôi ong đang phát triển tại Việt Nam.
MỘT SỐ SẢN PHẨM TỪ NỌC ONG
Hiện nay, nọc ong được sử dụng rộng rãi trong y học và làm đẹp, với nhiều chế phẩm từ nọc ong xuất hiện ở các nước như Mỹ, Hàn Quốc, Nga, và Trung Quốc Nọc ong thường được chiết xuất dưới dạng dung dịch trong nước hoặc dầu (Apitoxin) để tiêm dưới da, cùng với các sản phẩm khác như viên nén, cao xoa bóp, và kem Đặc biệt, nọc ong có khả năng kích thích cơ thể sản sinh collagen và elastin, giúp da săn chắc, mềm mịn và ngăn ngừa lão hóa, do đó ngày càng nhiều sản phẩm làm đẹp từ nọc ong được phát triển.
Bee venom (BV) cream BV eye drops BV pellet
BV powder BV Homeopathic solution BV mark
Hình 7: Một số sản phẩm từ nọc ong
LÝ DO CẦN PHẢI THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
Tỷ lệ mắc bệnh viêm khớp, đặc biệt là viêm khớp dạng thấp, tại Việt Nam hiện đang ở mức cao, chiếm khoảng 0,5-1% dân số Chi phí cho việc điều trị bệnh này ước tính lên đến 10 tỷ đồng mỗi năm.
Viêm khớp dạng thấp là nguyên nhân hàng đầu gây tàn phế trong số các bệnh lý phổ biến, vượt qua cả bệnh tim mạch, đái tháo đường và tai biến mạch máu não Mặc dù thuốc đặc trị có hiệu quả, nhưng chi phí cao và nguy cơ tác dụng phụ nghiêm trọng khi sử dụng lâu dài là vấn đề đáng lo ngại.
Nọc ong được biết đến như một phương thuốc trị viêm khớp, được sử dụng phổ biến ở nhiều nước châu Á như Trung Quốc, Hàn Quốc và Việt Nam thông qua việc ngâm ong trong rượu hoặc cho ong chích trực tiếp vào huyệt Các quốc gia phát triển như Mỹ, Brazil, Nhật Bản, Hàn Quốc, Nga và Trung Quốc đã nghiên cứu và ứng dụng nọc ong trong y học và mỹ phẩm Nhiều nghiên cứu cho thấy nọc ong không chỉ hiệu quả trong việc điều trị viêm khớp mà còn có tác dụng giảm đau, hỗ trợ điều trị ung thư, cao huyết áp, hen suyễn, và thậm chí giúp làm đẹp da và chống lão hóa Giá nọc ong hiện nay dao động từ 36-300 USD/1 gram, với nọc ong từ New Zealand có giá cao hơn 33% do nhu cầu trong ngành công nghiệp mỹ phẩm Trong khi các trang trại nuôi ong trên thế giới kết hợp cả hai hoạt động lấy mật và chiết xuất nọc ong, Việt Nam vẫn chủ yếu chỉ nuôi ong lấy mật, chưa tận dụng được nguồn nọc ong quý giá này.
Nghiên cứu đề tài này tại Việt Nam là cần thiết để phát triển sản phẩm dược phẩm và mỹ phẩm mới, đồng thời tận dụng nguồn nọc ong làm nguyên liệu hóa dược, giúp các trang trại nuôi ong gia tăng lợi nhuận từ việc khai thác nọc ong.
MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
Mục tiêu tổng quát
Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất nọc ong từ loài ong mật nuôi Apis mellifera
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU II.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT NỌC ONG TỪ LOÀI ONG MẬT APIS
Hóa chất, dụng cụ, thiết bị và địa điểm thực hiện
II.1.1.1 Hóa chất và dụng cụ
Lọ nhỏ có nắp 1,5 mL (Vial)
Thiết bị thu thập nọc ong hiệu BVC 0412, hãng IGK electronics, Bungaria gồm:
Hệ thống khung kích nọc sử dụng mạng lưới dây điện bọc trong lớp màng polyetylene mỏng, kết hợp với bộ biến áp xoay chiều Tần số xung dao động từ 50 đến 1000 Hz, với thời gian mỗi xung kéo dài từ 3 đến 6 giây.
Máy đông cô Eyela FDU-1200
II.1.1.3 Địa điểm thực hiện
Ong mật Apis mellifera được nghiên cứu tại trang trại của ông Lê Minh Điền ở Ấp Đồng Nhơn, xã Lương Quới, huyện Giồng Trôm, tỉnh Bến Tre Chế độ ăn của ong chủ yếu bao gồm mật và phấn hoa từ các loại hoa như dừa, bưởi, chôm chôm và nhãn, đây là những cây ăn trái chủ yếu trong khu vực Bên cạnh đó, ong cũng được cung cấp thêm thức ăn công nghiệp chủ yếu là bột đậu nành.
Ngoài ra, chúng tôi còn thu thập thêm các mẫu nọc ong ở Bình Đại (Bến Tre), Thạnh Hóa (Long An) và Vĩnh Linh (Quảng Trị).
Phương pháp nghiên cứu quy trình chiết xuất nọc ong
Nọc ong được chiết xuất bằng thiết bị thu thập nọc ong sử dụng cơ chế sốc điện để kích thích ong tiết ra nọc Thiết bị hoạt động dựa trên nguyên tắc sốc điện bằng dòng điện một chiều, với các dây điện trần giúp ong bám vào và tiết nọc Tấm kính nhẵn không chỉ thu nọc mà còn bảo vệ ong khỏi mất kim, đảm bảo tính mạng cho chúng Sau khi rút tấm kính, các tinh thể trắng sẽ xuất hiện trên bề mặt, và sử dụng dao bén để cạo sẽ thu được nọc ong thô Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng thiết bị thu thập nọc ong hiệu BVC 0412 của hãng IGK electronics nhập từ Bulgaria.
32 Đặt thiết bị này ngay cửa ra vào của thùng ong, khi ong bay ra sẽ bám trên dây điện, bị kích điện sẽ tiết ra nọc
Hình 8: Thiết bị chiết xuất nọc ong Model BVC 0412 (IGK)
Hệ thống bao gồm ba phần chính: khung sườn bằng gỗ, dây điện và mạch điện cùng đèn LED điều khiển Đặc biệt, hệ thống được thiết kế với bộ pin tích hợp, cho phép hoạt động mà không cần nguồn cắm Để sử dụng, chỉ cần đặt tấm kiếng trượt vào rãnh dưới mạng dây và bật công tắc.
Hệ thống được trang bị vi mạch điều khiển, hoạt động liên tục trong 50 giây và nghỉ 10 giây Sau 40 phút, hệ thống sẽ tự động tắt, đây là thời gian tối ưu cho hiệu suất hoạt động Ngoài ra, người dùng có thể tắt hệ thống chủ động sau 20 phút Nguồn năng lượng sử dụng là pin AAA với điện áp từ 24-30 V.
Sau khi máy tự tắt hoặc được tắt chủ động, cần để hệ thống trong 5 đến 20 phút mà không rút tấm kính ra, giúp ong bay đi và nọc khô Sử dụng kẹp để loại bỏ các tạp chất trên tấm kính và dùng dao cạo để thu thập nọc ong thô, chuyển vào lọ nhỏ có nắp tối màu Lọ nọc ong nên được đặt trong bình hút ẩm chứa CaCl2 khan trước khi vận chuyển về phòng thí nghiệm để lưu trữ Nọc ong cần được bảo quản ở nhiệt độ -4 oC để tránh phân hủy.
Hình 9: Dùng dao cạo các mảng trắng bám trên tấm kính (a) Bột nọc ong dạng thô (b); Nọc ong được bảo quản trong vial tối màu (c)
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất nọc ong
Hình 10: Thiết bị chiết xuất nọc ong đang hoạt động được đặt tại cửa ra vào tổ
II.1.3.1 Khảo sát thời gian chiết xuất nọc ong trong ngày
Số lượng ong thợ bảo vệ trong tổ thay đổi theo thời gian trong ngày, ảnh hưởng đến lượng nọc ong thu gom được Nghiên cứu được thực hiện trên 8 thùng ong mật với số lượng đàn, độ tuổi và chế độ ăn uống tương đồng Thời gian chiết xuất nọc ong được cố định là 40 phút, thực hiện một lần trong ngày tại các khung giờ: 7h-9h, 9h-11h, 11h-13h, 13h-15h, và 15h-17h, trong suốt một tháng.
Khung giờ thu gom nọc ong hiệu quả nhất là từ 9h-11h, với khối lượng nọc ong trung bình đạt 22,67 mg, do lúc này ong hoạt động tích cực để lấy mật, dẫn đến sự xuất hiện đông đảo tại cửa tổ Ngược lại, từ 11h-13h, ong thường trở về tổ sau khi lấy mật, và do tập tính xã hội, chúng chỉ bay xung quanh tổ khi cảm thấy có nguy hiểm, khiến số lượng ong bám vào bộ thu nọc giảm đáng kể, với khối lượng trung bình chỉ đạt 5,23 mg.
Hình 11: Khảo sát thời gian chiết xuất nọc ong trong ngày
II.1.3.2 Khảo sát số lần chiết xuất nọc ong trong ngày
Một nghiên cứu đã được thực hiện trên 8 thùng ong mật có đặc điểm tương đồng về số lượng đàn, độ tuổi và chế độ ăn uống Quá trình chiết xuất nọc ong được tiến hành trong 40 phút theo hướng dẫn của thiết bị, với 5 lần chiết xuất liên tiếp trong một ngày, tại 5 khung giờ khác nhau: 7h-9h, 9h-11h, 11h-13h, 13h-15h và 15h-17h.
Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự giảm đáng kể khối lượng nọc ong khi số lần chiết xuất nọc ong trong ngày tăng lên so với việc chiết xuất chỉ một lần mỗi ngày Do đó, chúng tôi quyết định thực hiện chiết xuất nọc ong một lần trong khoảng thời gian từ 9h đến 11h hàng ngày cho mỗi thùng ong, nhằm đảm bảo chất lượng nọc, sức khỏe của ong và tối đa hóa khối lượng nọc thu được.
Hình 12: Khối lượng nọc ong chiết xuất 1 lần và 5 lần trong ngày
II.1.3.3 Khảo sát số lượng ong chết sau mỗi lần chiết xuất nọc ong
Khảo sát được tiến hành trên 10 thùng ong mật có số lượng đàn, độ tuổi và chế độ ăn uống tương đồng Thời gian chiết xuất nọc ong được cố định là 40 phút theo hướng dẫn của thiết bị, và số lượng ong chết được ghi nhận sau mỗi lần chiết xuất.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, trung bình sau mỗi lần chiết xuất, chỉ có 2 con ong chết, một con số không đáng kể so với tổng đàn Điều này cho thấy mức độ thiệt hại thấp hơn nhiều so với quá trình thu hoạch mật ong, khi số lượng ong chết lên tới khoảng 20 con.
Bảng 2: Số lượng ong chết sau mỗi lần chiết xuất nọc ong
Số lượng ong chết (con)
Số lượng ong chết (con)
Số lượng ong chết (con)
Số lượng ong chết (con)
Trung bình 2 II.1.3.4 Khảo sát sản lượng mật ong trong quá trình chiết xuất nọc ong
Khảo sát được thực hiện trên 10 thùng ong có chiết xuất nọc ong và 10 thùng ong không chiết xuất nọc ong, với số lượng đàn, độ tuổi và chế độ ăn uống tương đồng Thời gian chiết xuất nọc ong được cố định là 40 phút theo hướng dẫn thiết bị, thực hiện mỗi ngày một lần trong khoảng thời gian từ 9h đến 11h Sau 7 ngày, tiến hành thu mật ong và khảo sát thí nghiệm kéo dài trong 4 tuần liên tiếp.
Hình 13 minh họa sản lượng mật ong thu được từ các thùng ong sau 4 tuần khảo sát (xem Phụ lục 4) Kết quả cho thấy sản lượng mật ở các thùng gần như không có sự thay đổi.
II.1.3.5 Xây dựng quy trình làm sạch và bảo quản nọc ong
Nọc ong thô khô có dạng rắn, màu trắng hơi vàng Để loại bỏ các tạp chất, sử dụng kính lúp và nhíp nhọn đầu Sau đó, cho nọc vào vial và đặt trong desicator chứa CaCl2 để hút ẩm Sau 5 tiếng, đậy nắp vial, quấn bằng giấy nhôm và bảo quản trong ngăn đá tủ lạnh.
Nọc ong thô sau khi thu gom từ trang trại thường chứa các tạp chất rắn không tan như bụi, đất, phấn hoa và keo ong Để tinh chế nọc ong mà không làm thay đổi thành phần, hàm lượng và hoạt tính sinh học, cần sử dụng nước cất để làm sạch, theo các tài liệu tham khảo.
Hòa tan nọc ong thô vào nước cất và lắc mạnh trong 30 phút với tốc độ 3.000 vòng/phút Sau đó, lọc dung dịch qua phểu lọc bằng màng cellulose có kích thước lỗ 20 µm Dung dịch sau khi lọc được đông cô ở nhiệt độ dưới -40 °C, tạo ra nọc ong dạng bột mịn và nhẹ Khi đông cô, cần sử dụng màng che phủ có lỗ rỗng trên miệng bình chứa Mẫu nọc ong sau khi làm sạch có dạng rắn, màu trắng và được bảo quản tối ở nhiệt độ -4 °C Hiệu suất quá trình tinh chế đạt 93,59%.
Bảng 3: Hiệu suất quá trình tinh chế nọc ong
STT Khối lượng nọc ong thô (g)
Khối lượng nọc ong tinh (g)
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG NỌC ONG
II.2.1 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
II.2.1.1 Hóa chất và dụng cụ
Acetonitrile (HPLC grade) (Merck - Việt Nam)
Acid trifluoroacetic (PA grade) (Merck - Việt Nam)
Acid formic (PA grade) (Merck - Việt Nam)
Nọc ong chuẩn loài Apis mellifera (lyphophilized powder) (Sigma-Aldrich)
Phospholipase A2 (1956 units/mg solid) (Sigma-Aldrich)
Phễu lọc thường, áp suất kém
Lọ nhỏ có nắp 1,5 mL (Vial)
Giấy nhôm, giấy lọc, … II.2.1.2 Thiết bị
Hệ thống HPLC 1200 series (Agilent) và đầu dò micrO-TOF-QII (Bruker)
Thiết bị thu thập nọc ong BVC 0411 (Bulgaria)
Hệ thống nước cất khử ion (Mili-Q Milipore)
II.2.2 Xây dựng quy trình đánh giá chất lượng nọc ong bằng phương pháp RP/HPLC/Q-TOF
II.2.2.1 Chuẩn bị dung dịch
Dung dịch nội chuẩn insulin được pha chế với nồng độ 1 àg/mL bằng nước cất khử ion Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chất nội chuẩn insulin, một peptide có tính chất tương tự như nọc ong, bao gồm các thành phần chính là peptide và enzym Việc này nhằm cải thiện độ chính xác và độ đúng của phép phân tích.
Dung dịch chuẩn apamin: Tiến hành pha dãy chuẩn tại các nồng độ 0,12, 0,24, 0,72, 1,2, 2,4 và 4,8 àg/mL bằng dung dịch nội chuẩn insulin 1 àg/mL
Dung dịch chuẩn PLA2: Tiến hành pha dãy chuẩn tại các nồng độ 10, 15, 25,
35, 60 và 100 àg/mL bằng dung dịch nội chuẩn insulin 1 àg/mL
Dung dịch chuẩn melittin: Tiến hành pha dãy chuẩn tại các nồng độ 10, 30, 50,
100, 150 và 200 àg/mL bằng dung dịch nội chuẩn insulin 1 àg/mL
Dung dịch nọc ong của hãng Sigma-Aldrich được pha chế bằng cách hòa tan nọc ong trong nước cất khử ion và lắc đều Sau đó, dung dịch được pha loãng với dung dịch nội chuẩn insulin 1 àg/mL, tạo ra các nồng độ dung dịch lần lượt là 100 và 300 àg/mL.
Dung dịch mẫu được tạo ra bằng cách hòa tan một lượng mẫu nọc ong chiết xuất trong nước cất khử ion và lắc đều Sau đó, pha loãng bằng dung dịch nội chuẩn insulin 1 àg/mL để thu được dung dịch chuẩn với nồng độ 100 và 300 àg/mL.
II.2.2.2 Quy trình xử lý mẫu
Nọc ong thô sau khi thu gom từ trang trại thường chứa các tạp chất như bụi, đất, phấn hoa và keo ong Để bảo toàn thành phần và hoạt tính sinh học của nọc ong, cần hòa tan mẫu với nước cất khử ion, lắc mạnh trong 30 phút với tốc độ 3.000 vòng/phút, sau đó ly tâm trong 3 phút với tốc độ 4.000 vòng/phút và lọc qua màng lọc cellulozo 20 àM Dung dịch thu được sẽ được phân tích bằng phương pháp RP-HPLC/Q-TOF.
II.2.2.3 Tối ưu hóa các thông số hệ thống RP-HPLC
Hệ thống phân tích khối phổ sử dụng nguồn ion hóa phun điện tử (ESI) và microQTOF của Bruker, kết hợp với phần mềm Analyst 1.4.2 Nghiên cứu điều kiện phân tích đồng thời và riêng lẽ các thành phần chính của nọc ong như melittin, apamin và phospholipase A2 bằng kỹ thuật ion hóa phun điện tử với chế độ bắn ion dương Các thông số khảo sát bao gồm áp suất phun sương, nhiệt độ, lưu lượng khí làm khô, thế áp và năng lượng va chạm, với kết quả được trình bày trong bảng 4.
39 tối ưu đối với phân tích các peptide tại phòng Thí nghiệm Phân tích Trung tâm, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM
Bảng 4: Thông số tối ưu của hệ thống phân tích khối phổ
Chế độ quét : ion dương
End plate offset (Thế áp trên end plate) - 500 V Funnel 1 RF 350.0 Vpp
Capillary (Thế capillary) - 4500 V Funnel 2 RF 400.0 Vpp
Nebulizer (Áp suất phun sương) 2 bar ISCID energy
Dry gas (Lưu lượng dòng khí làm khô) 9.0 L phút -1 Hexapole
Dry temp (Nhiệt độ khí làm khô) 200 o C
Collision energy (Năng lượng va chạm) 8.0 eV Ion energy 8.0 eV
Collision RF (Thế giữ ion trong
700.0 Vpp Low mass 500 m/z Transfer time (Thời gian chuyển khối từ bộ tứ cực vào TOF) 65 às Detector
Pre puls storage time (Thời gian lưu giữ ion trước khi vào TOF) 20 às Source 0 V a Lựa chọn cột pha tĩnh và hệ dung môi pha động
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200 kết hợp với hệ thống tiêm mẫu tự động và cột sắc ký Phenomenex C18 110 (150 mm x 2.00 mm x 5,0 µm) được sử dụng để phân tích các thành phần chính có trong nọc ong.
Trong sắc kí pha đảo, việc phân tích protein và peptide yêu cầu sử dụng chất xúc tác ghép cặp ion trong pha động để nâng cao độ nhạy và làm sắc nét peak sắc kí, từ đó cải thiện khả năng tách biệt các peptide và enzym trong nọc ong Sử dụng hệ pha động có 0,1% acid formic (FA), kết quả cho thấy hệ RP-HPLC/Q-TOF không tách biệt được từng thành phần của nọc ong, và peak sắc kí của MCD peptide và apamin không lưu tốt trên cột Do đó, cần tìm kiếm các điều kiện tối ưu để phân tích chính xác từng thành phần trong nọc ong.
Hình 14: Sắc kí đồ RP-HPLC/Q-TOF của nọc ong hãng Sigma-Aldrich với pha động 0.1% acid formic
Nghiên cứu đầu tiên của tác giả Szokan 11 về hệ RP-HPLC/UV đã đề xuất sử dụng acid trifluoroacetic (TFA) trong hệ rửa giải để phân tích thành phần của nọc ong TFA là một thuốc thử ghép cặp ion phổ biến trong phân tích peptide và enzyme Nhiều nghiên cứu trên hệ HPLC/UV cho thấy nồng độ TFA khoảng 0,1% là tối ưu, giúp tạo ra peak sắc ký nhọn trên hầu hết các loại cột pha đảo.
Để cải thiện độ nhạy đầu dò RP-HPLC/Q-TOF, nồng độ TFA thấp hơn sẽ mang lại hiệu quả tốt hơn, mặc dù các peak phân tích có thể không đối xứng do bề mặt silica không tinh sạch Do đó, việc sử dụng cột pha tĩnh với bề mặt silica tinh khiết kết hợp với pha động có nồng độ TFA thấp là cần thiết để tăng độ nhạy và độ chọn lọc của phương pháp Nghiên cứu cho thấy nồng độ TFA khoảng 0,01% có khả năng tách tốt hơn so với nồng độ cao hơn Dựa trên các phân tích này, chúng tôi đã chọn hệ dung môi pha động A: nước cất khử ion và pha động B: ACN có chứa TFA.
Sắc kí đồ RP-HPLC/UV của nọc ong được thực hiện trên cột C18 Phenomenex 110 với kích thước 150 mm × 2,0 mm × 5,0 µm, ở nhiệt độ cột 40°C và tốc độ dòng 0,5 mL/phút Chương trình gradient bao gồm 0 - 20% B trong 30 phút, 21 - 80% B trong 40 phút, và 81 - 100% B trong 10 phút, với hệ dung môi pha động A là H2O và B là ACN có chứa TFA.
41 b Tối ưu hóa chương trình gradient dung môi
Chúng tôi đã tiến hành khảo sát ba hệ chương trình gradient dung môi để phân tách riêng biệt các thành phần có trong nọc ong, tương ứng với thời gian rửa giải.
60, 70 và 80 phút nhằm tìm ra hệ gradient tối ưu nhất (Bảng 5)
Bảng 5: Hệ khảo sát chương trình gradient dung môi
Tốc độ dòng (mL/phút)
Kết quả từ hình 16 cho thấy chương trình gradient dung môi với thời gian rửa giải 80 phút (Bảng 6) mang lại khả năng rửa giải tốt nhất Trong khi đó, chương trình gradient 70 phút không tách biệt hiệu quả các thành phần chính cần phân tích, và chương trình 60 phút có độ phân giải thấp Thời gian dài cho chương trình gradient là cần thiết để tách riêng từng thành phần trong nọc ong, đặc biệt là apamin, PLA2 và melittin.
Hình 16: Sắc kí đồ RP-HPLC/Q-TOF của nọc ong hãng Sigma-Aldrich theo 3 chương trình gradient dung môi
Bảng 6: Chương trình gradient dung môi tối ưu
Thời gian (phút) Pha A (%) Pha B (%) Tốc độ dòng (mL/phút)
Pha A: H2O chứa 0,01 % TFA Pha B: ACN chứa 0,01 % TFA c Tối ưu hóa pH trong pha động
Khảo sát sự thay đổi pH được thực hiện bằng cách điều chỉnh nồng độ TFA trong pha động A, sử dụng nước cất khử ion với các nồng độ 0,005%, 0,01% và 0,015% Đồng thời, pha động B giữ nguyên nồng độ ACN chứa 0,01% TFA.
Hình 17: Khảo sát ảnh hưởng của sự thay đổi pH trong pha động
Kết quả khảo sát cho thấy diện tích và chiều cao các peak RP-HPLC/Q-TOF của ba thành phần chính thay đổi ít khi nồng độ TFA từ 0,05% đến 0,015% Tuy nhiên, thời gian lưu của apamin và PLA2 tăng mạnh ở nồng độ TFA 0,01%, trong khi thời gian lưu của melittin hầu như không thay đổi Do đó, pha động với 0,01% TFA được xem là hệ pha động tối ưu, vì tại nồng độ này, thời gian lưu của apamin lớn nhất so với PLA2 và melittin.
Nọc ong chứa các peptide và enzym có khối lượng phân tử lớn và đa điện tích, do đó, việc tối ưu hóa nhiệt độ cột là rất quan trọng Để khảo sát nhiệt độ cột, chúng tôi đã tiến hành thay đổi nhiệt độ tại các mức 50 o C, 60 o C và 70 o C.
NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP VÀ ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN CỦA NỌC ONG TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM
II.4.1 Đánh giá độc tính cấp của nọc ong trên chuột nhắt trắng
II.4.1.1 Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu
Nguyên liệu, thiết bị nghiên cứu
- Nọc ong (Giồng Trôm – Bến Tre) dạng bột được hòa tan trong nước muối và tiêm bắp thịt vào đùi chuột
- Cân điện tử của Nhật, độ chính xác 0.001 gam
- Cốc chia vạch, bơm kim tiêm 1ml
- Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả 2 giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 18 – 22g do
Ban chăn nuôi Học viện Quân Y cung cấp
Chuột được nuôi trong phòng thí nghiệm của Bộ môn Sinh lý học từ 5-7 ngày trước khi bắt đầu nghiên cứu, trong suốt thời gian này chúng được cung cấp thức ăn chuyên dụng cho chuột và có quyền uống nước tự do.
II.4.1.2 Phương pháp nghiên cứu
Chuột được chia thành 6 lô, mỗi lô gồm 8 con, và được tiêm nọc ong với liều tăng dần để xác định liều tối đa không gây chết và liều tối thiểu gây chết 100% chuột Trong 72 giờ sau tiêm, tình trạng chuột được theo dõi để phát hiện dấu hiệu nhiễm độc như nôn, co giật và kích động, cùng với số lượng chuột chết Tất cả chuột chết được mổ để đánh giá tổn thương và từ đó xây dựng đồ thị tuyến tính xác định LD 50 của thuốc thử Cuối cùng, tình trạng chuột được theo dõi đến ngày thứ 7 sau khi tiêm, và dữ liệu được xử lý bằng thuật toán t-test Student trong phần mềm Microsoft Excel.
II.4.1.3 Kết quả nghiên cứu
Chuột nhắt trắng được tiêm nọc ong với các liều từ thấp đến cao Kết quả cho thấy, ở liều 32mg/kg, 100% chuột bị chết, trong khi ở liều 12mg/kg, không có chuột nào chết sau 72 giờ tiêm.
Bảng 20: Độc tính cấp của nọc ong
Lô Liều dùng (mg/kg) Số chuột thử Số chuột chết Số chuột sống
Theo phương pháp xác định độc tính của thuốc 21 , tính được:
Nghiên cứu này cho thấy kết quả tương đồng với các nghiên cứu trước, chỉ ra rằng LD 50 ở người là 2,8 mg/kg, với hệ số ngoại suy từ chuột nhắt là 12 Sự khác biệt có thể xuất phát từ giống và chủng loại của người cũng như động vật thí nghiệm.
II.4.2 Đánh giá độc tính bán trường diễn của nọc ong trên chuột cống trắng
II.4.2.1 Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu
Nguyên liệu, thiết bị nghiên cứu
- Nọc ong (Giồng Trôm – Bến Tre) dạng bột
- Kít định lượng các enzyme và chất chuyển hóa trong máu: Urea/bun-color, Creatinine, Aspartate minotransferase (AST/GOT), Alanine Aminotransferase (ALT/GPT), của Hãng Biosystems/Tây Ban Nha
- Dung dịch xét nghiệm máu hóa chất Swelab, Hãng Swelab, Thụy Điển
- Dung dịch NaCl 0,9% được sản xuất bởi Euro-Med, Philippine
- Các hóa chất xét nghiệm và làm tiêu bản mô bệnh học
- Máy Sinh hóa bán tự động BTS 350, hãng Biosystem, Tây Ban Nha, Sản xuất năm
- Máy phân tích huyết học Swelab Alpha, Hãng Swelab, Thụy Điển, Sản xuất năm 2014
- Cân phân tích của Nhật
- Chuột cống chủng Wistar, giống đực trưởng thành, lông trắng, cân nặng 190 ± 20g, do Trung tâm động vật Học viện Quân y cung cấp
Chuột được nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Bộ môn Sinh lý học - Học viện Quân y, trong thời gian 5-7 ngày trước khi tiến hành nghiên cứu, với đầy đủ thức ăn và nước uống.
II.4.1.2 Phương pháp nghiên cứu
Chuột cống trắng được chia làm 3 lô, mỗi lô 8 con
- Lô chứng: tiêm nước muối 1 ml/100g/ngày
- Lô NO2: tiêm bắp nọc ong liều 2mg/kg
- Lô NO6: tiêm bắp nọc ong liều 6 mg /kg (gấp 3 lần lô NO2)
Chuột được tiêm nước muối hoặc thuốc thử trong 4 tuần liền, mỗi ngày một lần vào buổi sáng
Các chỉ tiêu theo dõi trước và trong quá trình nghiên cứu:
- Tình trạng chung, thể trọng của chuột
- Đánh giá chức năng tạo máu thông qua số lượng hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu
- Đánh giá mức độ hủy hoại tế bào gan thông qua định lượng hoạt độ enzym trong máu: ALT, AST
- Đánh giá chức năng thận thông qua định lượng nồng độ urea, creatinin huyết thanh
- Các thông số theo dõi được kiểm tra vào trước lúc tiêm thuốc, sau 4 tuần tiêm thuốc
Sau 4 tuần tiêm thuốc, chuột được mổ để quan sát toàn bộ các cơ quan một cách đại thể Đồng thời, tiến hành kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc vi thể của gan và thận ở 30% số chuột trong mỗi lô.
- Các xét nghiệm vi thể được thực hiện tại Bộ môn Giải phẫu bệnh viện
Các số liệu thu thập được xử lý bằng phương pháp thống kê y sinh học theo t- test
- Student và test trước sau Biểu diễn ± SD
II.4.2.3 Kết quả nghiên cứu
Trong thời gian thí nghiệm, chuột ở cả 3 lô hoạt động bình thường, ăn uống tốt, nhanh nhẹn, lông mượt, mắt sáng, phân khô a Sự thay đổi thể trọng chuột
Bảng 21: Ảnh hưởng của nọc ong đến thể trọng chuột
Lô chứng Lô NO2 Lô NO6
Kết quả từ bảng 21 chỉ ra rằng sau 2 và 4 tuần tiêm thuốc thử, trọng lượng chuột ở tất cả các lô đều tăng so với trước khi nghiên cứu, với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p0,05) Bên cạnh đó, cần tiến hành đánh giá chức năng tạo máu để có cái nhìn tổng quan hơn về ảnh hưởng của nọc ong.
Bảng 22: Ảnh hưởng của nọc ong đến số lượng hồng cầu trong máu chuột
Thời gian Số lượng hồng cầu ( T/l )*
Lô chứng Lô NO2 Lô NO6
Trước tiêm thuốc 5,82 ± 1,26 5,71 ± 1,03 5,51 ± 1,24 Sau 4 tuần tiêm thuốc 5,65 + 1,14 5,58 + 1,14 5,32 + 0,83 p (trước - sau) > 0,05 > 0,05 > 0,05
Bảng 23: Ảnh hưởng của nọc ong đến hàm lượng huyết sắc tố trong máu chuột
Thời gian Hàm lượng huyết sắc tố (g/dl )
Lô chứng Lô NO2 Lô NO6
Sau 4 tuần tiêm thuốc 10,42 + 1,43 9,31 + 3,70 8,15 + 1,51 p (trước - sau) > 0,05 > 0,05 > 0,05
Bảng 24: Ảnh hưởng của nọc ong đến số lượng bạch cầu trong máu chuột
Thời gian Số lượng bạch cầu (G/l)
Lô chứng Lô NO2 Lô NO6
Bảng 25: Ảnh hưởng của nọc ong đến công thức bạch cầu trong máu chuột
Lô chứng Lô NO2 Lô NO6
Kết quả từ các bảng 21, 22, 23 và 24 cho thấy sau 4 tuần tiêm nọc ong, các xét nghiệm đánh giá chức năng tạo máu như số lượng hồng cầu, hàm lượng huyết sắc tố, số lượng bạch cầu và công thức bạch cầu ở lô NO2 (tiêm nọc ong liều 2 mg/kg/ngày) và lô NO6 (tiêm nọc ong liều 6 mg/kg/ngày) không có sự khác biệt có ý nghĩa so với lô chứng, cũng như không có sự khác biệt giữa các thời điểm trước và sau khi tiêm (p>0,05).
Bảng 26: Ảnh hưởng của nọc ong đến hoạt độ AST (GOT) trong máu chuột
Thời gian Hoạt độ AST (UI/L)
Lô chứng Lô NO2 Lô NO6
Trước tiêm thuốc 129,10 ± 12,81 136,20 ± 10,64 141,90 ± 15,12 Sau 4 tuần tiêm thuốc 126,08 + 17,40 130,6 + 19,5 132,61 + 23,75 p (trước – sau) > 0,05 > 0,05 > 0,05
Bảng 27: Ảnh hưởng của nọc ong đến hoạt độ ALT (GPT) trong máu chuột
Thời gian Hoạt độ ALT (UI/L)
Lô chứng Lô NO2 Lô NO6
Trướctiêm thuốc 40,70 ± 7,70 44,60 ± 6,87 46,10 ± 5,53 Sau 4 tuầntiêm thuốc 41,30 + 5,58 39,95 + 12,76 41,15 + 9,36 p (trước – sau) > 0,05 > 0,05 > 0,05
Kết quả từ các bảng 25 và 26 cho thấy sau 4 tuần tiêm nọc ong, không có sự khác biệt có ý nghĩa về mức độ hủy hoại tế bào gan (hoạt độ AST, ALT trong máu chuột) giữa lô NO2 (tiêm 2mg/kg/ngày) và lô NO6 (tiêm 6mg/kg/ngày) so với lô chứng, cũng như so sánh giữa hai thời điểm trước và sau khi tiêm (p>0,05).
Bảng 28: Ảnh hưởng của nọc ong đến nồng độ ure trong máu chuột
Thời gian Ure (mg/dL)
Lô chứng Lô NO2 Lô NO6
Sau 4 tuần tiêm thuốc 4,18 + 0,64 3,87 + 0,82 3,93 + 0,57 p (trước - sau) > 0,05 > 0,05 > 0,05
Kết quả từ bảng 27 cho thấy sau 4 tuần tiêm nọc ong, nồng độ urea trong máu của chuột ở cả lô NO2 (tiêm 2mg/kg/ngày) và lô NO6 (tiêm 6mg/kg/ngày) không có sự thay đổi đáng kể so với lô chứng, cũng như không có sự khác biệt giữa hai thời điểm trước và sau khi tiêm thuốc thử (p>0,05).
Bảng 29: Ảnh hưởng của nọc ong đến nồng độ creatinin trong máu chuột
Thời gian Creatinin (mg/dL)
Lô chứng Lô NO2 Lô NO6
Trước tiêm thuốc 41,37 ± 5,84 44,83 ± 7,94 46,02 ± 6,85 Sau 4 tuần tiêm thuốc 45,29 + 6,26 45,70 + 8,57 42,63 + 7,90 p (trước - sau) > 0,05 > 0,05 > 0,05
Kết quả từ bảng 28 cho thấy, sau 4 tuần tiêm nọc ong với liều 2mg/kg/ngày (lô NO2) và 6mg/kg/ngày (lô NO6), nồng độ creatinin trong máu chuột không có sự thay đổi có ý nghĩa thống kê so với lô chứng, cũng như không có sự khác biệt giữa hai thời điểm trước và sau khi tiêm thuốc thử (p>0,05).
Trong nghiên cứu trên tất cả các chuột thực nghiệm, bao gồm cả lô chứng và hai lô điều trị, không ghi nhận sự thay đổi bệnh lý nào về mặt đại thể ở các cơ quan như tim, phổi, gan, lách, tuỵ, thận và hệ thống tiêu hóa.
Hình thái vi thể gan
+ Lô chứng: hình ảnh tế bào gan bình thường và thoái hóa mức độ nhẹ
+ Lô NO2: hình ảnh tế bào gan bình thường và thoái hóa mức độ nhẹ
+ Lô NO6: hình ảnh tế bào gan bình thường và thoái hóa mức độ vừa
Hình 33: Hình thái vi thể gan chuột lô chứng, tế bào gan thoái hóa nhẹ
Hình 34: Hình thái vi thể gan chuột lô NO2, tế bào gan thoái hóa nhẹ
Hình 35: Hình thái vi thể gan chuột lô NO6, tế bào gan thoái hóa vừa
Hình thái vi thể thận
+ Lô chứng: hình ảnh thận bình thường
+ Lô NO2: thận bình thường
+Lô NO6: thận bình thường
Hình 36: Hình thái vi thể thận chuột lô chứng, thận bình thường
Hình 37: Hình thái vi thể thận chuột lô NO2, thận bình thường
Hình 38: Hình thái vi thể thận chuột lô NO6, thận bình thường f Nhận xét chung
Nghiên cứu cho thấy mẫu thuốc thử nọc ong với liều 2 mg/kg/ngày và 6 mg/kg/ngày (liều cao gấp 3 lần) không gây độc tính bán trường diễn trên chuột, ngay cả khi được tiêm liên tục trong 4 tuần.
Tất cả các chỉ số theo dõi về tình trạng sức khỏe tổng quát, bao gồm cân nặng, chức năng tạo máu, chức năng gan, mức độ hủy hoại tế bào gan, chức năng thận và mô bệnh học gan, thận đều nằm trong giới hạn bình thường và không có sự khác biệt rõ rệt so với lô chứng Tóm tắt kết quả nghiệm độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của nọc ong cho thấy không có dấu hiệu bất thường nào.
Độc tính cấp của nọc ong trên chuột nhắt trắng:
Độc tính bán trường diễn của nọc ong trên chuột cống trắng:
