THÔNG TIN CHUNG
1 Tên đề tài: “Xây dựng cơ sở dữ liệu trình tự DNA barcode cho một số loài lan rừng
Việt Nam dựa trên marker phân tử DNA barcode”
2 Đơn vị chủ trì: Phòng Thực nghiệm cây trồng, TT Công nghệ Sinh học Tp HCM Địa chỉ: 2374 quốc lộ 1, Phường Trung Mỹ Tây, Quận 12, Tp HCM Điện thoại: 08.3 715 37 92
3 Đơn vị phối hợp chính:
4 Chủ nhiệm đề tài: TS Huỳnh Hữu Đức
5 Cán bộ tham gia thực hiện: TS Huỳnh Hữu Đức, ThS Phan Diễm Quỳnh,
6 Thời gian thực hiện: 36 tháng (Từ 01/2015 đến 12/2017)
Tổng dự toán: 450.000.000đ (Bằng chữ: Bốn trăm năm mươi triệu)
Kinh phí đã sử dụng: 450.000.000 (Bằng chữ: Bốn trăm năm mươi triệu)
Xây dựng cơ sở dữ liệu trình tự DNA cho một số giống lan rừng Việt Nam tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp Hồ Chí Minh bằng cách sử dụng marker phân tử DNA barcode Mục tiêu là đánh giá sự đa dạng nguồn gen, phục vụ cho công tác bảo tồn và lai tạo giống hiệu quả.
9 Các nội dung nghiên cứu đã thực hiện được so với đăng ký
TT Nội dung đăng ký
Thời gian (bắt đầu – kết thúc) Kết quả thực hiện/Kết quả phải đạt Đánh giá
01 Đánh giá, chọn lọc một số giống lan rừng Việt Nam tiêu biểu trong bộ sưu tập lan của
Trung tâm, dùng để thiết lập cơ sở dữ liệu trình tự
- Đánh giá, chọn lọc được 41 giống lan rừng Việt Nam đặc trưng trong đó:
Dendrobium: 35 giống, Aerides: 01 giống, Coelogyne: 01 giống, Spathoglottis: 01 giống, Rhynchostylis:
01 giống, Arachnis: 01 giống, Ascocentrum: 01 giống Đúng tiến độ
Xây dựng quy trình kỹ thuật (sinh học phân tử) cho việc đánh giá đa dạng nguồn gen dựa trên kỹ thuật
- Quy trình tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp CTAB
- Tách chiết DNA tổng số bằng kit
- Khảo sát với 05 cặp mồi (matK2.1F và matK5R, matK472F và matK1248R, matK390F và matK1326R, rbcL1F và rbcL724R, rbcLaF và rbcLaR) cho 02 marker DNA barcode rbcL và matK của
- Dòng hóa 02 marker DNA barcode vào plassmid pJET
- Kiểm tra sự hiện diện chính xác của 02 marker DNA barcode mục tiêu trong plasmid bằng việc xác định kích thước sau khi PCR và điện di
- Giải trình tự Đúng tiến độ
Khảo sát, đánh giá và xây dựng bộ marker phân tử
DNA barcode cho một số giống lan rừng Việt Nam
Khảo sát đã được thực hiện với 22 cặp mồi chuyên biệt cho các vùng DNA barcode, bao gồm cả các vùng mã hóa và không mã hóa như rbcL, matK, atpF-atpH, psbK-psbI, trnH-psbA, ITS, ndh, ycf, rpoB1, rpoB2, rpoC1, và rpoC2 Nghiên cứu này được thực hiện đúng tiến độ.
Phân tích và thiết lập cơ sở dữ liệu trình tự DNA của các đoạn DNA barcode cho một số giống lan rừng
Phân tích cây phát sinh loài được thực hiện dựa trên ba vùng DNA barcode: vùng rbcL với 37 mẫu giống lan, vùng matK với 41 mẫu, và vùng ITS với 33 mẫu Ngoài ra, còn có sự kết hợp giữa rbcL và matK trên 37 mẫu giống lan, cùng với rbcL, matK và ITS trên 33 mẫu giống lan Công việc này được thực hiện đúng tiến độ.
NỘI DUNG KHOA HỌC
ĐẶT VẤN ĐỀ
Việc sưu tầm và lai tạo các giống hoa lan phù hợp với khí hậu và thị hiếu người tiêu dùng là cần thiết để phát triển hoa lan tại Thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh phía Nam Đây là định hướng chính của Thành phố và Trung tâm Công nghệ Sinh học, nhằm thúc đẩy sự chuyển đổi cơ cấu cây trồng nông nghiệp theo hướng công nghệ cao Trung tâm đã thực hiện và hoàn thành dự án này để đạt được mục tiêu trên.
Trung tâm đã sưu tập và nhân nhanh 371 dòng lan, bao gồm 102 giống lan rừng Việt Nam, phục vụ cho nhu cầu nội tiêu và xuất khẩu Hằng năm, Trung tâm tiếp tục thu thập và chọn lọc thêm nhiều giống lan rừng mới, hiện tại có 137 giống Đây là nguồn gen đa dạng và phong phú, nhưng vẫn chưa được khai thác hết.
Trung tâm đã thành công trong việc lai tạo một số tổ hợp lan có tiềm năng thương mại cao, tuy nhiên, để đánh giá toàn diện sự đa dạng và mối liên hệ giữa các giống lan, cần nghiên cứu sâu hơn về thông tin di truyền ở mức độ phân tử Dựa trên thông tin di truyền này, việc chọn lọc các dòng bố mẹ sẽ chính xác hơn, từ đó tăng cơ hội lai tạo các giống lan mới Với tầm nhìn chiến lược về lai tạo giống lan và số hóa cơ sở dữ liệu nguồn gen của lan rừng Việt Nam, chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng cơ sở dữ liệu trình tự DNA cho một số giống lan rừng Việt Nam dựa trên marker phân tử DNA barcode” Mục tiêu của đề tài là xây dựng quy trình sinh học phân tử và cơ sở dữ liệu trình tự DNA nhằm đánh giá nguồn gen và sự đa dạng của các giống lan rừng Việt Nam.
Xây dựng cơ sở dữ liệu trình tự DNA cho một số giống lan rừng Việt Nam tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp Hồ Chí Minh thông qua marker phân tử DNA barcode Mục tiêu là đánh giá sự đa dạng nguồn gen, phục vụ công tác bảo tồn và lai tạo giống hiệu quả.
Xây dựng quy trình kỹ thuật sinh học phân tử nhằm tạo cơ sở dữ liệu trình tự DNA cho các đoạn DNA barcode của một số loài thuộc họ lan Đánh giá và lựa chọn bộ DNA barcode phù hợp cho các giống lan rừng Việt Nam dựa trên bộ sưu tập hiện có tại Trung tâm.
Thiết lập cơ sở dữ liệu trình tự DNA của các đoạn DNA barcode là bước quan trọng trong việc phân tích và đánh giá sự đa dạng nguồn gen của một số giống lan rừng Việt Nam, dựa trên bộ sưu tập lan hiện có tại Trung tâm.
1.2 Ý nghĩa và tính mới về khoa học và thực tiễn
Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp Hồ Chí Minh đã sưu tập 137 giống lan rừng Việt Nam với sự đa dạng về chủng loại Việc khai thác nguồn gen này là cần thiết để bảo tồn và lai tạo giống lan mới Do đó, nghiên cứu sâu hơn ở mức độ phân tử dựa trên DNA của nguồn gen là hướng đi đúng, giúp tối đa hóa các nguồn lực hiện có và phát triển các nghiên cứu chuyên sâu.
Kỹ thuật DNA barcode đang được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trên toàn cầu để phân loại, đánh giá đa dạng sinh học và bảo tồn nguồn gen Dựa trên trình tự DNA của các gen, phương pháp này cho phép xác định nhanh chóng các sinh vật trong hệ thống phân loại và làm rõ mối quan hệ cũng như nguồn gốc giữa chúng Qua đó, DNA barcode hỗ trợ các phương pháp phân lập, dòng hóa, lưu trữ và bảo tồn nguồn gen, đồng thời phân tích sự đa dạng sinh học, góp phần phục vụ cho các nghiên cứu chuyên sâu trong tương lai.
Các kỹ thuật và phương pháp phân tích di truyền ở mức độ phân tử sẽ được áp dụng thông qua sinh tin học, từ đó nâng cao khả năng truy xuất và trao đổi thông tin phục vụ cho nghiên cứu.
Đề tài này có giá trị khoa học cao, không chỉ về kỹ thuật của các phương pháp sinh học phân tử mà còn về ứng dụng của hệ thống phân tích trong sinh tin học Hơn nữa, nó còn mang tính ứng dụng cao khi tạo ra cơ sở dữ liệu trình tự DNA, góp phần quan trọng cho công tác bảo tồn và phát triển các giống Lan mới mang thương hiệu Việt Nam trong tương lai.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược về Phong lan
Họ lan (Orchidaceae) là một trong những họ thực vật có hoa lớn nhất, thuộc bộ Măng tây (Asparagales) và lớp thực vật một lá mầm Họ này phân bố rộng rãi trên toàn cầu, chủ yếu tập trung ở vùng nhiệt đới Theo thống kê từ vườn thực vật hoàng gia Kew, họ lan hiện có khoảng 880 chi và gần 22,000 loài được công nhận, mặc dù con số thực tế có thể lên tới 25,000 loài Điều này cho thấy sự đa dạng sinh học của họ lan, với số lượng giống lan gấp 4 lần so với loài động vật có vú.
Họ lan chiếm khoảng 6–11% tổng số loài thực vật có hoa, với số lượng loài chim gấp đôi Mỗi năm, khoảng 800 giống lan mới được phát hiện, trong đó các chi lớn nhất bao gồm Bulbophyllum với khoảng 2.000 loài, Epidendrum với khoảng 1.500 loài, Dendrobium với khoảng 1.400 loài, và Pleurothallis với khoảng 1.000 loài (Pillon và Chase, 2007).
Hoa lan được yêu thích nhờ vẻ đẹp độc đáo và đa dạng màu sắc, từ những bông hoa nhỏ bằng hạt gạo đến những bông lớn có đường kính lên tới 1 mét Chúng có mặt trong hầu hết các màu sắc của cầu vồng và nhiều sự kết hợp khác nhau Mặc dù phần lớn hoa lan trên thị trường không có hương thơm, nhưng trong tự nhiên có nhiều loại hoa lan mang hương thơm đặc trưng, như hoa lan vanilla từ Mexico, được sử dụng trong ẩm thực toàn cầu Đặc biệt, một số loại hoa lan phát ra mùi như thịt thối để thu hút côn trùng.
Châu Á, đặc biệt là Đông Nam Á, là khu vực có sự đa dạng phong phú về hoa lan, trong đó Việt Nam nổi bật với nhiều chủng loại và màu sắc khác nhau Lan rừng Việt Nam không chỉ thu hút những người yêu hoa trong nước mà còn gây ấn tượng với những tín đồ yêu lan trên toàn thế giới nhờ vào những đặc điểm riêng biệt của chúng.
Lan rừng Việt Nam hiện có hơn 750 loài với đặc trưng đa dạng, mỗi loại yêu cầu điều kiện sinh thái riêng biệt Việt Nam, với địa lý và khí hậu phong phú từ Bắc tới Nam, là nơi sinh sống của nhiều loài lan đặc hữu quý giá Các loài lan như Ascocentrum minitaum, Huyết Nhung, Hồng Lan và Mỹ Dung Dạ Hương mang đến nhiều sắc màu khác nhau, tạo ra tiềm năng cho sự lai tạo phong phú Ngoài ra, những loài như Aerides multiflora và Dendrobium annamensis cũng góp phần làm phong phú thêm bảng màu tự nhiên Không chỉ về sắc đẹp, nhiều giống lan rừng Việt Nam còn có độ bền cao, với một số loài nở lâu hơn 2 tháng.
Dạ Hương, Huyết Nhung, Hoàng Lan, Hồng Lan) những cũng có loại nở trung bình từ
Phong lan rừng Việt Nam có thời gian nở từ 1 đến 2 tuần, với nhiều loài như Long tu, Kim điệp, Đuôi cáo, và Ngọc điểm Một số loài như Thạch hộc chỉ nở trong một ngày Kích thước của các loài phong lan rất đa dạng, từ những giống nhỏ như Eria đến những loài lớn hơn 10 cm như Hạc Đĩnh, Huyết Nhung, Mỹ Dung và Dạ Hương Mặc dù kích thước của lan rừng thường nhỏ hơn so với các giống lan lai, nhưng chúng lại nổi bật với hương thơm hấp dẫn.
8 hương thơm có thể kể đến chính là Mỹ Dung Dạ Hương, Hạc Đỉnh, Đuôi Cáo, Ngọc Điểm…
Lan rừng Việt Nam là nguồn lợi nhuận tiềm năng với hiệu quả kinh tế cao nếu được khai thác và lai giống hợp lý Không chỉ mang lại vẻ đẹp, các giống lan còn có khả năng thu ngoại tệ cho đất nước Đây là một trong những tặng phẩm quý giá mà thiên nhiên ban tặng cho vùng núi rừng Tuy nhiên, nguồn gen này vẫn chưa được khai thác và quản lý hiệu quả, điển hình là giống lan hài.
Paphiopedilum delenatii, do không được khai thác kịp thời và hợp lý nên Việt Nam chưa thể khai thác triệt để loài hoa này
Việt Nam có khoảng 500 loài phong lan ở các tỉnh miền Nam, chưa kể đến nhiều loại có thể chưa được phát hiện do ảnh hưởng của chiến tranh Điều này khẳng định rằng Việt Nam là một trong những quốc gia sở hữu trữ lượng phong lan phong phú nhất trên thế giới.
2.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa lan
Theo Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Tp Hồ Chí Minh, từ năm 2004 đến 2010, diện tích hoa kiểng tại thành phố đã tăng từ 591,5 ha lên 1.401 ha Sự gia tăng này chủ yếu tập trung vào các loại cây như mai vàng, hoa lan, bon sai và cây kiểng Đặc biệt, diện tích trồng hoa lan đã mở rộng từ 20 ha năm 2003 lên 104,5 ha vào năm 2010, với hai nhóm chính là Dendrobium và Mokara Nhiều mô hình trồng hoa lan hiện nay đạt doanh thu cao.
Sản phẩm hoa lan của Tp Hồ Chí Minh có giá trị khoảng 1 tỉ đồng/ha, không chỉ phục vụ nhu cầu hoa cắt cành cho thành phố mà còn cung cấp cho nhiều tỉnh thành khác trong cả nước Tuy nhiên, khả năng cung cấp hiện tại chưa đáp ứng đủ nhu cầu tiêu thụ, dẫn đến việc hàng năm phải nhập khẩu một lượng lớn hoa lan từ Thái Lan và Đài Loan (Dương Hoa Xô và cộng sự, 2011).
Hiện nay, tại Tp HCM, nhiều cơ quan và đơn vị như Viện Sinh học nhiệt đới, Trung tâm nghiên cứu và phát triển nông nghiệp công nghệ cao, và Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đang tích cực nghiên cứu và nhân giống hoa lan Đặc biệt, Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp HCM đã đạt được nhiều kết quả đáng kể trong việc lai tạo các giống lan mới.
Trung tâm CNSH Tp HCM đóng vai trò quan trọng trong việc bảo tồn và lai tạo các giống Lan mới phục vụ nhu cầu trong nước và xuất khẩu Đơn vị đã sưu tập được nhiều giống Lan rừng Việt Nam đa dạng, góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành hoa Lan.
137 giống Lan được coi là nguồn giống bố mẹ quý giá cho công tác lai tạo Tuy nhiên, hiện tại việc sưu tập và đánh giá các dòng Lan chủ yếu dựa trên hình thái, thiếu dữ liệu chuyên sâu về di truyền ở mức độ phân tử Việc bổ sung cơ sở dữ liệu về bản chất di truyền của các giống Lan sẽ nâng cao giá trị bộ sưu tập và mở ra cơ hội mới cho lai tạo giống.
2.4 Lai tạo hoa lan và chọn lọc giống bố mẹ
Trong quá trình lai tạo hoa lan, nhân giống hữu tính vẫn là phương pháp chủ đạo để tạo ra các giống hoa lan với đặc tính di truyền nổi bật như khả năng ra hoa dày, màu sắc rực rỡ, thời gian tồn tại lâu và hương thơm Tuy nhiên, kỹ thuật này rất phức tạp do phụ thuộc vào tính tương hợp di truyền giữa giống bố và mẹ Hơn nữa, hạt lan nhỏ và quy trình gieo ươm phức tạp dẫn đến tỷ lệ nảy mầm thấp, cùng với tính phân ly cao, yêu cầu thời gian sàng lọc dài Do đó, việc lựa chọn và sàng lọc các dòng bố mẹ phù hợp là cực kỳ quan trọng trong công tác lai tạo giống lan.
Trong công tác tạo giống hoa lan, việc chọn lựa giống bố mẹ rất quan trọng, thường dựa vào các đặc tính nổi trội như khả năng sinh trưởng, hình thái thân lá, màu sắc, cấu trúc hoa và hương thơm Mỗi loài hoa lan có những ưu điểm riêng, ví dụ, một số loài có hình thái thân lá đẹp nhưng màu sắc hoa lại không nổi bật, trong khi những loài khác lại có màu hoa đẹp nhưng thiếu hương thơm và thời gian tồn tại ngắn Để tạo ra giống hoa lan hoàn hảo, cần áp dụng các biện pháp lai tạo hợp lý nhằm kết hợp các đặc tính mong muốn Việc chọn bố mẹ có quan hệ di truyền gần gũi, như cùng loài hoặc cùng chi, thường mang lại hiệu suất lai tạo tốt hơn và giúp con lai phát triển bình thường Ngược lại, nếu chọn bố mẹ khác chi, việc tạo quả có thể gặp khó khăn và quả cũng không có khả năng hình thành hạt.
VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Dendrobium, Aerides, Coelogye, spathoglottis, Rhyncostylis, Ascocentrum, Arachnis.
3.2.1 Đánh giá, chọn lọc một số giống lan rừng Việt Nam tiêu biểu trong bộ sưu tập Lan của Trung tâm, dùng để thiết lập cơ sở dữ liệu trình tự DNA
Chọn khoảng 30 giống lan đặc trưng từ bộ sưu tập giống lan rừng Việt Nam của Trung tâm, dựa trên các tiêu chí như: lựa chọn một số chi phổ biến như Dendrobium, Aerides, Coelogye, spathoglottis, Rhyncostylis, Ascocentrum và Arachnis, với ưu tiên chọn những giống có khả năng nở hoa trong điều kiện nuôi trồng tại Trung tâm Mỗi chi sẽ chọn từ 3-5 cá thể, và việc định danh sẽ dựa trên nền tảng phân loại học Các chuyên gia phân loại học sẽ tiến hành đánh giá và phân loại sơ bộ dựa trên hình thái thân, lá, cùng với đánh giá chi tiết dựa trên hình hoa khi cây nở.
3.2.2 Xây dựng quy trình kỹ thuật (sinh học phân tử) cho việc thiết lập cơ sở dữ liệu trình tự DNA dựa trên marker phân tử DNA barcode
3.2.2.1 Xây dựng quy trình tách chiết DNA tổng số
Các mẫu lá thu thập từ vườn lan được sử dụng để chiết xuất DNA tổng số thông qua phương pháp CTAB và bộ kit tinh chế DNA thực vật GeneJET.
* Phương pháp CTAB (Doyle and Doyle, 1990)
1 Nghiền 200 mg mẫu lá cho đến khi thành bột mịn trong khoảng 500 μl dung dịch CTAB
2 Chuyển hỗn hợp mẫu/CTAB sang microtube
3 Ủ hỗn hợp mẫu/CTAB khoảng 15 phút ở 55 o C trong bồn nước
4 Sau khi ủ, ly tâm hợp mẫu/CTAB ở 12000 rpm trong 5 phút Chuyển dịch nổi sang ống mới
5 Thêm vào mỗi ống 250 μl hỗn hợp Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1) và trộn dung dịch bằng cách đảo ngược ổng Sau đó, ly tâm ống ở tốc độ 13000rpm trong
6 Chuyển pha lỏng bên trên (chứa DNA) sang ống mới
7 Thêm vào mỗi ống 50 μl Ammonium Acetate 7.5 M, tiếp theo là 500 μl ethanol tuyệt đối
8 Đảo ống chậm rãi nhiều lần để kết tủa DNA Thông thường, có thể nhìn thấy DNA kết tủa trong dung dịch Có thể để ống ở -20 o C trong 1 giờ sau khi thêm ethanol
9 Để rửa DNA, ly tâm hỗn hợp chứa DNA, loại bỏ dịch nổi, thêm vào 500 μl ethanol 70% lạnh và đảo ống Lặp lại bước này thêm 1 lần
10 Sau khi rửa, ly tâm thu DNA ở tốc độ 13000 rpm trong 1 phút Loại bỏ dịch nổi và để DNA khô (khoảng 15 phút)
11 Chú ý không để DNA quá khô như vậy sẽ khó hòa tan trở lại
12 Hòa DNA trong nước đã lọc khử trùng, không chứa Dnase (khoảng 50 – 400 μl)
13 Có thể thêm RNaseA (10 μg/ml) vào nước trước khi hòa tan DNA (10 μl RNaseA trong 10ml H2O)
14 Ủ DNA ở 65 o C trong 20 phút để phá hủy Dnase và bảo quản ở 4 o C
* Tách chiết DNA bằng bộ kit (GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit)
1 Cân 100 mg mẫu lá nghiền trong nitơ lỏng thành bột mịn
2 Chuyển vào effendorf chứa sẵn 350 àl Lysis Buffer A
3 Bổ sung 50 àl Lysis Bufer B, 20 àl RNase A, trộn đều (vortex) trong 1 phỳt, ủ ở
4 Bổ sung 130 àl Precipitation Solution, lắc đều, giữ lạnh trờn đỏ trong 5 phỳt
5 Ly tâm 14000 rpm trong 5 phút
6 Thu dịch nổi chuyển sang ống mới ( khoảng 450 – 550 àl)
7 Bổ sung 400 àl Plant gDNA Binding solution, 400 àl 96% ethanol, lắc đều hỗn hợp
8 Chuyển 1/2 hỗn hợp (khoảng 600 – 700 àl) vào cột spin column
9 Ly tâm 8000rpm trong 1 phút, loại bỏ dịch lỏng qua cột
10 Chuyển 1/2 hỗn hợp còn lại vào cột spin column
11 Ly tâm 8000rpm trong 1 phút, loại bỏ dịch lỏng qua cột
12 Bổ sung 500 àl dung dịch rửa ( Wash Buffer I), ly tõm 10000 rpm trong 1 phỳt, loại bỏ dịch qua cột
13 Đặt cột vào tube mới, bổ sung 500 àl Wash Buffe II vào cột, ly tõm 14000 rpm trong 3 phút, loại bỏ dịch lỏng qua cột
14 Đặt cột vào tube mới, bổ sung 100 àl Elution, ủ ở nhiệt độ phũng trong 5 phỳt
15 Ly tâm 10000 rpm trong 1 phút, thu dịch lỏng qua cột
16 Lặp lại bước 14 và 15 Thu dịch lỏng (chứa DNA tổng số)
17 Sử dụng và bảo quản -20 0 C
3.2.2.2 Phân lập vùng DNA barcode
Để phân lập đoạn DNA barcode, cần sử dụng các cặp mồi phù hợp với từng vùng DNA barcode như rbcL và matK thông qua phản ứng PCR Phản ứng được thực hiện trong thể tích 20 µl, bao gồm các thành phần phản ứng theo bảng 4.1 và chu kỳ nhiệt độ quy định Kết quả của phản ứng được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,2%, sau đó nhuộm bằng thuốc nhuộm an toàn, và cuối cùng quan sát sự xuất hiện của các băng DNA trên gel bằng máy Geldoc.
Chọn lọc cặp mồi PCR cho từng loài và chi như:
• rbcLaF (5’-ATG TCA CCA CAA ACA GAG ACT AAA GC-3’) và rbcLaR
(5’-GTA AAA TCA AGT CCA CCR CG-3’)
• rbcL 1F (5’-ATG TCA CCA CAA ACA GAA AC-3’) và rbcL 724R (5’-TCG
CAT GTA CCT GCA GTA GC-3’)
• matK390F (5’-CGA TCT ATT CAT TCA ATA TTT C-3’) và matK1326R (5’-
TCT AGC ACA CGA AAG TCG AAG T-3’)
• matK472F (5’-CCC RTY CAT CTG GAA ATC TTG GTT C-3’) và matK1248R (5’-GCT RTR ATA ATG AGA AAG ATT TCT GC-3’)
• matK2.1F (5’-CCT ATC CAT CTG GAA ATC TTA G-3’) và matK5R (5’-
GTT CTA GCA CAA GAA AGT CG-3’)
Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của mồi:
- Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của mồi matK2.1F – matK5R với dãy nhiệt độ:51 0 C – 57 0 C
- Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của mồi matK390F – matK1326R với dãy nhiệt độ:
- Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của mồi matK472F – matK1248R với dãy nhiệt độ:
- Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của mồi rbcLaF - rbcLaR với dãy nhiệt độ: 52 0 C –
- Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của mồi rbcL1F – rbcL724 R với dãy nhiệt độ:
Bảng 1.1 Thành phần phản ứng PCR
STT Thành phần Nồng độ đầu Nồng độ cuối
4 My Taq HS DNA polymerase 5U/àL 0.05U
Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
Các đoạn DNA barcode sau khi phân lập bằng phản ứng PCR được gắn vào vector pJET1.2 bằng CloneJET TM PCR Cloning Kit Phản ứng được thực hiện với thể tích 20 µl, theo thành phần phản ứng như bảng 4.2 Sau khi vortex hỗn hợp và ly tâm trong 3 - 5 giây, hỗn hợp gắn được ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút và sau đó bảo quản ở -20 °C.
Bảng 1.2 Thành phần phản ứng tạo dòng
STT Thành phần Thể tích phản ứng
3 Vector pJET1.2/blunt Coning 1 àl
4 Nước Bổ sung đủ 19 àl
Kiểm tra sự hiện diện chính xác của các đoạn DNA barcode mục tiêu trong plasmid và lưu trữ:
Kiểm tra kết quả bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi pJET1.2F và pJET1.2R chuyên biệt cho vector Phản ứng PCR được thực hiện với thể tích 20 µl, chứa các thành phần cần thiết.
Kết quả phản ứng của 19 thành phần được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,2% Sau khi nhuộm bằng thuốc nhuộm an toàn, sự xuất hiện của các băng DNA trên gel được quan sát bằng máy Geldoc.
Bảng 1.3 Thành phần phản ứng PCR kiểm tra sự hiện diện sự chính xác của đoạn DNA barcode mục tiêu
STT Thành phần Nồng độ đầu Nồng độ cuối
4 My Taq HS DNA polymerase 5U/àL 0.05U
Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
Bản đồ và tính năng của vector tạo dòng pJET1.2/blunt:
Hình 1.1 Bản đồ vector pJET1.2/blunt Vùng trình tự DNA của MCS
Hình 1.2 Vùng trình tự DNA của MCS 3.2.2.4 Giải trình tự
Sau khi tạo dòng plasmid và kiểm tra bằng kỹ thuật PCR, plasmid sẽ được giải trình tự để xác định đoạn gen đã được nhân dòng Kết quả giải trình tự sẽ được so sánh với các trình tự đã được công bố trên ngân hàng gen, nhằm đảm bảo rằng đoạn gen đã được nhân dòng đúng là đoạn gen mục tiêu mà chúng ta quan tâm.
3.2.3.Khảo sát, đánh giá và xây dựng bộ marker phân tử DNA barcode cho một số giống lan rừng Việt Nam (thực hiện năm 2016 và tiếp tục trong năm 2017)
Khảo sát và chọn lọc các marker DNA barcode cho các giống Lan được chọn lựa Việc chọn lựa các marker dựa trên 2 đặc tính chính:
Tính phổ quát: tương thích tối đa với các mẫu được khảo sát Khảo sát hai marker chính: rbcL, matK
Tính chuyên biệt: khả năng phân biệt và định danh cao giữa các mẫu được khảo sát
Khảo sát tối thiểu 3 marker: psaB, atpB, trnH-psbA
Trình tự các mồi cho từng marker DNA barcode dựa trên khuyến nghị của BOLD
Tối ưu hóa điều kiện PCR cho từng cặp mồi
Thành phần và số lượng các cặp mồi có thể thay đổi dựa trên kết quả tối ưu hóa điều kiện PCR cho các loài đã chọn.
Việc hiệu chỉnh các cặp mồi cho từng marker
Khảo sát và chọn lọc các cặp mồi thích hợp cho từng loại marker DNA barcode ứng dụng cho Lan
Khảo sát và chọn lọc các cặp mồi ban đầu dựa trên việc đối chứng giữa trình tự mồi và cơ sở dữ liệu DNA barcode có sẵn trên NCBI (genebank).
Tối ưu hóa điều kiện PCR cho từng cặp mồi là bước quan trọng để đảm bảo tính tương thích Các cặp mồi được kiểm tra qua PCR trên mẫu Lan thực tế nhằm xác nhận hiệu quả và độ chính xác của quá trình này.
Thành phần và số lượng các cặp mồi có thể điều chỉnh dựa trên kết quả tối ưu hóa điều kiện PCR cho các loài đã chọn.
3.2.4 Phân tích và thiết lập cơ sở dữ liệu trình tự DNA của các đoạn DNA barcode cho một số giống lan rừng Việt Nam (thực hiện trong năm 2017)
Trình tự DNA barcode của từng giống Lan sẽ được lưu trữ trong cơ sở dữ liệu mềm, cho phép truy xuất và thao tác dễ dàng bằng các phần mềm phù hợp, theo hướng dẫn của BOLD - Hệ thống Dữ liệu Mã vạch Sự sống.
Các đoạn DNA barcode từ các mẫu Lan khảo sát bước đầu được so sánh tính tương đồng và phân tích sơ bộ bằng phần mềm Clustal
Sự phân tích mối liên hệ di truyền và tiến hóa giữa các giống Lan được thực hiện thông qua phần mềm MEGA cùng với một số phần mềm tương tự khác.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Đánh giá, chọn lọc một số giống lan rừng Việt Nam tiêu biểu trong bộ sưu tập Lan của Trung tâm, dùng để thiết lập cơ sở dữ liệu trình tự DNA
4.1.1 Chọn lọc các giống lan rừng dựa trên bộ sưu tập các giống lan rừng Việt Nam của Trung tâm để thiết lập cơ sở dữ liệu trình tự DNA
Chọn 41 giống lan đặc trưng dựa trên bộ sưu tập các giống lan rừng Việt Nam của Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp Hồ Chí Minh đang được trồng tại điều kiện nhà lưới để thiết lập cơ sở dữ liệu trình tự DNA
Bảng 2.1 liệt kê các giống lan được chọn để xây dựng cơ sở dữ liệu trình tự DNA, dựa trên bộ sưu tập các loài lan rừng tại Trung tâm Công nghệ sinh học TP.HCM.
STT Tên loài Tên chi Tên khoa học
D001 Thủy tiên tím Dendrobium amabile (Lour.) O’ Brien
D002 Hoàng phi hạc Dendrobium signatum Rchb.f
D003 Giả hạc hè Dendrobium superbum
D004 Giả hạc trắng Dendrobium Nestor
D005 Thủy tiên dẹt Dendrobium sulcatum Lindl
D006 Đại ý thảo Dendrobium aphyllum (Roxb.)
D007 Hoàng thảo thái bình Dendrobium pulchellum Roxb ex Lindl
D008 Thủy tiên mỡ gà Dendrobium densiflorum Wall ex Lindl
D009 Long tu Dendrobium primulinum Lindl
D010 Thủy tiên vàng Dendrobium thyrsiflorum Rchb.f;
D011 Thủy tiên trắng Dendrobium farmeri PaxtonLindl.f.Rrchb.f
D012 Giả hạt xuân mới Dendrobium anosmum var alba
D014 Báo hỷ Dendrobium secundum (Bl.) Lindl
D015 Xương cá Dendrobium aloifolium (Bl.)
D016 Den Rừng mới Dendrobium chrysotoxum
D017 Đại ý thảo 3 màu Dendrobium devonianum Paxt
D018 Thập nhất hoa tím Dendrobium hercoglossum Rchb f
D019 Long nhãn Dendrobium fimbriatum HookRchb.f.Rrchb.f
D020 Phi điệp vàng Dendrobium chryseuam
D021 Trúc đen Dendrobium salaccense (Bl.) Lindl
D022 Hoàng thảo râu môi Denrobium brymerianum Rrchb.f
D023 Trường sơn xanh Dendrobium venustum TeijsmanLindl
D024 Giả hạt xuân Dendrobium anosmum Lindl
D025 Kim điệp vàng Dendrobium capillipes Rchb.f.Rrchb.f
D026 Trường sơn trắng Dendrobium delacourri
D027 Kim thoa thạch hộc Dendrobium nobile Lindl.f.Rrchb.f
D028 Thái bình lai Dendrobium Gatton sunriseLindl.f
D029 Hoàng thảo xoán họng vàng Dendrobium tortile Lindl
D030 Hồng liên Dendrobium linguella Rchb f.Rrchb.f
D031 Hoàng thảo tuyết mai Dendrobium crumenatum SwRrchb.f
D032 Hoàng thảo ngọc thạch Dendrobium crystallinum Rchb f
D033 Hoàng thảo cong Dendrobium intricatum
D034 Hoàng thảo vôi Dendrobium cretaceum LindlRrchb.f
D035 Trầm hương Den anosmum x Den
Ae001 Đuôi cáo Aerides Aerides multiflora Roxb
Co001 Thanh đạm 3 gân Coelogyne Coelogyne trinervis Lindl
Sp001 Chu đinh lan tím Spathoglottis Spathoglottis plicata Bl
Rh001 Hải yến Rhynchostylis Rhynchostylis coelestis Rchb.f
As001 Hoả hoàng cam Ascocentrum Ascocentrum miniatum (Lindley) Schltr
Ar001 Bò cạp tía Arachnis Renanthera evrardii
4.1.2 Một số hình ảnh của các giống lan được chọn lọc trong nghiên cứu
Thủy tiên tím Hoàng phi hạc Thủy tiên dẹt Đại ý thảo
Thủy tiên mỡ gà HT long tu Thủy tiên vàng
Thủy tiên trắng Giả hạc xuân mới HT hoa vàng Báo hỷ
HT xương cá Dendro rừng mới Ý thảo 3 màu HT thập nhất hoa
Long nhãn kim điệp Phi điệp vàng HTtrúc đen Hoàng thảo râu môi
Trường sơn xanh Giả hạc xuân Kim điệp vàng Trường sơn trắng
HT ngọc thạch Hoàng thảo cong Hoàng thảo vôi
Trầm hương Đuôi cáo Thanh đạm 3 gân Chu đinh lam tím
Hải yến Hỏa hoàng cam Bò cạp tía
Hình 2.1 Một số giống lan được chọn lọc để thực hiện trong nghiên cứu
4.2 Xây dựng quy trình kỹ thuật (sinh học phân tử) cho việc thiết lập cơ sở dữ liệu trình tự DNA dựa trên marker phân tử DNA barcode (thực hiện năm 2015) 4.2.1 Kết quả ly trích DNA tổng số
Sự hấp thu ánh sáng khác nhau của các base nito trong DNA mạch kép và mạch đơn cho phép xác định hàm lượng DNA trong dung dịch Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm giúp xác định nồng độ DNA, trong khi giá trị 280 nm được sử dụng để kiểm tra độ tinh sạch của dung dịch Protein hấp thụ mạnh ở 280 nm và cũng có sự hấp thụ ở 260 nm, gây sai lệch trong việc tính toán nồng độ acid nucleic Khi tỷ lệ OD260/OD280 đạt từ 1,8 đến 2, dịch ly trích DNA được coi là tinh sạch.
Ly trích DNA bằng CTAB 2% với các kỹ thuật nghiền mẫu và bổ sung hoặc không bổ sung β-mercaptoethanol, PVP
Bảng 2.2 Kết quả kiểm tra chất lượng và nồng độ DNA tổng số bằng NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer
Hình 2.2 A: Kết quả điện di DNA tổng số, B: sản phẩm PCR khuếch đại vùng ITS với cặp mồi ITS1-F-ITS1-R
Chất lượng DNA sau khi ly trích bằng 9 quy trình khác nhau được kiểm tra qua điện di trên gel Agarose 1% và nồng độ DNA được xác định bằng máy NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer Kết quả cho thấy tất cả các nghiệm thức đều có vạch xuất hiện, nhưng độ sáng của các vạch khác nhau Mẫu DNA được nghiền trong CTAB 2% + β-mecaptoethanol cho vạch rõ và sáng nhất.
Máy NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer cho phép xác định nồng độ DNA tổng số thông qua tỷ lệ OD ở bước sóng 260 nm và 280 nm Tỷ lệ 260/280 nằm trong khoảng 1,8 – 2,0 cho thấy DNA thu được là tinh sạch, trong khi tỷ lệ dưới 1,8 cho thấy sự hiện diện của protein Kết quả từ bảng 1 chỉ ra rằng các phương pháp thử nghiệm có tỷ lệ 260/280 dưới 1,8, cho thấy DNA còn lẫn protein Nghiệm thức 3 có tỷ lệ 260/280 cao nhất là 1,73, tiếp theo là nghiệm thức 1 với 1,58 và nghiệm thức 7 với 1,46, trong khi các nghiệm thức còn lại đều dưới 1,3 Kết quả điện di của nghiệm thức 1, 3 và 7 cho thấy hiệu quả tốt nhất, chứng tỏ rằng phương pháp nghiền mẫu và thành phần CTAB ảnh hưởng đến hiệu quả ly trích DNA.
Kết quả khuếch đại vùng ITS1 trên cpDNA cho thấy sản phẩm khuếch đại đạt khoảng 400 bp, với độ sáng khác nhau giữa các thí nghiệm Cụ thể, thí nghiệm 2, 3, và 7 có độ sáng rõ nhất, trong khi nghiệm thức 3 và 7 cho kết quả phù hợp với điện di DNA tổng số Điều này chứng tỏ rằng phương pháp ly trích DNA có ảnh hưởng đến phản ứng PCR và các kỹ thuật khác, cũng như điều kiện kết tủa trong giai đoạn thu DNA tổng số.
Bảng 2.3 Kết quả kiểm tra chất lượng và nồng độ DNA tổng số bằng NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer
Chú thích: NT 1 – 6: Nghiễn mẫu trong CTAB 2% + 0,2% β-mercaptoethanol ở điều kiện thường NT 7 – 12:
Nghiền mẫu DNA được thực hiện trong dung dịch CTAB 2% kết hợp với 0,2% β-mercaptoethanol và 2% PVP ở điều kiện thường Đối với NT 13 – 18, mẫu được nghiền trong nitơ lỏng, sử dụng cùng tỷ lệ CTAB, β-mercaptoethanol và PVP để chiết xuất DNA tổng số Trong trường hợp 0, không có sự bổ sung nào, trong khi tỷ lệ 1:1 đề cập đến việc bổ sung thể tích tương ứng với dung dịch thu được.
Hình 2.3 trình bày kết quả điện di DNA tổng số và sản phẩm PCR khuếch đại vùng ITS với cặp mồi ITS1F-ITS4R từ DNA tổng số được chiết xuất bằng phương pháp CTAB cải tiến.
Kết quả điện di cho thấy nghiệm thức có bổ sung Ammonium acetate 7,5M (nghiệm thức 4-6, 10-12, 16-18) đều cho các vạch sản phẩm DNA tổng Ngược lại, nghiệm thức 3 và 6 không bổ sung Ammonium acetate 7,5M, ethanol 99%, isopropanol 99% không thu được DNA tổng số, với tỷ lệ 260/280 lần lượt là 0,98 và 0,05 Nồng độ DNA của nghiệm thức 3-2 là 0,05 ng/µl và nghiệm thức 6-2 là 0 ng/µl, cho thấy rằng việc không bổ sung các hóa chất này trong giai đoạn kết tủa sẽ không thu được DNA Nếu chỉ sử dụng ethanol 99% và isopropanol 99% mà không có Ammonium acetate 7,5M, tỷ lệ 260/280 đạt khoảng 1,8-2, với nghiệm thức 1 là 1,92 và nghiệm thức 2 là 47,92 Nồng độ DNA của nghiệm thức 1 và 2 lần lượt là 139,32 ng/µl và 47,92 ng/µl Khi kết hợp Ammonium acetate 7,5M với ethanol 99% hoặc isopropanol 99%, DNA thu được có độ tinh sạch cao với tỷ lệ 260/280 là 1,96 và nồng độ DNA 77,8 ng/µl khi kết hợp với ethanol, và 1,74 với 43,78 ng/µl khi kết hợp với isopropanol Điều này cho thấy Ammonium acetate 7,5M ảnh hưởng đến quá trình tủa DNA, với nồng độ DNA thu được cao hơn khi không bổ sung Kết quả điện di cũng cho thấy sự tương đồng giữa 2 nghiệm thức có và không bổ sung PVP 2% Tuy nhiên, việc bổ sung PVP 2% vào CTAB làm giảm độ tinh sạch và nồng độ DNA tổng số, chứng tỏ PVP ảnh hưởng tiêu cực đến chất lượng DNA Nghiệm thức 13-18 cho thấy khi thay đổi phương pháp nghiền trong CTAB thành nghiền trong nitơ lỏng, giữ nguyên điều kiện kết tủa DNA như ở nghiệm thức 7-12, kết quả cũng có sự thay đổi đáng kể.
Phương pháp nghiền mẫu và thành phần hóa chất trong quá trình nghiền mẫu có mối liên hệ chặt chẽ, ảnh hưởng đến chất lượng và nồng độ DNA tổng số Việc tăng cường chất lượng này là rất quan trọng để đạt được kết quả phân tích chính xác.
Kết quả khuếch đại vùng ITS1 trên DNA tổng số ly trích cho thấy sự thay đổi trong thành phần kết tủa DNA theo 18 phương pháp khác nhau Đặc biệt, nghiệm thức 9 (không bổ sung thành phần nào) và nghiệm thức 12 (chỉ bổ sung Ammonium acetate 7,5M) có độ sáng thấp hơn so với các nghiệm thức khác Mặc dù vậy, hai nghiệm thức này không cho thấy sản phẩm DNA và nồng độ DNA ở dạng vết Ngược lại, nghiệm thức không bổ sung Ammonium acetate 7,5M và sử dụng ethanol 99% để tủa đã cho kết quả độ sáng cao nhất, chứng tỏ rằng việc không bổ sung Ammonium acetate 7,5M vẫn có thể thu được DNA chất lượng tốt với nồng độ cao.
Nghiệm thức 7 – 18 cho thấy chất lượng và nồng độ DNA tổng số thu được thấp hơn so với các nghiệm thức khác khi nghiền mẫu trong CTAB 2% + 0,2% β-mercaptoethanol + 2% PVP ở nhiệt độ thường, điều này ảnh hưởng đến phản ứng PCR Sản phẩm khuếch đại của vùng ITS1 ở nghiệm thức 13-18 cũng mờ hơn, và kết quả điện di cho thấy mặc dù tất cả các thí nghiệm đều có sản phẩm khuếch đại, nghiệm thức 15 và 18 lại cho chất lượng thấp và không có sản phẩm Nghiên cứu chỉ ra rằng việc nghiền mẫu trong nitơ lỏng với 2% PVP trong CTAB có thể làm giảm chất lượng phản ứng PCR, dẫn đến ảnh hưởng tiêu cực đến các kỹ thuật phân tích tiếp theo.
ĐÁNH GIÁ CHUNG
5.1 Nhận xét và đánh giá kết quả đạt được so với yêu cầu Đề tài nghiên cứu đã thu được các kết quả sau:
A total of 41 distinct Vietnamese wild orchid species have been evaluated and selected, comprising 35 Dendrobium varieties, as well as one each from Aerides, Coelogyne, Spathoglottis, Rhynchostylis, Arachnis, and Ascocentrum DNA extraction was performed using a specialized kit.
- Đã xây đựng được quy trình kỹ thuật cho việc thiết lập trình tự cơ dữ liệu DNA trên lan
Nghiên cứu này tiến hành khảo sát với 22 cặp mồi chuyên biệt cho các vùng DNA barcode, bao gồm cả vùng mã hóa và không mã hóa như rbcL, matK, atpF-atpH, psbK-psbI, trnH-psbA, ITS, ndh, ycf, rpoB1, rpoB2, rpoC1, và rpoC2 Tất cả 12 vùng trình tự DNA barcode đã được khuếch đại bằng từng cặp mồi chuyên biệt cho mỗi vùng, với 41 mẫu lan thuộc các chi khác nhau.
Dendrobium, Aerides, Coelogyne, Spathoglottis, Rhyncostylis, Aascocentrum, Arachnis Tỷ lệ khuếch đại các vùng DNA barcode với primer chuyên biệt là rbcL
(97,6%), psbK-psbI (97,6%), trnH-psbA (61%), ITS1 (85,4%), ITS (87,6%; 51,6%),
ITS2(75,6%), rpoB1 (85,4%), rpoB2 (92,7%), rpoC1 (85,4%), rpoC2 (58,5%), ndh (0%), ycf (0%) trên 41 mẫu lan rừng Việt Nam
Giải trình tự DNA barcode rbcL, matK, ITS trên 41 mẫu lan cho thấy tỷ lệ giải thành công lần lượt là 90,24% cho rbcL, 100% cho matK và 80,40% cho ITS Kết quả BLAST trên Genbank cho thấy mức độ tương đồng và bao phủ của rbcL đạt từ 93-99% và 87-99%, matK từ 85-100% và 88-99%, trong khi ITS đạt từ 71-99% và 88-100%.
Trình tự các đoạn DNA barcode rbcL , matK, ITS được lưu trữ dưới dạng cơ sở dữ liệu mềm
Phân tích cây phát sinh loài dựa trên ba vùng DNA barcode cho thấy sự đa dạng sinh học trong các mẫu giống lan Cụ thể, vùng rbcL được nghiên cứu trên 37 mẫu, vùng matK trên 41 mẫu, và vùng ITS trên 33 mẫu giống lan Ngoài ra, kết hợp rbcL và matK trên 37 mẫu, cùng với ba vùng rbcL, matK và ITS trên 33 mẫu, cung cấp cái nhìn sâu sắc về mối quan hệ tiến hóa của các giống lan này.
5.2 Các nội dung công vệc chưa hoàn thành và lý do (nếu có)
ĐỀ NGHỊ
Ứng dụng marker DNA barcode rbcL, matK, ITS và một số marker khác để xây dựng cơ sở dữ liệu cho lan rừng Việt Nam, xác định loài
Giải trình tự một số DNA barcode khác để đánh giá mức độ hiệu quả giữa các vùng marker khác nhau.