Xây dựng bộ sưu tập các chủng vi khuẩn bacillus spp pseudomonas spp có khả năng đối kháng nấm colletotrichum spp gây bệnh thán thư trên cây ớt

Nội dung tham gia chính Sản phẩm chủ yếu đạt được Ghi chú* 1 Trần Thùy Trang Trần Thùy Trang Nội dung 1, 2, 3 - Xây dựng được bộ sưu tập chủng vi sinh vật bao gồm tác nhân gây b

Trang 1

ỦY BAN NHÂN DÂN SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TP HCM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC TP HCM

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ:

“XÂY DỰNG BỘ SƯU TẬP CÁC CHỦNG VI KHUẨN Bacillus spp.,

Pseudomonas spp CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM

Colletotrichum spp GÂY BỆNH THÁN THƯ TRÊN CÂY ỚT”

Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM Chủ nhiệm nhiệm vụ: ThS Trần Thùy Trang

Trang 2

ỦY BAN NHÂN DÂN SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TP HCM

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC TP HCM

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

XÂY DỰNG BỘ SƯU TẬP CÁC CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP.,

PSEUDOMONAS SPP CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM

COLLETOTRICHUM SPP GÂY BỆNH THÁN THƯ TRÊN CÂY ỚT

(Đã chỉnh sửa theo kết luận của Hội đồng nghiệm thu ngày 17/11/2020)

Trang 3

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

TP Hồ Chí Minh, ngày 23 tháng 11 năm 2020

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KH&CN

I THÔNG TIN CHUNG

1 Tên nhiệm vụ:

Xây dựng bộ sưu tập các chủng vi khuẩn Bacillus spp., Pseudomonas spp có khả

năng đối kháng nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư trên cây ớt

Thuộc chương trình: Thu thập, thành lập và bảo quản quỹ gen các chủng vi sinh vật

ở các tỉnh phía Nam trong ứng dụng nông nghiệp, thủy sản, môi trường, dược phẩm

2 Chủ nhiệm nhiệm vụ:

Họ và tên: Trần Thùy Trang

Ngày, tháng, năm sinh: 21/03/1990 Nam/ Nữ: Nữ

Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Trung tâm công nghệ sinh học TP.HCM

Điện thoại: 02837153792 Fax: 02838916997

E-mail: ttcnsh.snn@tphcm.gov.vn

Website: www.hcmbiotech.com.vn

Địa chỉ: 2374 quốc lộ 1, khu phố 2, phường Trung Mỹ Tây, Q12, Tp.HCM

Họ và tên thủ trưởng tổ chức: PGS.TS Dương Hoa Xô

Số tài khoản: 3713.0.1007645

Tại kho bạc Nhà nước TP HCM

Trang 4

II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN

1 Thời gian thực hiện nhiệm vụ:

- Theo Hợp đồng đã ký kết: 24 tháng từ tháng 11 năm 2018 đến tháng 11 năm 2020

- Thực tế thực hiện: từ tháng 11 năm 2018 đến tháng 11 năm 2020

Thời gian

(Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ)

Thời gian (Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ)

c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:

Đối với đề tài:

- Lý do thay đổi (nếu có): Phần kinh phí của phần thuê dịch vụ bên ngoài thấp hơn so với

dự toán Phần kinh phí chênh lệch được chuyển qua phần công thực hiện thêm nội dung so với đề cương và kinh phí in ấn, phô tô các tài liệu (Công văn 2137/SKHCN-QLKH ngày 25/8/2020 của Sở Khoa học Công nghệ về việc trả lời công văn số 517/CNSH ngày 27/7/2020 của Trung tâm Công nghệ Sinh học, quyết định số 216/QĐ/CNSH về việc thay

đổi kinh phí chi tiết cho nhiệm vụ “Xây dựng bộ sưu tập các chủng vi khuẩn Bacillus spp.,

Pseudomonas spp có khả năng đối kháng nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư trên

cây ớt”)

Trang 5

- Lý do thay đổi (nếu có):

3 Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài/dự án:

(Liệt kê các quyết định, văn bản của cơ quan quản lý từ công đoạn xét duyệt, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực hiện nếu có); văn bản của tổ chức chủ trì nhiệm vụ (đơn, kiến nghị điều chỉnh nếu có)

Số

TT

Số, thời gian ban

thán thư trên cây ớt”

Trang 6

Pseudomonas spp có khả năng đối kháng

sưu tập các chủng vi khuẩn Bacillus spp.,

Pseudomonas spp có khả năng đối kháng

11 Số 700/CNSH ngày

13/10/2020

Báo cáo thực hiện công văn số 2137/SKHCN ngày 25/8/2020 của Sở KHCN TP.HCM

4 Tổ chức phối hợp thực hiện nhiệm vụ:

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

1

2

5 Cá nhân tham gia thực hiện nhiệm vụ:

(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10 người kể cả chủ nhiệm)

Trang 7

Nội dung tham gia chính

Sản phẩm chủ yếu đạt được Ghi

chú*

1 Trần Thùy

Trang

Trần Thùy Trang

Nội dung

1, 2, 3

- Xây dựng được bộ sưu tập chủng

vi sinh vật bao gồm tác nhân gây bệnh thán thư và các chủng vi khuẩn vùng rễ cây ớt

- Chọn lựa được các chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng với tác nhân gây bệnh thán thư trên cây ớt

- Đăng ký trình tự gen các bộ chủng vi sinh vật vào ngân hàng gen

Xây dựng và lưu giữ cơ sở dữ liệu các bộ chủng vi sinh vật trong các

Bộ sưu tập giống vi sinh vật Bảo quản các bộ chủng vi sinh vật trong các Bộ sưu tập giống vi sinh vật

2 Lê Thị Mai

Châm

Lê Thị Mai Châm

Nội dung

1, 2

3 Nguyễn Thị

Ánh Nguyệt

Nguyễn Thị Ánh Nguyệt

Nội dung

1, 2, 3

- Đăng ký trình tự gen các bộ chủng vi sinh vật vào ngân hàng gen Xây dựng và lưu giữ cơ sở dữ liệu các bộ chủng vi sinh vật trong các Bộ sưu tập giống vi sinh vật

Bảo quản các bộ chủng vi sinh vật trong các Bộ sưu tập giống vi sinh vật

4 Nguyễn Thị

Thùy Dương

Nguyễn Thị Thùy Dương

Nội dung

1, 2, 3

- Chọn lựa được các chủng vi

Trang 8

nhân gây bệnh thán thư trên cây ớt

- Đăng ký trình tự gen các bộ chủng vi sinh vật vào ngân hàng gen Xây dựng và lưu giữ cơ sở dữ liệu các bộ chủng vi sinh vật trong các

5 Đặng Hoàng

Quyên

Đặng Hoàng Quyên

Nội dung

1

Xây dựng được bộ sưu tập các chủng

vi sinh vật gây bệnh thán thư cây ớt

6 Ngô Thùy

Trâm

Đinh Anh Hòa

Nội dung

1, 2, 3

- Đăng ký trình tự gen các bộ chủng vi sinh vật vào ngân hàng gen Xây dựng và lưu giữ cơ sở dữ liệu các bộ chủng vi sinh vật trong các Bộ sưu tập giống vi sinh vật Bảo quản các bộ chủng vi sinh vật trong các Bộ sưu tập giống vi sinh vật

7 Đặng Hoàng

Quyên

Đạo Nữ Diệu Hồng

Nội dung

1, 3

8 Võ Thị Thu

Oanh

Trần Thị Phấn

Nội dung

2

Đánh giá khả năng phòng trừ bệnh thán thư trên cây ớt ở điều kiện in vivo của các chủng vi khuẩn được sàng lọc

Hiếu

Nội dung

1, 2, 3

- Chọn lựa được các chủng vi

Trang 9

khuẩn có khả năng đối kháng với tác nhân gây bệnh thán thư trên cây ớt

- Lý do thay đổi (nếu có): Do nhân sự trong đề cương được duyệt luân chuyển công tác và thay đổi một số nội dung trong đề tài sau báo cáo giám định

7 Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:

8 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước và nước ngoài)

Số

TT

Các nội dung, công việc

chủ yếu (Các mốc đánh giá chủ yếu)

Theo kế hoạch

Thực tế đạt được

1

2

Trang 10

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA NHIỆM VỤ

1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:

Thực tế đạt được Đánh giá

Yêu cầu khoa học

2

d) Kết quả đào tạo:

Theo kế hoạch Thực tế đạt

được

Trang 11

2 Tiến sỹ

- Lý do thay đổi (nếu có):

đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp:

Theo

kế hoạch

Thực tế đạt được

2

e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế

2 Đánh giá về hiệu quả do nhiệm vụ mang lại:

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:

Tình hình dịch bệnh trên cây trồng ở nước ta diễn biến rất phức tạp, tác nhân gây bệnh ngày càng đa dạng về kiểu gen và kiểu hình dẫn đến công tác phòng trừ rất khó khăn nếu chỉ sử dụng các phương pháp hóa học, cơ học, vật lý cũng như các chế phẩm chứa các chủng vi sinh vật nhập nội

Các chế phẩm sinh học có trên thị trường có tác động chậm và bị ức chế bởi nhiều yếu tố môi trường dẫn đến sự hạn chế sử dụng trong thực tế Nguyên nhân sâu xa là do tác nhân gây bệnh trở nên đột biến, hình thành loài mới và thành phần vi sinh vật trong chế phẩm chỉ được sàng lọc ở quy mô nhỏ, thậm chí không được cập nhật thường xuyên nên có thể vẫn chưa tuyển chọn được chủng tối ưu nhất Vì vậy, đề tài tiến hành thu thập mẫu từ nhiều vùng chuyên canh cây ớt ở toàn bộ khu vực phía Nam, sử dụng các phương pháp phân lập thích hợp kết hợp định danh hình thái và sinh học phân tử hiện đại để xác định danh pháp khoa học của các chủng phân lập được Từ đó, xác định được sự đa dạng loài

của tác nhân gây bệnh và xây dựng được bộ sưu tập vi khuẩn Bacillus spp và

Pseudomonas spp có ích Điều này sẽ giúp ích cho công tác quản lý dịch bệnh thán thư

trên rau màu tổng hợp

Đề tài phân lập các chủng vi sinh vật bản địa thuộc chi Collectotrichum, Bacillus và

Pseudomonas và đánh giá một số hoạt tính của chúng nhằm để đưa vào các Bộ sưu tập

giống vi sinh vật Việc có sẵn bộ giống với lý lịch rõ ràng và dữ liệu đầy đủ sẽ rút ngắn

Trang 12

khoảng cách giữa nghiên cứu và ứng dụng, từ đó giúp tạo ra các sản phẩm có chất lượng

đáp ứng nhu cầu của ngành nông nghiệp và các ngành khác có liên quan

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:

Hàng năm, số lượng chủng giống vi sinh vật được mua từ các nước khác trên thế giới rất nhiều Trong khi đó, Việt Nam nói chung và khu vực phía Nam nói riêng được dự đoán là vùng mang tính chất đa dạng sinh học và đặc trưng cao cho vùng lại chưa được

khai thác đúng mức Việc phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus spp và

Pseudomonas spp có ích sẽ làm tiền đề tạo ra các chế phẩm sinh học có khả năng phòng

trừ bệnh cho cây trồng Hiện nay, việc sử dụng thuốc hóa học vừa ô nhiễm môi trường, vừa dẫn đến tồn dư thuốc hóa học trong nông sản tạo nên rào cản cho việc xuất khẩu nông sản đến các nước khác, ảnh hưởng đến nền kinh tế của đất nước Việc sử dụng chế phẩm sinh học vừa làm tăng năng suất nền nông nghiệp và góp phần tạo ra các sản phẩm nông nghiệp hữu cơ, góp phần tăng trưởng nền kinh tế trong nông nghiệp Hơn nữa, với bộ sưu tập với đầy đủ các dữ liệu Vi sinh vật sẽ cung cấp cho các nghiên cứu liên quan, tiết kiệm chi phí, thời gian trong nghiên cứu

(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do nhiệm vụ tạo ra so với các sản phẩm cùng loại trên thị trường…)

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của nhiệm vụ:

I Báo cáo tiến độ

Lần 1 31 tháng 5 năm 2019 Đã phân lập và định danh

được 47 chủng nấm

Colletotrichum spp gây bệnh

thán thư trên ớt thuộc các loài C scovillei, C truncatum, C endophyticum,

C gigasporum, C siamense,

C karstii

II Báo cáo giám định

Lần 1 Tháng 11 năm 2019 - Đã phân lập và định danh

Trang 13

khả năng đối kháng tốt với nấm nấm HCM141 (BLD2.1,

BLD3.2, BLD4, BLD6, BLD7, BLD9, BLD10.2, BHCM1, BHCM2, BHCM6.1, BHCM7.3, BHCM8.2, BHCM8.3, BHCM9.1, BTG1.2, BTG2, BTG4, BTG7, BTG9, BTG10, BTG11) Sau khi định danh sinh học phân tử cho thấy 21 chủng này tương

đồng với các loài B subtilis,

B amyloliquefaciens

III Nghiệm thu cơ sở

Tháng 9 năm 2020 - Đã phân lập và định danh

BHCM6.1, BHCM7.3, BHCM8.2, BHCM8.3, BHCM9.1, BTG1.2, BTG2, BTG4, BTG7, BTG9, BTG10, BTG11) Sau khi định danh sinh học phân tử cho thấy 21 chủng này tương

đồng với các loài B subtilis,

Trang 14

chủng vi khuẩn

(Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas guariconensis, Pseudomonas mosselii) có

khả năng đối kháng tốt với

nấm HCM141

- Đánh giá khả năng phòng trừ bệnh thán thư của 31 chủng vi khuẩn được phân

lập trong điều kiện in vivo

- Đăng ký 78 chủng vi sinh

vật (Colletotrichum spp.,

Bacillus spp và Pseudomonas spp.) lên ngân

sưu tập giống HBCM và VTCC

Chủ nhiệm đề tài

(Họ tên, chữ ký)

Thủ trưởng tổ chức chủ trì

(Họ tên, chữ ký và đóng dấu)

Trang 15

MỤC LỤC

BÁO CÁO THỐNG KÊ i

MỤC LỤC 2

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 6

DANH MỤC CÁC BẢNG 7

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ 9

MỞ ĐẦU 12

Chương 1 - TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 18

1.1 Bệnh thán thư trên ớt 18

1.2 Tác nhân gây bệnh và đặc điểm phát sinh bệnh thán thư trên ớt 19

1.3 Phân loại, định danh và đặc điểm sinh học nấm Colletotrichum 20

1.4 Cơ chế gây bệnh của nấm Colletotrichum 25

1.5 Một số biện pháp phòng ngừa bệnh thán thư 26

1.6 Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus spp và Pseudomonas spp .29

1.6.1 Vi khuẩn Bacillus spp .29

1.6.2 Vi khuẩn Pseudomonas spp .34

1.7 Một số phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của vi khuẩn với nấm bệnh 45

1.8 Mục tiêu của nhiệm vụ 47

Chương 2 - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 48

2.1 Khảo sát, thu thập, phân lập, định danh nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư trên cây ớt 48

2.2 Phương pháp thu mẫu, phân lập các chủng vi khuẩn đối kháng 52

Trang 16

2.3 Sàng lọc các chủng vi khuẩn và đánh giá khả năng phòng trừ bệnh thán thư trên cây ớt 55

2.4 Xây dựng lý lịch và bảo quản các bộ chủng Colletotrichum spp., Bacillus spp., Pseudomonas spp trong ngân hàng gen vi sinh vật 57

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 60 Chương 3 - KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 61

3.1 Kết quả thu thập, phân lập, định danh nấm Colletotrichum spp gây

bệnh thán thư trên cây ớt ở Tiền Giang, Lâm Đồng và TP HCM 61 3.1.1 Kết quả thu thập mẫu bệnh thán thư trên ớt tại các vùng Tiền Giang, Lâm Đồng và TP HCM 61 3.1.2 Kết quả phân lập các chủng gây bệnh thán thư trên ớt tại các vùng Tiền Giang, Lâm Đồng và TP HCM 62

3.1.3 Đặc điểm đại thể và vi thể các chủng Colletotrichum spp được

phân lập từ các vườn ớt tại Tiền Giang 65

3.1.4 Đặc điểm đại thể và vi thể của các chủng Colletotrichum spp

được phân lập từ các vườn ớt tại TP Hồ Chí Minh 68

3.1.5 Đặc điểm đại thể và vi thể của các chủng Colletotrichum spp

được phân lập từ các vườn ớt tại Lâm Đồng 71

3.1.6 Kết quả định danh các chủng nấm Colletotrichum bằng phương

pháp sinh học phân tử 74 3.1.7 Kết quả khảo sát khả năng gây bệnh thán thư các chủng nấm

Colletotrichum sp trên ớt 81 3.2 Kết quả thu thập, phân lập, định danh các chủng Bacillus spp có khả

năng đối kháng với tác nhân gây bệnh thán thư trên cây ớt 86 3.2.1 Kết quả thu thập mẫu tại Tiền Giang, Lâm Đồng và TP HCM 86

Trang 17

3.2.2 Kết quả sàng lọc nhanh các mẫu đất chứa các chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng với nấm bệnh 88 3.2.3 Kết quả phân lập, định danh hình thái và sàng lọc các chủng vi

khuẩn Bacillus spp có ích 89 3.2.4 Kết quả sàng lọc Bacillus spp có khả năng đối kháng mạnh với chủng nấm HCM141 trên đĩa Petri 100 3.2.5 Kết quả định danh Bacillus spp bằng sinh học phân tử 107 3.3 Kết quả thu thập, phân lập, định danh các chủng Pseudomonas spp có

khả năng đối kháng với tác nhân gây bệnh thán thư trên cây ớt 112 3.3.1 Kết quả thu thập mẫu tại các vùng Tiền Giang, Lâm Đồng và TP HCM .112 3.3.2 Kết quả phân lập, định danh hình thái và sàng lọc các chủng vi

khuẩn Pseudomonas spp có ích 116 3.3.3 Kết quả sàng lọc Pseudomonas spp có khả năng đối kháng mạnh

với nấm HCM 141 trên đĩa Petri 131

3.3.4 Kết quả định danh Pseudomonas spp bằng sinh học phân tử 138

3.4 Kết quả đánh giá khả năng phòng trừ bệnh thán thư trên ớt ở điều kiện

in vivo 143

3.4.1 Kết quả đánh giá khả năng phòng trừ bệnh thán thư của các chủng

vi khuẩn trên ớt chỉ thiên 143 3.4.2 Kết quả đánh giá khả năng phòng trừ bệnh thán thư của các chủng

vi khuẩn trên ớt sừng vàng 147 3.4.3 Kết quả đánh giá khả năng phòng trừ bệnh thán thư của các chủng

vi khuẩn trên ớt sừng dài 151

Trang 18

3.5 Xây dựng lý lịch và bảo quản các bộ chủng Colletotrichum spp.,

Bacillus spp., Pseudomonas spp trong ngân hàng gen vi sinh vật 156

3.5.1 Đăng ký dữ liệu các bộ chủng vi sinh vật vào ngân hàng gen 156

3.5.2 Xây dựng và lưu giữ cơ sở dữ liệu các bộ chủng vi sinh vật trong các Bộ sưu tập giống vi sinh vật 160

3.5.3 Bảo quản các bộ chủng vi sinh vật trong bộ sưu tập gen HBCM và VTCC .164

KẾT LUẬN 165

KIẾN NGHỊ 167

TÀI LIỆU THAM KHẢO 167

PHỤ LỤC 1

Trang 19

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BC Biotechnology Collection

CRD Completely Randomized Design

IAA Indole-3-Acetic Acid

NCBI National Center For Biotechnology Information PCR Polymerase Chain Reaction

PDA Potato Dextrose Agar

PDB Potato Dextrose Broth

VTCC Vietnam Type Culture Collection

Trang 20

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các loài Colletotrichum gây bệnh thán thư trên ớt ở các vùng khác

nhau trên thế giới 20

Bảng 1.2 Các nhóm được chia theo “Bergey's Manual of Determinative

Bacteriology” xuất bản năm 1974 36

Bảng 1.3 Các nhóm được chia theo “Bergey's Manual of Systematic

Bacteriology” năm 1984 38

Bảng 1.4 Các loài thuộc chi Pseudomonas đã được chấp nhận năm 2005 40

Bảng 3.1 Kí hiệu vườn, mẫu và vị trí thu mẫu bệnh thán thư trên ớt 61 Bảng 3.2 Số chủng nấm phân lập từ mẫu ớt bệnh ở các vườn ớt 62 Bảng 3.3 Kết quả sàng lọc đặc điểm vi thể các chủng nấm phân lập 64

Bảng 3.4 Hình ảnh đại thể và vi thể của các chủng nấm Colletotrichum spp

phân lập từ các vườn ớt tỉnh Tiền Giang 65

phân lập từ các vườn ớt tại TP Hồ Chí Minh 69

phân lập từ các vườn ớt tại Lâm Đồng 72

Bảng 3.7 Kết quả định danh các chủng phân lập Colletotrichum .78 Bảng 3.8 Tỷ lệ bệnh sau khi chủng nấm Colletotrichum spp trên ớt sừng

theo thời gian .82

Bảng 3.9 Chỉ số bệnh thán thư của các chủng nấm Colletotrichum spp theo

thời gian .84

Bảng 3.10 Thông tin các mẫu đất thu thập được .87 Bảng 3.11 Đặc điểm đại thể và vi thể của 57 chủng vi khuẩn phân lập được90

Bảng 3.12 Hiệu quả đối kháng với chủng nấm HCM141 của các chủng vi

khuẩn Bacillus spp phân lập từ tỉnh Lâm Đồng 100

khuẩn Bacillus spp phân lập từ tỉnh Tiền Giang 102

Trang 21

khuẩn Bacillus spp phân lập ở TP HCM 103

Bảng 3.15 Kết quả BLAST vùng gen 16S rRNA các chủng vi khuẩn .108

Bảng 3.16 Thông tin các mẫu đất và chủng vi khuẩn phân lập được 112

Bảng 3.17 Kết quả sàng lọc nhanh mẫu đất chứa vi khuẩn đối kháng 115

Bảng 3.18 Kết quả thử nghiệm sinh hóa của các chủng vi khuẩn .117

Bảng 3.19 Đặc điểm đại thể và vi thể của 56 chủng vi khuẩn phân lập 119

Bảng 3.20 Các chủng Pseudomonas phân lập tại các khu vực lấy mẫu 131

Bảng 3.21 Phần trăm đối kháng nấm HCM 141 của các chủng vi khuẩn Pseudomonas spp phân lập từ tỉnh Tiền Giang 132

Bảng 3.22 Phần trăm đối kháng nấm HCM 141 của các chủng vi khuẩn Pseudomonas spp phân lập từ tỉnh Lâm Đồng 133

Bảng 3.23 Phần trăm đối kháng nấm HCM 141 của các chủng vi khuẩn Pseudomonas spp phân lập từ Thành phố Hồ Chí Minh 135

Bảng 3.24 Kết quả định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử các chủng Pseudomonas spp được lựa chọn .139

Bảng 3.25 Chỉ số bệnh trên ớt của bộ chủng Bacillus spp và Pseudomonas spp được tuyển chọn trong điều kiện phòng thí nghiệm có khả năng đối kháng đối với nấm Colletotrichum spp trên ớt chỉ thiên .143

Bảng 3.26 Chỉ số bệnh trên ớt của bộ chủng Bacillus spp và Pseudomonas spp được tuyển chọn trong điều kiện phòng thí nghiệm có khả năng đối kháng đối với nấm Colletotrichum spp trên ớt sừng trâu .147

Bảng 3.27 Chỉ số bệnh trên ớt của bộ chủng Bacillus spp và Pseudomonas spp được tuyển chọn trong điều kiện phòng thí nghiệm có khả năng đối kháng đối với nấm Colletotrichum spp trên ớt sừng dài .151

Bảng 3.28 Mã đăng ký trên ngân hàng gene NCBI của các chủng 156 Bảng 3.29 Mã các chủng vi sinh vật được đăng ký trên Bộ sưu tập giống

Trang 22

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Đặc điểm hình thái C acutatum 22 Hình 1.2 Đặc điểm hình thái C gloeosporioides 23 Hình 1.3 Đặc điểm hình thái C truncatum 24 Hình 1.4 Đặc điểm hình thái C karstii 24 Hình 1.5 Đặc điểm hình thái C plurivorum 25 Hình 1.6 Cơ chế xâm nhiễm của Colletotrichum spp lên mô thực vật 26 Hình 1.7 Đặc điểm hình thái vi khuẩn Bacillus spp .30 Hình 1.8 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Pseudomonas sp .35 Hình 1.9 Sợi nấm C gloeosporioides bị P aeruginosa tác động 43

Hình 2.1 Phương pháp sàng lọc nhanh các mẫu có khả năng đối kháng với

nấm Colletotrichum spp .53

Hình 2.2 Phương pháp cấy vi khuẩn đối kháng và nấm trên đĩa Petri .56

Hình 3.1 Hình thái vi thể và đại thể của nấm phân lập 63

Hình 3.2 Một số hình ảnh ớt chỉ thiên được gây bệnh trực tiếp trên cây 64 Hình 3.3 Kết quả PCR khuếch đại trình tự ITS 75 Hình 3.4 Kết quả PCR khuếch đại trình tự TUB2 76 Hình 3.5 Kết quả PCR khuếch đại trình tự GAPDH 76

Hình 3.6 Cây phát sinh loài các chủng phân lập Colletotrichum với các loài

Colletotrichum có quan hệ họ hàng gần dựa trên vùng trình tự đa gen TUB2-GAPH .77

ITS-Hình 3.7 Một số địa điểm thu mẫu đất tại các vườn ớt .86

Hình 3.8 Kết quả đồng nuôi cấy dịch đất và nấm Colletotrichum spp .89

Hình 3.9 Hình điện di các mẫu DNA tổng với cặp mồi Bsub5F và Bsub3R

của các chủng vi khuẩn Bacillus spp 99

Hình 3.10 Khả năng đối kháng giữa chủng vi khuẩn BLD6 và nấm HCM141

ở các thời gian khác nhau 106

Trang 23

Hình 3.11 Kết quả đồng nuôi cấy vi khuẩn Bacillus spp với nấm HCM141

sau 15 ngày 106

Hình 3.12 Hình điện di các mẫu DNA tổng với cặp mồi 20F, 1500R của các

chủng vi khuẩn Bacillus spp .107

Hình 3.13 Cây phát sinh loài của các chủng vi khuẩn phân lập với các nhóm

vi khuẩn có quan hệ họ hàng gần dựa trên phân tích trình tự 16S rDNA .110

Hình 3.14 Kết quả PCR xác định vi khuẩn B subtilis 111 Hình 3.15 Kết quả PCR xác định vi khuẩn B amyloliquefaciens 111

Hình 3.16 Một số hình ảnh đồng nuôi cấy nấm PHCM14 và PLD16 và dịch

pha loãng từ các mẫu đất trên môi trường thạch PDA .115

Hình 3.17 Hình ảnh đồng nuôi cấy chủng PTG2.1 với nấm HCM141 trên

môi trường PDA .138

Hình 3.18 Cây phát sinh loài được xây dựng từ vùng gen 16SrDNA của các

chủng theo phương pháp Maximum Likelihood .142

Hình 3.19 Khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum spp của một số

nghiệm thức trên ớt chỉ thiên 147

nghiệm thức trên ớt sừng vàng .151

nghiệm thức trên ớt sừng dài 155

Hình 3.22 Các chủng vi sinh vât Bacillus spp., Pseudomonas spp.,

Colletotrichum spp đăng ký trên ngân hàng gene NCBI 160

Hình 3.23 Mã đăng ký một số chủng vi sinh vật trên Bộ sưu tập giống Vi

sinh vật HBCM Thành phố Hồ Chí Minh .162

Hình 3.24 Thông tin các chủng vi sinh vât Colletotrichum spp., Bacillus spp.,

Pseudomonas spp được lưu giữ ở bộ sưu tập HBCM 163

Hình 3.25 Giấy chứng nhận các chủng Vi sinh vật được ký gửi tại Bộ sưu tập

Trang 24

Hình 3.26 Các chủng vi khuẩn được bảo quản bằng các phương pháp khác

nhau 164

Hình 3.27 Các chủng nấm Colletotrichum spp được bảo quản các phương

pháp khác nhau 164

Trang 25

MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài

Bệnh thán thư hay còn gọi là anthracnose do nấm Colletotrichum gây ra

[107] Bệnh gây hại rất phổ biến đối với nhiều loại cây trồng trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng Ở nước ta, ớt là loài cây trồng có giá trị kinh

tế cao, được trồng phổ biến ở khu vực phía Nam Tuy nhiên, đây cũng là đối

tượng bị nấm Colletotrichum spp gây thiệt hại nặng nề về năng suất cũng như

chất lượng nông sản Trên thực tế, bệnh thán thư được ghi nhận trên hầu hết các vùng trồng ớt ở nước ta, đặc biệt vào mùa mưa, tỷ lệ bệnh có thể lên tới

70% Nấm Colletotrichum có khả năng gây hại trên nhiều bộ phận của cây

như thân, lá, quả và hạt, nhưng chủ yếu là gây thối quả hàng loạt trong giai đoạn chín, gây thiệt hại nặng nề về năng suất, có khi thất thu lên tới 100% Do vậy, việc nghiên cứu tìm hiểu đặc tính sinh lý, sinh hóa, sự đa dạng và khả

năng gây bệnh của các chủng Colletotrichum spp để đưa ra biện pháp phòng

trừ rất quan trọng

Hiện nay, biện pháp phòng trừ bệnh thán thư là sử dụng thuốc hóa học Biện pháp này có hiệu quả nhưng lại ảnh hưởng xấu đến môi trường, gây nguy hiểm đến sức khỏe con người và dễ làm nấm bệnh trở nên kháng thuốc

Do vậy, việc sử dụng chế phẩm sinh học phòng ngừa bệnh hại đang được tập trung hướng đến trong nền nông nghiệp, vì có hiệu quả phòng bệnh cao vừa mang lại nhiều lợi ích về môi trường và sinh thái

Với lợi thế địa lý, khu vực phía Nam Việt Nam kết nối với dãy Trường Sơn và khu hệ núi cao Himalaya tạo ra những vùng sinh quyển độc đáo thể hiện qua những quần thể thực vật đặc hữu kéo dài từ cao nguyên Langbiang

tới bờ biển Tây Nam Bộ như thông đỏ Pinus krempfii, thông 5 lá Đà Lạt Pinus dalatensis [109], dầu cát Dipterocarpus cf condorensis [62], thu hải đường

Bà Tài Begonia bataiensis [112]… Theo sự đa dạng khu hệ thực vật, khu hệ

Trang 26

học và đặc trưng cao cho vùng Đều này được thể hiện qua những công bố gần

đây về nhiều loài vi sinh vật mới được ghi nhận như nấm Phlebopus spongiosus [84], nấm Tomophagus cattienensis [58], vi khuẩn Nguyenibacter [108] với loài mới Nguyenibacter vanlangensis…Tất cả các loài vi sinh vật

mới được ghi nhận trên đều là những loài có tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp, thủy sản, môi trường, thực phẩm tại nước ta Tuy nhiên, các nghiên cứu về đa dạng sinh học của các nhóm vi sinh vật bản địa tại phía Nam còn sơ sài, rời rạc và chưa thực sự chú trọng đến vấn đề xây dựng, bảo tồn và phát huy thế mạnh nguồn gen, đặc biệt là đối với bộ chủng vi sinh vật trong đất

vùng rễ ở cây ớt Trong các đối tượng vi sinh vật, vi khuẩn Bacillus spp và Pseudomonas spp có nhiều tiềm năng và được nghiên cứu rất nhiều trong

phòng trừ bệnh hại Từ thực tế này nhóm nghiên cứu thực hiện đề tài “Xây

dựng bộ sưu tập các chủng vi khuẩn Bacillus spp., Pseudomonas spp có khả năng đối kháng nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư trên cây ớt”

Đánh giá các công trình nghiên cứu liên quan đến nhiệm vụ

Trên thế giới, việc nghiên cứu tác nhân gây bệnh thán thư cũng như các

vi sinh vật đối kháng đã được chú trọng từ lâu Bệnh này được xác định do

nấm Colletotrichum gây ra [107], gây thiệt hại nặng nề cho cây trồng, đặc biệt

trên cây ớt Cho đến nay, có nhiều chủng vi sinh vật được chứng minh có khả

năng phòng trừ bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gây ra

Bacillus là đối tượng vi sinh vật được nghiên cứu rất nhiều Vi khuẩn này được chứng minh vừa hiệu quả trong điều kiện invitro và invivo Cụ thể, Narasimhan và Shivakumar (2012) đã phân lập các chủng B subtilis có khả năng đối kháng 57% với C gloeosporioides [70] Ashwini và cộng sự (2014)

sử dụng vi khuẩn B subtilis làm tác nhân đối kháng sinh học phòng ngừa bệnh thán thư trên ớt do nấm C gloeosporioides OGC1 gây ra Vi khuẩn B subtilis có khả năng đối kháng với nhiều tác nhân gây bệnh trong điều kiện in vitro từ 41 – 57% Trong thí nghiệm xử lý hạt giống với tác nhân gây bệnh và

Trang 27

vi khuẩn đối kháng cho hiệu quả kháng bệnh trên 87,5%, tỷ lệ nảy mầm đạt

85%, so với đối chứng không dùng vi khuẩn B subtilis thì mức độ nhiễm

bệnh trên 77,5% và chỉ 1% hạt giống nảy mầm được thành cây Điều này cho

thấy hiệu quả trong phòng ngừa bệnh thán thư của vi khuẩn B subtilis là rất

khả quan [17]

Ngoài ra, cho đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu trên thế giới chứng

minh vi khuẩn Pseudomonas spp có khả năng phòng trừ bệnh thán thư và các

bệnh khác trên cây trồng Điển hình là Singhai và cộng sự (2011) đã sử dụng

4 chủng vi khuẩn Pseudomonas để thử nghiệm tác động lên sự phát triển của

khoai tây và năng suất thu hoạch cùng với sự ức chế nấm bệnh đốm vảy thông thường ở cà chua [98] Thí nghiệm đồng ruộng được thực hiện tại tỉnh

Varanasi, Ấn Độ Kết quả, khi bổ sung vi khuẩn Pseudomonas R1 cùng phân

trùn vào đất cho kết quả tối ưu nhất bao gồm tăng tốc độ tăng trưởng, năng suất, giảm tỉ lệ bệnh cũng như chỉ số bệnh Kết quả định danh cho thấy chủng

này là P mosselii [98] Linu và Jisha (2013) đã phân lập được 2 chủng Pseudomonas spp có khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum spp từ

78% đến 89% trong điều kiện phòng thí nghiệm [59] Năm 2013,

Bakthavatchalu và cộng sự cho thấy P aeruginosa có khả năng vừa có khả năng đối kháng nấm Rhizoctonia solani (52%), vừa có khả năng đối kháng với nấm Colletotrichum gloeosporioides (49%) [18] Suthin và cộng sự (2014) đã nghiên cứu cho thấy trong điều kiện phòng thí nghiệm, Pseudomonas fluorescens có khả năng ức chế 75,6% sự phát triển của nấm Colletotrichum capsici [104] Patel và cộng sự (2015) đã tuyển chọn được chủng vi khuẩn P guariconensis trong 25 chủng vi khuẩn phân lập, có khả năng kích thích sinh trưởng đậu phộng vừa bảo vệ đậu phộng khỏi bệnh thối cỗ rễ do A niger (66%) [80] Honari và cộng sự (2018) đã phân lập được 2 chủng P nitroreducens Kết quả thử nghiệm khả năng đối kháng với nấm bệnh

Trang 28

toàn sự phát triển của nấm bệnh trên đồng ruộng Trong đó, chủng P nitroreducens AHH4 có thể kiểm soát nấm bệnh ở điều kiện phòng thí nghiệm

và đồng ruộng mạnh nhất [47]

Ngoài ra, có nhiều tác giả nghiên cứu đồng thời vi khuẩn Pseudomonas

và Bacillus trong đối kháng bệnh trên cây trồng Karimi và cộng sự (2012) đã phân lập 6 chủng Pseudomonas và 6 chủng Bacillus từ đất vùng rễ đậu đũa

[53] Các chủng này được đánh giá khả năng đối kháng với nấm bệnh

Fusarium oxysporum ở điều kiện in vitro và in vivo Mỗi chủng phân lập được

kiểm tra khả năng tổng hợp protease, siderophore, cyanide hydrogen, indole acetic acid, chất kháng nấm bay hơi, hệ enzyme cellulase ngoại bào Sau định

danh, 6 chủng là B subtilis (B1, B6, B28, B40, B99 và B108), 2 chủng là P putida (P9 và P10) và 4 chủng là P aeuroginosa (P11, P12, P66 và P112) Trong điều kiện in vitro, khả năng sản xuất cyanide hydrogen, siderophore,

protease và indole acetic acid (IAA) của các chủng là khác nhau Trong điều

kiện nhà kính, khi xử lý hạt và ủ trong đất, P aeuroginosa P12, B subtilis

B28 cho kết quả kiểm soát nấm bệnh tốt nhất (41,9%, 44.2%) Các chỉ số tăng trưởng như chiều cao của cây, trọng lượng khô và tươi của cây ở các nghiệm thức bổ sung B28, P12 và P112 là tối ưu nhất [53] Moreira và cộng sự (2014)

đã đánh giá khả năng phòng trừ nấm C acutatum của vi khuẩn Bacillus spp

và P putida trong điều kiện phòng thí nghiệm cho thấy, khi xử lý với nồng độ

105 bt/ml vi khuẩn Bacillus spp có khả năng ức chế nảy mầm bào tử nấm đến 67,5%; trong khi đó P putida chỉ ức chế được 27% ở nồng độ 105 CFU/ml [68]

Bên cạnh đó, có một số nghiên cứu về dịch chiết vi sinh vật có khả năng ức chế được nấm gây bệnh trên cây trồng Nhóm nghiên cứu của

Goswami và cộng sự (2015) đã chứng minh được dịch chiết từ vi khuẩn P aeruginosa ở nồng độ 100 µg/ml có khả năng ức chế 86,6% khả năng nảy mầm của bào tử và ức chế 57,8% sự phát triển sợi nấm C falcatum [44]

Trang 29

Ở Việt Nam, Nguyễn Huy Thảo (2008) cũng đã khảo sát khả năng đối

kháng của 18 chủng vi khuẩn Bacillus spp với 4 chủng nấm Colletotrichum

spp gây bệnh thán thư trên sen ở Cần Thơ và Đồng Tháp trong điều kiện

phòng thí nghiệm Kết quả cho thấy, cả 18 chủng vi khuẩn Bacillus spp đều

có khả năng đối kháng với 4 chủng nấm Colletotrichum spp [9] Nguyễn Thị

Tuyết Nhung và cộng sự (2006) đã nghiên cứu sự đối kháng của một số chủng

Pseudomonas spp đối với nấm Fusarium oxysporum gây bệnh trên cây trồng [5].Trần Thị Thu Hà và cộng sự (2017) đã nghiên cứu chế phẩm P putida có khả năng đối kháng với bệnh chết nhanh trên cây hồ tiêu do nấm Phythophora

lập từ đất có khả năng phòng trừ bệnh thán thư hiệu quả Tuy nhiên, đề tài này

còn nhiều hạn chế trong quá trình nghiên cứu Các chủng Colletotrichum spp

chỉ được phân lập từ các vùng trồng ớt ở ấp Bàu Đưng, xã An Nhơn Tây và xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi nên tính đa dạng không cao Hơn nữa, các chủng nấm phân lập chỉ được định danh với cặp mồi ITS5, ITS4 Theo Jayawardena và cộng sự (2016) [51] và De Silva và cộng sự (2019) [36], phức

hợp Colletotrichum acutatum bao gồm 34 loài có quan hệ gần [36, 51], trong

đó, ít nhất 7 loài được xác định gây bệnh thán thư trên ớt [36] là C acutatum,

C brisbanense, C cairnsense, C fioriniae, C nymphaeae, C scovillei và C simmondsii [65] Phức hợp Colletotrichum gloeosporioides bao gồm 38 loài

có quan hệ gần [36, 51], trong đó, ít nhất 10 loài được xác định gây bệnh thán

Trang 30

kahawae, C queenslandicum, C siamense, C tropicale, C viniferum [65] và

C endophytica [37] Nhóm nghiên cứu Phoulivong và cộng sự (2010) đã

chứng minh rằng chỉ với cặp mồi ITS sẽ không phân biệt được các loài trong các phức hợp này [85] Một số nghiên cứu trong và ngoài nước chỉ sử dụng cặp mồi này định danh nên có thể tính chính xác trong các kết luận chưa cao

Đối với bộ vi khuẩn Bacillus spp., mặc dù có hiệu quả trong đối kháng với

nấm bệnh nhưng các vi khuẩn này chỉ được phân lập từ đất trồng ớt ở huyện Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang và 5 chủng từ bộ sưu tập vi sinh vật Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh được phân lập từ đất trồng cải xanh, huyện Bình Chánh Vì vậy, tính đa dạng về loài của bộ chủng

Collectotrichum hay Bacillus thu thập được chưa cao

Bên cạnh đó, bộ chủng vi sinh vật được phân lập từ các đề tài nghiên cứu có thể chưa được lưu giữ tốt dẫn đến tình trạng mất chủng hay thất lạc chủng Vì vậy, các đề tài kế tiếp không có tính kế thừa Do đó, đề tài “Xây

dựng bộ sưu tập các chủng vi khuẩn Bacillus spp., Pseudomonas spp có khả năng đối kháng nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư trên cây ớt” sẽ xây

dựng bộ sưu tập nguồn gen vi sinh vật, đồng thời lưu giữ ở Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật VTCC Hà Nội và Bộ sưu tập giống vi sinh vật HBCM Thành phố Hồ Chí Minh để cung cấp giống vi sinh vật Bên cạnh đó, đề tài tiến hành đăng ký các chủng vi sinh vật trên ngân hàng gen NCBI, góp phần vào việc lưu giữ thông tin cho các nghiên cứu sau này

Trang 31

Chương 1 - TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Bệnh thán thư trên ớt

Bệnh thán thư (anthracnose disease) được xem là tác nhân chính gây sụt giảm mạnh năng suất sản xuất ớt ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới Điển hình là Ấn Độ, quốc gia đã từng dẫn đầu về sản xuất và xuất khẩu ớt, tuy nhiên trong vài năm trở lại đây, sản lượng ớt của nước này giảm mạnh và hiện chỉ đứng thứ ba về sản lượng ớt trên toàn thế giới Ước tính riêng Ấn Độ, năng suất ớt sụt giảm hàng năm vào khoảng 29,5% gây thiệt hại khoảng 491,67 triệu Đô la Mỹ Ngoài ra, mức thiệt hại liên quan đến bệnh thán thư cũng được báo cáo ở nhiều vùng khác trên thế giới, ví dụ ở Hàn Quốc khoảng 10%, trong khi đó ở Việt Nam mức thiệt hại có thể lên đến 80% [94] Sở dĩ mức thiệt hại cao là do mầm bệnh tác động ở cả giai đoạn trước và sau thu hoạch, làm giảm từ 10 – 80% năng suất thương phẩm của trái ớt [94, 107]

Thương tổn trái do bệnh thán thư là khía cạnh quan trọng nhất về mặt kinh tế bởi chỉ một thương tổn nhỏ trên trái cũng đủ làm giảm giá trị thị trường, do đó làm ảnh hưởng đến lợi nhuận của trái ớt Bệnh có khả năng ảnh hưởng đến hầu như tất cả các phần nằm phía trên mặt đất của cây ớt Tuy nhiên bệnh chủ yếu gây thối quả ở cả giai đoạn xanh và chín, đặc biệt là giai đoạn trái chín, do vậy bệnh còn được biết đến với cái tên khác là bệnh thối trái chín trên ớt (ripe fruit rot of chilli) Bệnh có thể được mang trong hạt, đất, nước và không khí, do vậy có thể làm hư hại ở giai đoạn nảy mầm hoặc hư hại trên các phần nằm phía trên mặt đất của cây [94] Đối với quả, vết bệnh ban đầu là một đốm nhỏ, hơi lõm, ướt trên bề mặt vỏ quả, sau 2 – 3 ngày kích thước vết bệnh có thể lên tới 1 cm đường kính Vết bệnh thường có hình thoi, lõm, phân ranh giới giữa mô bệnh là một đường màu đen chạy dọc theo vết bệnh Trên bề mặt vết bệnh có những chấm nhỏ là đĩa cành của nấm gây bệnh Các vết bệnh có thể liên kết với nhau làm quả bị thối, vỏ khô có màu trắng

Trang 32

làm cây bị chết dần hoặc cây bệnh có quả ở từng phần nhưng quả ít, chất lượng kém [6]

1.2 Tác nhân gây bệnh và đặc điểm phát sinh bệnh thán thư trên ớt

Nấm Colletotrichum là tác nhân chính gây ra bệnh thán thư trên nhiều

đối tượng cây trồng khác nhau, bao gồm các cây ngũ cốc, cây họ đậu, các loại

rau, cây lâu năm và cây ăn quả [107] Các nghiên cứu cho thấy Colletotrichum

gây bệnh thán thư trên hơn 121 chi thuộc 45 họ thực vật [94] Trong hệ thống

phân loại bệnh học cho thấy các loài Colletotrichum khác nhau có thể kết hợp

gây ra bệnh thán thư trên cùng đối tượng ký chủ hoặc một loài có thể xâm nhiễm trên nhiều đối tượng ký chủ khác nhau [94, 107]

Trên thế giới, nhiều loài Colletotrichum đã được xác định là nguyên nhân chính gây ra bệnh thán thư trên ớt (Bảng 1) Trong số các loài này, C truncatum (tên gọi khác là C capsici) là tác nhân gây bệnh phổ biến và có ảnh hưởng mạnh mẽ nhất ở một số quốc gia Ngoài ra, C gloeosporioides cũng

thường được phân lập trong các mẫu bệnh thán thư trên ớt [90] Các loài

Colletotrichum khác nhau thường gây bệnh ở các bộ phận khác nhau trên ớt [94, 107] Điển hình là C acutatum và C gloeosporioides chủ yếu lây nhiễm

trái ở tất cả các giai đoạn phát triển, nhưng không lây nhiễm trên lá và thân

vốn bị xâm nhiễm chủ yếu bởi C coccodes và C dematium [107] Ngoài ra,

tùy vào các giai đoạn phát triển của trái mà có sự hiện diện khác nhau của các

loài Colletotrichum [94, 107], ví dụ C truncatum phổ biến ở trái ớt chín, trong khi C acutatum và C gloeosporioides xuất hiện chủ yếu ở giai đoạn trái

xanh non và trái xanh trưởng thành [107]

Ngoại trừ 4 loài Colletotrichum gây bệnh thán thư trên ớt đã ghi nhận

từ năm 2007 là C acutatum, C truncatum, C gloeosporioides và C nigrum [39], cho đến nay Việt Nam đã ghi nhận thêm ít nhất 3 loài gồm C fructicola,

C aeschynomenes và C siamense [4] Qua đó, cho thấy diễn biến phức tạp

của dịch bệnh Ngoài ra, với điều kiện khí hậu khá thuận lợi cho sự phát triển

Trang 33

của nấm bệnh, đặc biệt vào giai đoạn tháng 5 - 7 khi cây ớt đang ở thời kỳ thu hoạch trái [6] cũng gây thêm rất nhiều khó khăn trong việc kiểm soát bệnh

Bảng 1.1 Các loài Colletotrichum gây bệnh thán thư trên ớt ở các vùng khác

nhau trên thế giới [94, 107]

1 Australia

C brisbanense, Colletotrichum acutatum, C atramentarium, C dematium, C gloeosporioides var minor, C gloeosporioides var

gloeosporioides

2 Brazil C boninense

3 India C truncatum, C acutatum

4 Indonesia C acutatum, C gloeosporioides, C nymphaeae,

8 Papua New Guinea C truncatum, C gloeosporioides

9 Sri Lanka C acutatum

10 Đài Loan C acutatum, C truncatum, C gloeosporioides

11 Thái Lan C acutatum, C truncatum, C gloeosporioides, C

siamense, C scovillei, C asianum

coccodes

13 Zimbabwe C nymphaeae

1.3 Phân loại, định danh và đặc điểm sinh học nấm Colletotrichum

Giới (Kingdom): Fungi

Trang 34

Nấm Colletotrichum sống nội sinh, sợi nấm mảnh, phân nhánh, không

màu, có vách ngăn, có nội bào và gian bào, khi già sợi nấm sẫm màu Trên môi trường nuôi cấy, tản nấm có dạng vòng tròn đồng tâm, không có vách ngăn [107] Nhiệt độ phát triển thích hợp để nấm nảy mầm và hình thành bào

tử là 26 – 32oC, tối ưu ở 28 – 30oC, độ ẩm là 92% [70]

Cho đến nay, việc định danh nấm Colletotrichum chủ yếu dựa trên

nguồn gốc ký chủ, các mô tả hình thái và phân tử [40, 41, 54] Các phân tích hình thái thường được sử dụng bao gồm đặc điểm khuẩn lạc, bào tử đính (conidia) và đĩa áp trên môi trường nuôi cấy [36, 37] Tuy nhiên, do tác động của môi trường lên tính ổn định của hình thái và sự tồn tại của các dạng trung gian nên những tiêu chuẩn này chưa hoàn toàn đủ để phân biệt các loài

Colletotrichum [30, 40, 54, 74] Chính vì vậy, các phân tích phân tử, mà điển

hình là giải trình tự đoạn ITS1-5.8S-ITS2 (ITS – internal transcribed spacer) được xem như một công cụ bổ trợ vô cùng hữu hiệu và đáng tin cậy trong việc

phân biệt các loài Colletotrichum [40, 54] Mặc dù có nhiều bước tiến mới

trong việc kết hợp giữa hình thái và trình tự ITS để định danh nấm

Colletotrichum nhưng nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng nếu chỉ dựa trên quan

sát hình thái và xây dựng cây phát sinh loài theo trình tự ITS, vẫn chưa đủ để

phân biệt các loài Colletotrichum, đặc biệt là các loài có bào tử đính dạng

thẳng [36] [41, 54, 115] Để giải quyết vấn đề này, hiện nay phương pháp

phân tích cây phát sinh loài đa gene được xem là lựa chọn tốt nhất [30, 41, 54,

115] Ngoài ITS, các trình tự thường được sử dụng trong phân tích này bao gồm glutamine synthetase (GS), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), calmodulin (CAL), actin (ACT), chitin synthase (CHS–1), β-tubulin (TUB2), DNA lyase (APN2) và trình tự bên trong nằm giữa DNA lyase và gene Mat1-2 (APMAT) [30, 41, 54]

Dựa trên các phân tích hình thái và phân tử, nấm Colletotrichum được chia thành 11 phức hợp loài khác nhau, bao gồm: caudatum, graminicola,

Trang 35

spaethianum, destructivum, acutatum, dematium, gigasporum, gloeosporioides, boninense, truncatum và orbiculare [30, 51] Gần đây, thêm

3 phức hợp loài mới đã được đưa ra là dracaenophilum, magnum và orchidearum [30] Giữa các phức hợp có sự khác biệt rất lớn về kiểu hình và

kiểu gene Tuy nhiên, trong cùng một phức hợp hình thái đĩa áp và màu sắc khuẩn lạc khá tương đồng giữa các loài [30] Hiện nay các loài gây bệnh thán

thư trên ớt chủ yếu thuộc các phức hợp acutatum, gloeosporioides, truncatum, boninense và orchidearum Trong đó, phổ biến nhất là phức hợp acutatum, truncatum và gloeosporioides [30]

Phức hợp Colletotrichum acutatum

Phức hợp này bao gồm 34 loài có quan hệ gần [36, 51], trong đó, ít nhất

7 loài được xác định gây bệnh thán thư trên ớt [36] là C acutatum, C brisbanense, C cairnsense, C fioriniae, C nymphaeae, C scovillei và C simmondsii [65] Trên môi trường môi trường nuôi cấy, hầu hết các loài trong

phức hợp này có bào tử đính nhọn ở một hoặc hai đầu (Hình 1.1) [51] Đĩa áp thường ở dạng đơn hoặc nhóm rời, màu nâu nhạt tới đậm, thành nhẵn, hình chùy, oval hoặc không đều, mép phẳng hoặc gợn sóng, đôi khi lồi (Hình 1.1) [32]

Hình 1.1 Đặc điểm hình thái C acutatum (chủng chuẩn CBS 112996) J – Q:

đĩa áp; R, S: bào tử đính [32]

Trang 36

Phức hợp Colletotrichum gloeosporioides

Phức hợp này bao gồm 38 loài có quan hệ gần [36, 51], trong đó, ít nhất

10 loài được xác định gây bệnh thán thư trên ớt là C conoides, C fructicola,

C gloeosporioides, C grossum, C kahawae, C queenslandicum, C siamense, C tropicale, C viniferum [65] và C endophytica [37] Trên môi

trường môi trường nuôi cấy, bào tử đính của phức hợp này có dạng hình trụ với hai đầu tròn nhưng hơi nhỏ dần về một đầu (Hình 1.2) [51] Đĩa áp thường

ở dạng đơn, màu nâu, hình cầu, elip hoặc có dạng hình thoi, chia thùy sâu, đôi khi hình thành nhiều thùy (Hình 1.2) [61, 115]

Hình 1.2 Đặc điểm hình thái C gloeosporioides (chủng chuẩn CGMCC

Trang 37

Hình 1.3 Đặc điểm hình thái C truncatum (i – l: từ chủng chuẩn CBS

120709; m, n: từ chủng chuẩn CBS 151.35) i – l: đĩa áp; m, n: bào tử đính [34]

Phức hợp Colletotrichum boninense

Phức hợp này bao gồm C boninense và 18 loài có quan hệ gần [51], trong đó, mới chỉ ghi nhận C karstii gây bệnh thán thư trên ớt [65] Trên môi

trường môi trường nuôi cấy, bào tử đính của phức hợp này có vết sẹo nền nổi

bật [31, 51], riêng C karstii bào tử có dạng trụ, tròn ở 2 đầu (Hình 1.4) [31] Đĩa áp C karstii thường mọc đơn hoặc nhóm nhỏ từ 2 – 3 đĩa áp, màu nâu,

dạng hình thuyền đến hình viên đạn, có nốt sần, thành nhẵn hoặc gợn sóng (Hình 1.4) [31]

Hình 1.4 Đặc điểm hình thái C karstii (chủng chuẩn CBS 127597) J – N:

đĩa áp; O, P: bào tử đính [31]

Phức hợp Colletotrichum orchidearum

Phức hợp này mới được giới thiệu vào năm 2019 bởi Damm và cộng sự

bao gồm 8 loài [33] Trong đó, đã ghi nhận ít nhất hai loài C plurivorum và

Trang 38

C sojae gây bệnh trên ớt [33, 36] Trên môi trường nuôi cấy, bào tử đính

thường có dạng hình trụ, tròn ở 2 đầu (Hình 1.5) Đĩa áp thường mọc đơn, màu nâu nhạt tới đậm, thành nhẵn, dạng hình thuyền đến hình viên đạn, mép

có gợn sóng, đôi khi chia thùy sâu (Hình 1.5) [33]

Hình 1.5 Đặc điểm hình thái C plurivorum (O – T: từ chủng chuẩn CBS

125474, U: từ chủng chuẩn CBS 903.69) O – S: đĩa áp; T, U: bào tử đính [33]

1.4 Cơ chế gây bệnh của nấm Colletotrichum

Nấm có thể xâm nhiễm được vào bên trong mô cây kí chủ và gây bệnh cần phải trải qua các giai đoạn: Bào tử phát triển trên bề mặt kí chủ, lây lan và bám chặt bề mặt, bào tử nảy mầm, hình thành đĩa áp, xâm nhiễm qua lớp biểu

bì của cây, phát triển và lây lan ra các vùng xung quanh, tạo ổ nấm và bào tử

[52, 87] Nấm Colletotrichum spp xâm nhiễm vào mô kí chủ theo hai cách:

bán kí sinh và hoại sinh (Hình 1.6) Giai đoạn ban đầu xảy ra giống nhau ở cả hai cách xâm nhiễm Bào tử mọc mầm (C) và hình thành đĩa áp (A) Đĩa áp hình thành vòi xâm nhiễm (PP), xâm nhập qua lớp biểu bì (Cu) của tế bào kí chủ Lúc này, xuất hiện đốm màu sáng (ILS) trên đĩa áp [38]

Trang 39

Hình 1.6 Cơ chế xâm nhiễm của Colletotrichum spp lên mô thực vật C: bào

tử; A: đĩa áp; Cu: biểu bì; PP: vòi xâm nhiễm; ILS: đốm sáng; PH: sợi nấm

sơ cấp; E: mô biểu bì; M: tế bào thịt lá; N: hoại sinh; SH: sợi nấm thứ cấp; ScH: dưới lớp biểu bì [38]

Ở Hình 1.6A, với cách xâm nhiễm bán kí sinh, vòi xâm nhiễm xuyên qua tế bào biểu bì của kí chủ và phồng to lên tạo ra khoang xâm nhiễm với sợi nấm có kích thước lớn, được gọi là sợi nấm sơ cấp (PH) Sợi nấm này có thể định vị lan sang các mô biểu bì (E) và tế bào thịt lá (M) kế cận Trong giai đoạn đầu sự định vị này, sự tương tác được thể hiện qua sự hình thành sợi nấm thứ cấp mỏng (SH) Các sợi nấm thứ cấp này đâm xuyên vào trong các tế bào, len lỏi theo các ngã gian bào đồng thời tiết enzyme phân hủy vách tế bào

và giết chết tế bào kí chủ [38]

Ở Hình 1.6B là cách xâm nhiễm hoại sinh Sự định vị trong tế bào kí chủ bắt đầu ở bên dưới lớp biểu bì (ScH), và thường không có giai đoạn kí sinh của sợi nấm bên trong vách hoặc nếu có thì giai đoạn này rất ngắn Nấm lây lan nhanh chóng qua các mô đi vào trong tế bào và qua các ngã gian bào [38]

1.5 Một số biện pháp phòng ngừa bệnh thán thư

Quản lý bệnh thán thư đã trở thành vấn đề quan trọng do chưa có biện

Trang 40

nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp hóa học, sinh học, cơ học và giống kháng bệnh để quản lý dịch hại

Áp dụng kỹ thuật canh tác

Mầm bệnh có thể bắt nguồn từ hạt giống, gió, nước và đất trồng Do đó, nên tập trung kiểm soát 4 yếu tố là hệ thống thoát nước, luân canh, giống và loại bỏ tất cả các bộ phận mô bị nhiễm bệnh ra khỏi đồng ruộng Ngoài ra, cần duy trì khoảng cách giữa các cây để làm giảm tán cây dày làm gia tăng độ ẩm Việc sử dụng rơm rạ và màng phủ nông nghiệp cũng có thể kiểm soát được sự lây lan của bệnh

Phương pháp sử dụng thuốc hóa học

Vì tác dụng nhanh nên phương pháp hóa học được xem như giải pháp hữu hiệu nhất để ngăn chặn sự phát tán của mầm bệnh hiện nay Tuy nhiên, tồn dư thuốc hóa học trong nông sản tạo nên rào cản cho việc xuất khẩu nông sản đến các nước khác, lần lượt ảnh hưởng đến nền kinh tế của đất nước Ngoài ra, kết quả thực tiễn cho thấy việc sử dụng đơn lẻ hoạt chất hóa học còn tạo ra tính kháng thuốc của tác nhân gây bệnh, gây thêm khó khăn cho việc quản lý dịch hại [94]

Sử dụng các giống kháng bệnh

Phát triển các giống kháng bệnh rất quan trọng và là chiến lượng bền vững để quản lý dịch bệnh Chiến lược này không những loại bỏ được sự thất thoát do bệnh gây ra mà còn ngăn chặn được vấn đề tồn dư hóa chất và chi phí khác để kiểm soát dịch bệnh Gần đây, Garg và cộng sự (2014) đã kết luận có

chín giống Capsicum kháng bệnh là BS-35, BS-20, BS-28, Punjab Lal, Bhut

Jolokia, Taiwan-2, IC-383072, Pant C-1 và Lankamura [94]

Sử dụng các chất chiết xuất từ thực vật

Các đặc tính của hoạt chất chiết xuất như dễ phân hủy, không gây độc cho con người, môi trường xung quanh và không để lại dư lượng là nguyên nhân làm cho biện pháp này được chú trọng cho đến nay Chiến lược này đã

Tiêu đề	Xây dựng bộ sưu tập các chủng vi khuẩn bacillus spp., pseudomonas spp. có khả năng đối kháng nấm colletotrichum spp. gây bệnh thán thư trên cây ớt
Tác giả	Trần Thùy Trang
Người hướng dẫn	PGS.TS. Dương Hoa Xô
Trường học	Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh
Thể loại	báo cáo
Năm xuất bản	2020
Thành phố	Thành phố Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	253
Dung lượng	17,88 MB

Xây dựng bộ sưu tập các chủng vi khuẩn bacillus spp pseudomonas spp có khả năng đối kháng nấm colletotrichum spp gây bệnh thán thư trên cây ớt

Kết quả định danh Pseudomonas spp. bằng sinh học phân tử