Ứng dụng vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật rhodopseudomonas palustris sản xuất chế phẩm sinh học dùng cho cây trồng trung tâm ươm tạo doanh nghiệp nông nghiệp công nghệ cao

TÓM TẮT Đề tài “Ứng dụng vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật Rhodopseudomonas palustris sản xuất chế phẩm sinh học dùng cho cây trồng” được thực hiện tại Trung tâm Ươm tạo doanh

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRUNG TÂM ƯƠM TẠO DOANH NGHIỆP NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO

BÁO CÁO TỔNG KẾT NHIỆM VỤ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

ỨNG DỤNG VI SINH VẬT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG

THỰC VẬT Rhodopseudomonas palustris SẢN XUẤT CHẾ

PHẨM SINH HỌC DÙNG CHO CÂY TRỒNG

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRUNG TÂM ƯƠM TẠO DOANH NGHIỆP NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO

BÁO CÁO TỔNG KẾT NHIỆM VỤ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

ỨNG DỤNG VI SINH VẬT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG

THỰC VẬT Rhodopseudomonas palustris SẢN XUẤT CHẾ

PHẨM SINH HỌC DÙNG CHO CÂY TRỒNG

Cơ quan chủ trì Chủ nhiệm đề tài

CN Nguyễn Ngọc Duy

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

MỤC LỤC

DANH SÁCH HÌNH iii

DANH SÁCH BẢNG iv

DANH SÁCH BIỂU ĐỒ v

TÓM TẮT vi

PHẦN MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết nhiệm vụ 1

2 Mục tiêu của nhiệm vụ 2

3 Giới hạn nghiên cứu 2

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn quang dưỡng tía không lưu huỳnh-họ Rhodospirillaceae 3

1.1.1 Phân loại vi khuẩn quang dưỡng tía 3

1.1.2 Giới thiệu khái quát về vi khuẩn tía không lưu huỳnh 4

1.2 Giới thiệu vi khuẩn quang dưỡng tía không lưu huỳnh Rhodopseudomonas palustris 8

1.3 Đặc điểm phân loại vi khuẩn quang hợp tía 10

1.4 Ứng dụng của VKQH tía 12

1.5 Một số nghiên cứu về vi khuẩn quang dưỡng tía không lưu huỳnh Rhodopseudomonas palustris 14

1.5.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 14

1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 15

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.2 Địa điểm và thời gian thực hiện 16

2.3 Vật liệu, thiết bị 16

2.4 Hóa chất 17

2.4.1 Môi trường phân lập, làm thuần và nuôi cấy 17

2.5.4 Phương pháp đánh giá khả năng tạo IAA của các chủng vi khuẩn thu

thập [1] 20

Định tính 20

2.5.5 Giải trình tự DNA để xác định loài 22

2.5.6 Phương pháp nhân sinh khối vi khuẩn Rhodopseudomonas palustris 22 2.5.7 Khảo sát ảnh hưởng của Rhodopseudomonas palustris đến sự sinh trưởng trên cây bắp trong phòng thí nghiệm [18] 23

2.6 Phương pháp xử lý số liệu 24

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn quang dưỡng Rhodopseudomonas palustris có ích cho cây trồng 25

3.1.1 Thu mẫu 25

3.1.2 Nuôi tích lũy và phân lập 26

3.1.3 Khả năng sinh IAA của 5 chủng R1, R3, R5, R9 và R11 30

3.1.4 Kết quả nhận diện tên loài bằng kỹ thuật sinh học phân tử 33

3.2 Nhân sinh khối Rhodopseudomonas palustris trong phòng thí nghiệm 35

3.3 Khảo sát ảnh hưởng của Rhodopseudomonas palustris đến sự sinh trưởng trên cây bắp trong phòng thí nghiệm 38

3.3.1 Ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt 38

3.3.2 Ảnh hưởng của Rhodopseudomonas palustris đến sự sinh trưởng trên cây bắp trong phòng thí nghiệm 39

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42

4.1 Kết luận 42

4.2 Đề nghị 42

SẢN PHẨM CỦA NHIỆM VỤ 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

PHỤ LỤC 47

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Các dạng tế bào ở VKQD tía không lưu huỳnh 5

Hình 2 Vi khuẩn Rhodopseudomonas palustris 8

Hình 3 Màng quang hợp của R.palustris 9

Hình 4 Sinh khối R.palustris 9

Hình 5 Đặc điểm biến dưỡng R.palustris 10

Hình 6 Huyền phù tế bào VKQD tía với màu sắc đặc trưng 26

Hình 7 Khuẩn lạc VKQD 27

Hình 9 Định tính IAA của các chủng thông qua thuốc thử Salkowski 31

Hình 10 Phản ứng IAA với thuốc thử Salkowski của các chủng nuôi cấy 8 ngày 33

Hình 11 Nhân sinh khối Rhodopseudomonas palustris 36

Hình 12 Điều kiện có ánh sáng sau 8 ngày 36

Hình 13 Nuôi trong điều kiện có oxy 37

Hình 14 Nuôi trong điều kiện không có ánh sáng 37

Hình 15 Khuẩn lạc Rhodopseudomonas palustris khi có sự hiện diện của oxy 37

Hình 17 Ảnh hưởng của vi khuẩn trên cây bắp 40

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1 Phân biệt các nhóm vi khuẩn quang dưỡng 4

Bảng 2 Một số đặc tính đặc trưng ở vi khuẩn quang hợp tía không lưu huỳnh [6] 7

Bảng 7 Đặc điểm mẫu phân lập 25

Bảng 8 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc các chủng vi khuẩn phân lập 28

Bảng 9 Kết quả nhuộm gram chủng vi khuẩn phân lập 29

Bảng 9 Hàm lượng IAA trong dịch nuôi cấy (µg/ml) theo thời gian 32

Bảng 10 Kết quả giải trình tự gen 16S rDNA các chủng vi khuẩn 34

Bảng 11 So sánh kết quả giải trình tự trên ngân hàng gen 35

Bảng 12 Ảnh hưởng của Rhodopseudomonas palustris đến sự nảy mầm hạt bắp 38

Bảng 13 Ảnh hưởng của Rhodopseudomonas palustris đến sự phát triển của rễ bắp 39

Bảng 14 Ảnh hưởng của Rhodopseudomonas palustris đến sự phát triển của chồi bắp 40

DANH SÁCH BIỂU ĐỒ

Đồ thị 1 Đường tương quan tuyến tính giữa hàm lượng IAA chuẩn và OD530nm 31

Đồ thị 2 Hàm lượng IAA trong dịch nuôi cấy (µg/ml) theo thời gian 32

TÓM TẮT

Đề tài “Ứng dụng vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật

Rhodopseudomonas palustris sản xuất chế phẩm sinh học dùng cho cây trồng”

được thực hiện tại Trung tâm Ươm tạo doanh nghiệp Nông nghiệp công nghệ cao,

từ tháng 1 đến tháng 12 năm 2018, đã tiến hành phân lập, tuyển chọn được 3 chủng

vi khuẩn Rhodopseudomonas palustris phân lập từ các mẫu đất, nước nhận diện

bằng kỹ thuật PCR, được chọn để khảo sát khả năng tổng hợp IAA và ảnh hưởng

của chúng lên sự phát triển của bắp trong điều kiện phòng thí nghiệm Kết quả thí

nghiệm cho thấy, cả ba chủng R1, R3, R9 đều có khả năng tổng hợp IAA Chủng

R3 tổng hợp được lượng IAA nhiều nhất 13,05µg/ml vào ngày thứ 8 Lượng IAA

sinh ra này góp phần làm tăng chiều dài rễ, chồi bắp trong thí nghiệm

THÔNG TIN CHUNG

1 Tên nhiệm vụ

Ứng dụng vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật Rhodopseudomonas palustris sản xuất chế phẩm sinh học dùng cho cây trồng

Chủ nhiệm:

- Họ và tên: Nguyễn Ngọc Duy

- Năm sinh: 1989 Nam/Nữ: nam

- Học vị: Cử nhân Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Năm đạt học vị: 2011

- Chức vụ: Chuyên viên phòng Hỗ trợ công nghệ vi sinh

- Tên cơ quan công tác: Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao

- Địa chỉ cơ quan: Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, Tp.HCM

- Điện thoại cơ quan: 08 62646103 Fax: 08 62646104

- Địa chỉ nhà riêng: 110, đường 489, ấp 2, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, TP.HCM

- Điện thoại: 0383290994

- Email: ngocduy89@hotmail.com

Điện thoại: 028.62646103 Fax: 028.62646104

E-mail: info@abi.com.vn Website: www.abi.com.vn

Địa chỉ: ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, Tp HCM

Văn phòng giao dịch: 499, Cách mạng Tháng 8, phường 13, quận 10, Tp HCM

Thời gian thực hiện: 12 tháng

Kinh phí được duyệt: 125.424.773 đồng

2 Nội dung

- Nội dung 1: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn quang dưỡng

Rhodopseudomonas palustris có ích cho cây trồng

- Nội dung 2: Nhân sinh khối Rhodopseudomonas palustris trong phòng thí nghiệm

- Nội dung 3: Khảo sát ảnh hưởng của Rhodopseudomonas palustris đến sự

sinh trưởng trên cây bắp trong phòng thí nghiệm

3 Sản phẩm

- Báo cáo khoa học

- Vi khuẩn Rhodopseudomonas palustris có khả năng kích thích sinh

trưởng thực vật

PHẦN MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết nhiệm vụ

Từ xưa đến nay, năng suất cây trồng luôn là vấn đề quan tâm hàng đầu của mọi nền nông nghiệp Do đó, đã có rất nhiều phương pháp được sử dụng nhằm cải thiện năng suất cũng như tăng cường sức đề kháng của cây trồng với mầm bệnh trong đó phổ biến nhất là sử dụng thuốc trừ sâu và phân bón hoá học Việc sử dụng

dư thừa lượng phân hoá học trong hệ thống canh tác hiện nay đã dẫn đến các mối nguy về môi trường như: gây ô nhiễm môi trường, thoái hoá đất và ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ con người Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, các biện pháp và xu hướng mới đã ra đời với mục tiêu xây dựng một nền nông nghiệp bền vững, thân thiện với môi trường mà vẫn đạt năng suất cao Bên cạnh đó, gần đây nhiều công bố khoa học cho thấy tiềm năng sử dụng tương tác có lợi giữa vi sinh vật với cây trồng để kích thích sinh trưởng ở thực vật

Khả năng kích thích sinh trưởng thực vật của các chủng vi sinh vật này được biết đến thông qua cơ chế cố định đạm hoặc sự sản sinh các hợp chất sinh học như các phytohormone, vitamin và cả một số loại enzyme có khả năng ức chế sự phát triển của mầm bệnh qua đó kích thích sinh trưởng của cây chủ Chính bởi những

ưu điểm này mà việc sản xuất các chế phẩm vi sinh từ vi sinh vật có khả năng kích

thích sinh trưởng thực vật đang là một hướng đi đầy tiềm năng Rhodopseudomonas palustris là một loại vi khuẩn có khả năng đặc biệt là có thể

sinh trưởng trong môi trường có hoặc không có oxy Đây là loại vi khuẩn có lợi và cần thiết cho cây trồng, có khả năng thích nghi với các điều kiện khí hậu khác nhau

Từ những thực tiễn đó, nhiệm vụ “Ứng dụng vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực

2 Mục tiêu của nhiệm vụ

Mục tiêu của nhiệm vụ là phân lập và tuyển chọn vi khuẩn

Rhodopseudomonas palustris có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật để sản

xuất chế phẩm vi sinh dùng cho cây trồng

3 Giới hạn nghiên cứu

Trong giới hạn của nghiên cứu về thời gian cũng như kinh phí, nhiệm vụ nghiên cứu được thực hiện trong điều kiện giới hạn của phòng thí nghiệm

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn quang dưỡng tía không lưu huỳnh-họ

Rhodospirillaceae

1.1.1 Phân loại vi khuẩn quang dưỡng tía

Molisch (1970) là người đầu tiên sử dụng sắc tố để phân loại vi khuẩn tía thành bộ Rhodobacteria với hai họ là Thiorhodaceae và Athiorhodaceae Pfennig

và Truper (1971) thay đổi tên bộ thành Rhodospirillales và tên họ thành Chromatiaceae và Rhodospirillaceae Imhoff (1984) chia nhóm vi khuẩn quang dưỡng (VKQD) tía lưu huỳnh thành hai họ là Chromatiaceae, Ectothiorhodospiraceae và vi khuẩn tía không lưu huỳnh thành họ Rhodospirillaceae Các thành viên của họ Chromatiaceae có đặc điểm là khi tăng trưởng trong môi trường có sulfide và sử dụng chất này làm chất cho điện tử sẽ hình thành hạt lưu huỳnh bên trong tế bào Theo Hansen (1974), vi khuẩn thuộc họ Rhodospirillaceae có khả năng sử dụng sulfide nhưng không tạo lưu huỳnh bên trong tế bào Chúng oxy hóa sulfide thành hợp chất có mức oxy hóa cao hơn như sulphate hoặc tetrathionate hoặc tạo lưu huỳnh bên ngoài tế bào

Như các VKQD khác, vi khuẩn tía chỉ có một quang hệ với sắc tố quang hợp

là diệp lục khuẩn (bacteriochlorophyll, bchl) a, b, c, d, e và rất nhiều loại carotenoid Các carotenoid là nhóm sắc tố quyết định màu sắc của vi khuẩn tía Chúng thường không có màu tía mà là màu nâu, màu hồng, đỏ cam, hoặc tím tía

Bảng 1 Phân biệt các nhóm vi khuẩn quang dưỡng

Nhóm vi khuẩn Chlorophyll

(Bchl)

Chất cho điện tử trong quang tự dưỡng

Quang

dị dưỡng

Hóa dưỡng

Vi khuẩn quang dưỡng không sinh ôxy

Vi khuẩn tía lưu huỳnh

Một vài loài

Một vài loài

Vi khuẩn tía lưu huỳnh

Có thể hầu hết các loài

Một vài loài

Vi khuẩn tía không lưu

S 2 O 3

-Tất cả các loài

Có lẽ tất

cả các loài

Vi khuẩn lục lưu huỳnh

(Chlorobiaceae)

Chủ yếu bchl c,d hoặc e

S- hoặc S 0 hoặc H 2

(hạt S 0 hình thành bên ngoài tế bào từ S - )

Có thể tất cả các loài

Không

Vi khuẩn lục hình sợi đa

bào (Chloroflexaceae)

Một hoặc nhiều bchl a, c,d

Quang tự dưỡng? Tất cả

các loài

Có lẽ tất

cả các loài

1.1.2 Giới thiệu khái quát về vi khuẩn tía không lưu huỳnh

Nhóm vi khuẩn tía không lưu huỳnh hay họ Rhodospirillaceae rất đa dạng

về hình thái, cấu trúc tế bào và đặc tính sinh lý nên chúng là nhóm vi khuẩn phân

bố rộng và đa dạng nhất trong vi khuẩn quang dưỡng (VKQD) tía nói chung Có

thể tìm thấy các loài VKQD tía không lưu huỳnh ở nhiều thủy vực khác và đất ẩm

có nhiều ánh sáng

Hình dạng tế bào có tính đặc trưng loài Khả năng di động, kiểu phân bố tiêm mao, kiểu phân chia và sự hiện diện màng nhày capsule rất nhiều kiểu Màng nội chất bên trong chứa quang hệ cũng có nhiều dạng cấu trúc (kiểu giống ngón tay hay bó ống, kiểu túi, kiểu cụm gắn với màng và kiểu phiến mỏng)

Vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía là nhóm vi sinh vật có sinh lý linh hoạt,

có thể phát triển quang dưỡng và trong bóng tối Chúng có thể sử dụng nguồn carbon vô cơ hoặc hữu cơ Nếu tăng trưởng là quang tự dưỡng thì H2, sunfua ở nồng độ thấp được sử dụng làm nguồn cho điện tử trong quang hợp Một vài loài

có thể sử dụng thiosulfate hoặc Fe2+ là nguồn cho điện tử [23]

Tế bào dạng cầu-que ở Rhodobacter sphaeroides

Tế bào hình xoắn ở Rhodospirillum rubrum Tế bào dạng vòng ở Rhodocyclus purpureus

Tế bào dạng que ở Rhodopseudomonas acidophila

Hình 1 Các dạng tế bào ở VKQD tía không lưu huỳnh

Tuy nhiên, hầu hết vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía phát triển tốt nhất trong môi trường dị dưỡng Đó là môi trường có chứa một số hợp chất hữu cơ dễ

sử dụng, chẳng hạn như malate hoặc pyruvat và ammoniac là nguồn nitơ

Hầu hết các loài VKQD tía không lưu huỳnh có thể phát triển trong điều kiện vi yếm khí đến hiếu khí và chịu được áp lực của oxy Một vài chủng rất nhạy

cảm với oxy Ở các loài Rhodopseudomonas capsulatus, Rhodobacter sphaeroides

cấu trúc tế bào sẽ bị tổn thương trong môi trường hiếu khí Khi áp lực oxy giảm, sắc tố quang hợp và màng trong tế bào chất bắt đầu được tạo thành Khi có oxy, huyền phù tế bào thường có màu nhạt hay không màu

Bảng 2 Một số đặc tính đặc trưng ở vi khuẩn quang hợp tía không lưu huỳnh [6]

Hình thức biến dưỡng rất linh động: hóa tự dưỡng, hóa dị dưỡng, quang dị dưỡng, quang tự dưỡng phụ thuộc vào những điều kiện có sẵn của môi trường

Các hợp chất hữu cơ khác nhau như acid hữu cơ (một hoặc hai nhóm chức), các rượu và nhiều loại đường, acid béo bào hòa mạch thẳng từ 5-18 carbon, hợp chất hữu cơ có vòng là chất cho điện tử và nguồn carbon Ammonia, nitơ phân tử, nitrate và nhiều hợp chất nitơ hữu cơ là nguồn đạm Biotin, thiamin, niacin và p-aminobenzoic là nhân tố tăng trưởng chính

1.2 Giới thiệu vi khuẩn quang dưỡng tía không lưu huỳnh

Màng quang tổng hợp phía bên trong, còn gọi là lamellae, có dạng phiến xếp song song với màng tế bào

Tế bào chứa diệp lục khuẩn a (Bchl a), phổ hấp thụ cực đại 854nm

Có hai giai đoạn phát triển chính:

+ Phân chia tế bào bằng cách nảy chồi, là kiểu phân chia không đối xứng, hình thành hai kiểu tế bào khác nhau; một bào tử di động và một tế bào khác có cuống không di động

+ Sự biệt hóa của một hệ thống phức tạp gồm các túi trên màng tế bào chất phía trong tế bào thành màng quang hợp hoàn chỉnh

Hình 3 Màng quang hợp của R.palustris

Hình 4 Sinh khối R.palustris

Đặc điểm biến dưỡng [3]

Vi khuẩn R.palustris có phương thức biến dưỡng rất linh động, có thể phát triển bằng các phương thức biến dưỡng như hóa tự dưỡng, hóa dị dưỡng, quang

dị dưỡng, quang tự dưỡng tùy theo điều kiện môi trường có sẵn, đặc biệt là các yếu tố sau: mức độ kỵ khí, nguồn carbon, cường độ ánh sáng

1.3 Đặc điểm phân loại vi khuẩn quang hợp tía

Các đặc tính hình thái, thành phần hóa học tế bào và đặc tính sinh lý đều rất quan trọng trong việc định danh VKQD Phổ hấp thụ cực đại của huyền phù tế bào nguyên vẹn cho thông tin về loại diệp lục khuẩn chính

Bảng 3 Phổ hấp thụ cực đại của diệp lục khuẩn ở tế bào sống

Diệp lục khuẩn Bchl Phổ hấp thụ cực đại (nm)

Ở nhiều loài, màu sắc huyền phù tế bào cho phép xác định loại carotenoid chính Spirilloxanthin là thành phần chính cho màu sắc đỏ và hồng, nếu có thêm rhodopin thì chuyển sang sắc nâu, okenon tạo màu đỏ tía và rhodopinal tạo màu tím tía Carotenoid loại spheroiden cho gam màu từ nâu vàng đến đỏ nâu (màu được hình thành tùy thuộc vàocác dẫn xuất bị oxy hóa khi có sự hiện diện của oxy)

và màu nâu xanh khi trong môi trường có thể oxy hóa khử mạnh [17, 18] Kết quả phân tích định lượng sắc tố của một mẫu tự nhiên có thể phản ánh mối liên hệ khá quan trọngcủa nhiều nhóm vi sinh vật quang dưỡng trong môi trường [22]

Isoprenoid Quinone có vai trò quan trọng trong chuỗi truyền điện tử VKQH tía tổng hợp nhiều loại Quinone khác nhau ở chiều dài và độ bão hòa của chuỗi polypreinyl Đặc điểm đa dạng này của quinone ở nhóm vi khuẩn tía không lưu huỳnh có giá trị cao trong phân loại

Giống và loài thường được phân biệt dựa trên sự so sánh nhiều đặc tính về hình dạng, kích thước tế bào, kiểu tiêm mao, cấu trúc màng trong tế bào chất, thành phần sắc tố, tỉ lệ các base của DNA và các đặc tính sinh lí (như khả năng sử dụng hợp chất nito, cabon, khả năng hô hấp hiếu khí và kị khí trong tối, tính mẫn cảm với sulfide, nhu cầu NaCl, nhiệt độ, pH), đặc tính sinh thái (môi trường tự nhiên

mà vi sinh vật thường phân bố) [24]

Những thông tin về kích thước và trình tự cytochrome c, cấu trúc lipopolysaccharid và trình tự gen mã hóa rRNA 16S được dùng để xác định mối quan hệ tiến hóa giữa các loài Lai phân tử DNA–DNA là tiêu chí quan trọng để phân biệt các loài gần nhau [8] Việc xác định thành phần GC của DNA có vai trò quan trọng để mô tả loài mới

1.4 Ứng dụng của VKQH tía

Những ứng dụng nổi bật của VKQH tía là xử lý nước thải, cải thiện môi trường, sản xuất hydro phân tử, sinh khối Các VKQH tía nói chung là nguồn cung cấp các thành phần của chuỗi truyền điệntử trong quang hợp và tạo ATP, nguồn vitamin và các phân tử hữu cơ khác

Sản xuất protein đơn bào

VKQH là nguồn cung cấp protein đơn bào có giá trị vì sinh khối VKQH giàu protein, vitamin và carotenoid Ở tế bào VKQH hàm lượng protein thường chiếm

60 – 70% trọng lượng khô, số lượng cũng như hàm lượng các axit amin không thay thế của chúng có thể tương đương với đậu tương, thịt, trứng gà

Ở loài Rhodopseudomonas capsulatus, protein và axit nucleic chiếm 61%

và 6% trọng lượng sinh khối; lượng acid amin khi ly giải tế bào tương đương với

Chlorella vulgaris, nhưng chứa thành phần methionin cao hơn

Các loại chất thải hay vật liệu rẻ tiền thường được tận dụng làm nguyên liệu

để nuôi cấy VKQH thu sinh khối Khi nuôi cấy đồng thời Rubriviax delatinosa và Rhodobacter sphaeroides trên bã mì, lượng vitamin B12 và carotenoid thu được

là 44 và 230µg/g chất khô

Sinh khối VKQH giàu vitamin, axit amin thiết yếu và axit amin có lưu huỳnh

là nguồn thức ăn tốt cho gia súc, phiêu sinh vật và tôm cá Giá trị dinh dưỡng của VKQH khi bổ sung vào thức ăn chăn nuôi đãđược chứng minh trong thực tiễn Mức độ sống sót của cá giống, tốc độ sinh trưởng và trọng lượng của chúng được gia tăng khi nuôi bằng thức ăn có bổ sung tế bào VKQH Việc bổ sung sinh khối của VKQH vào thức ăn của gà mái đã giúp cải thiện số lượng, chất lượng trứng gà [23]

Rhodopseudomonas sphaeroides, Rhodopseudomonas sulfidophilus và Rhodospirillum rubrum

Sản xuất hoocmon thực vật

Người ta đã phát hiện ra rằng một số hoocmon thực vật cũng có mặt trong

tế bào VKQH tía với vai trò điều chỉnh quá trình quang hợp Các hoocmon tách

ra từ R.rubrum có hoạt tính sinh lý khá cao và bao gồm ba loại cytokinin (hàm lượng1mg/g sinh khối tươi) có nguồn gốc adenin Dịch tế bào R.spharroides đã

nuôi cấy bằng nước thải có chứa kinetin hàm lượng 4,7g/l và zeatin với hàm lượng 2g/l Ngoài ra, người ta cũng tìm thấy một số chất kích thích sinh trưởng khác như auxin, idol–3–axetic axit (IAA), indol–3–butiric axit (ABA) trong tế bào

chủng R.palustris

Sản xuất các chất kháng sinh

Một trong những đặc tính của VKQH là có khả năng sinh các chất kháng vi sinh vật bao gồm: các chất kháng sinh, các chất kháng khuẩn và kháng virus [15] Hoạt chất kháng virus có thể được tìm thấy trong khá nhiều chủng thuộc loài

R.rubrum, R.capsulatus, C.vinosum Chất này thường tấn công vào các virus gây

Nước thải chứa hỗn hợp các chất hữu cơ phân tử lượng nhỏ, là nguồn cơ chất tốt cho vi khuẩn tía để tăng trưởng trong điều kiện kị yếm khí và vi hiếu khí VKQH thường được ứng dụng cùng với các vi sinh vật dị dưỡng yếm khí, hiếu khí,

và vi tảo trong các hệ thống làm sạch nước thải Các loài thường được sử dụng

trong xử lý nước thải là: R.Capsulatus, R.sphaeroides, Rhodopseudomonas palustris, Rhodospirillum fulvum…

1.5 Một số nghiên cứu về vi khuẩn quang dưỡng tía không lưu huỳnh

Rhodopseudomonas palustris

1.5.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Hiệu quả của vi sinh vật trong việc làm tăng khả năng sinh trưởng phát triển cây trồng, tiết kiệm phân bón hoá học cũng như tăng năng suất, chất lượng nông sản đã được khẳng định trong nhiều công trình nghiên cứu của nhiều nước trên thế giới Các chế phẩm vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật từ vi khuẩn quang dưỡng tía đã được nghiên cứu từ nhiều năm nay có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và xây dựng nền nông nghiệp bền vững

Naoki Harada và cộng sự (2005) đã nghiên cứu việc chủng

Rhodopseudomonas palustris vào ruộng lúa thí nghiệm, giúp tăng năng suất 9% so

với đối chứng [12]

Wai-Tak Wong và cộng sự (2014) nghiên cứu khả năng kích thích sinh

trưởng ở thực vật của vi khuẩn Rhodopseudomonas palustris, qua nghiên cứu tại Đài Loan đã cho thấy việc bổ sung Rhodopseudomonas palustris vào đất đã giảm

được 50% lượng phân bón trên cây cải bắp [19]

Duangporn Kantachotea và cộng sự (2015) đã nghiên cứu sử dụng

Rhodopseudomonas palustris tăng năng suất lúa, giảm khí thải mê-tan [2]

Leong Pei Pei (2015) đã nghiên cứu khả năng sinh Indole-3-acetic acid

80,77±2,13 μg/mL sau 48 giờ ủ, ở 35°C, môi trường nuôi cấy 5 g/L Tryptophan, 4,94 g/L glucose, 0,6 g/L KNO3 [9]

1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nhằm mục tiêu phát triển nông nghiệp sinh thái bền vững và ứng dụng công nghệ sinh học vào nông nghiệp, trong những năm gần đây Việt Nam có một số nghiên cứu về việc sử dụng vi khuẩn quang dưỡng tía:

Lê Thị Thúy Ái (2002) đã tiến hành phân lập được 31 chủng vi khuẩn quang dưỡng và khảo sát khả năng biến dưỡng hợp chất dị vòng của chúng [10]

Nguyễn Dương Tâm Anh (2005) đã nghiên cứu khả năng thu nhận hợp chất

Ubiquinone Q10 từ vi khuẩn Rhodopseudomonas palustris với hàm lượng Q10 thu

được 583 (µg/g SKT) [13]

Nguyễn Thị Hương Giang (2012) đã phân lập được 13 chủng vi khuẩn quang dưỡng tía để tạo chế phẩm vi sinh vật hữu hiệu xử lý sulfua đạt hiệu suất 77,8% [15]

Hồ Thị Nguyên Hân (2016) đã nghiên cứu sử dụng vi khuẩn quang dưỡng

tía Rhodobacter sp xử lý nước thải lò mổ, đã xử lý được 90% COD, 99,3% sulfide

sau 18 ngày [5]

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Các chủng vi khuẩn quang dưỡng được phân lập từ nhiều thủy vực tự nhiên ở địa bàn Củ Chi, Hậu Giang

2.2 Địa điểm và thời gian thực hiện

- Địa điểm: Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao - Ấp

1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, thành phố Hồ Chí Minh

+ Cân kỹ thuật (TE3102S), cân phân tích (Ohaus PA214)

+ Máy đo pH (Milwaukee Mi151)

+ Máy quang phổ UV-VIS (UVD-3000)

+ Kính hiển vi quang học (Axio Lab A1-Carl Zeiss)

+ Máy lắc (Việt Nam)

2.4 Hóa chất

2.4.1 Môi trường phân lập, làm thuần và nuôi cấy

Đề tài sử dụng môi trường SA do Imhoff và Truper thiết kế (1971) và được cải biên bởi Kawasaki (1993) [10]

Bảng 4 Thành phần môi trường SA (Sodium Acetate)

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp thu mẫu

Mẫu được thu tại các khu vực như sông, ao hồ tự nhiên, khu vực nước thải

và ruộng lúa Mẫu nước tại các thủy vực được thu ở độ sâu 10 cm; riêng các khu vực cạn như ruộng lúa, lấy cả nước và bùn Dùng lọ thủy tinh sạch lấy đầy mẫu nước để duy trì điều kiện yếm khí, mẫu được giữ lạnh ngay sau đó đến khi sử dụng [10]

2.5.2 Phương pháp làm giàu và phân lập

- Nuôi tích lũy: chuyển 1ml mẫu nước hoặc nước có bùn vào ống nghiệm 25ml chứa đầy môi trường dịch thể SA (nhằm tạo điều kiện yếm khí) Ủ ở nhiệt độ

300C, chiếu sáng bằng đèn với cường độ sáng khoảng 2000 lux Sau 5 -7 ngày, quan sát sinh khối vi khuẩn quang dưỡng tía với màu sắc đặc trưng từ nâu vàng đến đỏ tía [10]

- Phân lập và làm thuần: huyền phù sinh khối vi khuẩn quang dưỡng tía lấy

từ môi trường nuôi tích lũy được pha loãng và ria trên môi trường thạch SA Sau

đó đặt đĩa thạch vào tủ ủ yếm khí Sau 5 – 7 ngày, chọn các khuẩn lạc riêng rẽ, với màu sắc đặc trưng, huyền phù hóa từng khuẩn lạc trong nước cất vô trùng và ria trên môi trường thạch mới để làm thuần [10]

2.5.3 Phương pháp quan sát hình thái vi khuẩn

- Quan sát đại thể: Tiến hành quan sát khuẩn lạc đơn dưới kính lúp điện và làm tiêu bản ướt quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi ở vật kính 40 Các chỉ tiêu hình thái mô tả là: dạng, bề mặt, mép và màu sắc của khuẩn lạc, hình dạng tế bào

nguyên màu của thuốc nhuộm, VSV gram âm không giữ được màu của thuốc nhuộm nên mất màu và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung

Cách tiến hành:

- Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hòa vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí

- Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần

- Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô

- Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô

- Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô

- Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong không khí

Xem kết quả sau 30 phút Vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp IAA sẽ hiện lên màu hồng với thuốc thử Đối chứng 1: giấy lọc đặt trên đĩa môi trường không

có vi khuẩn, đối chứng 2: IAA chuẩn nồng độ 1000 ppm

Định lượng

- Thực hiện nuôi cấy các chủng vi khuẩn phân lập được trên môi trường SA

- Chuẩn bị môi trường lỏng trong các ống nghiệm, mỗi ống nghiệm 10ml dịch môi trường, hấp khử trùng 1atm, 45 phút

- Tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn phân lập được vào các ống nghiệm chứa môi trường đã khử trùng

- Cấy vi sinh vật trên môi trường SA có bổ sung 0,01% tryptophan Sau mỗi ngày nuôi cấy, tiến hành thu dịch nuôi cấy và li tâm 3500 vòng/ phút trong 20 phút để thu lấy dịch trong Đo lượng IAA được vi khuẩn tổng hợp và tiết ra môi trường bằng phương pháp so màu Salkowski ở bước sóng 530nm Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

Phương pháp xác định phương trình đường chuẩn của mối tương quan giữa chỉ số OD530nm và nồng độ IAA:

- Chuẩn bị dung dịch đệm Phosphat (200ml)

A: KH2PO4 0,136 g/100ml nước cất

B: K2HPO4 0,174 g/100ml nước cất

Lấy 39ml A + 61 ml B, thêm nước cất vừa đủ 200ml, điều chỉnh pH= 7

Cân 4,5g FeCl3 cho vào 1 lít H2SO4 10,8M đã pha ở trên để được thuốc thử

Salkowski

- Chuẩn bị đường chuẩn IAA

Cân 4mg IAA tổng hợp hòa tan với 20 ml dung dịch đệm phosphat được nồng độ là 200 mg/l Sau đó tiến hành pha loãng ra các nồng độ 0, 5, 10, 15, 20,

25, 30, 40, 50, 100mg/l Lấy 4ml thuốc thử cho vào các ống nghiệm có nồng độ IAA khác nhau có thể tích 2ml, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần

Ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng để phản ứng xảy ra hoàn toàn, sau đó tiến hành

2.5.5 Giải trình tự DNA để xác định loài

Sau khi phân lập được những dòng vi khuẩn ròng, kiểm tra và khảo sát đặc tính sinh học, chọn ra các dòng vi khuẩn có đặc tính tổng hợp IAA tốt, gửi mẫu đến phòng vi sinh Viện sinh học Nhiệt Đới giải trình tự DNA và so sánh tương quan di truyền với các dòng vi khuẩn có trên ngân hàng dữ liệu NCBI

2.5.6 Phương pháp nhân sinh khối vi khuẩn Rhodopseudomonas palustris

* Nhân giống cấp 1: vi khuẩn Rhodopseudomonas palustris sau khi được tuyển

chọn và sàng lọc được nhân sinh khối cấp 1 trên môi trường đặc hiệu (SA), ủ ở nhiệt độ 300C, ánh sáng 2000lux, sau khi kiểm tra mật độ (đạt 107CFU/ml) và độ thuần khiết được cấy vào bình lên men tỷ lệ 5% dịch lên men

* Môi trường lên men sinh khối: 1 lít môi trường gồm: 2,74g CH3COONa; 0,65g NH4Cl; 0,2g yeast [24]

* Lên men thu sinh khối: vi khuẩn Rhodopseudomonas palustris được nuôi

trong các chai thủy tinh đóng kín chứa đầy môi trường, pH 7, chiếu sáng bằng đèn với cường độ ánh sáng 2000 lux

2.5.7 Khảo sát ảnh hưởng của Rhodopseudomonas palustris đến sự sinh

trưởng trên cây bắp trong phòng thí nghiệm [18]

- Xử lý giống: hạt giống ngâm trong dung dịch natri hypoclorit 2% trong 3 phút, sau đó rửa lại bằng nước vô trùng 5 lần

- Hạt đã khử trùng được ủ với 50 ml vi khuẩn, ở nghiệm thức đối chứng ủ với nước vô trùng, môi trường nuôi vi khuẩn và dung dịch IAA 1,5 ppm, ủ nhiệt độ phòng trong 24 giờ

- Sau 24 giờ ủ, chọn 3 hạt nảy mầm gieo vào chậu nhựa tròn kính 20 cm, cao 15

cm, có đục lỗ nhỏ chứa giá thể mụn dừa đã được khử trùng Hạt được gieo cách mặt 2 cm Sau 5 ngày trồng, bổ sung 100 mL vi khuẩn, ở nghiệm thức đối chứng

bổ sung nước vô trùng, môi trường nuôi vi khuẩn và dung dịch IAA 1,5 ppm

Bố trí các công thức: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức 20 chậu:

ĐC1: 100 mL nước vô trùng

ĐC2: 100 mL Môi trường nuôi vi khuẩn

ĐC3: 100 mL dung dịch IAA 1,5 ppm

NT3: 100 ml vi khuẩn R9

NT4: 100 ml vi khuẩn hỗn hợp (HH=R1+R3+R9)

* Các chỉ tiêu đánh giá

Sau 15 ngày, tiến hành đánh giá các chỉ tiêu sau:

+ Chiều cao chồi: Bằng thước kẻ centimet, đo từ cổ rễ đến đỉnh lá cao nhất

+ Trọng lượng tươi chồi: cắt bỏ phần rễ, đem cân phần thân và lá

+ Trọng lượng khô chồi: cắt bỏ phần rễ, đem sấy phần thân và lá đến khi trọng lượng không đổi, sau đó đem cân xác định trọng lượng

+ Chiều dài rễ: Bằng thước kẻ centimet, đo từ cổ rễ đến chót rễ dài nhất

+ Trọng lượng tươi rễ: phần rễ được rửa sạch, cắt bỏ phần thân, cân trọng lượng

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn quang dưỡng Rhodopseudomonas

palustris có ích cho cây trồng

3.1.1 Thu mẫu

Mẫu được thu tại các khu vực như sông, ao hồ tự nhiên, khu vực nước thải

và ruộng lúa

Bảng 7 Đặc điểm mẫu phân lập